Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Proces kiełkowania endospor u Clostridium difficile i innych Clostridii coraz częściej różni się od modelowej bakterii tworzącej przetrwalniki, Bacillus subtilis. Kiełkowanie jest wywoływane przez drobnocząsteczkowe kiełkowniki i zachodzi bez potrzeby syntezy makromolekularnej. Chociaż istnieją różnice między mechanizmami kiełkowania zarodników u gatunków Bacillus i Clostridium, powszechnym wymogiem jest hydroliza kory podobnej do peptydoglikanu, która umożliwia pęcznienie i ponowne nawodnienie rdzenia zarodników. Po nawodnieniu może rozpocząć się metabolizm, co ostatecznie prowadzi do wzrostu komórki wegetatywnej. Wykrycie zhydrolizowanych fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania zarodników może być trudne, a modyfikacje wcześniej opisanych testów mogą być mylące lub trudne do odtworzenia. W związku z tym, opierając się na naszym ostatnim raporcie wykorzystującym ten test, szczegółowo opisujemy krok po kroku protokół kolorymetrycznego wykrywania fragmentów kory podczas kiełkowania zarodników bakterii.
Wprowadzenie
Endospory to metabolicznie uśpione formy bakterii, które pozwalają bakteriom przetrwać w niekorzystnym środowisku. U wielu bakterii przetrwalnikowych tworzenie się przetrwalników jest indukowane przez brak składników odżywczych, ale proces ten może być kontrolowany przez zmiany pH, ekspozycję na tlen lub inne stresy1. W metabolicznie uśpionej formie przetrwalników bakterie są odporne na promieniowanie UV, wysuszenie, wyższe temperatury i zamrażanie2. Większość wiedzy na temat procesu zarodnikowania pochodzi z badań na organizmie modelowym, Bacillus subtilis. Proces zarodnikowania rozpoczyna się od replikacji DNA i utworzenia włókna osiow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generowanie próbek
- Podgrzewać aktywować zarodniki C. difficile w temperaturze 65 °C przez 30 minut i przechowywać na lodzie.
Uwaga: Zarodniki C. difficile mogą być wytwarzane i oczyszczane w sposób opisany wcześniej7,9,10. - Przygotować roztwór do kiełkowania w temperaturze X + 1 ml, gdzie X jest liczbą próbek, które należy pobrać podczas oznaczania.
Uwaga: Roztwór do kiełkowania jest specyficzny dla badanych gatunków zarodników bakterii. Do oznaczania kiełkowania zarodników C. difficile użyliśmy roztworu 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glicyny i 10 mM kwasu taurocholowego w wodzie de....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tabela 1 przedstawia typowe wyniki uzyskane przy użyciu standardów NAG. Dane te są wykorzystywane do wygenerowania krzywej wzorcowej. Tabela 2 przedstawia typowe wyniki testu kiełkowania w buforze do kiełkowania uzupełnionym o 10 mM glicyny i 10 mM TA (warunki sprzyjające kiełkowaniu) lub o 100 mM glicyny (warunki niesprzyjające kiełkowaniu). Wobec braku TA przetrwalniki C. difficile nie kiełkują i obecność fragmentów kory w roztworze ulega niewi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Po stymulacji zarodniki poddawane procesowi kiełkowania tracą swoje właściwości odpornościowe bez konieczności syntezy makromolekularnej. Kiedy wyzwalane jest kiełkowanie zarodników, rdzeń zarodnika uwalnia DPA w zamian za wodę2. Ze względu na wysoką zawartość DPA w uśpionym zarodniku, rdzeń zarodnika znajduje się pod intensywnym ciśnieniem osmotycznym, a wyspecjalizowany peptydoglikan, kora, pomaga zapobiegać pęcznieniu rdzenia, działając, przypuszczalnie, jako bariera dla ekspansji2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Opisany projekt jest wspierany przez Nagrodę Numer 5R01AI116895 od Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowych Instytutów Zdrowia.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurka z nakrętką 2,0 ml | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf pipet | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μ l końcówki do pipet | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μ Końcówki do pipet VWR | 89079-458 | ||
| N-acetylo-D-glukozamina | Sigma | A3286-25G | |
| Kwas solny - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| Bezwodnik octowy | Alfa Aesar | L04295 | |
| Wodorowęglan sodu | BDH | BDH0280-500G | |
| Tetraboran potasu Tetrahydrat | Alfa Aesar | 39435 | |
| Wodorotlenek sodu | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(dimetyloamino)benzaldehyd | Sigma | 156477-100G | |
| Nasycony fenol | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-merkaptoetanol | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Urządzenia molekularne | ||
| Kwas octowy, lodowaty | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| Podgrzewana, obiegowa kąpiel wodna | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 dobrze przezroczyste płytki do hodowli tkankowych |
| Probówki hodowlane | VWR | 89000-506 | |
| Liofilizator | |||
| Bloki | |||
| Maszyna | wirowa |
Bibliografia
- Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation. Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species:....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Wykrywanie fragmentów koryprzetrwalniki Clostridium difficileoznaczanie cukrów redukującychkrzywa wzorcowa N-acetyloglukozaminyprzygotowanie roztworu do kiełkowaniailościowe określanie kiełkowania przetrwalnikówkolorymetryczna metoda detekcjikwas taurocholowy jako czynnik wyzwalający kiełkowaniehydroliza peptydoglikanu
