Artykuł metodologiczny

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

DOI:

10.3791/54135

⸱

1 sierpnia 2016

 ,  , 
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera (FRET) to potężne narzędzie do badania biologii komórki w czasie rzeczywistym. W badaniach wykorzystujących FRET powszechnie stosuje się hodowlę dwuwymiarową (2D), która nie naśladuje trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska komórkowego. Przedstawiono metodę wykonywania obrazowania FRET z wygaszoną emisją przy użyciu konwencjonalnej szerokopolowej mikroskopii epifluorescencyjnej komórek w środowisku hydrożelowym 3D. W tym miejscu opisano metodę analizy dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji sondy. Pomiar wewnątrzkomórkowych cyklicznych monofosforanów adenozyny (cAMP) wykazano w chondrocytach pod wpływem stymulacji forskoliny za pomocą sondy do aktywacji EPAC1 (ICUE1) i zdolności do wykrywania różnic w sygnalizacji cAMP w zależności od rodzaju materiału hydrożelowego, w tym hydrożelu sieciującego foto(PC-żel, dimetakrylan glikolu polietylenowego) i hydrożelu termoresponsywnego (TR-żel). W porównaniu z metodami 2D FRET, metoda ta wymaga niewiele dodatkowego nakładu pracy. Laboratoria już wykorzystujące obrazowanie FRET w 2D mogą z łatwością zastosować tę metodę do wykonywania badań komórkowych w mikrośrodowisku 3D. Może być dalej stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w zmodyfikowanych mikrotkankach 3D. Dodatkowo jest kompatybilny z innymi formami obrazowania FRET, takimi jak pomiar anizotropii i obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM), a także z zaawansowanymi platformami mikroskopowymi wykorzystującymi oświetlenie konfokalne, pulsacyjne lub modulowane.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja komórkowa jest zarówno złożona, jak i istotna dla wielu dziedzin, w tym farmakologii, inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Potrzebne są użyteczne narzędzia badawcze, aby pogłębić naszą wiedzę na temat biologii komórki i opracować optymalne materiały do regeneracji tkanek. Obrazowanie rezonansowego transferu energii metodą Förstera (FRET) jest niezbędnym narzędziem umożliwiającym analizę aktywacji receptorów, konformacji molekularnej i oddziaływań supramolekularnych (np. kompleksacji białko/DNA) w żywych komórkach. FRET to rodzaj nieradiacyjnego transferu energii między fluoroforami1. Ma wydajność, która jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między fluoroforem donorowym a fluoroforem akceptorowym. W ten sposób może dostarczyć informacji na temat odległości przestrzennej między dwiema różnymi cząsteczkami lub między regionami jednej cząsteczki w skali nanometrowej (zwykle 1 - 10 nm)2. Fluorofory donorowe i akceptorowe mogą być różnymi typami cząsteczek (hetero-FRET), w których donor ma wyższą emisję energii (krótsza długość fali) lub tego samego typu (homo-FRET). Obrazowanie FRET można wykonywać na stałych lub żywych komórkach, ale ogólnie rzecz biorąc, stałe komórki są używane do obrazowania interakcji molekularnych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, gdy szybkie systemy konfokalne są niedostępne. Żywe komórki są wykorzystywane do badania interakcji i procesów, które są hamowane lub zmieniane przez fiksację, takich jak wewnątrzkomórkowa odpowiedź sygnalizacyjnaw czasie rzeczywistym 3.

Badania na żywych komórkach, które wykorzystują obrazowanie FRET, wykorzystują dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe, częściowo ze względu na prostotę i niższe tło (brak emisji z komórek spoza płaszczyzny). Jednak hodowle 2D zmieniają również wiele procesów komórkowych w porównaniu z mikrośrodowiskiem fizjologicznym i kulturą trójwymiarową (3D)4,5. Na przykład natywne interakcje między komórkami i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa są drastycznie zmienione w hodowli 2D, co prowadzi do łatwych do zaobserwowania zmian w morfologii i polarności komórek6. Mikrodomeny błonowe (np. kaweole i tratwy lipidowe) oraz sygnalizacja receptora są silnie regulowane przez środowisko hodowli, częściowo dlatego, że wiążą składniki cytoszkieletu7,8, a kształt komórki i struktura cytoszkieletu są silnie regulowane przez przestrzenne środowisko hodowli9. Na mechanotransdukcję ma wpływ nie tylko matryca 3D, ale także bardziej złożone warunki obciążenia wtórnego powstające w środowiskach 3D w porównaniu z kulturami 2D10. Wreszcie, przepuszczalność matryc 3D jest mniejsza niż pożywki hodowlanej, na ogół ze zmniejszoną dyfuzją i zwiększonym wiązaniem cząsteczek sygnalizacji komórkowej w porównaniu z kulturami 2D. Dzięki kulturom 3D można stworzyć i obserwować mikrośrodowisko bardziej zbliżone do fizjologicznego w odniesieniu do sygnałów adhezyjnych, chemicznych i mechanicznych. Interakcje między komórkami mogą być promowane, a właściwości adhezyjne mogą być kontrolowane za pomocą struktury, składu i architektury (wzorów) materiału 3D11-13. Właściwości mechaniczne materiału można również dostosować do składu i struktury14,15. Hodowla komórek w hydrożelach pozwala zatem na badania FRET na komórkach pierwotnych, które w przeciwnym razie uległyby dedyferencjacji lub zmianie fenotypu przy użyciu konwencjonalnych technik, np. komórek z chrząstki stawowej. W związku z tym potrzebna jest metoda, która umożliwi testy FRET w żywych kulturach 3D.

Hydrożelowe rusztowania są idealne do badań 3D opartych na FRET, ponieważ mogą być optycznie przezroczyste i dostosowane do kontrolowania mikrośrodowiska i dostarczania sygnałów komórkowych. Hydrożele wykonane z naturalnych polimerów są stosowane w hodowlach komórkowych od dziesięcioleci, w tym żelatyna i fibryna16. Większą kontrolę nad mikrośrodowiskiem komórkowym można osiągnąć dzięki chemicznej modyfikacji tych polimerów oraz zastosowaniu polimerów syntetycznych17,18. Sztywność mechaniczną i przepuszczalność hydrożelu można kontrolować, zmieniając ich skład polimerowy i rozmiar oczek (gęstość polimeru i usieciowania)19,20. Co więcej, hydrożele mogą być bioaktywne poprzez włączenie czynników wzrostu i ligandów komórkowych. Ze względu na te możliwości, rozwój hydrożeli do zastosowań w biosensoryce, dostarczaniu leków i inżynierii tkankowej jest bardzo aktywnym obszarem badań21. Druk 3D hydrożeli jest również w trakcie opracowywania pod kątem wytwarzania mikrotkanek i narządów15. Tak więc obrazowanie komórek w hydrożelach metodą FRET jest nie tylko przydatne jako sposób na przybliżenie fizjologicznego zachowania komórek, ale także jako narzędzie do badania i optymalizacji wzrostu tkanek inżynieryjnych.

Binarne ratiometryczne sondy FRET są bardzo przydatne w badaniu sygnalizacji komórkowej i mogą być wykorzystywane w hodowlach hydrożelowych. Częściowa lista opublikowanych sond fluorescencyjnych i FRET znajduje się na stronie internetowej Cell Migration Consortium22. Najpopularniejszy typ sondy zawiera dwa różne fluorofory, które są skojarzone lub połączone przez element (elementy) rozpoznający (obszar wrażliwy na analit). Regiony te ulegają zmianie konformacyjnej, asocjacji lub dysocjacji po wykryciu analitu (np. wiązanie jonu lub cząsteczki, enzymatyczne rozszczepienie regionu), która zmienia odległość między fluoroforami, a tym samym wielkość FRET (wyższą lub niższą)23. Mniej powszechny, ale użyteczny typ sondy opiera się na wrażliwej na analit zmianie w nakładaniu się widmowym dwóch fluoroforów, co zmienia wielkość FRET. "Jednołańcuchowe" sondy ratiometryczne wykorzystują parę fluoroforów połączonych na pojedynczej cząsteczce. Sondy "dwułańcuchowe" wykorzystują pary fluoroforów na oddzielnych cząsteczkach, ale ich ekspresja może być sprzężona pod tą samą kasetą ekspresyjną24. W przeciwieństwie do badań z pojedynczą ekspresją fluoroforu (np. fluorescencyjne białka fuzyjne), badania z ratiometrycznymi sondami FRET nie wymagają podwójnej transfekcji w celu kontroli wydajności transfekcji lub żywotności komórek. Ratiometryczne sondy FRET są stosunkowo niewrażliwe na skuteczność transfekcji, gdy są wyrażone powyżej minimalnego progu (niewrażliwe na stężenie)23,25. Są niewrażliwe na fluktuacje źródła wzbudzenia i inne wewnątrzkomórkowe czynniki środowiskowe (np. pH, jony), o ile oba fluorofory reagują podobnie. Ponadto ich odpowiedź nie podlega opóźnieniu transkrypcji, w przeciwieństwie do fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych konstruktów promotor-reporter26,27.

Ratiometryczne sondy FRET są łatwo i często stosowane w konwencjonalnych systemach mikroskopów epifluorescencyjnych o szerokim polu. Mikroskopy szerokokątne są preferowane w stosunku do liniowych skaningowych systemów konfokalnych do obrazowania żywych komórek ze względu na obawy dotyczące kosztów systemu, wybielania fluoroforów i wychwytywania zmian sygnału z wystarczającą rozdzielczością czasową. Ponadto możliwa jest analiza pojedynczych komórek na dużej populacji komórek za pomocą zmotoryzowanego stolika i przechwytywania obrazu w wielu polach widzenia. Mikroskopia szerokokątna wymaga analizy sygnałów sondy hetero-FRET opartej na intensywności. Chociaż analiza intensywności nie wymaga skomplikowanego sprzętu, jak w przypadku innych metod FRET, potrzebne są dalsze prace po akwizycji, aby skorygować wpływ zachowań fluoroforów i konfiguracji mikroskopu/systemu obrazowania28. Przechwycona intensywność emisji fluoroforu jest funkcją energii wzbudzenia, wydajności kwantowej fluoroforu oraz połączonej czułości widmowej i liniowości filtra i kamery/detektora2. Mogą one być różne dla dawcy i akceptora i będą wymagały kalibracji do analizy ilościowej. Ponadto na obrazowanie emisji akceptora ma wpływ nakładanie się widmowe fluoroforów (wzbudzenie akceptora przez światło wzbudzenia donora i przebijanie emisji donorowej do widm emisyjnych akceptora)2. Sondy "jednołańcuchowe" są wewnętrznie znormalizowane, ponieważ ich fluorofory są równomolowe w nanoskali, podczas gdy fluorofory sond "dwułańcuchowych" mogą występować w różnych stechiometriach w komórce25,28. Jeśli fluorofory sond "jednołańcuchowych" mają podobną jasność (w funkcji współczynnika ekstynkcji i wydajności kwantowej), efekty czułości detektora nieliniowego są niewielkie i potrzebna jest tylko poprawka na fluorescencję tła i sprzężoną wydajność kwantową/czułość detektora23. W związku z tym "jednołańcuchowe" ratiometryczne sondy FRET są najłatwiej stosowane w mikroskopii szerokokątnej24.

Ten artykuł opisuje prostą technikę wykonywania obrazowania FRET żywych komórek w hodowlach hydrożelowych 3D przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego o szerokim polu. Może być łatwo przyjęty przez laboratoria już przeprowadzające eksperymenty FRET w 2D, a także laboratoria zainteresowane sygnalizacją międzykomórkową w mikrotkankach. Tutaj demonstrujemy metodę z obrazowaniem FRET, pomiar poziomów cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) w żywych chondrocytach w hydrożelach fotosieciujących (PC-żel, dimetakrylan glikolu polietylenowego) i termoczułych (TR-gel, Matrigel). Ratiometryczna sonda FRET jest wykorzystywana na bazie EPAC1 (ICUE1) do wykrywania poziomów cAMP w odpowiedzi na forskolinę, chemicznego agonistę cyklazy adenylowej, która katalizuje konwersję ATP do cAMP. cAMP jest jednym z głównych drugich przekaźników pośredniczących w sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G i aktywuje różne czynniki, w tym białka wymiany dalej aktywowane bezpośrednio przez cAMP (EPAC). Fluorofory rozsuwają się po związaniu cAMP z domeną EPAC, co powoduje zmniejszenie FRET. Opisano tutaj przygotowanie materiałów hydrożelowych, transfekcję komórek za pomocą sondy ICUE1 i zatopienie komórek w hydrożelach 3D. Wyjaśniono procedurę eksperymentu 3D FRET oraz analizę obrazu niezbędną do oceny aktywności sondy na komórkę. Omówiono również nieodłączne ograniczenia analizy FRET w 2D i 3D przy użyciu mikroskopii szerokokątnej. Przedstawiona tutaj technika stanowi ulepszenie w stosunku do istniejących metod 2D, ponieważ umożliwia analizę w bardziej fizjologicznym kontekście i wymaga mniej korekcji obrazu i kalibracji. Duża użyteczność polega na tym, że można użyć wielu przezroczystych materiałów, przy jednoczesnym zachowaniu preferencji komórkowych i transfekcyjnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotować dimetakrylan glikolu polietylenowego (PEGDM, 4 000 MW) za pomocą metakrylonia glikolu polietylenowego zgodnie z metodami opisanymi przez Lin-Gibsona i wsp. 29. Alternatywnie można zakupić PEGDM.
  2. Zsyntetyzować fotoinicjator, fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP), w dwuetapowym procesie, w którym najpierw dimetylofenylofosfonian reaguje z 2,4,6-trimetylobenzoilochorydem w reakcji Michaelisa-Arbuzowa, a następnie sól litu utworzoną przez dodanie bromku litu do 2-butanonu, zgodnie z Majima i wsp.30.
    Uwaga: Alternatywnie można zakupić inne fotoinicjatory, ale LAP wykazuje lepszą biokompatybilność i skuteczność sieciowania31.
  3. Funkcjonalizuj szklane szkiełka nakrywkowe, aby umożliwić wiązanie hydrożelu ze szkłem, a tym samym zapobiec ruchowi podczas obrazowania.
    1. W kapturze chemicznym z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej należy stosować metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu zgodnie z protokołem producenta dla żeli PC-gel i silany epoksydowe (3-Glycidoxypropylotrimetoxysilane) dla TR-gels31. Uwaga: Alternatywnie można zakupić wstępnie powlekane prowadnice. Należy pamiętać, że szkiełko nakrywkowe musi być większe niż studzienka naczynia PDMS w kroku 3.8.

2. Transfekcja komórek

  1. W kapturze do hodowli tkankowej i przy użyciu sterylnych technik rozmrozić i pokryć pożądane komórki w momencie konfluencji (50 - 70%), w tym przypadku chondrocyty bydlęce w ilości 15 000 komórek/cm2 w 6-dołkowych szalkach hodowlanych niepoddanych obróbce. Uwaga: Można użyć dowolnego odpowiedniego typu komórek, w tym komórek niezależnych od zakotwiczenia.
    1. Pozostawić komórki do regeneracji przez jeden dzień w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Przed kolejnymi krokami usuń pożywkę, spłucz PBS i dodaj 2 ml pożywki wolnej od fenolu i surowicy na dołek.
  2. Następnego dnia do każdej studzienki dodać 100 μl pożywki bez fenolu i surowicy oraz 3 μl odczynnika do transfekcji do autoklalawowanej szklanej probówki. Aby wymieszać, lekko potrząśnij tubką. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ogranicz ekspozycję na światło.
  3. Dodaj 1 μg DNA sondy FRET i lekko wstrząśnij. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej, z dala od światła przez 30 min.
    Uwaga: W tym eksperymencie użyto plazmidu ICUE1 (dzięki uprzejmości dr Jin Zhang33). Fluorofory w ICUE1 to cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP, donor) i żółte białko fluorescencyjne (YFP, akceptor). Stosunek odczynnika do transfekcji do plazmidowego DNA będzie wymagał dostosowania w celu optymalnej transfekcji różnych typów komórek.
  4. Rozprowadzić przygotowaną mieszaninę (~104 μl) kroplami do każdej z 6 studzienek zawierających komórki oraz 2 ml pożywki bez fenolu i surowicy. Nie pipetować w górę i w dół. Delikatnie zakręć talerzem, aby wymieszać.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Uwaga: Konfluencja hamuje skuteczność transfekcji i zmienia endogenną ekspresję receptorów.

3. Produkcja form PDMS do odlewania i hodowli hydrożeli

  1. Aby przygotować duże szkiełko do odlewania polidimetylosiloksanu (PDMS), należy najpierw umyć szklankę mydłem, spłukać dużą ilością wody, a następnie osuszyć izopropanolem, a następnie powietrzem.
    1. Potraktuj szkło odczynnikiem silikonowym zgodnie z protokołem producenta, aby PDMS można było łatwo odkleić po utwardzeniu. Spłukać resztki odczynnika z powierzchni toluenem nad pojemnikiem zlewnym. Pozostaw powierzchnię do całkowitego wyschnięcia na powietrzu lub użyj ciepła o temperaturze 100 °C, aby skrócić czas oczekiwania.
  2. Wybierz wysokość hydrożelu (np. 1 mm) i oblicz 1,2-krotność objętości PDMS potrzebnej do pokrycia szkiełka PDMS o tej grubości, korzystając z wymiarów szkiełka i wysokości hydrożelu. Uwaga: PDMS nie kurczy się.
    1. Wymieszać składniki zestawu PDMS w zlewce w stosunku wagowym 10:1. Po dokładnym wymieszaniu umieść zlewkę pod odkurzaczem domowym, aby odgazować. Uwolnij próżnię, jeśli bąbelki zaczną przelewać się przez pojemnik i powtórz.
      Uwaga: Można stosować inne grubości hydrożelu, ale kosztem zwiększonego tła i zwiększonego nieprzezroczystości, jeśli nie stosuje się wirowania (krok 6.2).
  3. Owiń folię aluminiową wokół podstawy i boków szkła, aby pomieścić PDMS. Ostrożnie wylej żądaną ilość odgazowanego PDMS na tę szklankę otoczoną folią. Zmierz wysokość PDMS. Należy pamiętać, że wysokość PDMS będzie maksymalną wysokością hydrożelu. Jeśli podczas nalewania powstaną bąbelki, ponownie odgazuj je lub przebij je szpatułką lub igłą.
  4. Umieść nieutwardzony PDMS na równej powierzchni w piekarniku w temperaturze 100 °C na 2 godziny lub pozostaw w temperaturze RT na 24 godziny.
  5. Ostrożnie usuń PDMS z powierzchni po utwardzeniu. Wykrać żądany kształt (np. cylindryczny stempel o średnicy 3 mm) dla hydrożeli.
    Uwaga: Fotosieciowanie pozwoli uzyskać nieco węższe cylindry PC-żel niż średnica formy ze względu na wygaszanie reakcji przez tlen cząsteczkowy w PDMS.
  6. Wysterylizuj dziurkowany PDMS. W przypadku eksperymentów krótkoterminowych zanurz PDMS w 70% etanolu na 1 godzinę.
  7. Zmontuj formę, dopasowując podstawę wysterylizowanego PDMS do sterylnego szklanego szkiełka nakrywkowego o grubości dopasowanej do korekcji obiektywu mikroskopu. Odłóż na bok do użycia w kroku 6.
  8. Stwórz większe naczynie PDMS przy użyciu powyższych metod (z dobrze szerszą i wyższą niż hydrożel), aby pomieścić hydrożel i pożywkę. Umieść średnią objętość co najmniej 10 razy większą niż hydrożel, aby zanurzyć hydrożel i zminimalizować rozcieńczenie analitu.

4. Przygotowanie roztworów prekursorów hydrożelu

  1. W kapturze do hodowli tkankowej i przy użyciu sterylnych technik należy przygotować roztwory prekursorów hydrożelu odpowiednie do badania bezpośrednio przed dodaniem komórek. Przygotować żel PC-gel z prekursora polimeru w następujący sposób.
    1. Zmieszać proszek PEGDM z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,2) w stężeniu 10% (w/v).
    2. Dodać fotoinicjator (np. LAP) o końcowym stężeniu 0,005 - 0,01% (w/v) i wymieszać pipetując. Przykryj roztwór folią aluminiową lub osłonij przed światłem, ponieważ LAP jest wrażliwy na światło.
      Uwaga: W tym przypadku stosuje się macierz zewnątrzkomórkową TR-gel o zredukowanym czynniku wzrostu, zgodnie z dostawą producenta.

5. Zawiesina komórek w roztworach hydrożelowych

  1. W kapturze do hodowli tkankowej i przy użyciu sterylnych technik odessać pożywkę z dołków.
  2. Dodaj PBS do studzienek, a następnie wyjmij, aby dokładnie wypłukać przyczepione monowarstwy komórek.
  3. Oddzielić komórki od substratu hodowlanego, stosując 2 do 3 ml na 25cm2 roztworu do dysocjacji komórek. Delikatnie rozdrobnić, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10–20 minut lub do momentu dysocjacji. W razie potrzeby mocno postukaj w naczynie, aby usunąć komórki.
    Uwaga: Dostępne są alternatywne roztwory dysocjacji komórek, których wybór jest ograniczony do tych, które nie wpływają na analizowany szlak sygnałowy poprzez rozszczepianie receptorów będących przedmiotem zainteresowania.
  4. Po odłączeniu komórek dodać 2 ml pożywki wolnej od fenolu i surowicy, zawiesić komórki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Uwaga: Można również stosować chemicznie zdefiniowaną pożywkę wolną z surowicy (np. uzupełnioną insuliną, transferyną i selenem).
  5. Podwielokrotnić żądaną liczbę komórek w zależności od typu komórek do sterylnych fiolek i osadów (np. 2,0 x 106 komórek w fiolce).
  6. Usunąć supernatant, dodać żądaną objętość prekursora hydrożelu i zawiesić komórki przez pipetowanie. Użyj objętości prekursora, która da 2 x 105 komórek/cm2 w płaszczyźnie xy, wizualizując oś z hydrożelu jako zapadniętego (np. 1,0 ml na fiolkę dla hydrożelu o grubości 1 mm zawierającego 2 x 106 komórek/ml). Uważaj, aby nie wytwarzać bąbelków.
    1. Szybko przejdź do następnego kroku, aby ograniczyć negatywny wpływ na żywotność komórek34.

6. Przygotowanie hydrożelu

  1. W kapturze do hodowli tkankowej i stosując sterylne techniki, dodać prekursor hydrożelu zawierający komórki do form odlewniczych przygotowanych w kroku 3 (np. 7,1 μl na 3 mm średnicy x 1 mm wysokości). Stwórz dodatkowy hydrożel, zgodnie z tymi samymi opisanymi metodami, aby użyć go do kalibracji systemu obrazowania mikroskopu i kalibracji sondy (jeśli naturalna wydajność sondy jest nieznana).
  2. Odwirować przygotowany prekursor hydrożelu zawierający komórkę przed żelowaniem/sieciowaniem, aby zoptymalizować obrazowanie, ograniczając komórki do jednej płaszczyzny ogniskowej i minimalizując sygnał poza płaszczyzną (ryc. 1). Dostosuj czas i siłę wirowania do rodzaju komórki i lepkości prekursora (400 g przez 4 min).
  3. Żeluj lub sieciuj roztwór
    1. W przypadku hydrożelu PC-gel należy napromienić prekursor zawierający komórkę źródłem światła UV-A (λ = 365 nm) przez czas ekspozycji równy 3,2 J/cm2 o grubości milimetra na fotousieciowanie.
      Uwaga: W obliczeniach należy użyć minimalnej grubości 1 mm. Ekspozycje powinny mieścić się w zakresie 1-5 minut. Użyj minimalnego czasu naświetlania. Należy unikać nadmiernego napromieniania komórek, ponieważ zmniejszy to żywotność i wybieli dawcę CFP. Jednak czasy ekspozycji krótsze niż 60 s nie są zalecane, ponieważ napromieniowanie o dużej intensywności prowadzi do radykalnego samogaszenia i słabej żywotności komórek.
    2. W przypadku hydrożelu TR umieść wypełnioną formę na szalce Petriego i przenieś do inkubatora w celu termicznego żelowania. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Po zżelowaniu lub usieciowaniu hydrożelu należy wyjąć formę odlewniczą hydrożelu PDMS i zastąpić ją przygotowaną większą naczynią PDMS (od kroku 3.5). Dociśnij PDMS do szkła sterylną szpatułką, aby go przykleić.
    1. Umieść tę szalkę PDMS ze szkiełkiem nakrywkowym w sterylnym pojemniku, takim jak szalka Petriego. Dodaj pożywkę bez fenolu lub pożywkę zdefiniowaną chemicznie (pożywkę wolną od surowicy uzupełnioną insuliną, transferyną i selenem (krok 5.4)) do dołka utworzonego za pomocą szalki PDMS i szkiełka nakrywkowego, aby hydrożel był zanurzony. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      Uwaga: Jeśli używasz specjalistycznego naczynia z szkiełkiem nakrywkowym, umieść w nim szkiełko nakrywkowe i podobnie dodaj podłoże.
    2. Alternatywnie, wykonaj ten krok dzień przed obrazowaniem FRET, aby umożliwić sondom regenerację, gdy długości fal napromieniowania nakładają się na widmo wzbudzenia dawcy CFP.

7. 3D Obrazowanie FRET

  1. Wyjąć szalkę PDMS z hydrożelem z szalki Petriego, przygotowanej w kroku 6.4, i zabezpieczyć ją w regulowanym uchwycie na próbkę do stolika mikroskopu XY (Rysunek 2). Umieść uchwyt próbki na stoliku mikroskopu. W razie potrzeby nałóż olej na obiektyw. Użyj obiektywu o kącie co najmniej 40X i dużej aperturze numerycznej (NA) (tj. 1,3 NA), aby uchwycić stosunkowo słabe emisje fluoroforów.
  2. Skonfiguruj pola widzenia (FOV) do akwizycji obrazu: Wybierz komórki do obrazowania za pomocą obrazowania w świetle przechodzącym i zweryfikuj transfekcję za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Wybierz co najmniej 15 różnych komórek.
    1. Wybierz komórki, które nie są ani zbyt jasne, ani zbyt ciemne (co w przeciwnym razie mogłoby prowadzić do nadmiernego nasycenia sondy lub niskiej czułości) i o współczynniku FRET od 0,0 do 1,0 (co w przeciwnym razie wskazuje na uszkodzenie lub zanik sondy binarnej). Następnie wyłącz światło, aby ograniczyć ekspozycję.
    2. Wybierz pola widzenia blisko środka hydrożelu i z interesującymi komórkami w stosunkowo płaskim polu oświetlenia (patrz rysunek 3B i krok 9.2 poniżej).
  3. Skonfiguruj ustawienia kamery dla kanałów obrazu FRET. Wybierz jedną z kilku komórek w pobliżu środka pola widzenia, aby zoptymalizować "konfiguracje optyczne" (tj. ekspozycję i wzmocnienie na kanał obrazu).
    Uwaga: Poniższa nomenklatura różni się w zależności od oprogramowania używanego do obsługi mikroskopu i kamery. Oprogramowanie mikroskopowe NIS-Elements jest tutaj używane do przechwytywania i analizy obrazu.
    1. Do analizy FRET sond jednołańcuchowych należy wybrać dwa kanały obrazu na pole widzenia: Emisja wygaszona (QE), która jest emisją donorową przy wzbudzeniu donorowym i Emisja akceptora przy wzbudzeniu akceptora (Aem).
      Uwaga: W przypadku sondy ICUE1 CFP-YFP stosuje się parę filtrów wzbudzenia i emisji CFP dla QE (418 - 442 ex, 458 - 482 em) oraz pary wzbudzenia i emisji YFP dla Aem (490 - 510 ex, 520 - 550 em).
    2. Ustaw ekspozycję dla QE i AEM, aby uzyskać maksymalne natężenie sygnału bez nasycenia (a w przypadku korzystania z CCD, z minimalnym możliwym wzmocnieniem), aby zminimalizować szumy tła. Utrzymuj konfiguracje optyczne takie same dla obu fluoroforów i przez cały czas trwania eksperymentu, a także dla grup eksperymentalnych, aby uniknąć zniekształcania wyników (tj. mocy wzbudzenia, rozmiaru tęczówki, ekspozycji i wzmocnienia kamery) (Rysunek 3A).
    3. Pozyskaj dodatkowe kanały obrazu, aby umożliwić więcej opcji analizy po akwizycji (np. obrazowanie z korekcją emisji uczulonej (cSE) (patrz Dyskusja)). W przypadku sondy ICUE1 CFP-YFP należy uzyskać kanały wzbudzenia (Ex) i emisji (Em) konfiguracjidawcy Ex -dawcy Em (QE, wybierz CFP-CFP w oprogramowaniu mikroskopu), dawcy Ex- akceptora Em (SE, wybierz CFP-YFP),akceptora Ex -akceptora Em (Aem, wybierz YFP-YFP) iakceptora Ex -dawcy Em (YFP-CFP) (patrz rysunek 3A).
  4. Skonfiguruj szybkość przechwytywania dla akwizycji obrazu poklatkowego.
    1. Zmniejsz szybkość przechwytywania, jeśli jest ograniczona przez sprzęt. W przypadku testów krótkoterminowych (np. 30 - 60 min) należy oznaczyć około 12 akwizycji na minutę dla każdego pola widzenia (częstotliwość próbkowania 5 sekund), aby uchwycić kinetykę sygnalizacji. Użyj minimalnej częstotliwości próbkowania niezbędnej, aby uniknąć znacznego fotowybielania sondy.
    2. Ustaw szybkość akwizycji, wpisując częstotliwość przechwytywania w oprogramowaniu mikroskopu. W przypadku testów długoterminowych (np. 24-godzinnych) należy rozpocząć od wysokiej szybkości akwizycji, aby uchwycić początkową odpowiedź impulsową, a następnie przełącz się na niską szybkość akwizycji, np. co 5 do 10 minut.
  5. Wybierz "Uruchom teraz" w oprogramowaniu mikroskopu, aby rozpocząć akwizycję obrazu i rejestrować obrazy przez 5 minut, aby ustalić linię bazową dla odpowiedzi sondy w wyznaczonych polach widzenia.
  6. Po 5 minutach od uzyskania obrazu odpipetować żądany analit agonistyczny lub antagonistyczny (np. Forskolina przy 100 nM), wymieszać pipetując i kontynuować obrazowanie.

8. Kalibracja FRET

  1. Kalibracja systemu: Użyj dodatkowego hydrożelu kalibracyjnego, wyprodukowanego zgodnie z opisem w kroku 6, aby uzyskać obrazy Aem co najmniej 6 reprezentatywnych komórek przy użyciu tych samych kryteriów FOV, konfiguracji optycznych i ustawień kamery, które są używane do obrazowania FRET powyżej (kroki 7.1, 7.2 i 7.3).
    Uwaga: Kwantyfikacja wydajności kwantowej i czułości spektralnej (QS) dla połączonego systemu obrazowania sondy i mikroskopu jest potrzebna do "bezwzględnej" analizy FRET, ale nie do "względnej" FRET.
    1. Fotowybielaj fluorofor akceptorowy, wybierając 5-minutową ekspozycję na światło wzbudzenia o pełnej intensywności (wzbudzenie na kanale AEM). Użyj wąskiej przysłony, aby wybielić tylko interesujące Cię komórki. Sprawdź, czy sygnał Aem jest co najmniej o 10% niższy niż oryginalny sygnał, porównując histogram intensywności sygnału (okno "LUT") przed i po fotowybielaniu. Kontynuuj fotowybielanie, jeśli utrata sygnału jest mniejsza niż 90%.
      Uwaga: Upewnij się, że fluorofor dawcy nie jest wybielany podczas tej procedury, używając filtrów wzbudzenia AEM, które nie pokrywają się ze spektrum wzbudzenia dawcy.
    2. Uzyskaj emisję donorową pod wpływem wzbudzenia dawcy za pomocą teraz wybielonego fluoroforu akceptorowego (Dem) przy użyciu tej samej konfiguracji optycznej, co w przypadku luzowania ilościowego w kroku 7.3.
    3. Oblicz QS na piksel jako Dem podzielone przez Aem po korekcji tła, jak w sekcji 9 poniżej. QS = Dem/Aem
    4. Oblicz średni QS wśród komórek na podstawie średnich komórkowych.
  2. Oszacuj wewnętrzną wydajność FRET sondy (Ei) przy użyciu próbki kalibracyjnej. Wywołać maksymalny próg sondy i obliczyć Ei = 1 - QE/(Aem x QS) jak w sekcji 9 poniżej. Alternatywnie można użyć Ei = cSE/Aem lub Ei obliczonego przy użyciu konwencjonalnego testu punktu końcowego dla wydajności FRET z Ei = 1 - (QE/Dem).
    Uwaga: Ei jest potrzebne do ilościowego określenia bezwzględnej frakcji aktywowanych sond (FAP, tj. frakcja sond wiążących analit), ale nie jest konieczne do "względnej" analizy FRET.
    1. Nasycić odpowiedź sondy, stymulując kulturę agonistą produkcji/aktywacji analitu dla sond, które zwiększają FRET po interakcji z analitem.
    2. Zahamuj interakcję sondy z analitem za pomocą antagonisty sygnalizacji dla sond, które zmniejszają FRET po związaniu analitu. Uwaga: W przypadku sondy ICUE1 należy stłumić poziomy cAMP za pomocą inhibitorów cyklazy adenylowej, takich jak 2′,5′-dideoksyadenozyna (swoista) lub 3-izobutylo-metyloksantyna (nieswoista).

9. Obliczanie współczynnika FRET

  1. Narysuj i wyznacz jeden obszar zainteresowania (ROI) na pole widzenia w pobliżu komórek, aby zdefiniować poziom tła (rysunek 3B) w każdym polu widzenia w czasie, ale ogranicz obszar zainteresowania do obszaru względnie jednorodnego oświetlenia nad środkiem obrazu (rysunek 4A). Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać wyjaśnienie opcji korekcji tła.
    1. Za pomocą oprogramowania mikroskopu: Wybierz strzałkę na "Ikonie ROI tła" i wybierz "Narysuj eliptyczne tło ROI" (inne kształty będą działać). Upewnij się, że wybrano opcję "Kontynuuj aktualizację przesunięcia tła". Aktywuj wyświetlanie zwrotu z inwestycji w tle, klikając ikonę ROI w tle. Alternatywnie użyj "Ikony ROI" i właściwości ROI ustawionych jako "Użyj jako ROI w tle" i "ROI są różne w każdym wielopunkcie".
    2. Z ImageJ: Użyj paska narzędzi, aby wybrać narzędzie do rysowania kołowego. Następnie dodaj kształt do menedżera ROI za pomocą menu "Analizuj→ Narzędzia→ Menedżer ROI". W razie potrzeby ustaw inny kolor tła ROI w Menedżerze ROI.
    3. Dla każdego kanału FOV i obrazu (np. QE i Aem) odejmij średnią wartość ROI w tle na punkt czasowy, aby utworzyć poprawiony obraz na kanał, np. sQEt,p = QEt,p - bQEt,p gdzie t to czas akwizycji, p to FOV (tj. pozycja xy), a bQE i bAem to wartości skalarne sygnału w tle ROI. Korzystaj z funkcji arytmetyki obrazu dostępnych w oprogramowaniu.
      1. W oprogramowaniu mikroskopu użyj "Ikony tła ROI" i wybierz "Odejmij tło za pomocą ROI". W wyskakującym okienku wybierz "Każdy obraz" w sekcji "Odejmij ROI tła wł." i wybierz "Wszystkie ramki" w sekcji "Zastosuj do".
        Uwaga: Aby ta funkcja działała poprawnie, w każdym polu widzenia musi być zdefiniowany zwrot z inwestycji w tle (np. funkcja nie odejmuje prawidłowo tła dla pola widzenia z ruchami w tle, jeśli niektóre pola widzenia mają niezdefiniowane obszary zwrotu w tle).
      2. W przypadku ImageJ użyj makra "BG Odejmowanie od ROI" napisanego przez Michaela Cammera (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. Zapisz poprawione szeregi czasowe obrazów, wybierając opcję "Zapisz jako" dla poniższych kroków analizy.
  2. Zdefiniuj ROI wokół komórki za pomocą maski binarnej dla każdej analizowanej komórki w każdym polu widzenia (Rysunek 4B). Użyj kanału AEM, aby określić próg obrazu dla pola widzenia na początku eksperymentu, zidentyfikować granice komórek i zdefiniować zwrot z inwestycji. Zapisz zwrot z inwestycji.
    1. Z oprogramowaniem mikroskopu: Dla każdej klatki (tj. FOV) najpierw użyj menu "Binarny→ Zdefiniuj próg" i wybierz "zastosuj do bieżącej klatki". Dostosuj dolną wartość progową, aby zaznaczyć komórki. Następnie użyj funkcji "Binary→ Close", aby w razie potrzeby wypełnić w masce binarnej. Następnie użyj ikony ROI, aby wybrać "Kopiuj plik binarny do ROI"; Warstwa binarna zostanie automatycznie usunięta.
      1. Dołączaj ROI dla kolejnych ramek do istniejącej puli ROI. Usuń wszelkie fałszywe zwroty akcji. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy ROI i upewnij się, że ich właściwości to "Użyj jako standardowego ROI" i "ROI są różne w każdym wielopunkcie".
      2. Z ImageJ: Dla każdego pola widzenia najpierw użyj menu "Image→ Adjust→ Threshold". Następnie użyj opcji "Analizuj→ Analizuj cząstki" z zaznaczonymi opcjami Pokaż kontury i Dodaj do menedżera. Użyj opcji "Binary→ Close", aby wypełnić "" w masce binarnej, jeśli to konieczne. Usuń fałszywe zwroty akcji. Dostępne są darmowe wtyczki, które pozwalają zautomatyzować ten proces.
  3. Oblicz współczynnik FRET oparty na QE dla każdego piksela, sQE/sAem dla analizy względnej (patrz krok 10) i EQE = sQE/(QS x sAem) dla analizy bezwzględnej (patrz krok 10) przy QS uzyskanym w kroku 8.1. Użyj zmiennoprzecinkowego podziału obrazów. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać wyjaśnienie pochodnych stosunków.
    1. Za pomocą oprogramowania mikroskopu: Użyj menu "Obraz →Operacje na obrazie" i wybierz "Zmiennoprzecinkowy".
    2. Z ImageJ: Użyj funkcji "Process →Image Calculator" lub wtyczki "Calculator_Plus.java". Uwaga: Alternatywnie makro "pH_ratioMacro".txt" można dostosować do obliczania współczynników FRET. Wykorzystuje makro korekcji tła opisane powyżej i jest dostępne pod adresem
  4. Eksportuj średni stosunek na komórkę (tj. na zwrot z inwestycji) do arkusza kalkulacyjnego i oprogramowania do tworzenia wykresów.
    1. Z oprogramowaniem mikroskopowym: Użyj przycisku eksportu ND w kontrolce analizy "Statystyki ROI" lub przycisku "Eksport arkusza kalkulacyjnego" w kontrolce analizy "Analiza czasowa".
    2. Z ImageJ: Najpierw wybierz menu "Analizuj →Ustaw pomiary" i upewnij się, że wybrano "Wartość średnią" i "Odchylenie standardowe". Następnie skorzystaj z Menedżera ROI i wybierz przycisk "Zmierz". Zapisz wygenerowane okno wyników.

10. Analiza współczynnika FRET

  1. Oblicz średni współczynnik FRET w komórkach w czasie na podstawie średnich współczynników na komórkę (wyeksportowanych w kroku 9.4). W tym obliczeniu należy wziąć pod uwagę podstawowe współczynniki FRET (stosunek przed podaniem analitu).
    Uwaga: Arkusz kalkulacyjny i oprogramowanie do tworzenia wykresów służy tutaj do wykreślania średnich współczynników FRET odjętych od linii bazowej i ich błędu standardowego średniej (SEM) przy użyciu regresji liniowej na linii bazowej, jak w krokach 10.1.2 i 10.1.3 poniżej (rysunki 5 i 6).
    1. Analiza względna (wielkość odpowiedzi): Znormalizuj każdą krzywą do wspólnej próbki referencyjnej (np. próbki niepoddanej działaniu substancji).
    2. Analiza bezwzględna (przebieg czasowy reakcji): Przesuń krzywe do wspólnego punktu początkowego, normalizując każdą krzywą za pomocą jej podstawowego współczynnika FRET.
      1. W arkuszu kalkulacyjnym i oprogramowaniu do tworzenia wykresów przeplataj dane (kolumny średnich stosunków na komórkę) z nowymi kolumnami, tak aby każda oryginalna kolumna została sparowana z nową kolumną zawierającą tylko dane dotyczące współczynników dla okresu bazowego (współczynniki przed dodaniem analitu). Wybierz "Wstaw kolumnę", aby wstawić pustą kolumnę po każdej kolumnie danych. Następnie skopiuj dane punktu odniesienia do sparowanych pustych kolumn.
      2. W arkuszu kalkulacyjnym i oprogramowaniu do tworzenia wykresów wybierz "Wstaw → nową analizę → Przekształć usuń linię bazową", a następnie ustaw "Wybraną kolumnę" na "co drugą", wybierz "załóżmy, że linia bazowa jest liniowa" i wybierz "Różnica" w sekcji "Obliczenia".
      3. Oblicz średni stosunek komórkowy i statystyki opisowe. W arkuszu kalkulacyjnym i oprogramowaniu do tworzenia wykresów wybierz "Wstaw → nową analizę → analiz XY → średnich wierszy z SD lub SEM", a następnie wybierz "Średnie wierszy z SEM" w wyskakującym okienku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prekursory hydrożelu, komórki i formy odlewnicze zostały przygotowane w sposób opisany powyżej. Roztwory prekursorów obciążone komórkami odlewano w formach PDMS, a następnie odwirowywano przed żelowaniem/fotosieciowaniem w celu unieruchomienia komórek w pobliżu szkiełka nakrywkowego i ułatwienia analizy obrazowania FRET (ryc. 1). Hydrożele z dołączonymi szkiełkami nakrywkowymi umieszczono w przygotowanych studzienkach obrazowych PDMS do obrazowania mikroskopowego (ryc. 2). Konfiguracje optyczne i parametry akwizycji obrazu zostały następnie ustawione tak, jak pokazano na rysunku 3A. Pokazano przechwytywanie wszystkich czterech kanałów obrazu związanych z FRET dla par fluoroforów CFP-YFP (patrz "Konfiguracja optyczna" na rysunku 3), tak jak jest to potrzebne dla sond niebinarnych. Jednak w tej pracy wymagane są tylko dwa obrazy dla jednołańcuchowej sondy binarnej ICUE1, QE = "CFP CFP" i Aem = "YFP YFP" (emisja wzbudzenia). Wybrano wiele FOV (pozycje xy), w których kilka komórek znajdowało się w jednorodnym obszarze oświetlenia (ryc. 3B). Po akwizycji poklatkowej dane sygnału dla sondy zostały wyeksportowane. Zwroty z inwestycji dla korekcji tła sygnałów kanałowych i dla analizy komórek zostały wyznaczone przy użyciu progowych obrazów Aem od początku eksperymentów (Rysunek 4). Komórki zostały wybrane z puli komórek jako te, które wyrażają wystarczającą (nie za słabą), ale nie za wysoką (nadmiernie jasną) sondę (Figura 4B). Współczynniki QE i SE FRET na piksel przy każdej akwizycji zostały obliczone przy użyciu zmiennoprzecinkowego podziału kanałów obrazu odjętego tła. Średni stosunek FRET na komórkę (tj. na ROI) został obliczony, znormalizowany do sygnału linii podstawowej przed stymulacją (tj. regresja na linii podstawowej odjęta od wszystkich punktów czasowych) i wykreślony ze słupkami błędów jako błąd standardowy średniej (SEM). Zarówno współczynniki FRET oparte na QE, jak i cSE wykrywają zwiększoną aktywność cAMP w chondrocytach pod wpływem stymulacji forskoliną (100 nM, ryc. 5). Współczynnik QE FRET był bardziej wrażliwy na korekcję tła niż współczynnik cSE FRET, ponieważ sygnał QE był niższy ze względu na niski podstawowy poziom aktywności cAMP w chondrocytach osadzonych w hydrożelach. Oba typy hydrożelu (TR-żel i PC-żel) wykazały wzrost współczynnika FRET w czasie (Figura 6), co wskazuje na zwiększoną odpowiedź sygnalizacyjną cAMP na dodanie forskoliny. Jak wskazuje stosunek QE FRET, chondrocyty w hydrożelach PC-gel wykazują większą zmianę cAMP (pokazano) i wyższy podstawowy poziom cAMP (EQE = 0,19 w PC-żelu vs. EQE = 0,09 w TR-żelu, nie pokazano na odjętym rysunku wyjściowym).

figure-results-1
Rysunek 1: Rozmieszczenie komórek w fotousieciowanym hydrożelu (PC-gel)
Odp .: Prekursor hydrożelu obciążony komórkami odwirowano, aby zmaksymalizować liczbę komórek w płaszczyźnie ogniskowej w pobliżu szkiełka nakrywkowego. B: Zwiększa to liczbę komórek w polu widzenia i minimalizuje sygnał tła z komórek poza płaszczyzną. (Podziałka = 200 μm) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Hydrożel w naczyniu PDMS
Hydrożel umieszczono w wysokiej studzience PDMS (10x objętość hydrożelu) z podstawą szkiełka nakrywkowego do obrazowania mikroskopowego i stymulacji analitu. Hydrożele PC-gel są przezroczyste i połączone ze szkiełkiem nakrywkowym, dzięki czemu pozostają na swoim miejscu przez cały czas trwania testu. Studzienka PDMS może być większa, aby pomieścić 10 razy więcej pożywki niż objętość hydrożelu, używając szerszego stempla biopsyjnego oprócz grubszego arkusza PDMS. (Podziałka = 2 mm) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Konfiguracja akwizycji dla obrazowania FRET
O: Akwizycja została skonfigurowana do przechwytywania obrazu co 7 sekund w wielu lokalizacjach. Do obliczenia współczynnika QE FRET potrzebne są tylko dwa kanały obrazu dla używanej tutaj sondy ICUE1 (binarna sonda jednołańcuchowa), QE = "CFP CFP" i Aem = "YFP YFP" (emisja wzbudzenia) pod kolumną "Optical Conf." w zakładce λ oprogramowania mikroskopu. B: Wybrano pola widzenia (pozycje "XY"), w których kilka komórek znajdowało się w jednorodnym obszarze oświetlenia. Wykres pod obrazem pokazuje intensywność oświetlenia wzdłuż niebieskiej linii z strzałką, która przechodzi przez środek pola widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wybór ROI dla analizy obrazowania FRET
O: Wybrano obszar zainteresowania (ROI) wolny od komórek, aby skorygować sygnał tła na każdym kanale. Obraz hydrożelu bezkomórkowego może być zamiast tego wykorzystany do odejmowania tła, jeśli gęstość komórek lub migracja są wysokie, lub jeśli maska cieniująca nie jest używana, gdy komórki nie leżą w jednorodnym polu oświetlenia. B: Zwrot z inwestycji komórki został wybrany przy użyciu progowania obrazu i binarnego maskowania kanału AEM. Wybranie zwrotu z inwestycji większego niż komórki wpłynie niekorzystnie na obliczenie średniego współczynnika FRET na komórkę ze względu na uwzględnienie proporcji zewnątrzkomórkowych generowanych przez szum tła. Obliczanie współczynnika komórkowego FRET przy użyciu średniej każdego kanału na komórkę nie jest zalecane, ponieważ zaniża to stosunek. (Podziałka = 50 μm) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Porównanie współczynników FRET w termoczułym hydrożelu (TR-gel)
Zarówno współczynniki FRET oparte na QE, jak i SE wykrywają zwiększoną aktywność cAMP w chondrocytach pod wpływem stymulacji forskoliny. Forskolina jest agonistą cyklazy adenylowej, która indukuje produkcję cAMP. FRET zmniejsza się, gdy sonda ICUE1 wiąże cAMP, a zatem współczynnik QE FRET (EQE = sQE/(sAem x QS)) wzrasta. I odwrotnie, stosunek SE FRET maleje i jest zatem wykreślany jako ESE = 1 - cSE/sAem. W chondrocytach osadzonych w hydrożelu stosunek QE FRET jest bardziej wrażliwy na korekcję tła niż stosunek SE FRET, ponieważ sygnał QE jest niski ze względu na niską podstawową aktywność cAMP. Słupki błędów = SEM, n = 25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Porównanie współczynnika FRET w różnych hydrożelach
Chondrocyty w obu typach hydrożelu zareagowały na stymulację forskoliną wzrostem aktywności cAMP, o czym świadczy zwiększony współczynnik QE FRET w czasie. Typ hydrożelu wpływa na odpowiedź komórkową poprzez kilka efektów, w tym różnice w przepuszczalności forskoliny i podstawowej aktywności komórkowej cAMP (EQE = 0,19 w PC-żelu vs. EQE = 0,09 w TR-żelu, nie pokazano). Słupki błędów = SEM, n dla TR-żel = 25, n dla PC-żel = 15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta pokazuje, w jaki sposób obrazowanie FRET może być wykorzystane do analizy sygnalizacji komórkowej w hydrożelach 3D. Podczas gdy wcześniejsze badania wykazały obrazowanie FRET komórek wysianych na podłożach hydrożelowych35-37, interakcji zewnątrzkomórkowych z hydrożelami38 oraz cząsteczek uwięzionych w hydrożelach39-41, jest to pierwsza publikacja opisująca analizę wewnątrzkomórkową opartą na obrazowaniu FRET komórek osadzonych w hydrożelach 3D. Praca rozwiązuje kilka problemów związanych z implementacją obrazowania FRET z 2D do 3D. Po pierwsze, obiektywy o dużej aperturze numerycznej są potrzebne do obrazowania FRET, aby zebrać wystarczający sygnał emisji, ale ograniczają one głębię ostrości. Komórki w tym miejscu mogą lekko osiąść poprzez wirowanie, aby zwiększyć liczbę komórek w płaszczyźnie ogniskowej w pobliżu szkła, aby to skompensować. Po drugie, rusztowania hydrożelowe 3D mogą dryfować w polu widzenia podczas obrazowania, co komplikuje analizę. Hydrożele w tym miejscu są przyklejane do szkiełka nakrywkowego, dzięki czemu pozostają utrwalone przez cały czas trwania eksperymentu. Po trzecie, dobór odpowiednich kompozycji hydrożelowych do 3D FRET jest niezbędny, ponieważ hydrożele mogą utrudniać wizualizację komórek. Tutaj stosuje się przezroczyste hydrożele PC-gel i TR-gel. Jednak zebranie komórek za pomocą wirowania do płaszczyzny ogniskowej w pobliżu szkiełka nakrywkowego można wykorzystać do obrazowania komórek w hydrożelach o większej dyfrakcji. Wybór hydrożelu zależy od warunków mikrośrodowiskowych, które należy zasymulować, które można znaleźć w przeglądzie hydrożeli42. Po czwarte, zastosowano alternatywne obliczenia dla współczynnika FRET jednołańcuchowej sondy ICUE1 (tj. EQE = QE/cAem) w celu zminimalizowania liczby kanałów obrazu wymaganych do analizy, a tym samym zminimalizowania fotowybielania. Średni współczynnik FRET na komórkę jest obliczany jako średnia współczynników na piksel w komórce, aby zminimalizować niedoszacowanie rzeczywistego współczynnika FRET. Na koniec opisano liniową analizę ratiometryczną i sposoby obliczania aktywowanej frakcji jednołańcuchowych sond binarnych.

Istnieje kilka krytycznych aspektów przeprowadzania udanych eksperymentów FRET przy użyciu mikroskopii szerokokątnej. Jeśli chodzi o sprzęt, kamera musi być wystarczająco czuła, aby wykryć niewielkie zmiany sygnału, co sprawia, że nowsze naukowe kamery CMOS i przetworniki CCD zwielokrotniające elektrony są lepiej przystosowane niż konwencjonalne CCD. Aby jak najlepiej przeanalizować rozkład przestrzenny współczynnika FRET, kamera musi mieć co najmniej dwukrotnie większą rozdzielczość przestrzenną niż funkcja rozrzutu punktów obiektywu (kryterium Nyquista). To sprawia, że systemy z podwójnym widokiem są mniej odpowiednie do tego zadania. Bardziej istotne jest dobranie odpowiedniej ekspozycji i szybkości akwizycji obrazu dla danej pary FRET, aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforów. Zaleca się zmniejszenie współczynnika pozyskiwania wraz ze wzrostem czasu trwania eksperymentu. Zastosowanie szybkich kół filtrów zwiększa szybkość akwizycji i liczbę pól widzenia do analizy, jednocześnie unikając problemów z rejestracją obrazu w przypadku modułów filtrów z podwójnym widokiem i głowicą rewolwerową. Niejednorodne pole oświetlenia komplikuje korekcję fluorescencji tła, która powstaje w wyniku autofluorescencji próbki i szumu systemu kamery. Niektóre hydrożele, szczególnie te zawierające białka kolagenowe, są wysoce autofluorescencyjne43,44. Współczynniki FRET są niedoszacowane bez korekty tła. W tym przypadku stosujemy prostą metodę korekcji tła, która opiera się na stosunkowo płaskim polu oświetlenia, które często można skonfigurować z oświetleniem epi-fluorescencyjnym nad środkiem obrazu (Rysunek 3B, Krok 7.2). W związku z tym ta metoda ogranicza interesujące komórki do tych, które znajdują się w tym polu oświetlenia. Opisana tutaj korekcja tła nie uwzględnia autofluorescencji komórkowej w długościach fal odczytywanych dla sondy binarnej. W takim przypadku nieznakowane komórki (bez transfekcji sondą) powinny być obrazowane w tych samych warunkach i odjęte tło. Można użyć kombinacji komórek oznaczonych i nieoznaczonych, a komórki nieoznaczone wybrać do zwrotu z inwestycji w tle. Alternatywne metody, które zapewniają analizę komórek na całym polu obrazu, obejmują użycie maski cieniującej, wielu zwrotów z inwestycji w tle lub identycznych próbek bez komórek, a protokół jest dostępny na żądanie.

Specyficzna dla obrazowania 3D FRET, odpowiedź sondy jest bardzo wrażliwa na przepuszczalność hydrożelu dla analitu (ryc. 6). W związku z tym te same regiony hydrożelu są porównywane w różnych zabiegach eksperymentalnych, najlepiej w punkcie symetrii geometrycznej, takim jak w pobliżu środka rusztowania, jak to jest tutaj stosowane. Alternatywnie, komory mikroprzepływowe/bioreaktory mogą być stosowane do szybkiego i równomiernego perfuzji hydrożelu z roztworem analitu45. Sygnał FRET może nie zostać wykryty (stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski), gdy autofluorescencja hydrożelu jest zbyt wysoka; Należy użyć cieńszego hydrożelu lub innej sondy (różne fluorofory). W odniesieniu do obrazowania 3D FRET w hydrożelach usieciowanych foto, zaleca się stosowanie minimalnej ekspozycji na promieniowanie i długości fal poza widmami wzbudzenia fluoroforów sondy. LAP może być używany z widzialnym źródłem światła o długości fali 405 nm, aby jeszcze bardziej zminimalizować potencjalne uszkodzenie komórek31,46. Zaleca się jednak stosowanie LAP z promieniowaniem 365 nm, ponieważ minimalizuje to bielenie sondy. 365 nm leży na końcu widma wzbudzenia dawcy CFP, podczas gdy 405 nm leży na szczycie wzbudzenia. Alternatywnie, ekspresja sondy może zostać odzyskana przez jeden dzień. Zastosowanie sond binarnych minimalizuje problemy związane z wrażliwością na różnice w poziomach ekspresji oraz w dyfuzji molekularnej fluoroforów donorowych i akceptorowych. Można stosować sondy niebinarne, ale z obrazowaniem SE zamiast QE i dodatkową korekcją na przebijanie widmowe widm wzbudzenia i emisji (patrz poniżej). Ponadto przeszkodą może być niska dostępność komercyjna i złożoność projektowania sond FRET. Najważniejszym czynnikiem decydującym o udanym eksperymencie pozostaje właściwa korekcja i analiza sygnałów fluorescencyjnych.

Alternatywne obliczenie współczynnika FRET jest wykorzystywane z kilku dodatkowych powodów, oprócz minimalizacji fotowybielania. W przypadku binarnych sond jednołańcuchowych powszechnie podawanym stosunkiem jest emisja akceptorowa pod wzbudzeniem donora (emisja uczulona, SE) do emisji donorowej pod wzbudzeniem donorowym (emisja wygaszona, QE), tj. stosunek FRET = SE/QE25,47,48. SE/QE jest nieliniowe w stosunku do zmian wydajności FRET21,22,47. Mianowicie, stosunek ten ma wykładniczo nieliniowy związek z wrodzoną wydajnością FRET sondy (Ei) (Donius, AE, Taboas, J. M. niepublikowana praca. (2015))), przy czym stosunek najbardziej liniowy dla Ei jest mniejszy niż około 15% . SE/QE będzie również niedoszacowywać frakcję aktywowanych sond (FAP , czyli frakcja sond wiążących analit). W związku z tym analiza SE/QE wymaga kłopotliwego badania równowagowej odpowiedzi na dawkę i dopasowania krzywej. Na szczęście stosunki SE lub QE do emisji akceptora pod wzbudzeniem akceptorowym (Aem) są liniowe względem Ei i FAP, czyli współczynników FRET SE/Aem i QE/Aem. SE / Aem jest często używany w sondach binarnych i wymaga jedynie kalibracji punktu końcowego (przy braku aktywności sondy i pełnej aktywności sondy), ale podstawowa sygnalizacja komórkowa utrudnia to. Aby wyeliminować potrzebę kalibracji punktu końcowego, SE można skorygować (cSE) pod kątem nakładania się widmowego widm wzbudzenia i emisji donorów i akceptorów (przebijanie spektralne) oraz pod kątem wydajności kwantowej i czułości spektralnej (QS) połączonego systemu obrazowania fluoroforów sondy i mikroskopu. Skorygowany współczynnik SE FRET oparty na cSE określa obserwowaną wydajność FRET sond w każdym pikselu obrazu, tj. ESE = cSE/Aem. Dostępne jest komercyjne i wolne oprogramowanie, które koryguje SE dla tych efektów, a czytelnik jest odsyłany do pracy Chena i Periasamy 2006 w celu szczegółowego wyjaśnienia metod50. Jednak obliczenie ESE wymaga uchwycenia trzech kanałów obrazu na punkt czasowy (SE, QE, Aem). Dlatego w tej pracy stosujemy również alternatywny stosunek FRET EQE = 1 - QE/cAem, który wymaga uchwycenia tylko dwóch kanałów obrazu (QE i Aem). Obliczenie EQE z tych kanałów wymaga jedynie skorygowania Aem dla QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem/Aem można łatwo oszacować za pomocą dwóch obrazów z jednej próbki kalibracyjnej, gdzie Dem jest emisją donora pod wzbudzeniem donorowym z bielonym akceptorem. FAP w dowolnym momencie można obliczyć, porównując E,SE lub EQE z Ei sondy.

Ostatecznie, wybór współczynnika FRET (ESE = cSE/Aem vs. EQE = QE/cAem) powinien opierać się na rozważeniu typu sondy i kanałów o najlepszym sygnale. Oba podejścia obejmują korekcję szumu tła obrazów na klatkę, jak opisano powyżej, w celu uwzględnienia zmian autofluorescencji w czasie. Zakładają one, że światło wzbudzenia Aem nie nakłada się na widmo wzbudzenia Dem, co często ma miejsce ze względu na konstrukcję sondy i konfigurację filtra mikroskopu. Sondy jednołańcuchowe mogą korzystać z jednego z nich, a wybór opiera się na najlepszym sygnale sondy (jasności), szumie kamery i sygnale tła na kanałach SE i QE. Dla sondy ICUE1 i zastosowanych tu warunków eksperymentalnych (typy ogniw i hydrożeli), SE ma silniejszy sygnał niż QE. Sondy dwułańcuchowe wymagają użycia ESE ze względu na nierównomolowy rozkład fluoroforów donorowych i akceptorowych. W przypadku sond, które zmniejszają FRET po związaniu analitu, takich jak ICUE1, wydajność FRET można "odwrócić", aby przedstawić dodatnią zmianę sygnalizacyjną po związaniu analitu, tak jak robimy to tutaj, gdzie ESE = 1 - cSE / Aem lub EQE = QE / (Aem x QS).

Analiza FAP jest wrażliwa na prawidłową korektę współczynników FRET oraz na oszacowanie Ei. Można go oszacować za pomocą tej samej próbki kalibracyjnej, która jest używana do QS i konwencjonalnego testu skuteczności FRET w punkcie końcowym, jako Ei = 1-(QE/Dem) (obraz QE, po którym następuje fotowybielanie akceptorowe i obraz Dem)28, ale należy zachować ostrożność, aby zminimalizować przypadkowe wybielanie dawcy. Opisujemy zmodyfikowaną wersję, w której podstawia się oszacowanie Dem na podstawie Aem skorygowane o QS, tj. Ei = 1 - (QE/(Aem x QS)). Alternatywnie można użyć Ei = cSE/Aem. Oszacowanie Ei w żywych komórkach wymaga, aby wszystkie sondy były doprowadzone do pełnego FRET. Jest to trudne do osiągnięcia w praktyce w przypadku sond, takich jak ICUE1, które zmniejszają FRET po związaniu analitu. Obliczanie Ei na podstawie in vitro przy użyciu lizatów komórkowych i oczyszczonego analitu jest najlepsze, ale wykracza poza zakres tej pracy. Tutaj zalecamy stosowanie 2′,5′-Dideoksyadenozyny w celu zmniejszenia cAMP w komórkach. Jednak względny FAP można obliczyć przy użyciu oszacowania Ei wyprowadzonego na podstawie podstawowego poziomu sygnalizacji. Z tych powodów w badaniach najczęściej podaje się współczynnik FRET (jak to zrobiono tutaj) lub względny FAP oparty na kalibracji punktu końcowego, gdzie linia bazowa sygnalizacji przed dodaniem agonisty jest dolną granicą, a sygnał po dodaniu drugiego agonisty, który nasyca sygnalizację, jest górną granicą. Forskolina jest często stosowana jako agonista kontroli do nasycenia sygnału cAMP. Alternatywnie można zastosować analog cAMP, taki jak 8-bromoadenozyno-3',5'-cykliczny monofosforan. Zaleca się stosowanie kontroli pozytywnych po zakończeniu badań w celu zidentyfikowania potencjalnych zmian w szlaku sygnałowym między eksperymentalnymi terapiami.

Obliczanie średniej odpowiedzi sygnalizacyjnej na komórkę wymaga uwzględnienia kilku czynników. Po pierwsze, średni współczynnik FRET powinien być obliczany jako średnia proporcji dla każdego piksela w komórce, tj. (∑(QE⁄cAem))/(liczba pikseli), a nie stosunek średniego QE i Aem w komórce, tj. (∑QE)⁄(∑cAem). Chociaż ten ostatni nie wymaga starannego maskowania, ponieważ szum tła jest niski, poważnie zaniża prawdziwy średni współczynnik FRET. Jednak proporcje pikseli wymagają obliczeń zmiennoprzecinkowych i starannego binarnego maskowania obszaru komórki w celu zdefiniowania ROI i uniknięcia uwzględniania fałszywych proporcji generowanych przez szum tła na zewnątrz komórki. Cała powierzchnia komórki musi być określona ilościowo, aby uniknąć stronniczości wyników w odniesieniu do kształtu komórki. Maskowanie może z czasem wymagać ponownego zdefiniowania w zależności od zmian w kształcie komórki i migracji. Alternatywnie, ROI większe niż komórka mogą być używane, jeśli kryteria wykluczenia są zdefiniowane w celu usunięcia proporcji pikseli z sygnałów QE i AEM, które spadają znacznie poniżej poziomów komórkowych i są bliskie poziomom tła. Opisane metody analizy szczegółowo opisują podstawowe kroki stosowane w tej pracy dla analizy FRET bez specjalistycznego oprogramowania/wtyczek. Producenci mikroskopów i inni dostawcy sprzedają moduły dodatkowe do swojego oprogramowania mikroskopowego, które obsługują zautomatyzowaną analizę ratiometryczną i FRET. Podobnie, oprogramowanie ImageJ w domenie publicznej ma kilka wtyczek dostępnych do analizy cząstek i FRET, takich jak RiFRET. Po drugie, średni współczynnik FRET oparty na pikselach zaniża rzeczywisty średni stosunek struktury komórkowej 3D, ponieważ używany jest obraz 2D. Sygnały 2D reprezentują i uśredniają wzdłuż osi z. Obliczanie rozkładu przestrzennego 3D współczynników FRET w żywych komórkach nie jest możliwe bez szybkiego obrazowania 3D (np. przy użyciu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem). Jest to problem zarówno w przypadku kultur 2D, jak i 3D, ale ma większy wpływ w 3D, ponieważ większa część struktury komórkowej znajduje się poza płaszczyzną. Jest to bardzo niepokojące w przypadku sond, które lokalizują się w strukturach komórkowych, takich jak sonda EPAC1 z błoną plazmatyczną PM-ICUE. Zobacz Spiering et al. 2013, aby uzyskać sugestie dotyczące korekty wpływu grubości komórek na obliczenia współczynnika24. Analiza rozkładu Aem może być wykorzystana do wykrycia, czy sonda gromadzi się w obszarach komórki i dostosowanej płaszczyźnie obrazowania. Pomoże to również zinterpretować rozkład przestrzenny współczynników FRET i wyeliminować fałszywe wyniki, np. identyfikując nasycenie sondy (tj. region o niskim Aem będzie miał niskie stężenie sondy i może wykazywać nasycenie sondy i wysoki współczynnik FRET). Po trzecie, różne poziomy wyjściowe FRET mogą wskazywać na różnicę w wydajności transfekcji, ekspresji sondy lub podstawowej sygnalizacji między grupami eksperymentalnymi. "Analiza względna" (krok 10.1.1) pomaga usunąć dryft współczynnika FRET w czasie, jeśli występuje. Ułatwia to porównanie względnej wielkości odpowiedzi między próbami, ale utrudnia porównanie z przebiegiem czasowym odpowiedzi dla próby referencyjnej (wykres kontrolny jest płaską linią). "Analiza bezwzględna" (krok 10.1.2) ułatwia porównanie szybkości odpowiedzi między próbkami, ale utrudnia porównanie wielkości odpowiedzi, ponieważ każda linia jest skalowana przez niepodobną stałą. W badaniach często stosuje się regresję liniową na linii bazowej w celu skorygowania dryfu współczynnika FRET w czasie.

Opisana metoda 3D FRET jest użytecznym i praktycznym sposobem wytwarzania i wykonywania obrazowania poklatkowego hydrożeli 3D obciążonych komórkami, które można zastosować do innych sond i metod obrazowania. Inne systemy FRET poza jednołańcuchowymi sondami binarnymi będą wymagały bardziej złożonej korekcji sygnałów opartych na intensywności, jak omówiono powyżej. Alternatywnie, obrazowanie czasu życia fluorescencji FRET (FLIM-FRET) może być wykorzystane do obliczenia wydajności FRET poprzez zmianę czasu życia emisji donora sondy. W przeciwieństwie do FRET OPARTEGO NA INTENSYWNOŚCI, FLIM-FRET jest niewrażliwy na szum tła, przebijanie widma, wydajność kwantową i czułość spektralną detektora2. Jednak systemy FLIM są drogie, złożone i rzadkie, a najlepiej sprawdzają się z fluoroforami z pojedynczym rozpadem wykładniczym i bez spływu FLIM 49. Opisana metoda może być również stosowana z bardziej zaawansowanymi platformami mikroskopowymi (np. FRET-TIRF, anizotropia fluorescencji, korelacja spektralna FRET). Zastosowanie tej metody do obrazowania 3D za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej ułatwi analizę subkomórkowego rozkładu odpowiedzi sygnalizacyjnej i zwiększy dokładność analizy sygnalizacji. Ta metoda 3D FRET umożliwi zaawansowane badania biologii komórki w symulowanych mikrośrodowiskach komórkowych 3D. W związku z tym może być łatwo stosowany w farmakologii i medycynie regeneracyjnej, w tym w badaniu sygnalizacji międzykomórkowej i przesiewowej odpowiedzi na leki w zmodyfikowanych mikrotkankach na bazie hydrożelu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe Szkoły Medycyny Stomatologicznej Uniwersytetu w Pittsburghu, nagrodę National Institutes of Health AR062598 oraz przyznanie P30 DE030740. Autorzy dziękują również dr Jin Zhangowi za plazmid ICUE1, Wayne'owi Rasbandowi za opracowanie ImageJ i Michaelowi Cammerowi za makro ImageJ.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polidimetylosiloksan (PDMS) [Zestaw elastomerów Sylgard 184]Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)NC0162601Odczynniki
Dimetakrylan glikolu polietylenowego (PEGDM)Przygotowany zgodnie z Lin-Gibson z PEG z Sigma Aldrich95904Odczynniki
3-(Trimetoksysililo)propylu MetakrylanSigma AldrichM6514Odczynniki
3- glicydoksypropylotrimetoksysilanSigmaAldrich 440167Odczynniki
DimetylofenylofosfonitSigma Aldrich149470-5g
Odczynniki Chlorek 2,4,6-trimetylobenzoiluOdczynniki Fisher ScientificAC244280100
2-butanoneFisher ScientificAC149670010Odczynniki
Bromek lituFisher ScientificAC199871000Odczynniki
IsopropanolSigma Aldrich190764Odczynniki
Sigmacote (odczynnik silikonowyzujący)Odczynniki Sigma AldrichSL2
Toluen Odczynniki Fisher ScientificAC36441-0010
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Odczynnikido SH3025601hyklonów
Opti-MEM Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowej (pożywka wolna od fenoli i surowicy)Odczynniki Life Technologies11058-021
Odczynnik do transfekcji FuGENE HD (odczynnik do transfekcji)Odczynniki PromegaE2311
Cellstripper (komórka roztwór dysocjacyjny)Odczynniki Corning25-056-CI
Czynnik wzrostu Zredukowany Matrigel, Odczynniki Corning 356231 bez fenoluOdczynniki
ForskolinSigma AldrichF6886
Końcówki do pipet (10,200,1,000 μ l) Fisher Scientific02-707-474, 02-707-478, 02-707-480Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Bezpudrowe rękawice diagnostyczneFisher Scientific19-149-863BJednorazowy sprzęt laboratoryjny
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-100Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Dziurkacz do biopsji (3 mm)Miltex3332Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-544CJednorazowy sprzęt
laboratoryjny Wstępnie powlekane szkiełka nakrywkowe (epoksysilan)ArrayitCCSLJednorazowy sprzęt laboratoryjny
Szkiełko szklaneFisher Scientific12550DJednorazowy sprzęt laboratoryjny
Sterylne fiolki (15 ml, 50 ml stożkowe)Fisher Scientific14-959-70C, 14-959-49AJednorazowy sprzęt laboratoryjny
Naczynie do hodowli komórkowych (6- cóż)Falcon351146Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Mikroskop epifluorescencyjny ze zmotoryzowanym stopniemNikonMEA53100 (Eclipse TiE Inverted)Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Regulowany uchwyt na próbki do stolika XYNikon77011393Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
60X (1.3 NA) (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)NikonMRD01605Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Źródło światła CFP/YFP i uchwyty filtrów wzbudzenia / emisji (źródło światła i koło lambda, system filtrów emisji lambda)Nikon (sprzedawca Sutter Instrument)77016231, 77016088Niejednorazowy sprzęt laboratoryjny
Zestaw filtrów CYF/YFPNikon (Chroma Technology Corp)77014928Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Aparat fotograficzny (ORCA Flash 4.0 v1)Nikon (Hamamatsu sprzedawca)77054076Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Oprogramowanie mikroskopowe NIS-Elements 40.20.02)NikonMQS31100 Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Prism (arkusz kalkulacyjny i oprogramowanie do tworzenia wykresów)GraphPad Software, IncVersion 6Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
System lamp punktowych UV UV do utwardzania OmniCure S1000 z filtrem 365nm lub innym źródłem światła (λ = 365 lub 405)OmniCureS1000Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Pomoc do pipet Drummond Scientific Co. DP-100Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
HemacytometrHausser ScientificReichert Bright-Line 1475Niejednorazowy sprzęt laboratoryjny
Próżniowa komora eksykatora/odgazowywacz Dowolnyduży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Kaptur do hodowli tkankowych Dowolnyduży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Okap chemiczny DowolnyDuży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
PiekarnikDowolnyDuży/niejednorazowy sprzęt laboratoryjny
SzpatułkaDowolnaNiejednorazowy sprzęt laboratoryjny
ZlewkaDowolnyNiejednorazowy sprzęt laboratoryjny
Inkubator Dowolnyduży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny
Obiektyw

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. , InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002(2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. , Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170(2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FRET ImagingThree dimensional HydrogelsWidefield MicroscopyCyclic AMP SignalingChondrocyte CellsPhotocrosslinking HydrogelThermoresponsive HydrogelRatiometric FRET ProbesQuenched Emission FRETBackground Subtraction

Powiązane artykuły