Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Podsumowanie

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Streszczenie

Odpowiedź immunologiczna wynika ze złożonej interakcji między niespecyficznym wrodzonym układem odpornościowym antygenu a adaptacyjnym układem odpornościowym specyficznym dla antygenu. Układ odpornościowy to stała równowaga w utrzymywaniu tolerancji na własne molekuły i szybkim reagowaniu na patogeny. Komórki dendrytyczne (DC) są potężnymi profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen, które łączą wrodzony układ odpornościowy z adaptacyjnym układem odpornościowym i równoważą odpowiedź adaptacyjną między sobą a nie-sobą. W zależności od sygnałów dojrzewania, niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie stymulowane do różnicowania się w immunogenne lub tolerogenne DC. Immunogenne komórki dendrytyczne dostarczają sygnały proliferacji do limfocytów T specyficznych dla antygenu w celu ekspansji klonalnej; podczas gdy tolerogenne komórki dendrytyczne regulują tolerancję poprzez delecję limfocytów T specyficznych dla antygenu lub klonalną ekspansję regulatorowych komórek T. Ze względu na tę unikalną właściwość komórki dendrytyczne są bardzo poszukiwane jako środki terapeutyczne w leczeniu nowotworów i chorób autoimmunologicznych. Komórki dendrytyczne mogą być ładowane specyficznymi antygenami in vitro i wstrzykiwane do organizmu ludzkiego w celu wytworzenia specyficznej odpowiedzi immunologicznej, zarówno immunogennej, jak i tolerogennej. W niniejszej pracy przedstawiono sposób wytwarzania in vitro z monocytów, niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych i dojrzałych moDC, które różnią się ekspresją markerów powierzchniowych, funkcją i fenotypami metabolicznymi.

Wprowadzenie

DC został po raz pierwszy opisany przez Paula Langerhansa (komórki Langerhansa) pod koniec XIX wieku, jak wspomina Jolles ¹ i scharakteryzowany przez Ralpha Steinmana i Zanvila Cohna w 1973 roku, którzy rozpoznali je jako profesjonalne komórki prezentujące antygen ². DC znajdują się we krwi obwodowej i w większości tkanek ciała, szczególnie obficie w tkankach narażonych na działanie środowiska zewnętrznego, takich jak skóra (obecna jako komórki Langerhansa) oraz w wyściółce nosa, płuc, żołądka i jelit, które umożliwiają im napotkanie antygenów zewnętrznych. Niedojrzałe DC mają zdolność endocytarną, ale stosunkowo niską zdolność do stymulacji limfocytów T ³. Niedojrzałe DC wyrażają różne receptory rozpoznawania wzorców (PRR), które wychwytują wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) lub wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP) ⁴. Aktywacja sygnałów niebezpieczeństwa napędza dojrzewanie w kierunku immunogennych DC, podczas gdy własne cząsteczki powodują brak odpowiedzi limfocytów T i apoptozę ⁵. Immunogenne DC charakteryzują się regulacją w górę cząsteczek MHC i kostymulujących cząsteczek powierzchniowych oraz ich zdolnością do przygotowania naiwnych limfocytów T ^6,7.

Niedojrzali DC mogą również dojrzewać do stanu indukującego Treg lub tolerogennego w odpowiedzi na metabolit witaminy D3 1a,25(O)₂D₃ i niektóre środki immunosupresyjne, takie jak interleukina-10 (IL-10), deksametazon i rapamycyna ^8-9. Tolerogenne DC charakteryzują się ekspresją immunoreceptorowych motywów hamujących opartych na tyrozynie (ITIM) zawierających receptory powierzchniowe i ligandy. Transdukcja sygnału ITIM zawierających członków rodziny ILT, ILT3 i ILT4 w tolerogennych DC hamuje alloproliferację i napędza ekspansję Foxp3 ⁺ Treg ^10,11. Te unikalne właściwości tolerogennych DC prowadzą do ich głębokiej siły działania in vivo, a mianowicie zdolności do wywoływania trwałej tolerancji na przeszczepione przeszczepy allogeniczne i hamowania rozwoju chorób autoimmunologicznych. Tolerogenne DC mogą być zatem postrzegane jako podtyp dojrzałych spolaryzowanych DC, które działają w hamowaniu aktywacji immunologicznej.

Obecnie istnieją dwa ogólne podzbiory komórek dendrytycznych w ludzkiej krwi obwodowej: plazmocytoidy DC i mieloidalne DC ¹². Krążące DC są rzadkie, stanowią mniej niż 2% leukocytów w ludzkiej krwi, co stanowi trudność w izolacji odpowiedniej liczby DC w celu zbadania ich funkcji immunoregulacyjnych. Aby przezwyciężyć ten problem, DC zróżnicowane monocytami są wykorzystywane jako model in vitro do badania funkcji komórek dendrytycznych. Te DC in vitro mają podobne receptory i funkcje w porównaniu do DC in vivo. Szczegółowe porównanie DC in vivo i DC pochodzących z monocytów in vitro (moDC) jest badane przez inne laboratoria ^13,14,15. Poinformowano również, że moDC i CD1c + DC były równoważne w prezentowaniu antygenu i indukowaniu funkcji limfocytów T¹⁵.

W tym artykule opisujemy metodę generowania niedojrzałych moDC z monocytów krwi obwodowej, a następnie różnicowania ich na immunogenne i tolerogenne DC. Te komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów (moDC) charakteryzują się markerami powierzchniowymi, profilem cytokin, funkcjami immunoregulacyjnymi i stanami metabolicznymi. Immunogenne i tolerogenne komórki dendrytyczne wytwarzają różne cytokiny, które powodują ekspansję allogenicznych limfocytów T lub limfocytów T regulatorowych. W niniejszej pracy profilowanie cytokin jest wykonywane za pomocą systemów wykorzystujących technologię multipleksową. Pożywkę wzrostową komórek inkubuje się z unieruchomionymi kolorowymi kulkami unieruchomionymi przeciwciałami i odczytuje w kompaktowym analizatorze. Stany metaboliczne DC są analizowane za pomocą analizatorów strumienia zewnątrzkomórkowego, które mierzą szybkość zużycia tlenu, wskaźnik oddychania komórkowego i szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, która odzwierciedla strumień glikolityczny w komórkach dendrytycznych. Pomiar tych wskaźników bioenergetycznych zapewnia środki do śledzenia zmian w metabolizmie komórkowym, które są niezbędne w rozwoju i funkcjonowaniu komórek dendrytycznych.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (NUS-IRB 10-250).

1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)

1. Przygotowanie odczynnika
   1. Przygotować PBS/EDTA: buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) i uzupełnić 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm. Uwaga: przed użyciem przechowywać PBS/EDTA w temperaturze 4 °C i ogrzać się do temperatury pokojowej.
   2. Przygotować bufor barwiący: roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm.
2. Zbierz krew ze stożka krwi
   Uwaga: Stożek krwi zawiera składniki białych krwinek pobrane ze szpitala po krowoferezie. Jeśli krew jest zbierana w probówkach z heparyną lub EDTA, rozcieńczyć krew PBS w stosunku 1:1 i przejść do kroku 1.3; w przypadku otrzymania kożuchy rozcieńczyć kożuchy z PBS w stosunku 1:2 i przejść do kroku 1.3.
   1. Odetnij dwa końce stożka, aby krew mogła wypłynąć do probówki o pojemności 50 ml. Należy pamiętać, że stożek zawiera zwykle 10 ml krwi.
   2. Za pomocą strzykawki z końcem zawierającej 30 ml PBS/EDTA umyć stożek i zebrać go w probówce o pojemności 50 ml.
   3. Rozcieńczyć krew dalej za pomocą PBS/EDTA do końcowej objętości 80 ml.
3. Izolacja PBMC przez odwirowanie gęstości¹⁶
   1. Podamy po 15 ml Ficollu do 4 świeżych probówek o pojemności 50 ml.
   2. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml dodać 20 ml rozcieńczonej krwi na warstwę Ficollu. Zwróć uwagę, aby trzymać probówkę o pojemności 50 ml pod kątem 45 i uważać, aby nie zakłócić interfazy.
   3. Odwirować probówki o stężeniu 805 x g bez hamulców przez 30 minut, 20 °C.
   4. Usunąć warstwę plazmy i zebrać pierścień PBMC leżący tuż pod warstwą plazmy za pomocą pipety Pasteura. Połączyć cztery probówki PBMC w dwie probówki o pojemności 50 ml. Należy pamiętać, aby unikać zbierania przezroczystej warstwy poniżej PBMC.
   5. Dodać PBS/EDTA do końcowej objętości 50 ml na probówkę PBMC i odwirować przy 548 x g z hamulcami przez 10 minut, 20 °C.
   6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w każdej probówce z 25 ml buforu barwiącego i połączyć w jedną probówkę o pojemności 50 ml.
   7. Wirować przy 367 x g z hamulcami przez 5 min, 4 °C.
   8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad z 10 ml buforu barwiącego.

2. Wzbogacanie monocytów przez separację magnetyczną¹⁷

1. Określ numer komórki
   1. Weź 20 μl zawiesiny komórek PBMC i wymieszaj z 20 μl błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru.
   2. Zawiesina komory wirówki przy 367 x g z hamulcami przez 10 min, 4 °C.
   3. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy do stężenia 10-7 komórek na 80 μl buforu barwiącyego.
2. Etykietowanie magnetyczne
   1. Dodać 20 μl mikrogranulek CD14 na 10-7 komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 2 - 8 °C.
   2. Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu barwiącego na^10-7 komórek i odwirować przy 367 x g z przerwami przez 10 minut, 4 °C.
   3. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w stężeniu^10-7 komórek na 50 μl buforu barwiącego.
3. Separacja magnetyczna
   1. Użyj kolumny średniej wielkości, aby uzyskać maksymalnie 2 x 10⁸ komórek.
      Uwaga: Wybierz odpowiednią kolumnę i separator zgodnie z całkowitą liczbą komórek i liczbą komórek CD14⁺ zalecaną w arkuszu danych.
   2. Umieścić kolumnę w polu magnetycznym odpowiedniego separatora i przygotować kolumnę przez przepłukanie 500 μl buforu barwiącego.
   3. Zawiesinę komórek należy pipetować na kolumnę i zbierać nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę, za pomocą probówki o pojemności 15 ml.
   4. Wymień nową probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną i przemyj kolumnę 3 razy 500 μl buforu barwiącego. Upewnij się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem nowego bufora barwiącego między praniami.
   5. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na świeżej probówce o pojemności 15 ml.
   6. Odpipetować 1 ml buforu barwiącego na kolumnę. Natychmiast wypłucz magnetycznie oznakowane ogniwa, mocno wciskając tłok (dostarczony w zestawie) do kolumny.
   7. Powtórz kroki od 2.3.2 do 2.3.6, używając eluowanej frakcji na nowej kolumnie, aby zwiększyć czystość komórek CD14+. Należy pamiętać, że kulki zostaną automatycznie uwolnione z komórek w hodowli podczas kroku 3.2.

3. Różnicowanie komórek dendrytycznych do różnych stanów aktywacji

1. Przygotowanie odczynnika (poziom endotoksyny musi być mniejszy niż 0,1 EU/ml we wszystkich odczynnikach)
   1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych: RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% aminokwasami endogennymi (NEAA) i 0,05 mM 2-merkaptoetanolem (2ME). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm.
   2. Przygotować cytokiny: rozpuścić IL-4 i GM-CSF w wodzie klasy do hodowli komórkowych odpowiednio do stężenia 0,25 mg/ml w warunkach aseptycznych. Podwielokrotność cytokin rozmieścić w probówkach mikrowirówek o objętości 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   3. Przygotować zapas witaminy D3: rozpuścić witaminę D3 w wodzie klasy do hodowli komórkowych do stężenia 100 mM w warunkach aseptycznych. Witaminę D3 rozlać do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Przygotować zapas deksametazonu: rozpuścić deksametazon w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych do stężenia 10 mM w warunkach aseptycznych. Porcję deksametazonu rozlać do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   5. Przygotować LPS: rozpuścić lipopolisacharydy (LPS) w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych do stężenia 1 mg/ml w warunkach aseptycznych. Porcję LPS rozlać do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Generowanie różnych moDC
   1. Nasiona 4 zestawów monocytów CD14 ⁺ w stężeniu 0,3 - 0,5 x 10⁶ / ml pożywki do hodowli komórkowych uzupełnione 200 ng / ml GM-CSF i 200 ng / ml IL-4 w 6 dołkach. Należy pamiętać, że jest to Dzień 0, a objętość pożywki w każdym 6 dołkach wynosi 2 ml.
   2. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   3. Usunąć 850 μl pożywki z kultury w dniu 4 i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 2 razy (200 ng/ml GM-CSF i 200 ng/ml IL-4). Dodaj tę mieszaninę komórek z powrotem do hodowli. Należy pamiętać, że stężenie 2x dodane dla GM-CSF i IL-4 stanie się 1x, gdy 1 ml pożywki zostanie ponownie dodany do kultury.
   4. Dodaj 1 μl bulionu witaminy D3 i 1 μl wywaru deksametazonu na ml pożywki do dwóch zestawów w dniu 5, aby wytworzyć tolerogenne moDC. Należy pamiętać, że końcowe stężenie witaminy D3 wynosi 100 nM, a deksametazonu 10 nM; Dodanie GM-CSF i IL-4 nie jest wymagane w dniu 5.
   5. Dodać 200 ng/ml GM-CSF i 200 ng/ml IL-4 do wszystkich zestawów w dniu 6.
   6. Dodaj 1 μg/ml LPS do jednego z zestawów traktowanych tylko GM-CSF i IL-4 w dniu 6, aby wytworzyć dojrzałe moDC.
   7. Dodać 1 μg/ml LPS do jednego zestawu tolerogennych moDC w dniu 6, aby wytworzyć tolerogenne moDC tolerogenne LPS.
   8. Zbierz różne typy moDC w dniu 7, przepłukując naczynie hodowlane PBS, EDTA do cytometrii przepływowej lub innych badań. Należy pamiętać, że zbierane są tylko nieprzylegające komórki. Należy pamiętać, że procentowa wydajność monocytów CD14 ⁺ dla niedojrzałych moDC, dojrzałych moDC, tolerogennych moDC i tolerogennych DC tolerogennych LPS wynosi odpowiednio około 90%, 50%, 60% i 60% i różni się w zależności od dawców krwi i partii FBS.

4. Cytometria przepływowa

1. Charakterystyka markerów powierzchni komórek na moDC
   1. Odłączyć komórki od naczynia hodowlanego, pipetując. Umyć komórki raz PBS/EDTA i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 x 10⁵ komórek na 50 μl buforu barwiącego w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   2. Inkubować 0,5 x 10 6-komórkowych porcji z HLADR sprzężonym z PerCP (1:100), CD80 sprzężonym z PE (1:50), CD83 sprzężonym z PE (1:25), CD86 sprzężonym z PE (1:50), CD11c sprzężonym APC (1:50), CD14 sprzężonym z PE (1:50) i BDCA3 sprzężonym z PE (1:50) i ILT3 sprzężonym z APC (1:25) w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Dopasowane izotypem MAb sprzężone PerCP (1:20), MAb sprzężone z PE (1:11), MAb sprzężone z APC (1:11) będą służyć jako kontrole ujemne.
   3. Wykryć poziomy ekspresji markerów powierzchniowych za pomocą cytometru przepływowego ¹⁸.
2. Analiza potencjału błonowego mitochondriów moDC
   1. Przygotować roztwór podstawowy 1 mM czerwonej chlorometylo-X-rozaminy (CMXRos), dodając 94,1 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) na 50 μg liofilizowanego czerwonego CMXRos.
   2. Inkubować 2 x 10⁵ moDC ze 100 nM Red CMXRos w 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 15 ml.
   3. Dodać 2 ml PBS/EDTA do komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 2 razy. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl PBS, EDTA, 2% FCS do analizy cytometrii przepływowej. Zwróć uwagę, aby użyć kanału PE do analizy sygnału Red CMXRos.
3. Charakterystyka markerowa limfocytów T
   1. Inkubować 50 μl limfocytów T allo CD4+ znakowanych 1,2 x 10⁽1:100) znakowanych CFSE (wygenerowanych z kroku 5.6) z CD3 sprzężonym z PerCP (1:200), CD4 sprzężonym PE/Cy7 (1:400) i CD25 sprzężonym APC/Cy7 (1:100) w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Wybarwić komórki T za pomocą komercyjnego zestawu z Foxp3-Alexa Fluor 647 (1:50) w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

5. Badania nad aloreakcjami

1. Przygotować 5 mM roztwór podstawowy estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE), dodając 18 μl DMSO do liofilizowanego CFSE, zgodnie z protokołem producenta.
2. Oczyść limfocyty T CD4 ⁺ z PBMC
   1. Określ liczbę komórek, pobierając 20 μl zawiesiny komórek PBMC i mieszając z 20 μl błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru.
   2. Zawiesina komory wirówki przy 367 x g z hamulcami przez 10 min, 4 °C.
   3. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w stężeniu 5 x 10 7 komórek na 1 ml buforu barwiącego w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml.
   4. Dodaj koktajl wzbogacający ludzkie limfocyty T CD4 ⁺ w 50 μl / ml komórek. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C) przez 10 minut.
   5. Wiruj cząstki magnetyczne przez 30 sekund i dodaj cząstki magnetyczne w komórkach o stężeniu 100 μl/ml. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   6. Dodać bufor barwiący do zawiesiny komórek o łącznej objętości 2,5 ml. Wymieszać komórki w probówce, delikatnie pipetując w górę i w dół 2 - 3 razy. Umieść probówkę w magnesie i inkubuj przez 5 minut.
   7. Odwróć magnes za pomocą rurki i zdekantuj zawiesinę (zawierającą limfocyty T) do nowej probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml.
3. Określić liczbę komórek i inkubować 1,2 x 10⁶ limfocytów T CD4⁺ z 5 μM CFSE w 1 ml PBS przez 20 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.
4. Dodać do komórek pięciokrotność pierwotnej objętości pożywki do hodowli komórkowych (przygotowanej zgodnie z krokiem 3.1.1) i inkubować przez 5 minut.
5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, 4 °C i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli komórkowych o stężeniu 2 x^10,5 na 75 μl.
6. Dodać 75 μl limfocytów T CD4 ⁺ znakowanych 2 x 10⁵ znakowanych CFSE do każdej kultury moDC zawierającej 75 μl pożywki do hodowli komórkowej z 0, 2,5 x 10³, 5 x 10³, 10 x 10³, 20 x 10³ i 40 x 10³ moDC w 96 dołkowych płytkach z dnem U. Hodowla przez 6 dni w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO_{2 .}
7. Zebrać przez pipetowanie limfocytów T CD4⁺ do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, 4 °C. Zebrać supernatant do analizy cytokin i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml PBS/EDTA i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

6. Analiza cytokin¹⁹

1. Zebrać supernatanty z badań alloreakcji zgodnie z opisem w kroku 5.5.
2. Przygotowanie odczynnika do analizy panelu magnetycznego ludzkiej cytokiny/chemokiny
   1. W celu przygotowania butelki do mieszania kulek unieruchomionych przeciwciałami do pojedynczych fiolek z kulkami (dołączonych do zestawu), należy wirować przez 1 minutę. Dodać 60 μl z każdej fiolki z kulkami przeciwciał do butelki do mieszania (dołączonej do zestawu) i doprowadzić do końcowej objętości 3 ml za pomocą rozcieńczalnika kulek (w zestawie).
   2. W celu przygotowania kontroli jakości należy rozpuścić Kontrolę jakości 1 i Kontrolę jakości 2 (zawarte w zestawie) w 250 μl wody dejonizowanej.
   3. W celu przygotowania buforu do płukania należy rozcieńczyć 30 ml 10x buforu do płukania (dołączonego do zestawu) w 270 ml wody dejonizowanej.
   4. W celu przygotowania wzorca cytokin ludzkich należy rozpuścić wzorzec cytokin ludzkich (dołączony do zestawu) w 250 μl wody dejonizowanej, aby uzyskać stężenie 10 000 pg/ml.
      1. Dodać 50 μl 10 000 pg/ml wzorca cytokin ludzkich do 200 μl buforu testowego (dostarczonego w zestawie) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać 2,000 pg/ml wzorca roboczego. Przenieś 50 μl wzorca cytokin ludzkich o stężeniu 2 000 pg / ml do 200 μl buforu testowego (dostarczonego w zestawie) w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać roboczą normę 400 pg / ml.
      2. Przenieść 50 μl wzorca cytokin ludzkich 400 pg / ml do 200 μl buforu testowego (dostarczonego w zestawie) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać normę roboczą 80 pg / ml. Przenieść 50 μl wzorca cytokin ludzkich o stężeniu 80 pg/ml do 200 μl buforu testowego (dostarczonego w zestawie) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać 16 pg/ml wzorca roboczego.
      3. Przenieś 50 μl wzorca cytokin ludzkich 16 pg / ml do 200 μl buforu testowego (dostarczonego w zestawie) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać normę roboczą 3,2 pg / ml. Wzorzec roboczy 0 pg / ml zawiera tylko 200 μl buforu testowego w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
3. Wstępnie zwilżoną płytkę filtracyjną (dołączoną do zestawu) poprzez pipetowanie 200 μl buforu testowego (w zestawie) do każdej studzienki płyty filtracyjnej. Uszczelnij i umieść płytkę filtracyjną na wytrząsarce płytowej na 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Odessać bufor testowy i dodać 25 μl każdego wzorca lub kontroli jakości do odpowiednich studzienek.
5. Dodać 25 μl pożywki do hodowli komórkowych (przygotowanej zgodnie z krokiem 3.1.1) do tła, wzorców i studzienek kontrolnych.
6. Dodać 25 μl buforu do oznaczania do dołków na próbki i dodać 25 μl próbki do odpowiednich dołków na próbki.
7. Spłukać butelkę do mieszania zawierającą kulki unieruchomione przeciwciałami i dodać 25 μl zmieszanych kulek do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę i inkubować z mieszaniem na wytrząsarce płytkowej przez noc w temperaturze 4 °C.
8. Odessać płyn i umyć płytkę 2 razy, dodając 200 μl/studzienkę buforu do płukania i zasysając płyn.
9. Dodaj 25 μl przeciwciał wykrywających (dostarczonych) do każdej studzienki. Zamknąć i inkubować z mieszaniem na wytrząsarce płytkowej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Dodać 25 μl streptawidyny-fikoerytryny (dostarczonej) do każdej studzienki zawierającej 25 μl przeciwciał wykrywających. Uszczelnić i inkubować z mieszaniem na wytrząsarce płytkowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
11. Odessać płyn i umyć płytkę zgodnie z opisem w kroku 6.8.
12. Dodać 150 μl/ studzienki płynu osłonkowego do wszystkich studzienek i ponownie zawiesić kulki na wytrząsarce płytkowej na 5 minut.
13. Wykrywanie intensywności fluorescencji koralików za pomocą systemu 3D ²⁰. Przeanalizuj dane dotyczące mediany intensywności fluorescencji przy użyciu pięcioparametrowej metody dopasowania krzywej logarytmiczno-logistycznej do obliczania stężeń cytokin/chemokin w próbkach²¹.

7. Pomiary wskaźnika zużycia tlenu w czasie rzeczywistym (OCR) i wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR)

1. Przygotowanie odczynników/materiałów
   1. Przygotować pożywkę OCR: Pożywkę do oznaczania uzupełnioną 25 mM glukozy i 1 mM pirogronianu sodu (pH 7,35). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm. Należy pamiętać, że to podłoże jest przygotowywane bez FBS, ponieważ składniki FBS są złożone i różnią się w zależności od partii.
   2. Przygotuj pożywkę ECAR: Pożywkę bazową uzupełnioną 2 mM L-glutaminą (pH 7,35). Wysterylizuj ten roztwór, filtrując przez filtr 0,2 μm. Należy pamiętać, że to podłoże jest przygotowywane bez wodorowęglanów, glukozy, pirogronianu i FBS. Należy pamiętać, że FBS ma pojemność buforową i będzie zakłócać odczyt ECAR.
   3. Przygotowanie związków do pomiarów OCR: Zawiesić oligomycynę w 630 μl pożywki OCR, aby uzyskać 100 μM roztworu podstawowego i rozcieńczyć pożywką OCR do stężenia roboczego 16 μM. Zawiesić 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu (FCCP) z 720 μl pożywki OCR, aby uzyskać 100 μM roztworu podstawowego i rozcieńczyć pożywką OCR do stężenia roboczego 4,5 μM. Zawiesić rotenon/antymycynę A w 540 μl pożywki OCR, aby uzyskać 50 μM roztworu podstawowego i rozcieńczyć pożywką OCR do stężenia roboczego 10 μM.
   4. Przygotować związki do pomiarów ECAR: Zawiesić glukozę za pomocą 3 ml pożywki ECAR, aby uzyskać 100 mM roztworu podstawowego i rozcieńczyć do 80 mM stężenia roboczego. Zawiesić oligomycynę z 720 μl pożywki ECAR, aby uzyskać 100 μM roztworu podstawowego i rozcieńczyć do stężenia roboczego 18 mM. Zawiesić 2-deoksy-D-glukozę w 1,5 ml pożywki ECAR, aby uzyskać 1000 mM roztworu podstawowego.
   5. Odpipetować 200 μl kalibru do każdego dołka wkładu i przechowywać w temperaturze 37 °C bez CO₂ na dzień przed pomiarami.
2. Pomiary OCR w czasie rzeczywistym
   1. Zebrać moDC i ponownie zawiesić każdy rodzaj moDC w pożywce OCR w stężeniu 60 x 10³ na 150 μl pożywki OCR.
   2. Wysiać 60 x 10³ komórek/basenik na 96-dołkowej płaskiej płytce z płaskim dnem pokrytej poli-D-lizyną i inkubować w inkubatorze niezawierającym zawartości_{CO2 2} przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Należy zwrócić uwagę, aby użyć 50 μl 50 ng/ml poli-D-lizyny do powlekania płytki przez 1 godzinę i umyć sterylną wodą. Przed użyciem utrzymuj płytkę w suchym miejscu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   3. Odpipetować 25 μl pożywki OCR do portu iniekcyjnego A dla wszystkich studzienek; 25 μl pożywki OCR zawierającej 16 μM oligomycyny w porcie B dla wszystkich studzienek; 25 μl pożywki OCR zawierającej 4,5 μM (FCCP) w porcie iniekcji C dla wszystkich studzienek i 25 μl pożywki OCR zawierającej 10 mM rotenonu/antymycyny A w porcie iniekcji D dla wszystkich studzienek. Należy zauważyć, że końcowe stężenie dołka dla oligomycyny wynosi 2 μM, FCCP wynosi 0,5 μM, a rotenon/antymycyna A wynosi 1 μM.
   4. Umieść płytkę w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego i przeprowadź pełne badanie OCR ze wszystkimi moDC jednocześnie w czterech kolejnych etapach: oddychanie podstawowe (po wstrzyknięciu pożywki z portu A), hamowanie kompleksu mitochondrialnego V (po wstrzyknięciu leku z portu B), maksymalna indukcja oddychania (po wstrzyknięciu leku z portu C) i hamowanie łańcucha transportu elektronów (po wstrzyknięciu leku z portu D) ²². Należy pamiętać, że pomiędzy wstrzyknięciami są 3 cykle i 6-minutowy odstęp między pomiarami.
3. Pomiary ECAR w czasie rzeczywistym
   1. Zebrać moDC i ponownie zawiesić każdy rodzaj moDC w pożywce ECAR w stężeniu 60 x 10³ na 150 μl pożywki ECAR.
   2. Wysiewać 6 x 10⁴ komórek/basenik na 96-dołkowej płaskiej płytce z płaskim dnem pokrytej poli-D-lizyną i inkubować w inkubatorze innym niż CO_{2 2} przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   3. Odpipetować 25 μl pożywki ECAR do portu A do wstrzykiwań dla wszystkich studzienek; 25 μl pożywki ECAR zawierającej 10 mM glukozy w porcie iniekcyjnym B dla wszystkich studzienek; 25 μl pożywki ECAR zawierającej 18 μM oligomycyny w porcie iniekcyny C dla wszystkich studzienek i 25 μl pożywki OCR zawierającej 1 000 mM 2-deoksy-D-glukozy w porcie D do wstrzykiwań dla wszystkich studzienek. Należy zauważyć, że końcowe stężenie studzienki dla glukozy wynosi 10 μM, oligomycyna wynosi 2 μM, a 2-deoksy-D-glukoza wynosi 100 mM.
   4. Umieścić płytkę w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego i przeprowadzić pełne badanie ECAR ze wszystkimi moDC jednocześnie w czterech kolejnych etapach: oddychanie podstawowe (po wstrzyknięciu pożywki z portu A), indukcja glikolizy (po wstrzyknięciu leku z portu B), maksymalna indukcja glikolizy (po wstrzyknięciu leku z portu C) i hamowanie glikolizy (po wstrzyknięciu leku z portu D) ²².
   5. Analizuj różnice statystyczne za pomocą jednokierunkowej ANOVA z wielokrotnym porównaniem Tukeya w teście końcowym.

Wyniki

Oczyszczanie monocytów i różnicowanie komórek dendrytycznych

Monocyty zostały oczyszczone z PBMC przez odwirowanie gęstości krwi obwodowej (Rysunek 1A), a następnie separację magnetyczną CD14⁺ z dodatnią selekcją (Rysunek 1B) i hodowane w kompletnej pożywce w obecności GM-CSF i IL-4 w celu uzyskania niedojrzałych komórek dendrytycznych (Rysunek 2A). Dodanie witaminy D3 i deksametazonu po GM-CSF i IL-4 spowodowało różnicowanie niedojrzałych moDC w tolerogenne moDC (Figura 2B). LPS dodano w celu wywołania dojrzewania niedojrzałych moDC do dojrzałych moDC (Figura 2C), a tolerogenne moDC stymulowano LPS w celu sprawdzenia odporności na dojrzewanie (Figura 2D). Próbki krwi wykorzystane w tej pracy zostały pobrane od zdrowych dawców, którzy uzyskali uprzednią świadomą zgodę.

moDC Charakterystyka

Charakterystyka markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej

Analiza markerów powierzchniowych DC wykazała, że dojrzałe moDC wyrażały najwyższe poziomy markerów dojrzewania HLA-DR, CD83 i CD86 w porównaniu do tolerogennych moDC traktowanych LPS, tolerogennych moDC i niedojrzałych moDC (Rysunek 3). Wyniki te wykazały, że tolerogenne moDC były odporne na dojrzewanie w porównaniu z niedojrzałymi moDC po stymulacji LPS. Ponadto tolerogenne moDC i tolerogenne moDC leczone LPS wykazywały zwiększoną ekspresję CD14, BDCA3 (CD141) i transkryptu immunoglobulinopodobnego (ILT)3 w porównaniu z niedojrzałymi i dojrzałymi moDC. Tolerogenne moDC, które tutaj wygenerowaliśmy, są zgodne z poprzednimi raportami ²³.

Charakterystyka funkcjonalna moDC

moDC wywołane dojrzewaniem stają się immunogenne i uwalniają cytokiny, które promują proliferację limfocytów T CD4⁺. Oceniliśmy immunogenność różnych podtypów moDC, mierząc proliferację współhodowanych limfocytów T. Tolerogenne moDC były słabo immunogenne w porównaniu z dojrzałymi moDC, o czym świadczy niska alloproliferacja limfocytów T CD4 ⁺ (Figura 4A). Tolerogenne moDC charakteryzują się niską Γ IFN-, niską IL-12p40 i wysoką produkcją cytokin IL-10 w alloreakcyjnych kokulturach z limfocytami T CD4 ⁺ (Figura 4B). Co więcej, zwiększenie liczby tolerogennych moDC w kokulturach dojrzałych limfocytów T CD4 ⁺ indukowanych przez moDC zwiększyło częstość limfocytów T regulatorowych T CD25 ^{o wysokiej zawartości} Foxp3 + (Figura 4C).

Analiza aktywności mitochondriów

Czerwony CMXRos służy do odzwierciedlenia aktywności mitochondriów do analizy poziomów potencjału błony mitochondrialnej w moDCs. Zaobserwowano, że tolerogenne moDC mają wyższą aktywność mitochondrialną w porównaniu z innymi podtypami zróżnicowanymi moDC (Figura 5A). Następnie za pomocą bioanalizatora ocenia się szybkość mitochondrialnego zużycia tlenu (OCR) dla różnych podtypów moDC. Pomiary OCR umożliwiają wgląd w profil metaboliczny w wysokiej rozdzielczości, dostarczając informacji, w tym między innymi o oddychaniu podstawowym, wolnej pojemności oddechowej, wycieku protonów i oddychaniu niemitochondrialnym. Pomiar OCR zapewnia sposób oceny zdolności komórek do reagowania na stres. Komórki są metabolicznie zaburzone przez dodanie kolejno trzech różnych związków. Pierwszym wstrzyknięciem jest oligomycyna (sprzęgacz ATP), która hamuje kompleks V łańcucha transportu elektronów (ETC), hamując syntezę ATP. Ten krok rozróżnia procent tlenu zużytego do syntezy ATP i procent tlenu zużytego do pokonania wycieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Drugim wstrzyknięciem jest FCCP (akcelerator ETC), który zakłóca syntezę ATP poprzez transport jonów wodorowych przez błonę mitochondrialną zamiast przez kanał protonowy kompleksu V. Zapadnięcie się potencjału błony mitochondrialnej prowadzi do szybkiego zużycia energii i tlenu, bez wytwarzania ATP. Leczenie FCCP można wykorzystać do obliczenia wolnej pojemności oddechowej komórek. Utrzymanie wolnej wydolności oddechowej w warunkach stresu ma kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek. Zdolność ta zależy od kilku czynników, w tym dostępności substratu i zdolności funkcjonalnej enzymów biorących udział w ETC. Trzecie wstrzyknięcie to połączenie rotenonu, inhibitora kompleksu I, i antymycyny A, inhibitora kompleksu III. Ta kombinacja wyłącza oddychanie mitochondrialne i obserwuje się, że OCR zmniejsza się w wyniku upośledzenia funkcji mitochondriów (ryc. 5C). Tolerogenne moDC wykazywały wyższe podstawowe poziomy OCR niż dojrzałe moDC (Figura 5D). Ponadto tolerogenne, tolerogenne i niedojrzałe moDC wykazały zwiększoną wolną pojemność oddechową w porównaniu z dojrzałymi moDC (Figura 5E).

Charakterystyka metaboliczna moDC

Ponieważ kwas mlekowy i protony są uwalniane z komórek podczas glikolizy, przeanalizowaliśmy aktywność glikolityczną moDC, przeprowadzając w czasie rzeczywistym analizę szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) (Rysunek 6B). W obecności glukozy szybkość glikolityczną wszystkich moDC wzrosła w porównaniu ze stadium podstawowym, przy czym dojrzałe moDC wykazywały wyższą szybkość glikolityczną niż niedojrzałe moDC (Figura 6D). Tolerogenne i niedojrzałe moDC wykazywały wyższą maksymalną glikolizę (indukowaną przez oligomycynę w obecności glukozy) w porównaniu z moDC traktowanymi LPS (Figura 6B). Zdolność glikoliczna tolerogennych i niedojrzałych moDC była wyższa niż dojrzałych moDC (Figura 6E). W przeciwieństwie do ich wysokiego wskaźnika glikolitycznego, rezerwa glikoliczna była najniższa w dojrzałych moDC (Figura 6F).

Rycina 1: Oczyszczanie monocytów z krwi obwodowej. (A) 25 ml krwi ostrożnie nakłada się warstwami na 15 ml Ficollu na probówkę o pojemności 50 ml przed odwirowaniem. PBMC są skoncentrowane w warstwie poniżej osocza po odwirowaniu gęstości. (B) PBMC są inkubowane z mikrogranulkami, które są sprzężone z monoklonalnymi ludzkimi przeciwciałami CD14 (izotyp: mysi IgG2a), a następnie ładowane do kolumny, która jest umieszczana w polu magnetycznym separatora w celu wyizolowania monocytów CD14 ⁺. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Charakterystyka morfologiczna moDC. (A) 200 ng/ml GM-CSF i IL-4 dodaje się do oczyszczonych monocytów CD14+ w dniu 0, 4 i 6 w celu wytworzenia niedojrzałych moDC; oraz (B) dodatkowy etap stymulacji 100 nM witaminą D3 i 10 nM deksametazonem w dniu 5 generuje tolerogenne moDC. Niedojrzałe moDC i tolerogenne moDC są stymulowane 1 μg/ml LPS w dniu 6 w celu wytworzenia (C) dojrzałych moDC i (D) tolerogennych moDC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Charakterystyka markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej. Poziomy ekspresji markerów powierzchniowych HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 i LT3 w tolerogennych (zielonych), tolerogennych LPS (czarnych), niedojrzałych (czerwonych), dojrzałych (niebieskich) moDC. Kontrolki izotypu są wyświetlane w kolorze szarym. Indywidualny histogram dla każdego typu komórki jest wykreślany z liczbą komórek na osi Y w stosunku do logarytmu intensywności fluoroforu osi X i nakładany na siebie. Wszystkie histogramy są reprezentatywne dla czterech niezależnych eksperymentów. Ten rysunek został zmodyfikowany z J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (1 czerwca 2015). Powielane i ponownie publikowane za zgodą praw autorskich. Prawa autorskie 2015. Amerykańskie Stowarzyszenie Immunologów, Inc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Charakterystyka funkcjonalna moDC. (A) Kwantyfikacja częstości alloproliferacji limfocytów T CD4 ⁺ indukowanych przez kohodowlę z rosnącą liczbą tolerogennych (TOL; zielony), tolerogennych LPS (L-TOL;), niedojrzałych (IMM; czerwony) i dojrzałych (MAT; niebieski) moDC. Dane zostały zebrane z czterech niezależnych eksperymentów; średnia + S.E.M. Różnice statystyczne między wszystkimi moDC a dojrzałymi moDC analizowano za pomocą dwukierunkowej ANOVA z wielokrotnym porównaniem Dunnetta po teście. (B) Analiza cytokin IFN-Γ (lewy panel), IL-12p40 (środkowy panel) i Il-10 (prawy panel) w supernatantach z alloreakcji między limfocytami T CD4 ⁺ hodowanymi wspólnie z rosnącą liczbą tolerogennych (zielony), niedojrzałych (czerwony) lub dojrzałych (niebieskich) moDC. Dane zebrano z sześciu niezależnych eksperymentów; średnia ± S.E.M. (C) Alloproliferacja limfocytów T CD4 ⁺ i ekspansja regulatorowych limfocytów T indukowana przez kohodowlę z dojrzałymi moDC w obecności rosnącej liczby tolerogennych moDC. Lewa oś Y, częstotliwość proliferacji limfocytów T CD4 ⁺. Prawa oś Y, częstotliwość komórek Foxp3 +^{o wysokiej zawartości} CD25 ^bramkowanych na proliferacyjnych limfocytach T CD4 ⁺. Dane zostały zebrane z trzech niezależnych eksperymentów; średnia ± S.E.M. Statystyczne różnice między obecnością a brakiem tolerogennych moDC analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA z wielokrotnym porównaniem Dunnetta po teście. (D) Alloproliferacja limfocytów T CD4 + (po lewej) i częstość komórek CD25highFoxP3 + (po prawej) indukowana przez kohodowlę z tolerogennymi moDC w obecności rosnącej liczby dojrzałych moDC. Dane zostały zebrane z dwóch do trzech niezależnych eksperymentów; średnia ± S.E.M. Różnice statystyczne między obecnością a brakiem dojrzałych moDC analizowano za pomocą dwukierunkowej ANOVA z wielokrotnym porównaniem Dunnetta po teście. Rysunek ten został zmodyfikowany z J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (1 czerwca 2015 r.). Powielane i ponownie publikowane za zgodą praw autorskich. Prawa autorskie 2015. Amerykańskie Stowarzyszenie Immunologów, Inc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza aktywności mitochondrialnej moDC. (A) Poziomy potencjału błony mitochondrialnej (Red CMXRos) w moDC uzyskano za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Zebrano dane z czterech niezależnych eksperymentów. Średnia ± S.E.M. (B) Schematyczne przedstawienie oddychania mitochondrialnego w czasie rzeczywistym. Analiza OCR rozpoczynająca się od oddychania podstawowego i po dodaniu oligomycyny (inhibicja kompleksu V), FCCP (maksymalna indukcja oddychania) i mieszaniny rotenon/antymycyna A (hamowanie łańcucha transportu elektronów [ETC]). Mitochondrialne SRC (maksymalne podstawowe odjęte od maksymalnego oddychania) wyprowadza się z krzywej OCR. (C) Reprezentatywne badanie kinetyczne mitochondriów OCR (pmol/min) w tolerogennych (TOL, zielony), tolerogennych LPS (L-TOL,), niedojrzałych (IMM, czerwony) i dojrzałych (MAT, niebieski) moDC przy użyciu sekwencyjnego dodawania oligomycyny (Olig), FCCP i rotenonu/antymycyny A (Rot-AA). (D) Kwantyfikacja OCR oddychania podstawowego moDC i (E) zapasowa wydolność oddechowa moDC. Dane zostały zebrane z pięciu niezależnych eksperymentów. Średnia ± S.E.M. Liczba ta została zmodyfikowana z J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (1 czerwca 2015 r.). Powielane i ponownie publikowane za zgodą praw autorskich. Prawa autorskie 2015. Amerykańskie Stowarzyszenie Immunologów, Inc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Charakterystyka metaboliczna moDC. (A) Schematyczne przedstawienie glikolizy w czasie rzeczywistym. Analiza ECAR rozpoczyna się od podstawowego ECAR, w którym komórki inkubowano w pożywkach wolnych od glukozy, a następnie dodano glukozę (indukcja glikolizy), oligomycynę (która indukuje maksymalną glikolizę komórek i hamowanie kompleksu V), a na końcu 2-deoksy-D-glukozę (hamowanie glikolizy). Szybkość glikolityczną (indukcja glikolizy odejmowana dla podstawowego ECAR), pojemność glikolityczną (maksymalna glikoliza odejmowana dla podstawowego ECAR) i rezerwę glikolityczną (maksymalna glikoliza odejmowana w celu indukcji glikolizy) wyprowadza się z krzywej ECAR. (B) Reprezentatywne badanie kinetyczne zależnego od glikolizy ECAR (mpH/min) w tolerogennych (TOL, zielony), tolerogennych LPS (L-TOL,), niedojrzałych (IMM, czerwony) i dojrzałych (MAT, niebieski) moDC przy użyciu sekwencyjnego dodawania glukozy (Gluc), oligomycyny (Olig) i 2-DG. (C) Słupki pokazują podstawowe poziomy ECAR: (D), szybkość glikolityczna, (E) pojemność glikolityczną i (F) rezerwa glikolityczną moDC. Dane zostały zebrane z trzech niezależnych eksperymentów; średnia 6 SEM. Różnice statystyczne analizowano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z wielokrotnym porównaniem Tukeya po teście. Liczba ta została zmodyfikowana z J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (1 czerwca 2015 r.). Powielane i ponownie publikowane za zgodą praw autorskich. Prawa autorskie 2015. Amerykańskie Stowarzyszenie Immunologów, Inc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W artykule opisano metodę wytwarzania z monocytów niedojrzałych moDC, tolerogennych moDC i dojrzałych moDC. Ważne kroki w tym protokole zostały szczegółowo omówione w poniższych punktach. Ważne jest, aby pamiętać, że ludzka krew obwodowa jest używana jako materiał wyjściowy w tym protokole i należy stosować uniwersalne środki ostrożności przy obchodzeniu się z ludzką krwią. Chociaż technicznie wykonalne jest wyprowadzenie DC ze szpiku kostnego u ludzi ²⁴, różnicowanie DC in vitro z komórek znajdujących się we krwi obwodowej jest preferowane ze względu na dostępność krwi obwodowej w porównaniu ze szpikiem kostnym. Wśród komórek znajdujących się we krwi obwodowej, hematopoetyczne komórki macierzyste i monocyty CD34 ⁺ są powszechnie stosowane do wytwarzania DC in vitro . Hematopoetyczne komórki macierzyste CD34 ⁺ są hodowane z GM-CSF i TNF-α w celu uzyskania podzbiorów CD1a ⁺ i CD14 ⁺ , które są następnie dalej różnicowane w komórki Langerhansa i komórki dendrytyczne. I odwrotnie, monocyty są hodowane w GM-CSF i IL-4 w celu wytworzenia niedojrzałych moDC. Do wzbogacania monocytów z krwi obwodowej stosuje się kilka protokołów; Na przykład poprzez przyleganie do plastikowych naczyń, zestawów do elutriacji i izolacji ^{25, 26}. Zaletą protokołu przestrzegania zaleceń lekarskich jest minimalne uszkodzenie komórek i stosunkowo opłacalność, jednak czystość komórek może być zagrożona; Wymagany jest dodatkowy krok, aby odłączyć komórki do dalszych eksperymentów. Elutriacja to technika polegająca na rozdzielaniu komórek na podstawie ich wielkości i gęstości. Zaletą elutriacji jest żywotność komórek, a monocyty mogą być łatwo wykorzystywane do dalszych eksperymentów; jednak technika ta jest ograniczona dostępnością elutriatora i niemożnością oddzielenia różnych populacji komórek (limfocytów T i monocytów) o podobnych parametrach sedymentacji. Dostępne na rynku zestawy izolacyjne wykorzystują mikrokulki magnetyczne do pozytywnej lub negatywnej selekcji populacji monocytów. Niektóre protokoły są nastawione na izolację monocytów przy użyciu selekcji negatywnej, ponieważ izolowane monocyty pozostają "nietknięte" (nie są związane markerami lub mikrogranulkami). W tym protokole kulki CD14 zostały użyte do pozytywnej selekcji ludzkich monocytów z PBMC. CD14 nie ma domeny cytoplazmatycznej, a wiązanie przeciwciała z CD14 nie wyzwala transdukcji sygnału. Co więcej, mikrogranulki odrywają się od monocytów po hodowli, a tym samym nie utrudniają procesu różnicowania. Ponadto CD14 ulega silnej ekspresji na większości monocytów i słabo na neutrofilach i niektórych szpikowych komórkach dendrytycznych, stąd ta metoda izolacji skutkuje wyższą czystością komórek niż inne metody¹⁷.

Monocyty krwi mogą być różnicowane w DC lub makrofagi, a los monocytów w dużej mierze zależy od środowiska cytokin. W tym artykule moDC są generowane przez dodanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i interleukiny 4 (IL-4) do ludzkich monocytów krwi obwodowej. GM-CSF jest wymagany do przeżycia monocytów, a IL-4 wywiera działanie hamujące na różnicowanie makrofagów; a kombinatoryczne dodawanie GM-SCSF i IL-4 do monocytów daje wyższy odsetek niedojrzałych moDC w porównaniu z pojedynczą cytokiną²⁷. Istnieją inne protokoły, które generują moDC poprzez dodanie czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α), interferonu alfa (IFN-α) i interleukiny 13 (IL-13) do monocytów krwi obwodowej ^28,29,30. Połączenie GM-CSF i IL-4 zostało zoptymalizowane w latach 90. i obecnie jest akceptowanym protokołem, który generuje plastikowe niedojrzałe DC zróżnicowane na immunogenne lub tolerogenne moDC i spolaryzowane na moDC promujące Th1, Th2 lub Th17.

Niedojrzałe moDC różnicują się w tolerogenne moDC przez dodanie witaminy D3 i deksametazonu. Istnieje kilka protokołów generowania tolerogennych DC, na przykład poprzez hamowanie czynnika jądrowego-kappa B (NF-kB), aktywację β-kateniny, witaminę D3, deksametazon i rapamycynę 31,32,33,34,35,9,36,37. Chociaż donoszono, że zarówno witamina D3, jak i sam deksametazon wywołują działanie tolerogenne na DC, połączenie witaminy D3 i deksametazonu powoduje większe zahamowanie alloproliferacji niż w przypadku stosowania pojedynczych leków. W związku z tym istniejący protokół wytwarzania tolerogennych DC został zmodyfikowany na kombinację witaminy D3 i deksametazonu. Metoda ta jest obecnie akceptowana jako model dla ludzkich tolerogennych DC o użyteczności terapeutycznej. Ważne jest również, aby pamiętać, że odtworzona witamina D3 i deksametazon mają krótki okres przydatności do spożycia.

W tym protokole dodano lipopolisacharydy (LPS) jako induktor dojrzewania DC. Niedojrzałe moDC można również indukować do dojrzewania za pomocą koktajlu prozapalnego: (TNF-α), Interleukiny 1 beta (IL-1β), Interleukiny 6 (IL-6) i prostaglandyny E2) lub cytokin prozapalnych (TNF-α i interferonu gamma (IFN-Γ)). Koktajl prozapalny generuje dojrzałe moDC o wysokich funkcjach kostymulujących i migracyjnych, ale wytwarzają one stosunkowo niski poziom IL-12³⁸. Sama TNF-α lub IFN-Γ nie jest w stanie indukować stabilnego fenotypu dendrytycznego ³⁹. LPS stymuluje receptor Toll-podobny 4 (TLR4), pośredniczy w aktywacji kinaz białkowych aktywowanych NF-kB i mitogenem (MAPK) w celu indukowania dojrzewania DC. Dojrzewanie DC indukowane przez LPS wykazuje regulację w górę markerów dojrzewania DC (CD83, CD86, HLA-DR), a także doprowadziło do produkcji IL-12p70. Ponadto etap ten może być dalej modyfikowany w celu sparowania LPS z agonistami TLR3 w celu wytworzenia dojrzałych DC do klinicznych szczepionek przeciwnowotworowych. W niniejszej pracy wykazano, że tolerogenne DC są oporne na dojrzewanie po leczeniu LPS. Te półdojrzałe, takie jak DC, nie są immunogenne i nie uwalniają cytokin prozapalnych ⁴⁰.

Ograniczenia tego protokołu polegają na procesie różnicowania. Proces trwa 8 dni od dnia 0 do dnia 7, co stanowi trudność w dostosowaniu do analiz o wysokiej przepustowości. Modyfikacja protokołu jest wymagana, aby skrócić proces różnicowania, a jednocześnie uzyskać dużą liczbę żywotnych DC w różnych stanach. Po drugie, DC są generowane przez dodanie cytokin w tym protokole, a cytokiny te nie utrzymują populacji DC przez długi okres czasu. Co więcej, cytokiny są stosowane w stężeniach znacznie wyższych niż in vivo i mogą powodować tendencyjny rozwój szlaków, które nie są fizjologicznie identyczne z DC in vivo . Na przykład wykazano, że hodowle prekursorów DC in vitro reagują na GM-CSF, który nie jest niezbędną cytokiną do prawidłowego różnicowania DC in vivo⁴¹. Niemniej jednak stymulacja cytokin może być użyteczną metodą generowania dużej liczby DC in vitro do eksperymentów. Możliwość poddania tych komórek wygenerowanych w tym protokole innym analizom, takim jak barwienie immunofluorescencyjne, cytometria przepływowa, badania reakcji allo i badania metaboliczne, zwiększa użyteczność tej metody. Te DC in vitro służą jako dobry model do poszerzania wiedzy na temat rozwoju, dojrzewania i prezentacji antygenu DC, co wcześniej było trudne do wykonania w przypadku rzadkiej liczby DC in vivo .

Zdolność DC do regulowania odporności immunologicznej w porównaniu z tolerancją czyni je atrakcyjnymi kandydatami w terapiach przeciwko nowotworom i chorobom autoimmunologicznym 42,43,44,45. Immunogenne DC wygenerowane w tym protokole mogą być wykorzystane do poprawy skuteczności szczepień przeciwko chorobom zakaźnym i nowotworom; podczas gdy tolerogenne DC mogą być stosowane do kontrolowania niepożądanych odpowiedzi limfocytów T i zapobiegania odrzuceniom po przeszczepie. Skomplikowana równowaga między odpornością a tolerancją zależy w ogromnym stopniu od statusu różnicowania DC. Różnicowanie DC to skoordynowany program komórkowy, który jest regulowany przez wiele szlaków sygnałowych i los metaboliczny. Różne stany różnicowania DC różnią się potrzebami bioenergetycznymi i biosyntezowymi; na przykład aktywowane DC wymagają bardziej energetycznych adaptacji metabolicznych ważnych dla przetrwania i migracji w porównaniu z DC w stanie spoczynku. Ważne jest, aby pamiętać, że witamina D3, deksametazon i rapamycyna są znane ze swojej zdolności do indukowania tolerogennych DC i opisano wpływ na metabolizm DC. W niniejszej pracy scharakteryzowano metabolizm energetyczny moDC z różnych stanów różnicowania za pomocą analizatorów strumienia zewnątrzkomórkowego, przy czym tolerogenne moDC wykazywały najwyższą plastyczność metaboliczną, a dojrzewanie wywołane LPS zmniejszało tę plastyczność. Metabolizm anaboliczny wspomaga dojrzewanie DC, podczas gdy metabolizm kataboliczny wpływa na tolerogenne funkcje DC⁴⁶. Centra prądu wygenerowane za pomocą tego protokołu można wykorzystać do oceny, czy zmiana stanu metabolicznego DC jest kluczem do modyfikacji odporności i tolerancji w terapiach. Podsumowując, przedstawiliśmy protokół generowania niedojrzałych, tolerogennych i dojrzałych moDC, kluczowy dla badania funkcji immunoregulacyjnych DC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Izolacja PBMC
Strzykawka	Becton, Dickinson	302832	Izolacja PBMC
1,5 ml probówka wirówkowa	Axygen	MCT-150-C	PBMC
15 ml probówka sokoła	Falcon	352096	izolacja PBMC
50 ml rurka falcon	Falcon	352070	Izolacja PBMC
Wirówka	Eppendorf	5810R	PBMC izolacja
0,2 i mikro; Filtr m	Sartorius stedim biotech	17597	do izolacji
PBMC	Miltenyi biotec	130-042-201	Wzbogacanie monocytów
Separator MiniMACS	Miltenyi biotec	130-042-102	Wzbogacanie monocytów
Woda klasy hodowli komórkowej	Invitrogen, Life Technologies		Hodowla komórkowa
RPMI	Gibco, Life Technologies	11875-093	Hodowla komórkowa
FBS	Hyclone	SH30070103	Hodowla komórkowa
Penicylina-streptomycyna	Gibco, Life Technologies	15140	Hodowla komórkowa
Fosforan Buforowana sól fizjologiczna	Gibco, Life Technologies	10010-031	Hodowla komórkowa
NEAA	Gibco, Life Technologies	11140-040	Hodowla komórkowa
EDTA	Gibco, Life Technologies	15575	Hodowla komórkowa
HEPES	Gibco, Life Technologies	15630-080	Hodowla komórkowa
Pirogronian sodu	Gibco, Life Technologies	11360-070	Hodowla komórkowa
GM-CSF	Miltenyi biotec	130-093-868	Hodowla komórkowa
IL-4	Miltenyi biotec	130-093-924	Hodowla komórkowa
Witamina D3	Sigma	D1530	Hodowla komórkowa
Deksametazon	Sigma	D2915	Hodowla komórkowa
LPS	Sigma	l2755	Hodowla komórkowa
trypan niebieski	Gibco, Life Technologies	15250-061	Hodowla komórkowa
Inksamitan PerCP HLADR	BioLegend	307628	Cytometria
CD80 sprzężona z PE	Nauki biologiczne	557227	Cytometria
CD83 sprzężona z PE	BD Biosciences	556855	Cytometria
CD86 sprzężona z PE	BD Biosciences	555665	Cytometria
CD11c sprzężona z APC	BD Biosciences	340544	Cytometria
CD14 sprzężona z PE	Miltenyi biotec	130-091-242	Cytometria
BDCA3 sprzężona z PE	Miltenyi biotec	130-090-514	Cytometria
ILT3 sprzężona z APC	eBioscience	12-5139-73	Cytometria
Dopasowany izotyp PerCP- sprzężony Mab	BioLegend	400250	Dopasowany izotyp cytometrii
PE - sprzężony Mab	Miltenyi biotec	130-091-835	Dopasowany izotyp cytometrii
APC- sprzężony Mab	Miltenyi biotec	130-091-836	Cytometria
BD LSR II Cytometr przepływowy	BD Pharmingen	BD LSR II	Cytometria
cytofix/cytoperm	Cytometria 554714 Biosciences		Cytometria
APC/CY7-sprzężone CD25	BD pharmingen	557753	Cytometria
PE/CY7-sprzężona CD4	Biolegend	300512	Cytometria
CD3 sprzężona z PerCP	Biolegend	300428	Cytometria
EasySep Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+	STEMCELL Technologies	19052	Badanie alloreakcji
Magnes EasySep	STEMCELL Technologies	18000	Badanie alloreakcji
Cell Trace Zestaw do proliferacji komórek CFSE	Sondy molekularne	C34554	Badanie alloreakcji
HBSS	Gibco, Life Technologies	14025092	Badanie alloreakcji
Alexa Fluor 647 sprzężony FoxP3	BD Biosciences	560889
Milliplex MAP Human Cytokina/Chemokine panel z kulkami magnetycznymi	Millipore	HCYTOMAG-60K	Analiza cytokin
5 ml Rurka polistyrenowa	Falcon	352058	Analiza cytokin
Luminex Scover Fluid	Millipore	SHEATHFLUID	Analiza cytokin
System FLEXMAP 3D z oprogramowaniem xPONENT	Luminex Corporation	FLEXMAP	Analiza cytokin
3D MitoTracker Red CMXRos	Cell Signalling	9082	Aktywność mitochondrialna
DMSO	Sigma Aldrich	D2650	Aktywność mitochondrialna
XF Assay Medium (OCR)	Seahorse Bioscience	102352-000	Adaptacja metaboliczna
Glukoza	Sigma Aldrich	G8769	Adaptacja metaboliczna
XF Podłoże podstawowe (ECAR)	Konik morski	Bioscience 102353-100	Adaptacja metaboliczna
L-glutamina	Gibco, Life Technologies	25030-081	Adaptacja metaboliczna
Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000	Adaptacja metaboliczna
XF Cell Mito Stress kit	Seahorse Bioscience	103015-100	Adaptacja metaboliczna
XF Zestaw stresu glikolizy	Seahorse Bioscience	103020-100	Adaptacja metaboliczna
Konik morski	Konik morski	Bioscience XFe96	Adaptacja metaboliczna