Artykuł metodologiczny

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

DOI:

10.3791/54138

⸱

22 czerwca 2016

 ,  , 
1Department of Biochemistry, College of Life Science & Biotechnology, Yonsei University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty T regulatorowe (T reg), które wyrażają Foxp3 jako czynnik transkrypcyjny, są podzbiorami limfocytów T CD4+. Limfocyty Treg odgrywają kluczową rolę w tolerancji immunologicznej i utrzymaniu homeostazy poprzez regulację odpowiedzi immunologicznej. Podstawową rolą limfocytówT reg jest hamowanie proliferacji efektorowych komórek T (Teff) i wytwarzanie cytokin, takich jak IFN-γ, TNF-α i IL-2. Wykazano, że zdolność limfocytów Treg do hamowania funkcji limfocytów Teff jest zwiększona podczas uporczywego zakażenia patogenem i rozwoju raka. Aby wyjaśnić funkcję limfocytów Treg w stanie spoczynku lub stanu zapalnego, opracowano różne testy supresji in vitro z wykorzystaniem mysich lub ludzkich limfocytówT reg. Głównym celem tego badania jest opracowanie metody porównywania różnic w fenotypie i funkcji supresyjnej między spoczynkowymi i aktywowanymi limfocytami Treg. Aby wyizolować aktywowane limfocytyT reg, myszy zostały zakażone klonem 13 (CL13) wirusa limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV), przewlekłym szczepem LCMV. Limfocyty Treg wyizolowane ze śledziony myszy zakażonych LCMV CL13 wykazywały zarówno aktywowany fenotyp, jak i zwiększoną aktywność supresyjną w porównaniu z limfocytami Treg w stanie spoczynku wyizolowanymi od myszy nieleczonych. W tym miejscu opisujemy podstawowy protokół analizy fenotypu ex vivo w celu odróżnienia aktywowanych limfocytów Treg od spoczynkowych limfocytów Treg. Ponadto opisujemy protokół pomiaru aktywności supresyjnej w pełni aktywowanych limfocytów Treg.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulatorowe komórki T (T reg) wyrażają skrzynkę widłową P3 (Foxp3) jako czynnik transkrypcyjny dla ich rozwoju i funkcji1. Ponadto limfocytyT reg wyrażają różne inne cząsteczki, takie jak CD252, gen aktywacji limfocytów 3 (LAG-3)3, receptor czynnika martwicy nowotworu indukowany glikokortykosteroidami 4 i cytotoksyczne białko związane z limfocytami T 4 (CTLA-4)5 na ich powierzchni lub w regionie wewnątrzkomórkowym. Podczas przewlekłego zakażenia różnego rodzaju patogenami, takimi jak wirusy6,7, bakterie8,9 i pasożyty10-12, lub w trakcie rozwoju raka13,14, limfocyty Treg różnicują się w aktywowane komórki, wykazując zwiększoną funkcję supresyjną ukierunkowaną na efektorowe limfocyty T CD4 + i CD8 +. Wiele prac sugeruje, że rozszerzone i aktywowane limfocyty Treg przyczyniają się do upośledzonej odpowiedzi limfocytów T CD8 + podczas infekcji przyjacielskim retrowirusem (FV)15-17. LimfocytyT reg indukowane FV hamują ekspresję IFN-γ lub granzymu B i reaktywność cytotoksyczną limfocytów T CD8 + 15-17. Co więcej, w modelu zakażenia wirusem opryszczki pospolitej stwierdzono, że wyczerpanie limfocytówT reg CD4 + CD25 + spowodowało ekspansję limfocytów T CD8 + specyficznych dla wirusa i poważne uszkodzenie tkanek przez infiltrację immunopatogennych limfocytów T CD4 + 18-20.

Myszy przewlekle zakażone szczepem klonu 13 wirusa limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV CL13)21-24 były szeroko stosowane do charakteryzowania fenotypu i funkcji efektorowych limfocytów T (T eff) i limfocytówT reg podczas przewlekłej infekcji wirusowej. Podczas uporczywego zakażenia LCMV specyficzne dla wirusa limfocytyT eff stopniowo tracą swoją funkcję efektorową i stają się wyczerpanymi limfocytami T (Texh). Z drugiej strony, limfocytyT reg wzmacniają ich zdolność do tłumienia odpowiedzi limfocytów T specyficznej dla wirusa25. Spadek zdolności funkcjonalnej limfocytów Teff można wytłumaczyć kilkoma czynnikami, takimi jak regulacja w górę receptorów hamujących na komórkach Teff, zmieniona funkcja komórek prezentujących antygen, produkcja cytokin immunoregulacyjnych oraz zwiększona częstotliwość lub zwiększona funkcja limfocytów Treg 26. Wśród czynników zaangażowanych w supresję limfocytów T, limfocyty Texh i limfocyty Treg ekspujące białko programowanej śmierci komórki-1 (PD-1) są powszechnie uważane za cechy charakterystyczne trwałości antygenu i środowiska supresyjnego. Niedawno doniesiono, że blokada szlaku PD-1 i ablacja limfocytówT reg prowadzą do poprawy funkcji limfocytów T i zmniejszenia wiremii podczas przewlekłej infekcji LCMV27. Ponadto limfocyty Treg są aktywowane podczas przewlekłego zakażenia myszy LCMV23,25, a ich funkcja supresyjna jest wzmocniona25. PD-1 ulega silnej ekspresji na komórkach Treg, a także na komórkach Texh, a poziom PD-1 wyrażany przez limfocyty Treg koreluje z siłą ich funkcji supresyjnej hamującej proliferację komórek T25.

Tutaj opisujemy metodę porównywania cech aktywowanych limfocytów Treg wyizolowanych od myszy zakażonych LCMV CL13 i limfocytów Treg w stanie spoczynku wyizolowanych od myszy wcześniej nieleczonych. Ponadto wyjaśniamy szereg procesów oddzielania aktywowanych limfocytów Treg i badamy ich fenotyp ex vivo, a także mierzymy ich aktywność supresyjną in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu, myszy były utrzymywane w specyficznym obiekcie wolnym od patogenów w Yonsei Laboratory Animal Research Center of Yonsei University. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Koreańskiej Agencji ds. Żywności i Leków przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Międzynarodowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Laboratorium Yonsei Animal Research Center na Uniwersytecie Yonsei.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 2% pożywki RPMI, rozcieńczając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do 2% i penicylinę-streptomycynę do 1% w RPMI
  2. Przygotuj kompletne nośniki RPMI. Do pożywki RPMI dodaj 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% L-glutaminy i 50 μM 2-merkaptoetanolu.
  3. Przygotuj bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). W tym celu należy uzupełnić sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w 2% FBS.
  4. Przygotować bufor do izolacji limfocytów T. W tym celu należy uzupełnić PBS o 2% FBS i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego.

2. Izolacja limfocytów śledziony

  1. Usuń śledziony od myszy wcześniej nieleczonych lub zakażonych LCMV CL13, jak opisano wcześniej19 i umieść je na szalkach Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierających 10 ml pożywki 2% RPMI.
    UWAGA: W tym badaniu eksperymenty 5 do 6 tygodniowych samic myszy C57B1L / 6J otrzymało 2 x 106 jednostek tworzących płytkę (pfu) LCMV CL13 poprzez dożylne wstrzyknięcie przez żyłę ogonową. Złóż ofiary na myszy w 16 dniu po infekcji (16 d p.i.)25. Przeanalizuj, czy naiwne myszy były tego samego dnia.
  2. Umieść sitko do komórek w probówce o pojemności 50 ml i przepłucz je 2 ml pożywki 2% RPMI. Umieścić śledzionę na sitku o wielkości 70 μm i zmielić za pomocą tłoka strzykawki. Przepłucz sitko komórkowe 2 ml pożywki 2% RPMI i wyjmij je z probówki o pojemności 50 ml.
  3. Napełnić probówkę pożywką o stężeniu 2% RPMI i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu lizującego ACK. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut
    UWAGA: Wskazana powyżej objętość buforu lizującego ACK dotyczy jednej śledziony. Odpowiednio zwiększ objętość dla zbiorczych próbek śledziony.
  4. Napełnić probówkę pożywką o stężeniu 2% RPMI i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki o gęstości 1 x 107 komórek/ml w pełnej pożywce RPMI.
    UWAGA: W celu zliczania żywych komórek wybarwić komórki błękitem trypanowym i liczyć tylko żywe komórki, które nie są barwione za pomocą hemocytometru.

3. Fenotypowanie konwencjonalnych komórek T (Tconv) śledziony i limfocytówT reg

UWAGA: Przed izolacją limfocytów Treg zbadaj fenotyp limfocytów śledziony wyizolowanych od wcześniej nieleczonych lub zakażonych myszy, barwiąc komórki różnymi przeciwciałami i analizując je za pomocą cytometrii przepływowej.

  1. Przenieść 50 μl komórek (5 x 105 komórek) między całkowitymi limfocytami śledziony do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U i dodać 150 μl buforu FACS na studzienkę. Wirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  2. Odrzucić supernatant. Wymieszać osad komórkowy i dodać 200 μl buforu FACS do studzienki. Wirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (2 razy).
  3. Przygotować koktajl przeciwciał do barwienia markerów powierzchniowych komórek w 50 μl buforu FACS na studzienkę z następującymi przeciwciałami i odczynnikami. Fioletowy barwnik anty-CD4, zielony barwnik anty-CD25, fioletowy barwnik anty-PD-1, barwnik anty-CD8 PerCP-Cy5.5 i odczynnik do wykrywania żywotności komórek w bliskiej podczerwieni (IR) fluorescencyjny barwnik reaktywny.
    UWAGA: W celu dalszej analizy fenotypu aktywowanych limfocytów Treg można dodać anty-CD10323,25 do barwienia markerami powierzchniowymi komórek.
  4. Zawiesić osad komórkowy z 50 μl koktajlu przeciwciał na studzienkę. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki dwukrotnie buforem FACS przez odwirowanie przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  5. Po ostatnim etapie płukania zdekantować supernatant i utrwalić komórki na 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C za pomocą 100 μl buforu utrwalającego przygotowanego zgodnie z protokołem producenta.
  6. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem do przemywania permeabilizacji (przygotowanym zgodnie z protokołem producenta) przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować roztwór przeciwciała do wewnątrzkomórkowego barwienia Foxp3 i ponownie zawiesić osad komórkowy z 50 μl roztworu przeciwciała anty-Foxp3.
    UWAGA: Aby dokładniej przeanalizować fenotypy limfocytów Tconv i Treg, na tym etapie można dodać anty-CTLA.
  8. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C i powtórzyć krok 3.6. Po ostatnim etapie płukania ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu FACS i zbadać fenotyp komórek za pomocą cytometru przepływowego25.
  9. Bramka żywej populacji komórek. Aby przeanalizować fenotypy limfocytów Tconv podczas infekcji LCMV CL13, zbadaj częstość komórek Foxp3-PD-1+ wśród limfocytów T CD4+ lub CD8+.
    UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych procent Foxp3-PD-1 + wynosi ponad 50% zarówno w populacjach limfocytów T CD4 +, jak i CD8 + przy 16 d p.i. z LCMV CL13.
    1. Aby przeanalizować częstotliwość i fenotypy limfocytów Treg, zbadaj częstość komórek Foxp3 + lub Foxp3 + PD-1 + wśród limfocytów T CD4 +.
      UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych odsetek komórek Foxp3 + lub Foxp3 + PD-1 + wynosi odpowiednio ponad 20% w populacji limfocytów T CD4 +.

4. Izolacja komórekT reg CD4+CD25+

UWAGA: Objętości wszystkich odczynników wskazanych poniżej dotyczą początkowej liczby komórek 1 x 107 wszystkich splenocytów.

  1. Przygotować komórki zgodnie z opisem w sekcji 2 przy użyciu myszy wcześniej zakażonych i przewlekle zakażonych LCMV. Umyj komórki, dodając 10 ml buforu do izolacji limfocytów T. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 μl buforu.
  2. W celu wzbogacenia limfocytów T CD4+ za pomocą magnetycznego systemu separacji komórek, dodaj 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 30 μl buforu, 20 μl mikrokulek antybiotyny do znakowania limfocytów T innych niż CD4+ i 10 μl przeciwciała CD25-PE do znakowania fluorescencyjnego komórek CD25+. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności.
  4. Dodać 2 ml buforu i przepuścić komórki przez sitko o pojemności 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml w celu usunięcia resztek komórek. Przemywać komórki przez odwirowanie przy stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w buforze o objętości 500 μl o gęstości do 1,25 x10,8 komórek.
  5. Zastosuj komórki do kolumny i zbierz komórki bez etykiet, które przechodzą przez kolumnę. Przemyć kolumnę, dodając 2 ml buforu i odwirować w sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty T CD4+ w 90 μl buforu.
  6. W celu znakowania magnetycznego komórek CD25+ dodać 10 μl mikrogranulek anty-PE, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  7. Dodać 2 ml buforu i przemywać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 500 μl buforu o gęstości do 1 x10,8 komórek.
  8. Aby wzbogacić komórkiT reg CD4 + CD25 +, nałóż komórki na kolumnę w celu pozytywnej selekcji i umyj kolumnę, dodając 2 ml buforu. Powtórz pranie trzy razy.
  9. Gdy kolumna jest pusta po ostatnim etapie mycia, dodać 1 ml buforu do kolumny i wypłukać magnetycznie znakowane komórki CD4 + CD25 + za pomocą tłoka.
  10. Powtórz kroki 4.8-4.9, aby zwiększyć czystość izolowanych limfocytówT reg CD4 + CD25 +. Przemyć komórki buforem FACS przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty TCD4 + CD25 + w stężeniu 2 x 106 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI.
  11. Aby sprawdzić czystość izolowanych komórekT reg CD4 + CD25 +, użyj 2 x 105 komórek z całkowitej izolowanej komórkiT T CD4 + CD25 +. Wybarwić komórki 50 μl buforu FACS zawierającego anty-CD4 FITC i odczynnik wykrywający żywotność komórek w bliskiej podczerwieni fluorescencyjny barwnik reaktywny.
    UWAGA: CD25 był już oznaczony PE podczas izolacji.
  12. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki buforem FACS przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Po umyciu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS i sprawdzić czystość za pomocą cytometrii przepływowej.
  13. Bramka populacji żywych komórek. Aby przeanalizować czystość limfocytówT reg, potwierdź procentową zawartość komórek CD4 + CD25 +.
    UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych odsetek komórek CD4 + CD25 + wśród oczyszczonych komórek wynosi ponad 80%.

5. Izolacja limfocytów T CD8+ i znakowanie limfocytów T CD8+

UWAGA: Objętości wszystkich odczynników wskazanych poniżej dotyczą początkowej liczby komórek 1 x 107 wszystkich splenocytów.

  1. Przygotuj komórki zgodnie z opisem w sekcji 2 przy użyciu naiwnych myszy. Umyj komórki, dodając 10 ml buforu do izolacji limfocytów T. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 μl buforu.
  2. W przypadku izolacji limfocytów T CD8 + za pomocą magnetycznego systemu separacji komórek, dodaj 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał do znakowania limfocytów T innych niż CD8 + i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 30 μl buforu i 20 μl mikrogranulek antybiotyny. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zastosuj komórki do kolumny i zbierz komórki bez etykiet, które przechodzą przez kolumnę. Przemyć kolumnę, dodając trzykrotnie 2 ml buforu.
  5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty T CD8+ w 2 ml buforu.
  6. Aby sprawdzić czystość wyizolowanych komórek, należy przygotować 50 μl roztworu przeciwciał w buforze FACS. Zawiesić 2 x 105 komórek między izolowanymi limfocytami T CD8 + w 50 μl roztworu przeciwciała.
    UWAGA: Aby przygotować roztwór przeciwciała, dodaj anty-CD8 FITC i odczynnik do wykrywania żywotności komórek (reaktywny barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni) do bufora FACS.
  7. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki buforem FACS przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Po umyciu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS i sprawdzić czystość komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
  8. Bramka populacji żywych komórek. Aby sprawdzić czystość limfocytów T CD8 +, potwierdź procentową zawartość limfocytów T CD8 +.
    UWAGA: Na podstawie wyników eksperymentalnych odsetek komórek CD8 + wśród oczyszczonych komórek wynosi ponad 90%.
  9. Dodaj PBS do izolowanych limfocytów T CD8 +. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić wyizolowane limfocyty T CD8 + w stężeniu 1 x 107 komórek/ml w PBS.
  10. Aby oznaczyć limfocyty T CD8 + do testu supresji in vitro, należy rozcieńczyć proliferację komórek śledząc fioletowy barwnik w PBS, aby uzyskać stężenie 5 μM przy RT.
    UWAGA: Przybliżone piki wzbudzenia i emisji fioletowego barwnika śledzącego proliferację komórek użytego w badaniu wynoszą odpowiednio 405 i 450 nm.
  11. Wymieszać dobrze równe objętości fioletowego barwnika śledzącego proliferację komórek (5 μM) i zawiesiny komórek (1 x 107 komórek/ml limfocytów T CD8+) w probówce o pojemności 15 ml i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Wirować probówkę co 10 minut.
  12. Napełnij probówkę zimnym, kompletnym podłożem RPMI i pozostaw probówkę na 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w stężeniu 2 x 106 komórek/ml z wstępnie podgrzaną kompletną pożywką RPMI. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

6. Konfiguracja testu supresyjnego in vitro przy użyciu limfocytów T reg CD4+CD25+ i limfocytów TCD8+

  1. Aby przygotować kulki pokryte anty-CD3/CD28, przenieś odpowiednią objętość kulek magnetycznych do 15 ml probówki (2,5 μl/1 x 105 komórek). Dodaj równą objętość PBS i wymieszaj. Przemyć przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad. Rozcieńczyć kulki magnetyczne w kompletnym podłożu (50 μl/dołek).
  2. Podwielokrotność 50 μl komórekT reg CD4 + CD25 + na studzienkę 96-dołkowej płytki U (1 x 105 komórek / studzienkę). Dodaj 50 μl limfocytów T CD8 + jako odpowiadające limfocyty T (Tlub Resp) na studzienkę (1 x 105 komórek / dołek). Dodać 50 μl rozcieńczonych kulek pokrytych anty-CD3/CD28 do każdego dołka.
    UWAGA: W tym kroku oznacz i ustaw studzienki kontrolne w następujący sposób: "tylko niestymulowana limfocyt T CD8 +" bez kulek pokrytych anty-CD3 / CD28; "tylko limfocyt T CD8+" z kulkami pokrytymi anty-CD3/CD28; "tylko limfocyt T CD8+" z kulkami pokrytymi anty-CD3/CD28; "Tylko komórkaT reg" z koralikami pokrytymi anty-CD3/CD28. Limfocyty Treg można rozcieńczać kompletnymi pożywkami i hodować wspólnie z komórkami Tresp w różnym stosunku komórek Tresp do komórekT reg (1: 0,25-1: 1).
  3. Dodać 50 μl lub odpowiednią objętość pożywki do wszystkich studzienek do całkowitej objętości 200 μl. Przykryć płytkę folią i inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.

7. Analiza proliferacji limfocytów T CD8+ i produkcji cytokin z limfocytów T CD8+

  1. W celu analizy produkcji cytokin, po 3 dniach hodowli, rozdzielić supernatant z każdej studzienki na inną płytkę i przeprowadzić test immunoenzymatyczny (ELISA).
    UWAGA: Supernatant może być podawany i przechowywany w temperaturze -70 °C. W tym eksperymencie zastosowano płytkę pokrytą przeciwciałem przeciw myszom IFN-γ do wykrycia produkcji IFN-γ zgodnie z protokołem producenta. Aby określić produkcję IFN-γ proliferujących limfocytów T CD8 + na poziomie pojedynczej komórki, można przeprowadzić barwienie cytokiny wewnątrzkomórkowej.
  2. Po oddzieleniu supernatantu od każdej studzienki, przemyć płytkę zawierającą komórki buforem FACS i odwirować przy 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (3 razy).
  3. Po umyciu wyrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 50 μl koktajlu przeciwciał w celu barwienia proliferowanych limfocytów T CD8 +. Inkubować przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby przygotować koktajl przeciwciał, dodaj anty-CD4 FITC, anty-CD8 PerCP-Cy5.5 i odczynnik do wykrywania żywotności komórek (reaktywny barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni) do bufora FACS.
    UWAGA: Przeciwciała przeciwko różnym markerom, takim jak CD44 lub CD69, można łączyć z innymi przeciwciałami w celu potwierdzenia aktywacji limfocytów T CD8 +. Pamiętaj, że limfocyty T CD8 + zostały już oznaczone fioletowym barwnikiem śledzącym proliferację komórek w kroku 5.10.
  4. Przemyć dwukrotnie przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Po ostatnim etapie płukania odrzucić supernatant i utrwalić komórki na 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C za pomocą 100 μl buforu utrwalającego.
  5. Przemyć dwukrotnie przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl buforu FACS i zmierzyć proliferację proliferacji komórek, śledząc fioletowe limfocyty T CD8 + znakowane fioletowym barwnikiem za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. Bramka populacji limfocytów T CD8 + wśród żywych komórek. Zmierz procenty podzielonych i niepodzielonych komórek zgodnie z rozcieńczeniem proliferacji komórek, śledzeniem fioletowego barwnika i rozcieńczeniem limfocytów T CD8 + zgodnie z następującym równaniem. % zahamowania = [(% proliferowanych limfocytów T CD8+ przy braku limfocytówT reg - % proliferowanych limfocytów T CD8+ w obecności limfocytówT reg)/(% proliferowanych limfocytów T CD8+ przy braku limfocytówT reg)] x 100. Kontynuuj analizę danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzyliśmy myszy z uporczywą infekcją wirusową, wstrzykując im dożylnie 2 x 106 p.f.u. LCMV CL13. Aby zbadać zmiany fenotypowe w limfocytach Treg i limfocytach Tconv podczas przewlekłej infekcji wirusowej, limfocyty śledziony uzyskane od naiwnych i zakażonych myszy wybarwiono różnymi przeciwciałami i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Przy 16 d p.i., PD-1 był regulowany w górę zarówno w komórkach Foxp3-CD4 + Tconv (<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż u myszy i ludzi występuje tylko niewielka liczba limfocytów Treg , ważne jest, aby zrozumieć ich funkcję, ponieważ odgrywają one kluczową rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i utrzymaniu tolerancji immunologicznej. Liczba i funkcje supresyjne limfocytów Treg wzrastają podczas przewlekłej infekcji wirusowej15-20 , a także progresji raka13,14. Jest to prawdopodobnie spowodowane ciągłą stymulacją antygenową. Aby ocenić funkcję limfocytów Treg w warunkach...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.-J.H. posiada patent i otrzymuje tantiemy patentowe związane ze szlakiem PD-1. Pozostali autorzy nie mają finansowych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2015R1A6A3A01020610 do HJP) oraz grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych, Ministerstwa Zdrowia, Opieki Społecznej i Spraw Rodzinnych, Republiki Korei (HI15C0493 do SJH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FITC Rat Anti-Mouse CD4RM4-5BD Biosciences553047
Cytofix/CytopermBD Biosciences554714
U-Bottom PłytkiBD Biosciences353077
BuforBiosciences554655
FITC Rat Anti-Mouse CD257D4BD Biosciences553072
Sitko do komórek, 70 mmBD Biosciences352350
Sitko do komórek, 40 mmBD Biosciences352340
Brilliant Violet 421 Anti-Mouse CD279 (PD-1)29F.1A12BioLegend135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4RM4-5Biolegend100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 FJK-16seBioscience17-5773
do barwienia Foxp3/czynnika transkrypcyjnegoeBioscience00-5223
PerCP-cyjanina5.5 Anty-mysz CD8a53-6.7eBiosicence45-0081
Mysz IFN-gamma Platinum ELISAeBiosicenceBMS606
RPMI 1640GE Nauki przyrodniczeSH30027
PBS (1x)GE Life SciencesSH30256
ACK BuforGibcoA10492-01
L-glutamina, roztwór 200 mMGibco Numer katalogowy 25030
Penicylina-Streptomycyna, 10 000 U/mlGibco Numer katalogowy 10378-016
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy martwych komórek w bliskiej podczerwieni LifetechnologiesL-34975
CD8a+ Zestaw do izolacji komórek T, myszMiltenyibiotec130-104-075
CD4+ CD25+ Zestaw do izolacji regulatorowych komórek T, myszMiltenyibiotec130-091-041
Kolumny separacyjne MACS, kolumnyLDMiltenyibiotec130-042-901
Kolumny separacyjne MACS, kolumnyMiltenyibiotec130-042-401
EDTA, 0,5 M (pH 8,0)PromegaV4231
2-merkaptoetanolSigma Life ScienceM7522
Płodowa surowicaThermo Fisher ScientificSH30919.03
CellTrace Zestawdo proliferacji komórek fioletowychTermo Fisher ScientificC34557
BD Canto II przepływocytometrBD Biosciences
Marienfeld superior
do hodowli tkankowych utrwalający BD Zestaw lizujący TGL LS bydlęca Flowjo TreeStar Hematocytomer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
  12. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Supresja limfocyt w Tcytometria przep ywowatest ELISAkuleczki CD3 CD28ekspresja Foxp3aktywowane limfocyty T regulatorowesupresja in vitroanaliza fenotypowa

Powiązane artykuły