Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Streszczenie

Proces kiełkowania endospor u Clostridium difficile i innych Clostridii coraz częściej różni się od modelowej bakterii tworzącej przetrwalniki, Bacillus subtilis. Kiełkowanie jest wywoływane przez drobnocząsteczkowe kiełkowniki i zachodzi bez potrzeby syntezy makromolekularnej. Chociaż istnieją różnice między mechanizmami kiełkowania zarodników u gatunków Bacillus i Clostridium, powszechnym wymogiem jest hydroliza kory podobnej do peptydoglikanu, która umożliwia pęcznienie i ponowne nawodnienie rdzenia zarodników. Po nawodnieniu może rozpocząć się metabolizm, co ostatecznie prowadzi do wzrostu komórki wegetatywnej. Wykrycie zhydrolizowanych fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania zarodników może być trudne, a modyfikacje wcześniej opisanych testów mogą być mylące lub trudne do odtworzenia. W związku z tym, opierając się na naszym ostatnim raporcie wykorzystującym ten test, szczegółowo opisujemy krok po kroku protokół kolorymetrycznego wykrywania fragmentów kory podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wprowadzenie

Endospory to metabolicznie uśpione formy bakterii, które pozwalają bakteriom przetrwać w niekorzystnym środowisku. U wielu bakterii przetrwalnikowych tworzenie się przetrwalników jest indukowane przez brak składników odżywczych, ale proces ten może być kontrolowany przez zmiany pH, ekspozycję na tlen lub inne stresy¹. W metabolicznie uśpionej formie przetrwalników bakterie są odporne na promieniowanie UV, wysuszenie, wyższe temperatury i zamrażanie². Większość wiedzy na temat procesu zarodnikowania pochodzi z badań na organizmie modelowym, Bacillus subtilis. Proces zarodnikowania rozpoczyna się od replikacji DNA i utworzenia włókna osiowego^3,4. Asymetryczna przegroda dzieli następnie komórkę na dwa przedziały o nierównej wielkości. Większy przedział, komórka macierzysta, pochłania mniejszy przedział, przedspornik. Zarówno komórka macierzysta, jak i przedzarodnik koordynują ekspresję genów, aby dojrzeć zarodnik, a komórka macierzysta ostatecznie ulega lizie, uwalniając uśpiony zarodnik do otaczającego środowiska¹.

Struktura i skład zarodników jest zachowana u wielu gatunków bakterii. Rdzeń zarodnika ma niższą zawartość wody niż komórka wegetatywna i jest bogaty w kwas dipikolinowy (DPA)^1,2. Podczas tworzenia zarodników DPA jest pompowany do rdzenia zarodników w zamian za wodę. Wokół rdzenia znajduje się wewnętrzna błona zarodników, w której u większości bakterii tworzących przetrwalniki znajdują się receptory rozpoznające małe cząsteczki stymulujące kiełkowanie (kiełkowniki)². Tuż za wewnętrzną błoną zarodnika znajduje się warstwa peptydoglikanu ściany komórkowej. Wyspecjalizowana warstwa peptydoglikanu (kora) otacza peptydoglikan ściany komórkowej i składa się z wielu tych samych składników, co peptydoglikan ściany komórkowej [naprzemiennie N-acetyloglukozamina (NAG) i kwas N-acetylomuraminowy (NAM)]. Jednak około 50% reszt NAM w korze zostało przekształconych w^{δ-laktam-5,6} muramino-laktamowy. Podczas kiełkowania zarodników te reszty muraminowo-δ-laktamowe są rozpoznawane przez enzymy lityczne kory przetrwalników (SCLE), umożliwiając w ten sposób degradację kory (proces niezbędny do całkowitego kiełkowania), ale nie ściany komórkowej. Wokół kory znajduje się błona zewnętrzna i kilka warstw białek płaszcza ².

Kontrolowanie procesu kiełkowania jest niezwykle ważne dla bakterii tworzących przetrwalniki. Kiełkowanie jest inicjowane, gdy receptory zarodkowe wchodzą w interakcję z odpowiednimi germinentami². W wielu bakteriach przetrwalnikowych tymi kiełkownikami są aminokwasy, cukry, nukleotydy, jony lub ich kombinacje². Kiełkowanie przetrwalników C. difficile jest inicjowane przez połączenie niektórych kwasów żółciowych [np. kwasu taurocholowego (TA)] i aminokwasów (np. glicyny)^7-10. Chociaż istnieją różnice między szlakiem kiełkowania C. difficile a szlakami badanymi u innych bakterii przetrwalnikowych, takich jak B. subtilis, wspólnym dla wszystkich jest bezwzględny wymóg degradacji kory zarodników, aby umożliwić wzrost komórki wegetatywnej z kiełkującego zarodnika^2,8. Degradacja kory mózgowej może być dokonana przez SCLE CwlJ/SleB (jak w B. subtilis) lub SleC (jak w wielu Clostridia). Hydroliza kory mózgowej zmniejsza ograniczenie ściany komórkowej i zarodników. Pozwala to na pełne nawodnienie rdzenia, co jest niezbędnym krokiem w reaktywacji wielu białek niezbędnych do metabolizmu komórkowego ².

Gdy zarodniki kiełkują, uśpione zarodniki przechodzą ze stanu jasnego fazowo na stan ciemny fazowo, a proces ten może być mierzony przez zmianę gęstości optycznej (OD) przy 600 nm¹¹. Poprzedni raport sugeruje, że duża część tej zmiany w OD jest spowodowana uwolnieniem DPA z zarodnika¹². Podczas naszego ostatniego badania staraliśmy się porównać czas kiełkowania zarodników C. difficile i monitorowaliśmy uwalnianie DPA i fragmentów kory⁹. W tym badaniu kluczowe znaczenie miało monitorowanie uwalniania fragmentów kory mózgowej, gdy zaczęły one być uwalniane przez kiełkujące zarodniki.

Test kolorymetryczny użyty tutaj opierał się na metodzie wykrywania cukrów z końcami redukującymi, opracowanej przez Ghuysena i wsp. ¹³. Ze względu na to, że inni opisali protokoły wykrywania cukrów redukujących¹⁴ lub zmodyfikowali te protokoły¹⁵, literatura na ten temat może być myląca. W tym miejscu szczegółowo opisujemy krok po kroku metodę kolorymetrycznego wykrywania cukrów redukujących uwolnionych z kiełkujących zarodników C. difficile. Chociaż w tym badaniu wykorzystano zarodniki C. difficile, cukry redukujące uwalniane podczas kiełkowania zarodników innych bakterii tworzących przetrwalniki można wykryć za pomocą tego protokołu^9,16,17.

Protokół

1. Generowanie próbek

1. Podgrzewać aktywować zarodniki C. difficile w temperaturze 65 °C przez 30 minut i przechowywać na lodzie.
   Uwaga: Zarodniki C. difficile mogą być wytwarzane i oczyszczane w sposób opisany wcześniej^7,9,10.
2. Przygotować roztwór do kiełkowania w temperaturze X + 1 ml, gdzie X jest liczbą próbek, które należy pobrać podczas oznaczania.
   Uwaga: Roztwór do kiełkowania jest specyficzny dla badanych gatunków zarodników bakterii. Do oznaczania kiełkowania zarodników C. difficile użyliśmy roztworu 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glicyny i 10 mM kwasu taurocholowego w wodzie dejonizowanej.
3. Przed rozpoczęciem testu należy pobrać 1,0 ml próbki roztworu do kiełkowania bez zarodników, która posłuży jako ślepa próba do wykrywania fragmentów kory
.
4. Dodaj zarodniki do OD₆₀₀ ~3,0 do roztworu do kiełkowania i szybko wiruj.
   Uwaga: Do naszych badań kiełkowania B. subtilis użyliśmy tych samych zarodników OD₆₀₀, co w przypadku C. difficile.
   Uwaga: Ta ilość zarodników dobrze sprawdzała się w monitorowaniu uwalniania fragmentów kory podczas kiełkowania zarodników C. difficile. Ilość zarodników użytych w tym teście powinna być określona doświadczalnie dla każdej bakterii lub szczepu.
5. Natychmiast po dodaniu zarodników usunąć próbkę o objętości 1,2 ml i odwirować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w temperaturze 14 000 × g. To jest zerowy punkt czasowy.
6. Przenieść 1,0 ml supernatantu z odwirowanej próbki do świeżej probówki w celu późniejszej analizy fragmentów kory.
   Uwaga: Jeżeli DPA wymaga monitorowania, należy pobrać oddzielną próbkę o objętości 100 μl w celu wykrycia DPA w roztworze przy użyciu testu opartego na fluorescencji terbu^9,18,19.
7. Pobraną próbkę zamrozić w temperaturze -80 °C.
8. Powtarzaj kroki 1.4 i 1.5 w regularnych odstępach czasu, aż wszystkie punkty czasu zostaną ukończone.
   Uwaga: Ze względu na czas potrzebny na odwirowanie i pobranie próbek, punkty czasowe oddalone od siebie o mniej niż 2 minuty nie były możliwe podczas naszej procedury, więc nasze odstępy między próbkami były raz na 2 minuty przez 14 minut.
9. Jako kontrolę pozytywną w celu zmniejszenia wykrywania i oznaczania ilościowego cukrów, należy uwzględnić następujące ilości N-acetyloglukozaminy (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 i 5 000. Przygotuj te próbki w tym samym czasie, co próbki kory mózgowej i biegnij razem z próbkami kory mózgowej, tak aby krzywa standardowa była istotna dla danych generowanych przez kiełkujące zarodniki.
10. Po pobraniu wszystkich próbek w punktach czasowych liofilizuj próbki.
    Uwaga: Nasze próbki poddaliśmy liofilizacji w probówkach z nakrętką o pojemności 2 ml.

2. Pomiar fragmentów kory mózgowej

1. Zawiesić liofilizowane próbki w 120 μl 3 N HCl uzupełnionego 1% fenolem i 0,5% β-merkaptoetanolem.
2. Przenieść zawieszone próbki do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml.
   Uwaga: Aby zapewnić powtarzalność, upewnij się, że cała liofilizowana próbka została ponownie zawieszona i przeniesiona.
3. Próbki inkubować w recyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 95 °C przez 4 godziny.
4. Po inkubacji umieścić próbki na lodzie, aż ostygną.
5. Zneutralizować próbki za pomocą 120 μl 3 M NaOH.
6. Do każdej próbki dodać 80 μl nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i 80 μl 5% roztworu bezwodnika octowego i odwirować.
7. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
8. Przenieść próbki z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na DOKŁADNIE 3 minuty
   Uwaga: Ten krok jest wrażliwy na czas, a dłuższe czasy mogą mieć wpływ na rozwój sygnału podrzędnego.
9. Wyjąć próbki z łaźni wodnej i schłodzić na lodzie.
10. Dodać 400 μl 6,54% K₂B₄O₇·4H₂O do każdej probówki i wirować.
11. Próbki inkubować w recyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 95 °C DOKŁADNIE przez 7 minut
    Uwaga: Ten krok jest wrażliwy na czas, a dłuższe czasy mogą mieć wpływ na rozwój sygnału podrzędnego.
12. Usuń próbki i umieść je na lodzie na 5 minut.

3. Odczynnik barwny

1. Gdy próbki znajdują się na lodzie (krok 2.12), przygotuj odczynnik barwiący. Rozpuścić 0,320 g p-dimetyloaminobenzaldehydu (DMAB; Odczynnik Ehrlicha) w 1,9 ml lodowatego kwasu octowego.
   Uwaga: Odczynnik jest wrażliwy na czas, temperaturę i światło i nie powinien być wykonywany z wyprzedzeniem.
2. Po całkowitym rozpuszczeniu DMAB dodać 100 μl 10 N HCl i odwirować.
3. Dodać 5 ml lodowatego kwasu octowego i odwirować.

4. Reakcja kolorymetryczna

1. Przenieś 100 μl każdej schłodzonej próbki kory do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Do każdej próbki dodać 700 μl świeżo przygotowanego roztworu barwnego.
3. Natychmiast przenieść próbki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować DOKŁADNIE przez 20 minut.
4. Przenieść 200 μl każdej próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę.
5. Oznacz ilościowo próbki przy długości fali 585 nm na czytniku płytek. Próbki powinny zaczynać się od żółtego koloru, a pozytywna reakcja zmieni się w fioletową. Im więcej kory mózgowej, tym głębszy fioletowy kolor.

Wyniki

Tabela 1 pokazuje typowe wyniki przy użyciu standardów NAG. Dane są używane do generowania krzywej standardowej. Tabela 2 przedstawia typowe wyniki testu kiełkowania w buforze do kiełkowania uzupełnionym 100 mM glicyny i 10 mM TA (warunki sprzyjające kiełkowaniu) lub tylko 100 mM glicyny (warunki niekiełkowania). Pod nieobecność TA, zarodniki C. difficile nie kiełkują, a obecność fragmentów kory w roztworze jest niewielka. Jednak w obecności zaró...

Dyskusja

Po stymulacji zarodniki poddawane procesowi kiełkowania tracą swoje właściwości odpornościowe bez konieczności syntezy makromolekularnej. Kiedy wyzwalane jest kiełkowanie zarodników, rdzeń zarodnika uwalnia DPA w zamian za wodę². Ze względu na wysoką zawartość DPA w uśpionym zarodniku, rdzeń zarodnika znajduje się pod intensywnym ciśnieniem osmotycznym, a wyspecjalizowany peptydoglikan, kora, pomaga zapobiegać pęcznieniu rdzenia, działając, przypuszczalnie, jako bariera dla ekspansji².

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka z nakrętką 2,0 ml	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μ l końcówki do pipet	VWR	89079-486
1 - 200 μ Końcówki do pipet VWR		89079-458
N-acetylo-D-glukozamina	Sigma	A3286-25G
Kwas solny - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
Bezwodnik octowy	Alfa Aesar	L04295
Wodorowęglan sodu	BDH	BDH0280-500G
Tetraboran potasu Tetrahydrat	Alfa Aesar	39435
Wodorotlenek sodu	BDH	BDH8019-500G
4-(dimetyloamino)benzaldehyd	Sigma	156477-100G
Nasycony fenol	Fisher	BP1750-400
2-merkaptoetanol	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Urządzenia molekularne
Kwas octowy, lodowaty	BDH	BDH3098-3.8LP
Podgrzewana, obiegowa kąpiel wodna	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 dobrze przezroczyste płytki do hodowli tkankowych
Probówki hodowlane	VWR	89000-506
Liofilizator
Bloki
Maszyna	wirowa