Artykuł metodologiczny

Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się

DOI:

10.3791/54136

⸱

14 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Health Sciences, Yale University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono podejście genetyki odwrotnej do zrozumienia rodzin genów związanych z chorobami ludzkimi, używając myszy jako systemu modelowego, a następnie opisano harmonogram fenotypowania myszy. Ponieważ myszy z wadami genu HtrA2 wykazywały objawy parkinsonowskie, schemat fenotypowania koncentruje się na identyfikacji wad neurologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby związane z wiekiem stają się coraz bardziej powszechne, a obciążenie rośnie wraz ze starzeniem się naszej populacji. Skuteczne leczenie jest konieczne, aby zmniejszyć wpływ wyniszczających stanów, ale w wielu przypadkach pozostaje nieuchwytne. Tylko dzięki zrozumieniu przyczyn i patologii chorób związanych ze starzeniem się, naukowcy mogą zacząć identyfikować potencjalne cele terapeutyczne i opracowywać strategie interwencji. Najczęstszymi schorzeniami związanymi z wiekiem są zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i ślepota. Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest główną przyczyną ślepoty u osób starszych. Badania asocjacyjne całego genomu wcześniej zidentyfikowały loci, które są związane ze zwiększoną podatnością na tę chorobę i zidentyfikowały dwa obszary zainteresowania: czynnik dopełniacza H (CFH) i locus 10q26, w którym znajdują się geny podatności na makulopatię związaną z wiekiem 2 (ARMS2) i czynnik wymagający wysokiej temperatury A1 (HtrA1). CFH działa jako ujemny regulator alternatywnego szlaku (AP) układu dopełniacza, podczas gdy HtrA1 jest zewnątrzkomórkową proteazą serynową. ARMS2 znajduje się przed HtrA1 w genomie naczelnych, chociaż gen ten jest nieobecny u myszy. Aby zbadać wpływ tych genów, wygenerowano humanizowane mysie linie knock-in Cfh i ARMS2, nokauty Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 i HtrA4, a także warunkową neuronalną delecję HtrA2. Spośród wszystkich genetycznie zmodyfikowanych myszy, tylko myszy pozbawione HtrA2, zarówno ogólnoustrojowo, jak i w tkankach nerwowych, wykazywały wyraźne fenotypy. W celu dokładnego i systematycznego zbadania tych myszy ustalono wstępny harmonogram fenotypowania, składający się z serii testów związanych z dwiema głównymi chorobami będącymi przedmiotem zainteresowania: AMD i chorobą Parkinsona. Genetycznie zmodyfikowane myszy można poddać odpowiednim eksperymentom w celu zidentyfikowania fenotypów, które mogą być związane z powiązanymi chorobami u ludzi. Przedstawiono tutaj schemat fenotypowania z naciskiem na mitochondria wraz z reprezentatywnymi wynikami z interesujących nas testów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby związane z wiekiem stają się coraz bardziej powszechne we współczesnym społeczeństwie. Wraz z postępem nauk medycznych i wzrostem średniej długości życia populacja nadal się starzeje, a obciążenie tymi chorobami rośnie. Skuteczne leczenie jest konieczne, aby zmniejszyć wpływ wyniszczających stanów, ale w wielu przypadkach pozostaje nieuchwytne. Tylko dzięki zrozumieniu przyczyn i patologii chorób związanych ze starzeniem się naukowcy mogą zacząć identyfikować potencjalne cele terapeutyczne i opracowywać strategie interwencji. Powszechne schorzenia związane z wiekiem obejmują zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona (PD) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). PD jest najczęstszym zaburzeniem ruchowym spowodowanym neurodegeneracją u ludzi. Większość pacjentów z chorobą Parkinsona wykazuje objawy, takie jak drżenie spoczynkowe, bradykinezja i sztywność po 50 roku życia. Wczesny początek zaobserwowano również w około 10% przypadków.

AMD jest główną przyczyną ślepoty u osób starszych, stopniowo uszkadzając fotoreceptory i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) w oku. Widzenie centralne jest upośledzone, ale widzenie peryferyjne jest na ogół nienaruszone. Istnieją dwie formy AMD. W postaci "suchej" między RPE a błoną Brucha (BM) tworzą się zewnątrzkomórkowe złogi białkowe znane jako druzy, co prowadzi do atrofii geograficznej i rozmycia widzenia centralnego. Cięższa "mokra" postać wynika z neowaskularyzacji od naczyniówki przez BM do warstw RPE i fotoreceptorów i może prowadzić do krwotoku pod siatkówką, który powoduje trwałe uszkodzenie tkanki siatkówki. Badania asocjacyjne całego genomu wcześniej zidentyfikowały loci, które są związane ze zwiększoną podatnością na tę chorobę i zidentyfikowały dwa obszary zainteresowania: czynnik dopełniacza H (CFH) na chromosomie 1 i locus 10q26,gdzie zlokalizowane są geny podatności na makulopatię związaną z wiekiem 2 (ARMS2) i czynnik wymagający wysokiej temperatury A1 (HtrA1). Kombinacje tych alleli zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia AMD w sposób zależny od dawki, a określone SNP mogą być preferencyjnie związane z mokrymi lub suchymi postaciami AMD3-6.

CFH działa jako negatywny regulator alternatywnego szlaku (AP) układu dopełniacza, hamując aktywację C3. Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) został powiązany ze zwiększonym ryzykiem AMD, powodując wymianę tyrozyny 402 w eksonie 9 z histydyną w wyniku podstawienia T do C1. W AMD uważa się, że AP jest nieprawidłowo regulowany z powodu utraty funkcji CFH, ale nie jest jasne, czy SNP odgrywa rolę przyczynową. Jedna z hipotez głosi, że dodatnio naładowana histydyna neguje zdolność CFH do wiązania się z oddziałującymi białkami, białkiem C-reaktywnym i siarczanemheparyny 1,7. Badania in vitro CFH Y402H dostarczają sprzecznych wyników dotyczących różnic funkcjonalnych między wariantami, a prace in vivo na myszach Cfh-/- wykazujących ekspresję humanizowanego CFH są w toku8. ARMS2 znajduje się przed HtrA1 w genomie naczelnych, chociaż gen ten jest nieobecny u myszy. HtrA1 jest proteazą serynową, ale ARMS2 jest słabo scharakteryzowany. Brak równowagi sprzężeń między SNP w locus związanym z AMD utrudnia określenie wkładu w ryzyko indywidualnych mutacji genów w tym regionie, ale ostatnie prace sugerują, że to nadekspresja HtrA1, a nie ARMS2, prowadzi do neowaskularyzacji i subsiatkówkowych złogów białkowych9-11. Jednak bliskie sąsiedztwo genów w tym locus może pozwolić na interakcje, których nie można zbadać przy użyciu losowo wstawionych transgenów.

Oprócz AMD, rodzina proteaz serynowych HtrA jest związana z wieloma chorobami ludzkimi. Wszystkie białka HtrA zawierają domenę proteazy seryny, po której następuje co najmniej jedna C-końcowa domena PDZ. HtrA1, HtrA3 i HtrA4 mają największą homologię, składającą się z peptydu sygnałowego, domeny wiążącej insulinopodobny czynnik wzrostu, domeny inhibitora proteazy Kazala, domeny proteazy serynowej i domeny PDZ. HtrA2 ma inny N-koniec, składający się z sekwencji lokalizacji mitochondrialnej, domeny transbłonowej i domeny wiążącej inhibitor apoptozy, a następnie domen proteazy i PDZ12-16. HtrA1 ssaków jest regulowany przez indukowaną substratem przebudowę w miejscu aktywnym domeny proteazy17-20, a HtrA2 może być również modulowany przez interakcję między proteazą serynową a domenami PDZ, która hamuje aktywność proteazy21. Co ciekawe, wydaje się, aby domena PDZ nie zapewniała podobnej regulacji do HtrA316. Proteazy HtrA mogą być również regulowane przez czynniki zewnętrzne: niedawno wykazano, że istnieje interakcja regulacyjna między HtrA1 a protoporfirynami22, a HtrA2 może być regulowana przez fosforylację po aktywacji szlaku kinazy p38 MAP w sposób zależny od PINK123. Delecja poszczególnych członków rodziny HtrA u myszy została udokumentowana, jednak efekty mechanistyczne są w większości niejasne, częściowo z powodu braku widocznych fenotypów.

HtrA1 odgrywa ważną rolę w kontroli jakości białek, a jego nieprawidłowa regulacja lub mutacja jest związana z wieloma różnymi chorobami ludzkimi, w tym zapaleniem stawów, rakiem i zwiększonym ryzykiem AMD3,4,24-32. Utrata funkcji HtrA2 w tkankach nerwowych jest związana z fenotypami PD u ludzi i myszy, podczas gdy jej utrata z tkanek nienerwowych powoduje przyspieszone starzeniesię 33-37. Rozregulowanie HtrA3 jest związane z chorobami, w tym stanem przedrzucawkowym i niektórymi typami raka38,39. Regulację w górę HtrA4 zaobserwowano w łożyskach pacjentów ze stanem przedrzucawkowym, ale myszy z nokautem nie wykazują jawnego fenotypu40,41. Postuluje się, że brak fenotypów obserwowany u niektórych myszy z nokautem jest wynikiem kompensacji między członkiem rodziny HtrA: uważa się, że zarówno HtrA4, jak i HtrA1 oddziałują z rodziną białek TGF-B, umożliwiając kompensację przez HtrA1 po delecji HtrA441. Podobnie, uważa się, że ponieważ HtrA1 i HtrA3 mają wysoki stopień homologii domenowej, mogą mieć funkcje komplementarne42. Zasugerowano jednak, że białka HtrA mogą odgrywać częściowo antagonistyczne role, konkurując o regulację wspólnych celów43.

Aby dokładniej zbadać te czynniki ryzyka, wygenerowano trzy humanizowane linie myszy knock-in. W Cfhtm1(CFH*9)jhoh i Cfhtm2(CFH*9)jhoh ekson 9 genu Cfh jest zastąpiony eksonem 9 homologu ludzkiego. Cfhtm1(CFH*9)jhoh koduje niezwiązaną z chorobą resztę tyrozyny w pozycji 402, podczas gdy Cfhtm2(CFH*9)jhoh przenosi Y402H, SNP związane z ryzykiem. W ARMS2tm1jhoh ludzka sekwencja ARMS2 została ukierunkowana na region powyżej HtrA1. Sekwencja STOP po bokach loxP umieszczona przed sekwencją genu, ale za dołączonym promotorem UbiC, została wycięta przez skrzyżowanie z myszami OzCre, które eksprymują rekombinazę Cre pod kontrolą promotora Rosa26, jak opisano wcześniej34. Oprócz tych linii knock-in wygenerowano allele warunkowego nokautu dla Cfh i HtrA1 (Cfhtm1jhoh i HtrA1tm1jhoh), a także innych znanych członków rodziny HtrA: HtrA2 (HtrA2tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3tm1jhoh) i HtrA4 (HtrA4tm1jhoh). Nokaity linii zarodkowej powstały przez skrzyżowanie myszy OzCre ze zwierzętami zmodyfikowanymi do flankowania określonych eksonów miejscami loxP, tak że delecja powoduje przesunięcie ramki i / lub delecję domeny aktywnej (Cfh; ekson 3, HtrA1; eksony 2-3, HtrA2: eksony 2-4, HtrA3; ekson 3, HtrA4; eksony 4-6)34,41. Neuronalna delecja HtrA2, usunięta za pomocą rekombinazy Cre pod kontrolą promotora Nestin (HtrA2 flox; Tg(Nes-cre)1Kln/J), opisano również34. Tylko myszy pozbawione HtrA2, zarówno ogólnoustrojowo, jak i w tkankach nerwowych, wykazywały wyraźne fenotypy, prezentując fenotypy parkinsonowskie.

Ponieważ zakłada się, że niektóre z tych interesujących genów są zlokalizowane w mitochondriach11,44-47, a delecja fenotypów Parkinsona generowanych przez HtrA2, opisano tutaj schemat fenotypowania z mitochondrialnym i neurologicznym ogniskiem, a także przedstawiono reprezentatywne wyniki interesujących testów. W celu zbadania genetycznie zmodyfikowanych myszy wyprodukowanych w celu dokładnego i systematycznego zbadania ludzkich chorób związanych z wiekiem ustalono wstępny harmonogram fenotypowania, składający się z serii testów związanych z dwiema głównymi chorobami będącymi przedmiotem zainteresowania: AMD i chorobą Parkinsona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami National Institutes of Health zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych oraz Instytucjonalnym Komitecie ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Yale.

1. Testy behawioralne genetycznie zmodyfikowanych myszy

Uwaga: Wszystkie myszy powinny być poddawane temu samemu schematowi testowania, aby ograniczyć różnice w przyzwyczajeniu do obsługi. Badania powinny być wykonywane za każdym razem o tej samej porze dnia.

    Test na
  1. kończynach tylnych noworodka
    Uwaga: Test kończyn tylnych jest przeprowadzany codziennie od dnia po urodzeniu (P) 4 do P10 w celu oceny siły, osłabienia i zmęczenia mięśni bliższych kończyn tylnych.
    1. Przenieś myszy do obszaru testowego i pozwól im odpocząć przez 30 minut przed badaniem.
    2. Przygotować aparaturę badawczą, czyszcząc stożkową probówkę o pojemności 50 ml z 70% etanolem, dociskając dwa (P4-P8) lub jeden (P9-P10) waciki do dna probówki i zabezpieczając w pozycji pionowej.
    3. Wyjmij jedno szczenię z klatki i zapisz wagę. Trzymaj szczeniaka w tacce na poduszce grzewczej, gdy nie testujesz.
    4. Delikatnie zawieś tylne kończyny noworodka nad krawędzią stożkowej rurki, tak aby była skierowana w dół w kierunku wacików. Policz liczbę wykonanych prób ściągnięcia i zmierz opóźnienie, aby spaść za pomocą stopera.
    5. Powtórz jeszcze raz, a następnie oznacz szczeniaka markerem. Następnie zidentyfikuj szczenięta P6 przez obcinanie palców. Przed wymianą delikatnie przetrzyj szczenięta pościelą z domowej klatki.
    6. Przetrzyj stożkową rurkę 70% etanolem.
    7. Powtarzaj testy na następnym szczenięciu, aż cały miot zostanie przetestowany.
    8. Wyrzuć wacik i stożkową rurkę. Wyczyść wszystkie urządzenia 70% etanolem.
  2. Test obserwacji odsadzenia
    Uwaga: Test obserwacji odsadzenia jest przeprowadzany codziennie od P19 do P21 w celu oceny poziomu ruchu i ogólnej aktywności.
    1. Przenieś myszy do obszaru testowego i pozwól im odpocząć przez 30 minut przed badaniem.
    2. Przygotuj pudełko testowe z pleksiglasu oznaczone siatką 6x6 składającą się z 2-calowych kwadratów na podstawie, czyszcząc 70% etanolem. Ustaw sprzęt wideo z boku tak, aby całe pudełko znajdowało się w polu view. Utrzymuj konfigurację i otoczenie takie same każdego dnia, aby uniknąć wprowadzania nowości.
    3. Wyjmij jedno odsadzone od klatki i umieść w czystym kubku. Rekordowa waga.
    4. Rozpocznij nagrywanie wideo, nagrywając kartę identyfikacyjną testu z numerem identyfikacyjnym myszy, wiekiem i datą testu. Przenieś mysz z kubka trzymającego na środkowy kwadrat. Czas na trzy minuty, licząc liczbę linii przebytych przez obie przednie łapy myszy podczas testu.
    5. Umieść mysz z powrotem w czystej klatce i zakończ nagrywanie wideo.
    6. Wyczyść aparaturę testową 70% etanolem.
    7. Powtarzaj, aż cały miot zostanie przetestowany, a następnie zwróć wszystkie szczenięta do klatki domowej.
    8. Wyczyść wszystkie urządzenia testujące 70% etanolem.
    9. Korzystając z filmów, określ ilościowo liczbę zdarzeń odchowowych, zliczając po obserwacji wizualnej, w której mysz stoi z obiema przednimi łapami z dala od podparcia, oraz zdarzeniach pielęgnacyjnych, w których obie przednie łapy są zaangażowane w czyszczenie.
  3. Test wytrzymałości na trzymanie siatki drucianej
    Uwaga: Test siły chwytu jest przeprowadzany co drugi dzień między P22 i P26, w celu oceny siły nerwowo-mięśniowej.
    1. Przenieś myszy do obszaru testowego i pozwól im odpocząć w klatce domowej przez 30 minut przed badaniem.
    2. Przygotuj aparaturę, czyszcząc pudełko z pleksi i siatkę siatkową 70% etanolem. Umieść folię bąbelkową na dnie pudełka i przykryj papierem.
    3. Podziel myszy na grupy po trzy, umieszczając je w indywidualnych kubkach.
    4. Umieść pierwszą mysz na środku siatki drucianej i powoli odwróć 10-20 cm nad miękką powierzchnią na dnie pudełka z pleksi. Zmierz opóźnienie do spadku za pomocą stopera. Zakończ testowanie po upływie 60 sekund, jeśli mysz nie upadnie.
    5. Umieść mysz z powrotem w kubku, przetrzyj siatkę 70% etanolem i połóż papier na folii bąbelkowej. Przeprowadź test na pozostałych dwóch myszach w grupie, zanim powrócisz do pierwszej. Powtarzaj tę czynność, aż każda mysz zostanie przetestowana łącznie trzy razy.
    6. Przywróć grupę do czystej klatki i kontynuuj z pozostałymi grupami. Jeśli w dowolnej grupie jest mniej niż trzy myszy, upewnij się, że dozwolony jest 5-minutowy interwał odzyskiwania między próbami.
    7. Umieść wszystkie myszy z powrotem w klatce domowej, wyrzuć papier i wyczyść sprzęt testowy z 70% etanolem.

2. Badanie struktury siatkówki

  1. Znieczulenie zwierząt w temperaturze P30-35 przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia, ściskając opuszkę stopy i kontynuuj tylko w przypadku braku odpowiedzi, zgodnie z wytycznymi IACUC. Perfuzja z 4% PFA/PBS48.
  2. Aby usunąć oczy, oczyść skórę w miejscu nacięcia 70% etanolem, a następnie przetnij skórę u podstawy czaszki. Zdejmij skórę, aby odsłonić czaszkę i oczyść ją 70% etanolem. Używając czystych narzędzi, ostrożnie przetnij czaszkę, aby dotrzeć do oczodołów i odsłonić oczy. Przeciąć nerw wzrokowy, delikatnie wyjąć oko z oczodołu i spłukać w PBS.
  3. Utrwal oczy w 4% PFA/PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umieść oczy na małej szalce Petriego zawierającej PBS. Wykonaj małe nacięcie na środku rogówki za pomocą nożyczek do usuwania ściegów. Usuń rogówkę, przecinając krawędź między rogówką a twardówką. Użyj kleszczy, aby usunąć tęczówkę. Na koniec zdejmij warstwy RPE, pozostawiając siatkówkę nienaruszoną, a soczewkę na miejscu.
    Uwaga: Utrwalenie 4% PFA/PBS spowoduje odklejenie RPE, co pozwoli na łatwe oderwanie RPE od zewnętrznej strony siatkówki.
  5. Ponownie umieścić w 4% PFA/30% sacharozy/PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed ponownym umieszczeniem oka na szalce Petriego zawierającej PBS. Wyciągnij soczewkę za pomocą kleszczy, zabierając ze sobą ciało szkliste.
  6. Cryoprotect w 30% sacharozie przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Pokryj oczka związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przenieś do formy do zatapiania zawierającej świeży OCT. Ustaw oko tak, aby płaszczyzna strzałkowa była równoległa do powierzchni tnącej, wykonując jak najmniej ruchów i unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Błyskawiczne zamrożenie poprzez zanurzenie formy w kąpieli z suchym lodem/etanolem. Przechowywać bloki w temperaturze -80 °C.
  8. Za pomocą kriostatu wytnij odcinki strzałkowe o grubości 20 μm i zbierz je na wstępnie oczyszczonych szkiełkach.
  9. Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną zgodnie ze standardowymi protokołami49. Obraz za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w mikroskopię jasnego pola.

3. Barwienie histochemiczne

  1. Przygotowanie próbki
    1. Poddaj eutanazji zwierzęta w wieku P30-35 za pomocą przedawkowania izofluranu (30% w glikolu propylenowym) poprzez inhalację z otwartą kroplą. Oceń eutanazję na podstawie ustania oddechu, bicia serca i braku reakcji na szczypanie opuszki stopy. Potwierdzić zgon w wyniku zwichnięcia szyjki macicy i usunięcia narządów, zgodnie z wytycznymi IACUC.
    2. Aby usunąć mózg, oczyść skórę w miejscu nacięcia 70% etanolem, a następnie przetnij skórę u podstawy czaszki. Zdejmij skórę, aby odsłonić czaszkę i oczyść ją 70% etanolem. Używając czystych narzędzi, ostrożnie przetnij czaszkę i usuń, aby odsłonić mózg. Usuń błony i delikatnie usuń mózg z jamy czaszki. Spłucz w PBS.
    3. Pokryj mózg w OCT i przenieś do formy do zatapiania zawierającej świeży OCT. Ustaw mózg tak, aby płaszczyzna strzałkowa była równoległa do powierzchni tnącej, wykonując jak najmniej ruchów i unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Błyskawiczne zamrożenie poprzez zanurzenie formy w kąpieli z suchym lodem/etanolem i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
    4. Za pomocą kriostatu wytnij odcinki strzałkowe o grubości 10 μm i zbierz je na wstępnie oczyszczonych szkiełkach.
  2. Barwienie diaforazy NADH
    1. Przygotować 0,05 M bufor Tris o pH 7,6, rozpuszczając 5,72 g Tris-HCl i 1,66 g zasady Tris w 1 l dejonizowanej wodzie. Przechowywać w temperaturze 4 °C do sześciu tygodni.
    2. Przygotować roztwór NADH (2,25 mM NADH w 0,05 M buforze Tris). Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować roztwór NBT (2,5 mM Nitro-Blue Tetrazolium w 0,05 M buforze Tris). Przechowywać w temperaturze 4 °C do sześciu tygodni w szklanej butelce.
    4. Połączyć równe objętości roztworu NADH i roztworu NBT, aby uzyskać roztwór barwiący i dodać 1 ml do każdego szkiełka. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 30 minut.
    5. Odessać roztwór barwiący i przemyć trzykrotnie dH2O.
    6. Płukać po trzy razy w rosnących i malejących stężeniach acetonu/dH20 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    7. Przepłukać trzykrotnie w dH2O i zamontować sekcje w roztworze wodnym. Obraz za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w mikroskopię jasnego pola. Niebieskie zabarwienie odpowiada aktywności enzymatycznej.
  3. Dehydrogenaza bursztynianowa Barwienie histochemiczne
    1. Przygotować 0,2 M sodu fosforanu jednozasadowego/dH2O i 0,2 M fosforanu dwuzasadowego sodu/dH2O.
    2. Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy o pH 7,6, łącząc 3 części fosforanu jednozasadowego z 20 częściami fosforanu dwuzasadowego sodu.
    3. Przygotować roztwór barwiący (0,1 M bursztynian sodu, 1,25 M NBT w 0,2 M buforze fosforanowym) i dodać 1 ml do każdego szkiełka. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 60 minut.
    4. Odessać roztwór barwiący i przemyć trzykrotnie w dH2O.
    5. Prać trzykrotnie w rosnących i malejących stężeniach acetonu/dH2O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Przepłukać trzykrotnie w dH2O i zamontować sekcje w roztworze wodnym. Obraz za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w mikroskopię jasnego pola. Niebieskie zabarwienie odpowiada aktywności enzymatycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja opisuje przykłady wyników możliwych do uzyskania przy użyciu tych metod. W teście kończyn tylnych liczba wykonanych prób pociągnięcia i opóźnienie do opadania są sumowane w dwóch kolejnych testach dla każdego dnia. Ten test może być wykorzystany do porównania genetycznie różnych grup w celu odróżnienia myszy o zmniejszonej sile nerwowo-mięśniowej. Myszy HtrA2tm1jhoh (HTRA2 KO) na rysunku 1A-B nie wykazują zmiany w liczbie pociągnięć i opóźnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potrzebne są solidne terapie, aby ograniczyć wpływ wyniszczających stanów związanych ze starzeniem się człowieka, ale pozostają one nieuchwytne w przypadku wielu schorzeń. Aby zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne i opracować strategie interwencji, należy najpierw zrozumieć przyczyny i patologię chorób związanych ze starzeniem się. Nie wszystkie genetycznie zmodyfikowane myszy od razu mają wyraźne fenotypy, które są związane z chorobą będącą przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli te geny zostały wcześniej powią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundusze na te badania pochodziły z Fundacji Medycznej Rosebay oraz Funduszu Badawczego Dziekana Szkoły Medycznej Yale (JH). Dziękujemy dr Claire Koenig za pomoc w eksperymentach behawioralnych. Genetycznie zmodyfikowane linie myszy zostały stworzone w Ozgene (Perth, Australia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EthanolDecon (Fisher Scientific)435541
Rurka stożkowa 50 mlWaciki Fisher Scientific1443222
Mata grzewcza
Tacka do przechowywania (tacka na kostki lodu)Walmart
Pudełko z pleksizbudowane w warsztacie12" na 12" 
Kamera Vixia HF R400Canon8155B004
9 uncji przezroczystych kubkówWalmart
1/4 cala siatka drucianaHome Depot204331884 (online) / 554219 (w sklepie)12" na 12" 
Folia bąbelkowaVWR470092-416
Kleszczyki proste do próbekVWR82027-438
Kleszcze preparacyjne z cienką końcówkąVWR82027-408
Drobne nożyczkiVWR82027-578
Roztwór paraformaldehydu 16%Mikroskopia elektronowa Sciences15710
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4American BioanalyticalAB11072-04000
SacharozaJT Baker4072-01
Szkiełka SuperfrostFisher Scientific12-550-15
Roztwór barwienia hematoksylinyFisher Scientific (Ricca)353016
Roztwór barwników eozyny yFisher Scientific (Ricca)2845-32
Chlorowodorek trisSigmaT3253
TrisAmerican BioanalyticalAB02000-01000
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowejSigmaN8129
Nitrotetrazolium Niebieski chlorekSigmaN6876
AcetonJT Baker9006-05
Sodu fosforan jednozasadowyjednowodny SigmaS9638
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnySigmaS9390
Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodnySigmaS2378
VectaMount wodne podłoże montażoweVector LabsH-5501-60
Szkło nakrywkoweFisher Scientific12-545-M60 mm x 24 mm
Mikroskop AxioImager A1Zeiss
Statyw do kamery wideoAmazon
Optymalna temperatura cięcia (OCT)Fischer Scientific23730571
Sekcja kriostatu  MaszynaLeica CM1900Wycofany z produkcji, ale od tego czasu zastąpiony przez CM1950
Walmart Sunbeam 0000756-500-000 Elektroniczny stoper GOGO PC396

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
  2. Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
  3. Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
  4. Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
  5. Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
  6. Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
  7. Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
  8. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
  9. Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
  10. Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
  11. Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
  12. Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
  13. Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
  14. Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
  15. Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
  16. Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142(2015).
  17. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
  18. Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
  19. Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19(2009).
  20. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
  21. Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
  22. Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362(2014).
  23. Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
  24. Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
  25. Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
  26. Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
  27. Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
  28. Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
  29. Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
  30. Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
  31. Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
  32. Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959(2011).
  33. Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
  34. Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789(2014).
  35. Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
  36. Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
  37. Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
  38. Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956(2012).
  39. Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
  40. Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
  41. Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
  42. Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
  43. Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
  44. Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
  45. Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
  46. Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
  47. Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
  48. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  49. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
  50. Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
  51. El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
  52. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  53. Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
  54. Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
  55. Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

test ko czyn tylnychtest obserwacji odsadzonych m odychtest si y chwytubarwienie na diaforaz NADHbarwienie na dehydrogenaz bursztynianowbarwienie histochemicznea cuch transportu elektron wknockout HtrA2

Powiązane artykuły