Artykuł metodologiczny

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54127

⸱

4 lipca 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Streszczenie

Bramkowanie kanałów jonowych to sterowana bodźcem orkiestracja ruchów białek, która prowadzi do przejść między stanami zamkniętymi, otwartymi i odczulenymi. Fundamentalne znaczenie dla tych przemian ma wewnętrzna elastyczność białka, która jest krytycznie modulowana przez skład lipidowy błony. Aby lepiej zrozumieć strukturalne podstawy funkcji kanałów, konieczne jest zbadanie dynamiki białek w fizjologicznym środowisku błonowym. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest ważnym narzędziem do charakteryzowania przejść konformacyjnych między stanami funkcjonalnymi. W porównaniu z NMR i krystalografią rentgenowską, informacje uzyskane z EPR mają z natury niższą rozdzielczość. Jednak w przeciwieństwie do innych technik, w EPR nie ma górnej granicy masy cząsteczkowej białka, wymagania dotyczące próbki są znacznie niższe, a co ważniejsze, białko nie jest ograniczone siłami sieci krystalicznej. W związku z tym EPR doskonale nadaje się do badania dużych kompleksów białkowych i białek w odtworzonych układach. W tym artykule omówimy ogólne protokoły znakowania spinowego kierowanego w miejscu i rekonstytucji błony przy użyciu prokariotycznego, bramkowanego protonami, pentamerycznego kanału jonowego bramkowanego ligandem (pLGIC) z Gloeobacter violaceus (GLIC) jako przykładu. Opisana zostanie kombinacja podejścia EPR do fali ciągłej w stanie ustalonym (CW) i impulsowego (rezonans elektronów podwójnych elektronów-DEER), które umożliwi pełną ilościową charakterystykę dynamiki kanałów.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady, zrozumienie struktury pentamerycznych kanałów jonowych bramkowanych ligandem (pLGIC) wzrosło skokowo, dzięki mnogości struktur o wysokiej rozdzielczości kilku członków rodziny. Kluczowe czynniki, które doprowadziły do obecnych postępów w tej dziedzinie, obejmują odkrycie prokariotycznych kanałów pLGIC,1-3 znaczne postępy w ekspresji białek błony eukariotycznej,4-6 oraz ogromne przełomy w podejściach do określania struktury. 7 Struktury te zapewniają wyraźny konsensus co do ogólnej ochrony trójwymiarowej architektury pLGIC. Jednak dwa główne obszary, które wydają się pozostawać w tyle, to funkcjonalna charakterystyka tych preparatów kanałowych i mechanistyczny opis funkcji kanału.

Bramkowanie zmiany konformacyjne są złożone i zachodzą na przestrzeni 60 A wzdłuż długości kanału, a przejścia te są intensywnie modulowane przez lipidy błonowe. W szczególności wykazano, że ujemne lipidy, cholesterol i fosfolipidy modulują funkcję pLGIC8-11. Chociaż dokładna rola tych składników lipidowych w funkcjonowaniu kanałów pozostaje nieznana, pełne zrozumienie molekularnego bramkowania wymagałoby zbadania tych kanałów w ich naturalnym środowisku. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) i spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) to techniki z wyboru do badania dynamiki białek w odtworzonych układach. Spektroskopia EPR nie jest ograniczona wielkością cząsteczki (jak w przypadku NMR) ani właściwościami optycznymi próbki (jak spektroskopia fluorescencyjna), a tym samym umożliwia pomiary pełnowymiarowych konstruktów odtworzonych w natywnych warunkach lipidowych. Technika ta jest niezwykle czuła i ma stosunkowo niskie wymagania dotyczące próbek (w zakresie piko-kretów). Oba te aspekty sprawiają, że technika ta dobrze nadaje się do badania dużych białek błonowych, które są trudne do ekspresji w ilościach przekraczających miligram.

Użycie spektroskopii EPR w połączeniu z kierunkowym znakowaniem spinowym zostało opracowane przez Wayne'a Hubbella i współpracowników i zostało dostosowane do badania różnych typów białek. Dane 12-24 EPR wykorzystano do zbadania struktur drugorzędowych, zmian w konformacji białka, głębokości insercji błony oraz interakcji białko-białko/białko-ligand.

Metoda polega na podstawianiu cysteiny w interesujących miejscach poprzez mutagenezę ukierunkowaną. Aby zapewnić etykietowanie specyficzne dla miejsca, konieczne jest zastąpienie natywnych cystein innym aminokwasem (np. seryną) w celu stworzenia matrycy bez cysteiny. Zdecydowanie najpopularniejszą etykietą spinową jest specyficzny dla tiolu MTSL: (1-oksylo-2,2,5,5-tetrametylo-Δ3-pirolino-3-metylo) metanetiosiulfonian, który przyłącza się do białka poprzez mostek wiązania dwusiarczkowego. Ze względu na wysoką specyficzność, stosunkowo mały rozmiar (nieco większy niż tryptofan) i elastyczność regionu łącznikowego, wykazano, że ta etykieta spinowa ma doskonałą reaktywność nawet z zakopaną cysteiną. Ponadto, aby zmaksymalizować reaktywność, reakcja znakowania białka odbywa się w postaci rozpuszczonej w detergentach. Po oddzieleniu nadmiaru wolnego spinu za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, białko jest odtwarzane w liposomach lub dwuwarstwowych systemach naśladujących o określonym składzie lipidowym. Ogólnie rzecz biorąc, mutageneza cysteiny jest dobrze tolerowana w większości części białka, a stosunkowo mały rozmiar sondy spinowej powoduje minimalne zaburzenia struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych. Aby upewnić się, że modyfikacja zachowała funkcje typu dzikiego, oznakowane i odtworzone kanały można badać za pomocą pomiarów patch-clamp.

Białko funkcyjne jest następnie poddawane pomiarom spektroskopowym, które zasadniczo dostarczają trzech głównych typów informacji:12,14,15,20,22,23,25-27 dynamika spin-probe poprzez analizę kształtu linii; dostępność sondy dla paramagnetycznych środków relaksacyjnych; oraz rozkład odległości. 27 Odległości EPR mierzy się na dwa różne sposoby. Pierwsza z nich opiera się na technice fali ciągłej (CW), w której do wyznaczenia odległości wykorzystuje się poszerzenie widma wynikające z oddziaływań dipolarnych między znacznikami spinowymi (w zakresie odległości 8 - 20 A). 28,29 Druga to metoda impulsowego EPR, w której pomiary odległości można rozszerzyć do 70 A. 30-34 W podwójnym rezonansie elektronowym (DEER) oscylacje amplitudy spin-echo są analizowane w celu określenia odległości i rozkładów odległości. Tutaj echo spinowe jest modulowane przy częstotliwości oddziaływania dipolarnego. Łącznie parametry te są wykorzystywane do określenia topologii białka, drugorzędowych elementów strukturalnych i zmian konformacyjnych białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mutogeneza celowana i mutacje Cys

  1. Klonowanie i mutageneza
    UWAGA: GLIC typu dzikiego (wt) 35 posiada jedną naturalną cysteinę (C27), która zostaje zmutowana na serynę w celu stworzenia tła pozbawionego cystein. Mutacje cysteiny wprowadza się do tła pozbawionego cystein poprzez mutagenezę celowaną, używając starterów zawierających kodon cysteiny w pożądanej pozycji36.
    1. Wymieszać 5 μl 10x buforu do reakcji, 1 μl matrycowego DNA GLIC pozbawionego cystein (10 ng/μl)35, po 0,5 μl każdego z 40 μM starterów forward i reverse36, 1 μl dNTP (10 mM) oraz 41 μl wody dejonizowanej. Przemieszać próbkę kilkukrotnie pipetą, odwir fracciones (6,0 rpm), a na koniec dodać 1 μl polimerazy DNA.
    2. Ustawić termocykler zgodnie z poniższym protokołem:
      1. Denaturacja w 95 ºC przez 4 min.
      2. Denaturacja w 95 ºC przez 30 s.
      3. Przyłączanie (annealing) w 5 ºC przez 1 min.
      4. Elongacja w 68 ºC przez 10 min (około 1 min na każdy kb długości plazmidu).
      5. Powtórzyć kroki 1.1.2.2 - 1.1.2.4 przez 18 cykli.
      6. Końcowa elongacja w 68 ºC przez 10 min.
      7. Temperatura przechowywania 4 ºC
        UWAGA: Temperatura przyłączania jest obliczana na podstawie Tm startera.
    3. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 1 μl DpnI, dokładnie wymieszać pipetą i odwirować (6,0 rpm) przez 1 min. Inkubować przez 2 h w 37 °C.
  2. Transformacja
    1. Rozmrozić kompetentne komórki E. coli na lodzie. Odmierzyć 30 μl komórek do 14 ml sterylnej probówki do transformacji i dodać do komórek 1 μl trawionego DNA. Wymieszać, delikatnie opukując ściankę probówki. Inkubować przez 20 min na lodzie.
    2. Umieścić probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 42 ºC na 45 s, a następnie ponownie przenieść na lód na 2 min. Dodać 40 μl sterylnej pożywki SOC i inkubować komórki w inkubatorze przy 37 ºC przez 1 h z wytrząsaniem.
    3. Wysiać 10 μl komórek na płytki LB zawierające kanamycynę (50 μM) i 1% glukozy. Inkubować płytki przez noc (O/N) w 37 ºC.
    4. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić w 5 ml pożywki LB/kanamycyna w celu hodowli przez noc (O/N). Inkubować kulturę przez noc (~16 h) w 37 ºC w inkubatorze z wytrząsaniem.
    5. Wyekstrahować DNA z kultury O/N za pomocą minipreparatyki37. Ilość DNA oznaczyć spektrofotometrycznie, mierząc absorbancję przy długości fali 260 nm. Stężenie powinno wynosić ~10 - 200 ng/μl. Potwierdzić obecność mutacji standardowymi strategiami sekwencjonowania rekombinowanego DNA 38,39.

2. Ekspresja i oczyszczanie białka GLIC

  1. Transformacja
    1. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1.2, przeprowadzić transformację 30 μl kompetentnych komórek C43 przy użyciu 1 μl (~10 - 20 ng/μl) plazmidu zawierającego gen kodujący GLIC wraz z miejscem cięcia proteazy ludzkiego rynowirusa (HRV)-3C (Sekwencję plazmidu i genu podano w tekście uzupełniającym) 35 (z kroku 1.2.5).
    2. Wysiać 10 μl komórek na płytki LB-agar zawierające 1% glukozy i 50 μg/ml kanamycyny, a następnie inkubować je przez noc (O/N, ~16 h) w temperaturze 37 ºC w inkubatorze.
    3. Wizualnie sprawdzić obecność kolonii i upewnić się, że nie są one przerośnięte oraz nie występują kolonie satelitarne. Bezzwłocznie szczelnie zamknąć płytki parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 ºC.
  2. Przygotowanie kultur nocnych i mediów hodowlanych
    1. Wybrać pojedynczą odizolowaną kolonię za pomocą pętlą i przenieść ją do 10 ml sterylnej kolby zawierającej 20 ml pożywki Luria Broth (LB) uzupełnionej o sterylną 1% glukozę i 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować przez noc (O/N, ~16 h) w temperaturze 37 ºC w wytrząsarce przy 250 rpm.
    2. Autoklawować 90 ml pożywki Terrific Broth (TB) (Patrz: Skład mediów i buforów) w szklanych kolbach Fernbacha o pojemności 2,8 l w cyklu parowym w temperaturze 121 ºC przez 20 min.
  3. Przygotowanie dużych kultur hodowlanych
    1. Dodać 10 ml sterylnego buforu fosforanowego potasu (Patrz: Skład mediów i buforów) do autoklawowanej pożywki TB. Dodać sterylną glukozę (stężenie końcowe 0,2%), kanamycynę (50 μg/ml) oraz 10 ml kultury nocnej. Inkubować w temperaturze 37 ºC w wytrząsarce przy 250 rpm.
    2. Kontrolować gęstość optyczną przy długości fali 60 nm (OD60) za pomocą densytometru lub spektrofotometru co godzinę, aż osiągnie wartość 0,5 (~2 h). W tym momencie zmniejszyć prędkość do 150 rpm i obniżyć temperaturę do 18 ºC. Monitorować OD60 co 30 min, aż osiągnie 0,8 (~1 h).
    3. Dodać 50 ml glicerolu i kontynuować wytrząsanie kultury, aż OD60 osiągnie 1,0 - 1,2 (~15 - 30 min).
      UWAGA: W tych warunkach schłodzenie kultury z 37 ºC do 18 ºC zajmuje około godziny. Ważne jest, aby glicerol dodać do kultury po jej schłodzeniu do 18 ºC.
    4. Indukować komórki za pomocą 20 μM IPTG (izopropyl-tio-β-galaktozydu), przywrócić prędkość wytrząsania do 250 rpm i inkubować przez kolejne ~16 h w temperaturze 18 ºC.
  4. Oczyszczanie białka
    1. Upewnić się, że OD60 po 16 h wynosi ~16 - 18. Zebrać komórki w butelkach wirówek o pojemności 1,0 l, wirując przy 8 50 x g w temperaturze 4,0 ºC przez 15 min. Odlać supernatant i zważyć butelkę z osadem komórkowym. Obliczyć masę osadu, odejmując masę pustej butelki od masy całkowitej.
      UWAGA: Przewidywana masa osadu komórkowego to ~30 - 35 g/L. Należy jednak zauważyć, że końcowy OD60 i masa osadu mogą się różnić w zależności od mutantów.
    2. Resuspender osad bakteryjny w 150 ml lodowatego Buforu A (10 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) na każdy 1,0 l kultury. Dodać DNazę I (10 μg/ml) i inhibitory proteaz (fenylometylosulfonyl fluorek (1 mM), leupeptynę (2,0 μg/ml), aprotyninę (2,0 μg/ml) oraz pepstatynę A (1 μg/ml)).
    3. Zhomogenizować komórki, przepuszczając je przez homogenizator komórkowy w chłodni w temperaturze 4,0 ºC. Powtórzyć proces trzykrotnie, aby zlizować większość bakterii. Wirować komórki przy 14 0 x g przez 15 min, zebrać supernatant pipetą i przenieść do czystej probówki wirówkowej. Odrzucić osad zawierający niezlizowane komórki i ciałka inkluzyjne.
    4. Wirować supernatant przy 168 00 x g przez 1 h. Ostrożnie odlać supernatant, nie naruszając osadu błonowego.
    5. Połączyć osad błonowy z 1 l kultury i resuspender go w Buforze A (uzupełnionym o 10% glicerolu) do końcowej objętości 50 ml. Dodać 0,5 g n-docecyl-β-D-maltopiranozydu (DDM) do zawiesiny błonowej i mieszać na rotatorze przez 2 h w temperaturze 4,0 ºC.
    6. Po solubilizacji błon usunąć szczątki komórkowe z lizatu poprzez wirowanie przy 168 00 x g przez 1 h. W tym czasie przygotować żywicę amylozową. Przenieść 3 ml żywicy pipetą do pustej polipropylenowej kolumny chromatograficznej. Przemyć żywicę, przepuszczając 10 objętości złoża wody (3 razy), a następnie 10 objętości złoża Buforu A zawierającego 0,5 mM DDM.
    7. Po wirowaniu delikatnie zebrać supernatant pipetą i przenieść do czystej probówki stożkowej 50 ml. W celu wiązania okresowego dodać zrównoważoną żywicę amylozową do probówki stożkowej. Powiązać wyekstrahowane białko z żywicą amylozową, mieszając na rotatorze przez 2 h w temperaturze 4,0 ºC.
    8. Przepuścić całą zawiesinę przez kolumnę chromatograficzną i zebrać przepłuczynę. Następnie przepuścić całą zebraną przepłuczynę przez żywicę po raz drugi, aby zmaksymalizować wiązanie.
    9. Przepłukać 10 objętościami złoża buforu A z 0,5 mM DDM, 0,5 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiną (TCEP) i 1 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), aby usunąć niezwiązane białka.
    10. Eluować białko GLIC za pomocą 10 ml Buforu A zawierającego 40 mM maltozy oraz 0,5 mM DDM i 0,05 mM TCEP. TCEP zapobiega utlenianiu łańcuchów bocznych cysteiny. Zebrać cały eluat.
    11. Skoncentrować elutowane białko za pomocą koncentratora wirówkowego (odcięcie masy cząsteczkowej = 50 KDa) do stężenia 4 - 6 mg/ml, dodać proteazę HRV-3C (20 μg na 10 mg białka) i inkubować przez noc w temperaturze 4,0 ºC.
      UWAGA: Stopień trawienia proteazą należy sprawdzić, przeprowadzając elektroforezę w żelu SDS-PAGE (Patrz: krok 2.5.5 oraz Rysunek 1).
  5. Ukierunkowane znakowanie spinowe
    1. Przygotować około 100 μl roztworu zapasu 20 mM (1-oksy-2,2,5,5-tetrametyl-Δ3-pyroliny-3-metylu) MTSL 40 w DMSO i przechowywać zapas w temperaturze -20 ºC w alikwotach po 25 μl.
    2. Wykorzystać próbkę po trawieniu proteazą do znakowania spinowego za pomocą MTSL. Dodać 10-krotny nadmiar molowy znacznika spinowego MTSL (stosunek molowy monomeru GLIC do MTSL 1:10). Inkubować na lodzie przez 1 h. Dodać drugą dawkę znacznika spinowego w 5-krotnym nadmiarze molowym i inkubować przez kolejną godzinę.
      UWAGA: W przypadku pozycji zakopanych (o niskiej wydajności znakowania spinowego, opisanych poniżej), dodaje się 30-krotny nadmiar molowy znacznika spinowego, a białko inkubuje się przez 6 h.
    3. Przepuścić próbkę przez kolumnę do szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC) z wykluczaniem wielkości, uprzednio zrównoważoną Buforem A i 0,5 mM DDM, aby oddzielić odcięte MBP i nadmiar wolnego znacznika spinowego od pentamerów GLIC. Zbierać frakcje po 1 ml do całkowitej objętości elucji 30 ml. Połączyć frakcje zawierające pentamery GLIC (Rysunek 1). FPLC przeprowadzić zgodnie z instrukcją producenta.
    4. Wyznaczyć stężenie próbki za pomocą spektrofotometru, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm. Molowy współczynnik ekstynkcji i szacowana masa cząsteczkowa monomeru GLIC wynoszą odpowiednio 49 850 M-1 cm-1 i 36 380 Da. Skoncentrować roztwór białka za pomocą koncentratora wirówkowego (odcięcie masy cząsteczkowej = 50 KDa) do stężenia końcowego ~8-10 mg/ml i umieścić na lodzie. Próbka jest teraz gotowa do rekonstytucji.
    5. Jako dodatkową kontrolę jakości w celu upewnienia się, że preparat jest jednorodny biochemicznie, przeprowadzić redukcyjną elektroforezę SDS-PAGE (1,0% β-ME).
      UWAGA: Żel barwiony Coomassie powinien wykazać pojedynczy prążek przy ~3 kDa odpowiadający monomerowi GLIC (Rysunek 1).
    6. W przypadku mutantów znakowanych spinowo, u których podejrzewa się występowanie poszerzenia dipolowego, przeprowadzić niedoznakowanie próbek w obecności znacznika diamagnetycznego 41. Inkubować elutowane białko z 0,1-krotnością MTSL na lodzie przez 1,0 h. Następnie dodać 20-krotny nadmiar molowy znacznika diamagnetycznego (1-acetoksy-2,2,5,5-tetrametyl-Δ3-pyroliny-3-metylu) metanotiosulfonianu.
      UWAGA: Odczynnik diamagnetyczny użyty w tym przypadku jest izosteryczny względem znacznika paramagnetycznego i posiada identyczną chemię znakowania.
    7. Inkubować próbkę na lodzie przez 2 h. Przepuścić próbkę przez kolumnę do chromatografii z wykluczaniem wielkości, uprzednio zrównoważoną Buforem A i 0,5 mM DDM, zgodnie z krokiem 2.5.3.
  6. Wydajność znakowania spinowego
    1. Wydajność znakowania spinowego definiuje się jako stosunek stężenia znacznika spinowego do stężenia łańcucha bocznego cysteiny (monomeru GLIC). Aby określić wydajność znakowania spinowego próbki, całkowitą intensywność sygnału próbki porównuje się ze standardem o znanym stężeniu przy użyciu wykresu kalibracyjnego. Przygotować roztwory standardu EPR (takiego jak 2,2,6,6-tetrametylopiperydyny-1-oksylowy: TEMPO) w zakresie stężeń (10 - 250 μM) poprzez rozpuszczenie w wodzie.
    2. Zmierzyć sygnał EPR dla każdego z tych roztworów i wyznaczyć pole pod krzywą (podwójna całka sygnału EPR) dla każdego stężenia (zgodnie z opisem w kroku 6.1). Stworzyć krzywą kalibracyjną, nanosząc zmierzone pole jako funkcję stężenia TEMPO i dopasowując linię prostą.
      UWAGA: Pole pod sygnałem EPR w pierwszej pochodnej lepiej opisuje intensywność widma niż amplituda szczyt-szczyt. Całkowanie sygnału EPR w pierwszej pochodnej daje widmo absorpcyjne, a druga całka daje pole pod widmem absorpcyjnym (które jest proporcjonalne do stężenia spinów). Należy zapewnić stałą linię bazową zarówno w obszarze niskiego, jak i wysokiego pola widma.
    3. Zmierzyć stężenie białka znakowanego spinowo w detergencie za pomocą spektrofotometru (zgodnie z krokiem 2.5.4). Następnie zmierzyć sygnał EPR próbki i wyznaczyć pole podwójną całką sygnału EPR według kroków opisanych w sekcji 6.1. Korzystając z wykresu kalibracyjnego, określić stężenie znacznika odpowiadające zmierzonemu sygnałowi EPR. Obliczyć wydajność znakowania spinowego jako stosunek molowy znacznika spinowego do stężenia białka.

3. Rekonstytucja GLIC w błonach Asolectin

  1. Przygotowanie liposomów
    1. Opłucz czystą kolbę okrągłodenną o pojemności 25 ml 5 ml chloroformu i wysusz kolbę strumieniem gazu N2 w dygestorze. Przenieś 10 mg asolektyny (roztwór zapasowy polarnego ekstraktu soi 25 mg/ml w chloroformie) do kolby i wysusz lipidy pod ciągłym strumieniem gazu N2.
      UWAGA: Wybór lipidów do rekonstytucji opiera się na wynikach eksperymentów opisanych w sekcji 4.
    2. Po odparowaniu chloroformu umieść kolbę w próżni na 1 h, aby zapewnić całkowite wysuszenie. Dodaj 1 ml Buforu A do rekonstytucji do wysuszonych lipidów i energicznie wymieszaj kolbę na wortexie, aby zawiesić pellet lipidowy.
    3. Aby przygotować małe pęcherzyki jednowarstwowe, poddaj zawiesinę lipidową sonikacji w chłodni sonikacyjnej, aż roztwór pęcherzyków stanie się mniej więcej przeźroczysty i nie będą widoczne żadne grudki (około 10 - 15 min). Do mieszaniny dodaj DDM do stężenia końcowego 4 mM i inkubuj w RT przez 30 min.
  2. Rekonstytucja
    1. Dodaj oczyszczone białko z kroku 2.5.4 do mieszaniny lipidowej.
      UWAGA: Stosunek białka do lipidów zależy od rodzaju eksperymentu. Do pomiarów prądów makroskopowych stosuje się stosunek 1:10 0. W badaniach EPR rekonstytucję przeprowadza się przy wyższym stosunku białka do lipidów (1:2 50), aby zmaksymalizować sygnał. Wcześniej wykazano, że przy tych stężeniach nie obserwuje się agregacji bocznej42.
      UWAGA: Typowa ilość robocza GLIC dla EPR to ~1 mg, choć w zależności od badanego miejsca mogą być skuteczne również mniejsze ilości.
    2. Inkubuj próbkę w temperaturze 4 ºC przez 1 h przy łagodnym obracaniu, a następnie rozcieńcz próbkę do 15 ml Buforem A.
      UWAGA: Ten krok obniża stężenie detergentu poniżej krytycznego stężenia micelarnego (CMC).
    3. Usuń pozostały detergent z zawiesiny, dodając kuleczki polistyrenowe (z hydrofobowymi porami, które wychwytują detergent). Dodaj 80 mg czystych kuleczek i inkubuj zawiesinę liposomalną O/N na nutatorze w temperaturze 4 ºC.
      1. Aby przygotować kuleczki do użycia, odważ ~100 mg i przenieś je do stożkowej probówki 50 ml. Dodaj 10 ml metanolu, energicznie wstrząśnij, odwiruj kuleczki przy 8 0 x g przez 2 min i odlej metanol. Powtórz ten proces płukania metanolem trzy razy. Powtórz ten sam proces z 30 ml wody dejonizowanej, płucząc trzy razy.
    4. Następnego dnia przenieś liposomy do probówki do ultrawirowania 25 ml, używając filtra kolumnowego w celu usunięcia kuleczek, i dalej rozcieńcz próbkę do 25 ml. Centryfuguj próbki przy 168 0 x g przez 2 h. Odlej supernatant i resuspenduj pellet, używając 10 μl Buforu B.

4. Wyznaczenie optymalnego składu lipidów do rekonstytucji metodą FRET

  1. Zastosuj test oparty na transferze energii między fluorescencyjnymi dipolami (FRET), aby określić skład błony, który utrzymuje monodyspersyjność białka.
  2. Oczyść białko wt GLIC (z natywną cysteiną, C27), postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 2. Znakuj białko stosunkiem molowym 10:1 (znak/monomer) za pomocą fluoresceiny-maleimidu lub tetrametylorodaminy-maleimidu, stosując procedurę z sekcji 2.5.
  3. Zgodnie z krokami w sekcji 3.2 dotyczącymi rekonstytucji, przygotuj trzy różne próbki dla każdego testowanego składu lipidów; po pierwsze, GLIC znakowany fluoresceiną w stosunku molowym 1: 1 50 (pentamer: lipid). po drugie, GLIC znakowany rodaminą w stosunku molowym 1: 1 50 (pentamer: lipid). Po trzecie, zmieszaj zsolubilizowany w detergencie GLIC znakowany fluoresceiną i rodaminą (stosunek molowy 1:1). Rekonstytuuj tę mieszaninę w stosunku 1: 750 (pentamer: lipid).
    UWAGA: Wykorzystano trzy systemy lipidowe: asolektynę, POPC:POPG (stosunek molowy 3:1) oraz ekstrakt polarny z E. coli. Stosunek białka do lipidów podczas rekonstytucji w eksperymencie FRET jest wyższy niż stosunek użyty do pomiarów EPR (1:750 w porównaniu do 1: 1 50 stosowanego w badaniach EPR).
  4. Rozcieńcz zawiesinę liposomów (aby zmniejszyć sygnał rozpraszania światła; ~5 μl w 95 μl Buforu A), a następnie przelej próbkę do kuwety kwarcowej i umieść ją we fluorymetrze.
  5. Ustaw długość fali wzbudzenia na 490 nm (co odpowiada maksimum absorpcji dla donora: fluoresceiny). Zgodnie z instrukcją producenta, zarejestruj widma emisji w zakresie od 50 nm do 60 nm.
    UWAGA: W przypadku próbki GLIC znakowanej fluoresceiną zaobserwujesz pik przy 518 nm (odpowiadający emisji fluoresceiny) bez piku przy 572 nm (odpowiadającego emisji rodaminy). W przypadku próbki GLIC znakowanej rodaminą nie zaobserwujesz piku przy 518 nm, lecz przy 572 nm, wynikający z bezpośredniego wzbudzenia rodaminy przy 490 nm. Dla próbki zawierającej oba znaki (fluoresceinę i rodaminę), spadek intensywności piku fluoresceiny i odpowiadający mu wzrost piku rodaminy stanowi sygnał FRET, który prawdopodobnie wskazuje na lateralną agregację białka w błonie.
  6. Monitoruj amplitudę emisji rodaminy przy 572 nm w różnych odstępach czasu (od 0 do 24 h), rejestrując pomiary co godzinę przez pierwsze 6 h, a następnie po inkubacji przez noc (Rysunek 2). Dla każdego przedziału zmierz intensywność fluorescencji przy 572 nm (dla rodaminy: Ia) oraz przy 518 nm (dla fluoresceiny: Id). Odejmij wkład bezpośredniej aktywacji rodaminy (próbka 2 w kroku 4.3) od Ia (Iac). Oblicz stosunek FRET jako Iac/(Iac + Ib). Porównaj FRET w różnych odstępach czasu i dla różnych składów lipidowych.
    UWAGA: W ramach kontroli przeprowadź kroki 4.5 i 4.6 dla próbek zsolubilizowanych w detergencie i porównaj widma emisji z widmami dla rekonstytuowanych liposomów. Użyj ekimolarnej mieszaniny znakowanego białka w detergencie (opisanej w kroku 4.3) i rozcieńcz ją w Buforze A uzupełnionym o 0.5 mM DDM. Oczekuje się, że próbki w detergencie wykażą minimalny sygnał FRET.

5. Pomiary funkcjonalne za pomocą rejestracji patch-clamp

  1. Przygotować proteoliposomy do pomiarów metodą patch-clamp w dokładnie taki sam sposób, jak w przypadku badań EPR (Sekcja 3.1).
    UWAGA: Należy jednak dostosować stosunek białka do lipidów w zależności od rodzaju wykonywanego pomiaru (rejestracje pojedynczego kanału vs makroskopowe). Proteoliposomy należy szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 ºC do momentu użycia. Zazwyczaj GLIC rekonstytuuje się w stosunku molowym białko:lipid 1: 10 0 dla prądów makroskopowych oraz 1: 50 0 dla rejestracji pojedynczych kanałów.
  2. Rozmrozić liposomy na lodzie. Wypłukać czystą szklaną płytkę wodą i etanolem, a następnie całkowicie osuszyć. Nanieść kroplę 10 μl proteoliposomów na środek płytki i suszyć przez noc (O/N) w eksykatorki w temperaturze 4 oC pod próżnią.
  3. Rehydratować wysuszone proteoliposomy, dodając 20 μl Buforu B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.0), a następnie umieścić płytkę w szalce Petriego na wilgotnym papierze filtracyjnym. Przykryć szalkę i pozostawić do rehydratacji przez około 2 h.
    UWAGA: Proces ten pozwala na uzyskanie gigantycznych liposomów wielowarstwowych, które nadają się do tworzenia patchy.
  4. Wyciągnąć pipety do patch-clamp z cienkościennych kapilar borokrzemowych (~1 - 2 μm średnicy końcówki), korzystając z ustawień zalecanych przez producenta wyciągarki do pipet. Wypolerować termicznie za pomocą palnika do uzyskania oporności 1,5 - 2MΩ po napełnieniu Buforem B.
  5. Napełnić komorę pomiarową Buforem B za pomocą pipety i podłączyć elektrodę uziemiającą Ag/AgCl. Używając końcówki do pipety o pojemności 2 μl, delikatnie oderwać liposomy od krawędzi i przenieść 1 μl zawiesiny do komory pomiarowej. Odczekać kilka minut, aż liposomy osiądą na dnie.
  6. Napełnić pipetę do patch-clamp Buforem B, używając niemetalicznej igły strzykawki, i zamontować ją w głowicy wzmacniacza. Zlokalizować pojedynczy, odizolowany pęcherzyk do patchowania. Zastosować niewielkie dodatnie ciśnienie, aby zapobiec zapchaniu się pipety, i wprowadzić końcówkę do komory pomiarowej.
  7. Zastosować impulsy testowe w celu zmierzenia oporności pipety i skompensowania offsetu napięcia pipety. Zbliżyć pipetę do pęcherzyka, a po nawiązaniu kontaktu zastosować niewielkie ciśnienie ujemne, aby delikatnie przyciągnąć pęcherzyk do pipety i utworzyć szczelność gigaomową (gigaohm seal).
  8. Monitorować oporność pipety przez cały proces. Po utworzeniu szczelności gigaomowej ostrożnie wycofać pipetę z liposomu, aby utworzyć patch typu inside-out. Wyłączyć impuls testowy.
  9. Ustawić potencjał holdingowy na -100 mV i zastosować impuls pH. Niskie pH uzyskano za pomocą 10 mM buforu cytrynianowo-sodowego C (150 mM NaCl, 10 mM cytrynianu, pH 3.0). (Rysunek 3)
    UWAGA: Rejestracje są przeprowadzane z częstotliwością próbkowania 10 kHz dla pomiarów makroskopowych i 40 kHz dla pomiarów pojedynczych kanałów.

6. Pomiary EPR

  1. Spektroskopia EPR w trybie ciągłym
    1. Przenieś zawiesinę liposomów z kroku 3.2 do 200 μl przenieść próbki do probówek i odwirować je w wirówce. Odrzucić nadsącz; próbka jest gotowa do pomiarów EPR.
      UWAGA: W przypadku pomiarów EPR ważne jest usunięcie z próbki liposomów jak największej ilości buforu. Próbki wodne absorbują elektryczną składową mikrofal, co prowadzi do nagrzewania i utraty czułości.
    2. Aby przeprowadzić wymianę buforu, przenieś 20 μl osadu liposomów za pomocą pipety do probówki do wirówki mikrocentryfugowej. Dodać 180 μl buforu D (10 mM NaCl, 10 mM cytrynianu, pH 3,0) i inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 42 ºC przez 5 min. Odwiruj próbkę, usuń nadsącz za pomocą pipety i powtórz ten proces trzy razy, aby zapewnić całkowitą wymianę buforu.
      UWAGA: Alternatywnie wymianę buforu można przeprowadzić, poddając próbki wielokrotnym cyklom zamrażania i odmrażania.
    3. Plastikowe kapilary przepuszczalne dla gazów nadają się do pomiarów zarówno kształtów linii widmowych, jak i dostępności rozpuszczalnika. Należy delikatnie uderzyć kapilarą o sypki osad proteoliposomów, aby zaciągnąć próbkę do wnętrza, a następnie uszczelnić koniec woskiem kostnym.
      UWAGA: Typowe objętości próbek wynoszą ~5 μl a pożądane stężenie spinów wynosi 150 μMJeśli celem jest pomiar samych kształtów linii, można zastosować kwarcowe kapilary o średnicy zewnętrznej 0,4 mm. W razie potrzeby do napełniania kapilary próbką można użyć pipety.
    4. Obsługa spektrometru
      1. Przeprowadź pomiary CW-EPR w temperaturze pokojowej (292–297 K) przy użyciu spektrometru pasma X wyposażonego w rezonator dielektryczny, zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
      2. Włącz chłodziarkę do wody, zasilacz oraz konsolę mostka mikrofalowego. Przed rozpoczęciem rejestracji pozwól systemowi na wyrównanie temperatury przez około 30 min. Otwórz oprogramowanie akwizycyjne.
      3. Wprowadź probówkę lub kapilarę z próbką do rezonatora, upewniając się, że odcinek rurki wypełniony próbką znajduje się w centrum wnęki rezonatora. Nastroj rezonator zgodnie z instrukcją obsługi spektrometru.
      4. Zarejestruj widmo absorpcji pierwszej pochodnej poprzez sweep pola przy mocy mikrofal dopadających wynoszącej 1,0 mW, częstotliwości modulacji 10 kHz i szerokości sweepu 10 G. Wyznacz optymalną moc dla eksperymentu, przeprowadzając badanie progresywnego nasycenia mocy, w którym wysokość szczyt-szczyt sygnału EPR CW pierwszej pochodnej jest mierzona jako funkcja pierwiastka kwadratowego z mocy mikrofal dopadających.
        UWAGA: Przy niższych mocach mikrofal natężenie sygnału rośnie proporcjonalnie do pierwiastka kwadratowego mocy, tak długo, jak populacja równowagowa stanów spinowych nie ulega zmianie. Jednakże, przy dalszym zwiększaniu mocy, relaksacja spin-sieć nie jest już w stanie utrzymać różnicy populacji równowagowej dwóch stanów spinowych, a amplituda sygnału zaczyna osiągać plateau lub ulega „nasyceniu”. Po przekroczeniu tego punktu amplituda sygnału może w rzeczywistości maleć wraz ze wzrostem mocy obserwacji z powodu inwersji populacji stanów spinowych. Ponadto, w przypadku widm poszerzonych z rozległymi skrzydłami, w których nie jest widoczna dobrze zdefiniowana płaska linia bazowa, należy zwiększyć zakres sweep do 150–20 G, aby zapobiec utracie pola.
      5. Zacznij od zastosowania amplitudy modulacji wynoszącej 1,0 G.
        UWAGA: Wartość ta zależy od próbki i jest dostosowana w celu zmniejszenia szumów niskoczęstotliwościowych w sygnale. Zastosowanie zbyt wysokiej wartości może doprowadzić do zniekształcenia lub poszerzenia sygnału.
      6. Ustaw stałą czasową i czas konwersji na 20,48 msec, czas sweep na 20,97 sec oraz rozdzielczość na 1024 punkty.
        UWAGA: Stała czasowa zależy również od próbki i jest dostosowana w celu odfiltrowania szumów wysokoczęstotliwościowych.
      7. Po pierwszym skanowaniu ustaw centrum pola w centrum sygnału EPR i wybierz szerokość zakresu sweep w taki sposób, aby ślad obejmował sygnał oraz odpowiedni odcinek linii bazowej po obu stronach.
        UWAGA: Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, należy zwiększyć liczbę skanów w zależności od natężenia sygnału EPR. Należy podać szerokość zakresu sweep oraz liczbę punktów.
      8. Zmierz dostępność znacznika spinowego dla czynników relaksacji kolizyjnej O2 lub kwas etylenodiaminodiacylowy (NiEDDA) przy użyciu protokołów nasycenia mocą27 opisany w kroku 6.1.4.4.
        UWAGA: Przygotować NiEDDA zgodnie z wcześniejszym opisem 26.
      9. W pierwszej kolejności należy przepłukać próbkę w jamie za pomocą N2 przez 5 min (aby usunąć O2)2). Pomiar widm dla każdej mocy mikrofalowej w zakresie od 5 do 35 dB w krokach co 3 dB, przy szerokości zakresu skanowania wynoszącej 30 G.
      10. Następnie należy przeprowadzić perfuzję próbki w jamie za pomocą napowietrzaj przez 10 min i zmierz widma przy różnych mocach mikrofalowych (5–35 dB w krokach co 3 dB), zgodnie z krokiem 6.1.4.9.
      11. Inkubować 20 μl osadu liposomów z 180 μl 50 mM NiEDDA (w buforze B lub buforze D) w kąpieli wodnej o temperaturze 42 ºC przez 5 min. Odwiruj próbkę i usuń nadsącz za pomocą pipety. Przenieś próbkę do kapilary i umieść ją w wnęce rezonatora. Powtórz krok 6.1.4.9.
        UWAGA: Zasada, na której opiera się ten eksperyment, polega na tym, że oddziaływanie z paramagnetycznymi czynnikami relaksacyjnymi poprzez wymianę spinową Heisenberga zapobiega nasyceniu sygnału i inwersji populacji. Rozpuszczalny w wodzie NiEDDA oraz rozpuszczalny w lipidach cząsteczkowy O22 są wykorzystywane odpowiednio jako reportery wody (zarówno w objętości, jak i w przedsionkach wewnątrzbiałkowych) oraz pozycji białka eksponowanych na membranę.
  2. Analiza danych:
    UWAGA: Analiza danych EPR obejmuje następujące etapy:14,22,23,25-27
    1. Oblicz ruchliwość sondy spinowej (ΔHO-1), jako odwrotność szerokości linii centralnej widma absorpcyjnego pierwszej pochodnej. ΔHo-1 odzwierciedla swobodę ruchu lub dynamikę sondy.
    2. Oblicz parametr dostępności (П), który jest szacunkiem dostępności sondy dla innych paramagnetycznych czynników relaksacji kolizyjnej, stosując się do poniższych kroków.
      UWAGA: Oddziaływanie sondy spinowej z paramagnetycznymi czynnikami relaksacyjnymi zwiększa szybkość relaksacji spinowo-sieciowej (T1)1) nitrylowego poprzez wymianę spinową Heisenberga.27
      1. Oszacuj parametr dostępności (П) na podstawie eksperymentów z nasyceniem mocy (6.1.4.8), w których mierzy się pionową amplitudę szczyt-szczyt linii środkowej pierwszej pochodnej widma EPR przy różnych mocach mikrofal.25 Należy wykreślić amplitudę sygnału jako funkcję pierwiastka kwadratowego z mocy mikrofalowej i dopasować do niej następujące równanie 27.
        Wzór równania absorpcji; reprezentacja matematyczna w analizie spektroskopowej.
        UWAGA: Gdzie A jest amplitudą sygnału, która jest miarą jednorodności nasycenia linii rezonansowej (zazwyczaj mieści się ona w zakresie od 0,5 do 1,5), I jest współczynnikiem skalowania, P jest mocą padającą, a [symbol] reprezentuje wartość, przy której amplituda pierwszej pochodnej wynosi połowę jej wartości nasycenia.
  3. Oblicz ΔP1/2 jako różnica w P1/2 wartości w obecności (O2 lub NiEDDA) oraz brak (perfuzja N2) paramagnetycznych czynników relaksacyjnych. Oblicz parametr dostępności (П), korzystając z równania:
    Wzór na równowagę statyczną: Π = [(ΔP białka / ΔH białka) / (P referencyjne / ΔH referencyjne)]; równanie
    UWAGA: W przypadku P1/2bibliografia oraz ΔHoreferencja są odpowiednio wartość połownego nasycenia mocy oraz szerokość linii środkowej dla wzorca odniesienia (takiego jak DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl))27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka biochemiczna mutantów GLIC znakowanych spinowo

Postępowanie zgodnie z powyższym protokołem zazwyczaj pozwala na uzyskanie białka fuzyjnego GLIC-MBP w zakresie 10 - 12 mg/L hodowli. Chociaż wartość ta może się różnić w zależności od konkretnego mutanta, szczególnie w przypadku pozycji ukrytych wewnątrz białka, wydajność może być znacznie obniżona. W takich przypadkach może zajść konieczność zwięks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spektroskopia EPR okazała się niezrównanym podejściem strukturalnym do ilościowego określania zmian konformacyjnych w białkach błonowych w środowisku zbliżonym do natywnego. Takie podejście pozwala nam zajrzeć w molekularne szczegóły dynamiki białek, które są ukryte w strukturach o wysokiej rozdzielczości z krystalografii rentgenowskiej i mikroskopii krioelektronowej. Należy jednak wziąć pod uwagę techniczne ograniczenia tego podejścia, które mogą mieć wpływ na ogólne zastosowanie do innych systemów, a także pamiętać o p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni obecnym i byłym członkom laboratorium Chakrapani za krytyczną lekturę i komentarze na temat manuskryptu. Prace te były wspierane przez grant National Institutes of Health (1R01GM108921) i American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) oraz SC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mutageneza ukierunkowana i mutacje
10x bufor reakcyjny PfuUltra HFAgilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc‎N0447L10 mM każdy dNTP
pfu Ultra DNA polimerazaAgilent Technologies600380-512,5 U/ul
DPNINew England BioLabs Inc‎R0176S20 000 U/ml
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
podłoża SOCNew England BioLabs Inc‎B9020S
KanamycinFisher ScientficBP905
LB mediaInvitrogen127957084
Zestaw do miniprepuQIAGEN27106
C43 kompetentne komórkiLucigen60446
Ekspresja i oczyszczanie
glukozyFisher ScientficD16
TryptoneFisher BioreagentsBP1421-500
Ekstrakt drożdżowyAmrescoJ850
GlicerolFisher BioreagentsBP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (izopropylo-tio-β-galaktozyd)Złoto BiotechnologiaI2481C25
Trizma BaseSigma Life ScienceT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase ISigma Life ScienceDN25
PMSFAmrescoM145
LeupeptynaAmrescoJ580
PepstatynaAmrescoJ583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Żywica amylozowaNew England BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
MaltoseAcros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
Pusta polipropylenowa kolumna chromatograficznaBioRad731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oksylo-2,2,5,5-tetrametylo-3-pirolino-3-metylo) MetanetylosulfonianToronto Reaserch chemicals IncO873900
(1-acetoksy-2,2,5,5-tetrametylo-Δ 3-pirolino-3-metylo)metanetiosiulfonianToronto Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
Rekonstytucja
Lipid asolektynyAvanti polar lipids Inc541602C
Biokulki (kulki polistyrenu)Bio Rad152-3920
MetanolChemikalia FisherA413
FRET
Fluoresceinowo-maleimidowyThermoFisher ScientificF-150
Tetrametylorodamino-maleimidowyThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti polarne lipidy Inc850457C
POPGAvanti polarne lipidy Inc840457C
E.coli polarny ekstrakt lipidowyAvanti polar lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
Pomiar
Kapilary plastikowe TPXBrukerER221
EDDA (Kwas etylenodiamino-N, N'-diacetowy)Aldrich158186
Ni(OH)2Aldrich283622
CysEPR

Bibliografia

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4(2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271(2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714(2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spektroskopia EPRci g a fala EPRpodw jny rezonans elektronowyoczyszczanie bia ekrekonstytucja b onyprzygotowanie liposom welowa chromatografia filtracyjnakoncentracja od rodkowa

Powiązane artykuły