Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Podsumowanie

Proponujemy prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksanie (PDMS). Korzystając z tej techniki, nanoporowatą membranę perełkową o wielkości porów do ~45 nm wbudowano w mikrokanał i zastosowano do elektrokinetycznego wstępnego zagęszczenia próbek DNA.

Streszczenie

Polidimethylsiloxane (PDMS) jest dominującym materiałem budowlanym do produkcji urządzeń mikroprzepływowych ze względu na łatwość formowania i łączenia, a także przezroczystość. Jednak ze względu na miękkość materiału PDMS, wykorzystanie PDMS do budowy nanokanałów jest trudne. Kanały mają tendencję do łatwego zapadania się podczas wiązania plazmowego. W artykule przedstawiono metodę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki opartą na parowaniu w celu wytworzenia połączeń nanofluidycznych z porami poniżej 50 nm między dwoma mikrokanałami. Wielkość porów, jak również ładunek powierzchniowy złącza nanofluidycznego można przestrajać po prostu poprzez zmianę wielkości kulek krzemionki koloidalnej i funkcjonalizacji powierzchni na zewnątrz zmontowanego urządzenia mikroprzepływowego w fiolce przed procesem samoorganizacji. Wykorzystując samoorganizację nanocząstek o wielkości kulki 300 nm, 500 nm i 900 nm, udało się wytworzyć porowatą membranę o wielkości porów odpowiednio ~45 nm, ~75 nm i ~135 nm. Pod wpływem potencjału elektrycznego ta nanoporowata membrana zainicjowała polaryzację stężenia jonów (ICP), działając jak błona selektywna kationowo, aby skoncentrować DNA ~ 1,700 razy w ciągu 15 minut. Ten nielitograficzny proces nanowytwarzania otwiera nowe możliwości zbudowania przestrajalnego złącza nanofluidycznego do badania nanoskalowych procesów transportu jonów i cząsteczek wewnątrz mikroprzepływowego chipa PDMS.

Wprowadzenie

Nanofluidics to rozwijający się obszar badawczy μTAS (Micro Total Analysis Systems) do badania procesów biologicznych lub zjawisk transportu jonów i molekuł w skali długości 10¹-^{10 2} nm. Wraz z pojawieniem się narzędzi nanofluidycznych, takich jak nanokanały, procesy transportu cząsteczek i jonów mogą być monitorowane z niespotykaną precyzją i manipulowane, w razie potrzeby, poprzez wykorzystanie cech dostępnych tylko w tej skali długości do separacji i wykrywania. ^1,2 Jedną z tych charakterystycznych cech w nanoskali jest wysoki stosunek powierzchni do ładunku objętościowego (lub liczby Dukhina) w nanokanałach, który może powodować nierównowagę ładunku i inicjować polaryzację stężenia jonów (ICP) między nanokanałem a mikrokanałem. ³

Wspólna platforma urządzeń do badania zjawisk nanofluidycznych składa się z dwukanałowego systemu połączonego szeregiem nanokanałów jako złącze. ^4-6 Materiałem wybieranym do budowy takiego urządzenia nanofluidycznego jest krzem ze względu na jego wysoką sztywność, która zapobiega zapadaniu się kanału podczas procesów wiązania. ⁷ Jednak produkcja urządzeń silikonowych wymaga drogich masek i znacznej ilości przetwarzania w pomieszczeniu czystym. ^8-10 Ze względu na wygodę wytwarzania urządzeń poprzez formowanie i klejenie plazmowe, polidimetylosiloksan (PDMS) jest powszechnie akceptowany jako materiał budowlany dla mikrofluidyki i byłby również idealnym materiałem dla nanofluidyki. Jednak niski moduł Younga wynoszący około 360-870 KPa sprawia, że kanał PDMS łatwo się zwija podczas wiązania plazmowego. Minimalny współczynnik proporcji nanokanału (szerokość do głębokości) musi być mniejszy niż 10:1, co oznacza, że wytwarzanie urządzeń PDMS za pomocą standardowej fotolitografii stanie się niezwykle trudne, jeśli głębokość nanokanału musi być mniejsza niż 100 nm, co wymaga szerokości kanału mniejszej niż obecna granica fotolitografii wynosząca około 1 μm. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, podjęto próby stworzenia nanokanałów w PDMS przy użyciu metod nielitograficznych, takich jak rozciąganie w celu zainicjowania pęknięć o średniej głębokości 78 nm¹¹ lub w celu utworzenia zmarszczek po obróbce plazmowej. ¹² Zapadnięcie się kanału PDMS za pomocą nacisku mechanicznego pozwoliło na uzyskanie nanokanału o wysokości zaledwie 60 nm. ¹³

Mimo że te wysoce pomysłowe metody nielitograficzne pozwoliły na budowę nanokanałów o głębokości poniżej 100 nm, kontrola wymiarowa produkcji nanokanałów nadal stanowi przeszkodę dla szerokiej akceptacji PDMS jako materiału budulcowego dla urządzeń nanofluidycznych. Innym krytycznym problemem nanokanałów, czy to w krzemie, czy w PDMS, jest funkcjonalizacja powierzchni w przypadku, gdy istnieje potrzeba zmiany ładunku powierzchniowego na ściance kanału w celu manipulacji jonami lub cząsteczkami. Po zmontowaniu urządzenia poprzez klejenie, nanokanały są niezwykle trudno dostępne do funkcjonalizacji powierzchni ze względu na transport ograniczony dyfuzją. Aby stworzyć kanał w nanoskali o wysokiej wierności wymiarowej i łatwej funkcjonalizacji powierzchni, jednym z obiecujących podejść może być metoda samoorganizacji cząstek koloidalnych indukowanych przez parowanie^14-16 w urządzeniach mikroprzepływowych. Oprócz możliwości kontrolowania wielkości porów i właściwości powierzchni, istnieje nawet możliwość dostrojenia wielkości porów in-situ przy użyciu cząstek koloidalnych pokrytych polielektrolitami poprzez kontrolowanie ^{temperatury,17 pH,18,19} i siły jonowej. ¹⁸ Ze względu na te zalety, metoda samoorganizacji cząstek koloidalnych znalazła już zastosowanie w elektrochromatografii20, biosensorach21, koncentracji białek²² oraz separacji białek i DNA w mikrofluidyce. ^14,23 W tym badaniu zastosowaliśmy tę metodę samoorganizacji do zbudowania elektrokinetycznego urządzenia do wstępnego zatężania w PDMS, które wymaga nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami. ²⁴ Podstawowy mechanizm stojący za koncentracją elektrokinetyczną opiera się na polaryzacji stężenia jonów (ICP). ²⁵ Szczegółowy opis etapów produkcji i montażu znajduje się w poniższym protokole.

Protokół

1. Przygotowanie zawiesin koloidalnych kulek krzemionkowych

1. Przygotowanie zawiesin kulek krzemionkowych o długości fali 300 nm i 500 nm
   1. Wirować zawiesinę kulek krzemionki (10% w/v w wodzie) przez 30 sekund, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Odpipetować łącznie 600 μl zawiesiny podstawowej do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy sile 2 600 x g przez 1 min.
   2. Zastąp supernatant 400 μl 1 mM buforu fosforanu sodu (PB, pH 7,0).
   3. Zawiesić kulki krzemionki do końcowego stężenia 15% w 1 mM roztworze fosforanu sodu o pH 7,0 poprzez wirowanie.
2. Funkcjonalizacja powierzchniowa kulek karboksylowych krzemionki o długości 500 nm z poli(chlorowodorkiem alliloaminy, PAH) i poli(sulfonianem styrenu sodu, PSS) polielektrolitami
   1. Zawiesić 0,1 g kulek krzemionkowych o długości 500 nm z grupą karboksylową w 10 ml 1 M NaCl (pH 7,0) w celu uzyskania 1 % (w/v) zawiesiny kulek.
   2. Przygotować 0,4% WWA (MW 65K) w 1 M NaCl, rozpuszczając 300 μl roztworu podstawowego (20% m/v w wodzie) w 15 ml 1 M NaCl. Przygotować 0,9% PSS (MW 70K) w 1 M roztworze NaCl, rozpuszczając 0,18 g PSS w 20 ml roztworze 1 M NaCl. Wirować oba roztwory przez 1 minutę, aby całkowicie rozpuścić polielektrolity.
   3. Dodać 200 μl roztworu WWA do 9,8 ml 1% kulek karboksylowych krzemionki w probówce o pojemności 15 ml, aby osadzić dodatnio naładowaną warstwę polielektrolitu na kulkach krzemionkowych z karboksylową grupą funkcyjną. Wirować zawiesinę kulek przez 1 minutę i inkubować ją na rotatorze rurowym przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Odwirować zawiesinę kulek o stężeniu 1801 x g przez 1 minutę i zmyć niezwiązaną WWA pięciokrotnie 10 ml wody demineralizowanej. Po każdym odwirowaniu i usunięciu supernatantu, kulki były gęsto upakowane na dnie probówki. Rozbić grudkę kulki przez energiczne pipetowanie z 2 ml wody demineralizowanej przed dodaniem 8 ml wody demineralizowanej, tak aby kulki mogły zostać ponownie zawieszone i zmyte przed następnym etapem wirówki.
   5. Postępuj zgodnie z krokami w 1.2.3 i 1.2.4 dla powłoki PSS, aby nałożyć ujemnie naładowaną warstwę na koraliki. Ponownie zawiesić kulki w 9,8 ml 1 M NaCl przed osadzaniem PSS po usunięciu soczepiku wody DI z 5. etapu^płukania opisanego w ppkt 1.2.4.
      1. Wykonać ten sam energiczny etap pipetowania, używając 2 ml 1 M NaCl, aby rozbić grudkę kulki na dnie probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodać 8 ml 1 M NaCl. Dodać 200 μl roztworu PSS do 9,8 ml kulek krzemionkowych osadzonych pojedynczą warstwą WWA. Po wirowaniu przez 1 minutę i inkubacji przez 60 minut na rotatorze rurowym, powtórzyć 5 kroków mycia wodą DI.
      2. Zmierzyć potencjał zeta kulek przed i po każdej powłoce polielektrolitowej za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła zgodnie z protokołem producenta, aby sprawdzić, czy procedura osadzania polielektrolitu została przeprowadzona prawidłowo (patrz Tabela 1).
   6. Powtórz pięć etapów mycia wodą demineralizowaną po osadzeniu pojedynczej warstwy PSS i ponownie zawieś kulki w 650 μl 1 mM buforu fosforanu sodu z 0,05% Tween 20 (15% w/v) przed użyciem w urządzeniu mikroprzepływowym, aby zwiększyć jego płynność.
3. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną powyżej od 1.2.5 do 1.2.6 dla kulek krzemionkowych o długości 500 nm z aminową grupą funkcyjną, aby zdeponować pojedynczą warstwę PSS.

2. Produkcja mikroprzepływowego układu PDMS

1. Mikrofabrykacja wzorca krzemowego
   1. Wytwarzaj wzorzec krzemowy do formowania PDMS przy użyciu technik mikrowytwarzania w następujący sposób.
      1. Powłóż przędzę fotorezystor o grubości 1 μm z prędkością 4,000 obr./min na płytce krzemowej. Uformuj warstwę za pomocą litografii projekcyjnej (czas naświetlania 170 ms) i wytraw płaskie nanokanały o głębokości 700 nm i szerokości 2 μm (działające jako nanopułapki dla kulek krzemionkowych) za pomocą reaktywnego trawienia jonowego.
      2. Użyj następujących parametrów trawienia, aby uzyskać szybkość trawienia 3,5 nm/s: CHF₃ (45 sccm), CF₄ (15 sccm), Ar (100 sccm), ciśnienie 100 mTorr, moc RF 200 W.
   2. Drugą warstwę fotorezystu o grubości 1 μm należy obrócić z prędkością 2 000 obr./min i wyrównać z poprzednio wzorzystymi nanopułapkami. Modelowanie mikrokanalików za pomocą litografii kontaktowej i głębokiego reaktywnego trawienia jonowego (DRIE) krzemu. Należy użyć parametrów DRIE²⁶ w tabeli 2.
2. Produkcja formy PDMS
   1. Silanizuj krzem wzorcowy trichlorosilanem (50 μl) w słoiku próżniowym O/N.
      UWAGA: Tricholorozylan jest materiałem toksycznym i. Zawsze używaj go w kapturze chemicznym z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
   2. Wymieszaj bazę z utwardzaczem w proporcji 10:1 i odlej PDMS na silanizowany krzemowy wzorzec i utwardź go w temperaturze 70 °C przez 2 godziny w piecu konwekcyjnym.
   3. Usuń płytę PDMS z wzorca krzemowego za pomocą noża i przyklej ją plazmowo do czystej płytki za pomocą myjki plazmowej po obróbce plazmowej w czyszczarce plazmowej przez 1 minutę. Przymocuj taśmy wzdłuż krawędzi, aby zaznaczyć linię podziału dla następnego etapu odlewania PDMS.
   4. Silanizuj formę PDMS w słoiku próżniowym z trichlorosilanem (50 μl) O/N.
   5. Odlewać PDMS (baza: utwardzacz w proporcji 10:1) na silanizowanej formie PDMS i utwardzać w temperaturze 70 °C przez 2 godziny w piecu konwekcyjnym.
3. Produkcja urządzenia PDMS
   1. Oderwij utwardzoną płytę PDMS od formy PDMS wzdłuż linii podziału oznaczonej taśmą.
   2. Przebić otwory zbiornika dziurkaczem do biopsji 1,5 mm, oczyścić taśmą, spłukać alkoholem izopropylowym (IPA) i osuszyć azotem.
   3. Spajanie plazmowe urządzenia PDMS na szkiełku mikroskopowym o wymiarach 25 mm x 75 mm po obróbce plazmowej w czyszczalni plazmowej przez 1 min.
4. Zawiesinę perełek należy poddawać działaniu ultradźwięków przez 60 minut w kąpieli ultradźwiękowej przed napełnieniem. Odpipetować zawiesinę kulkową o długości 10 μl (niefunkcjonalizowane kulki krzemionkowe o długości 300 nm lub kulki karboksylowe krzemionki o długości 500 nm z warstwami PAH-PSS lub kulki aminowo-krzemionkowe o długości 500 nm z warstwą PSS) do wlotów 4 i 6 każdy (patrz rysunek 1 A, B) natychmiast po plazmowym połączeniu chipa PDMS ze szklanym podłożem. Delikatnie postukaj w chip PDMS końcówką pipety, aby poprawić wypełnienie kulek.
   1. Po napełnieniu kanałów doprowadzających ściegi zakryj taśmą wszystkie wloty z wyjątkiem 1 i 9. Suszyć urządzenie na powietrzu przez 3 godziny i przechowywać w temperaturze +4 °C przed użyciem. Rysunek 2 przedstawia krok po kroku schemat procesu samoorganizacji koloidalnej.

3. Eksperyment na elektrokinetyczną koncentrację DNA

1. Napełnić zbiorniki 3, 7 roztworem buforowym (10 μl 1 mM PB), a zbiornik 5 próbką DNA (10 μl 10 nM w 1 mM PB) i zastosować delikatne podciśnienie za pomocą odwróconej końcówki pipety na zbiornikach 2, 8 i 10 w celu napełnienia kanałów roztworami bez pęcherzyków (patrz rysunek 1B).
2. Dodać 10 μl 1 mM PB do zbiorników 2 i 8 oraz 10 μl 10 nM DNA do zbiornika 10 w celu zrównoważenia ciśnienia i odczekać 5 minut, aby osiągnąć równowagę.
3. Włóż przewody Pt do zbiorników 3, 5, 7, 10.
4. Przyłóż napięcie do złącza nanofluidycznego za pomocą dzielnika napięcia podłączonego do miernika źródła i przewodów Pt. Najpierw zastosować 30 V na zbiornikach 5, 10 i GND na zbiornikach 3, 7.
5. Zmniejsz napięcie do 25 V na zbiorniku 10 po ~30 sekundach.
6. Użyj mechanicznej migawki z okresowym otwieraniem co 5 s, aby zminimalizować fotowybielanie próbki podczas rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych z DNA.

Wyniki

Układ koncentratora elektrokinetycznego w PDMS, który zawiera samoorganizujące się połączenie nanofluidyczne między dwoma mikrokanałami, pokazano na rysunku 1A). Kanał w środku urządzenia jest wypełniony roztworem próbki DNA i otoczony dwoma kanałami roztworu buforowego z każdej strony za pośrednictwem kanału doprowadzającego kulki o szerokości 50 μm (ryc. 1B). Zawiesina koloidalna krzemionki jest wtłaczana do kanału dostarczania kulek natychmiast po zwią...

Dyskusja

Podążając za powszechnym schematem projektowania urządzeń do badania nanofluidyki, wyprodukowaliśmy połączenie nanofluidyczne między dwoma kanałami mikroprzepływowymi, wykorzystując samoorganizację koloidalnych nanocząstek napędzaną parowaniem zamiast litograficznego modelowania układu nanokanałów. Podczas przepływu cząstek koloidalnych do kanału dostarczania kulek, układ nanopułapek o głębokości 700 nm i szerokości 2 μm po obu stronach kanału dostarczania kulek o całkowitej szerokości 100 μm zapobiegał przepływowi zawie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól sodowa poli(kwasu styrenosulfonowego)	Polysciences	08772
Roztwór poli(alliloaminy) Sigma	Aldrich	479144-5G
Mikrosfera krzemionkowa - 300 nm	Polysciences	24321
Mikrosfera krzemionkowa - 500 nm	Polysciences	24323
Mikrosfera krzemionkowa karboksylowa funkcyjna - 500 nm	Polysciences	24753
Mikrosfera krzemionkowa Amina Funkcjonalna - 500 nm	Polysciences	24756
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning
Trichlorosilan	Sigma Aldrich	175552
Myjka ultradźwiękowa	Branson	3510
Tube Rotator	VWR	10136-084
Mieszalnik wirowy	Mikrowirówka WiseMix	VM-10
	VWR	Micro 1207
plazmowa	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Piekarnik	Thinky	ARE-250
Thermo	Scientific	PR305220M
Mikroskop	epifluorescencyjnyAparat CCD Nikon	Eclipse Ti
Andor		Clara
Platynowe elektrody	Alfa Aesar	43014
Miernik źródła Multimetr	cyfrowy Keithley	2400
	Extech	410
Szkiełka mikroskopowe	Thermo Scientific	2951-001
Tween 20	Merck Millipore	822184
Chlorek sodu	Fisher Scientific	7646-14-5
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma Aldrich	71505
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma Aldrich	S3264
DNA	IDT		CAA CCG ATG CCA CAT TAG CTA
C B-Phycoerythrin	Life Technologies	P-800
Dynamiczny system rozpraszania światła do pomiaru potencjału Zeta	Malvern	Zetasizer Nano S
Photoresist	Shipley	SPR700-1.0
Litografia projekcyjna	Nikon	NSR2005i9
Reaktywny wytrawiacz jonowy	Zastosowane materiały	AME P5000
ICP głęboko reaktywny wytrawiacz jonowy	STS	STS-6"
Litografia kontaktowa	Wizje elektroniczne	EV620
Fotorezystor Powlekarka	Deweloper SSI	SSI 150
Bezkontaktowy profilometr powierzchni	Wyko	NT 9800