Method Article

Opracowanie wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelit człowieka hodowanej w warunkach mikrograwitacji

DOI:

10.3791/54148

⸱

July 25th, 2016

 ,  , 
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki rosnące w środowisku trójwymiarowym (3D) reprezentują wyraźną poprawę w stosunku do hodowli komórek w środowiskach 2D (np. kolby lub szalki). W tym artykule opisano rozwój wielokomórkowego 3-wymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej jelita ludzkiego hodowanej w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktory o obrotowych ściankach i naczyniach (RWV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ komórki rosnące w trójwymiarowym (3-D) środowisku mają potencjał, aby wypełnić wiele luk w hodowli komórek w środowiskach 2-D (np. kolbach lub szalkach). W rzeczywistości powszechnie uznaje się, że komórki hodowane w kolbach lub szalkach mają tendencję do różnicowania się i utraty wyspecjalizowanych cech tkanek, z których pochodzą. Obecnie istnieją głównie dwa rodzaje systemów hodowli 3D, w których komórki są umieszczane w rusztowaniach naśladujących natywną macierz zewnątrzkomórkową (ECM): (a) modele statyczne i (b) modele wykorzystujące bioreaktory. Pierwszym przełomem były statyczne modele 3D. Modele 3D wykorzystujące bioreaktory, takie jak bioreaktory o obrotowych ściankach i zbiornikach (RWV), są nowszym osiągnięciem. Oryginalna koncepcja bioreaktorów RWV została opracowana w NASA Johnson Space Center na początku lat 90. i uważa się, że przezwycięża ograniczenia modeli statycznych, takie jak rozwój niedotlenionych, martwiczych rdzeni. Bioreaktory RWV mogą obejść ten problem, zapewniając dynamikę płynów, która umożliwia efektywną dyfuzję składników odżywczych i tlenu. Bioreaktory te składają się z podstawy rotatora, która służy do podtrzymywania i obracania dwóch różnych formatów naczyń hodowlanych, które różnią się typem źródła napowietrzania: (1) wolno obracające się naczynia boczne (STLV) ze współosiowym natleniaczem pośrodku lub (2) naczynia o wysokim współczynniku kształtu (HARV) z natlenianiem za pomocą płaskiej membrany do przenoszenia gazu z kauczuku silikonowego. Zbiorniki te umożliwiają wydajny transfer gazu przy jednoczesnym unikaniu tworzenia się pęcherzyków i wynikających z tego turbulencji. Warunki te skutkują przepływem laminarnym i minimalną siłą ścinającą, która modeluje zmniejszoną grawitację (mikrograwitację) wewnątrz naczynia hodowlanego. W niniejszym artykule opisano opracowanie wielokomórkowego 3-D organotypowego modelu błony śluzowej jelita ludzkiego składającego się z linii komórek nabłonka jelitowego oraz pierwotnych ludzkich limfocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów hodowanych w warunkach mikrograwitacji dostarczanych przez bioreaktor RWV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszy przełom w budowie modelu 3D został odnotowany na początku lat 80., kiedy naukowcy zaczęli badać różne typy rusztowań (np. lamininę, kolagen typu I, kolagen IV i fibronektynę) oraz koktajle czynników wzrostu, aby poprawić interakcje komórka-komórka i ECM w "statycznych" modelach 3D1-7. Od tego czasu głównym problemem związanym z tymi modelami były ograniczenia w przenoszeniu składników odżywczych i tlenu w pożywce i konstruktach tkankowych8. W przeciwieństwie do komórek w środowisku in vivo, które otrzymuje stały przepływ składników odżywczych i tlenu z otaczających sieci naczyń krwionośnych, statyczny charakter tych modeli utrudnia ich efektywną dystrybucję do komórek. Na przykład agregaty komórkowe generowane w modelach statycznych in vitro, które przekraczają kilka milimetrów, niezmiennie rozwijają niedotlenione, martwicze jądra9. Bioreaktory RWV mogą obejść ten problem, zapewniając dynamikę płynów, która umożliwia wydajną dyfuzję składników odżywczych i tlenu 10-12. Jednak do tej pory prace z wykorzystaniem bioreaktorów RWV ograniczały się do włączenia jednego lub dwóch typów komórek 13-17. Co więcej, zamiast orientacji przestrzennej podobnej do tkanek natywnych, komórki te tworzyły agregaty komórkowe. Głównym powodem tych ograniczeń był brak rusztowania zdolnego do zintegrowanego łączenia komórek. Rusztowania stosowane do tej pory w bioreaktorach RWV składają się, z nielicznymi wyjątkami 16-18, głównie z mikrokulek syntetycznych, cylindrów rurowych lub małych arkuszy 13-15,19-23. Są to sztywne materiały, których składem i elastycznością nie można manipulować, a do których komórki są przymocowane do ich powierzchni. W związku z tym jest mało prawdopodobne, że modele te zapewnią system, w którym można będzie oceniać, w sposób zintegrowany, różne składniki komórek, takie jak komórki zrębu (np. fibroblasty, komórki odpornościowe i śródbłonka), które powinny być rozproszone w rusztowaniu, aby ściśle naśladować tkankę ludzką.

Tutaj opisujemy rozwój wielokomórkowego trójwymiarowego modelu organotypowego błony śluzowej ludzkiego jelita, składającego się z linii komórek nabłonka jelitowego oraz pierwotnych ludzkich limfocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów24. Komórki te hodowano w warunkach mikrograwitacji zapewnianej przez bioreaktor RWV 13,25-30. W naszym modelu 3D ECM posiada wiele odrębnych właściwości, takich jak osmolalność podobna do pożywki hodowlanej (np. znikome ograniczenia dyfuzyjne podczas hodowli) oraz zdolność do włączania komórek i innych istotnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej, a także odpowiednią sztywność do stosowania w bioreaktorach24. Systemy biologiczne są bardzo złożone, a w ciągu ostatnich kilku lat nastąpiła zmiana punktu ciężkości badań nad błonami śluzowymi w kierunku badania interakcji komórek z otoczeniem, a nie badania ich w izolacji. W szczególności znaczenie interakcji komórka-komórka w wpływie na przeżycie i różnicowanie komórek jelitowych jest dobrze udokumentowane 31-34. W szczególności komunikacja między komórkami nabłonkowymi a ich niszą ma głęboki wpływ na ekspansję i różnicowanie komórek nabłonka 35. Rzeczywiście, powszechnie przyjmuje się, że nie tylko interakcje między komórkami, ale także między komórkami mają kluczowe znaczenie dla utrzymania i różnicowania komórek nabłonkowych w modelach hodowli 3D. Wcześniejsze badania wykazały, że białka jelitowe ECM, takie jak kolagen I 24,36,37, laminina 38 i fibronektyna 39, odgrywają zasadniczą rolę w wpływaniu na komórki nabłonka jelitowego w celu uzyskania orientacji przestrzennej podobnej do natywnej błony śluzowej. W związku z tym rozwój nowych technologii, takich jak nasz model 3D24, które mogą naśladować różnorodność fenotypową jelit, jest konieczny, jeśli naukowcy zamierzają odtworzyć złożoną architekturę komórkową i strukturalną oraz funkcję mikrośrodowiska jelitowego. Modele te stanowią ważne narzędzie w opracowywaniu i ocenie nowych leków doustnych i potencjalnych szczepionek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie próbki krwi zostały pobrane od ochotników, którzy uczestniczyli w protokole o numerze HP-00040025-1. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu Maryland zatwierdziła ten protokół i zezwoliła na pobranie próbek krwi od zdrowych ochotników do badań zawartych w tym manuskrypcie. Cel tego badania został wyjaśniony ochotnikom, a wszyscy ochotnicy wyrazili świadomą, podpisaną zgodę przed pobraniem krwi.

Uwaga: Patrz Tabela 1 dla przygotowania pożywki suplementu. Patrz Tabela 2 w celu przygotowania pożywek 3-D.

1. Przygotowanie naczyń hodowlanych

  1. Odkręcić nakrętkę otworu napełniania naczynia o pojemności 50 ml i napełnić 50 ml sterylnej pożywki hodowlanej (np. RPMI). Wszystkie zabiegi wykonuj w sterylnych warunkach w okapie laminarnym.
  2. Załóż nakrętkę i wytrzyj rozlane medium na dowolnej powierzchni 70% etanolem.
  3. Pozostawić naczynie do inkubacji przez co najmniej 15 minut do O/N przy suchej temperaturze rynkowej.
  4. Użyj portu do napełniania, aby wyrzucić pożywkę hodowlaną i dodać 30 ml pożywki 3D.
  5. Wytrzyj rozlane medium na dowolnej powierzchni 70% etanolem.

2. Przygotowanie komórek

  1. Ludzka linia komórek nabłonkowych (HCT-8)24,40.
    1. Komórki hodowlane w RPMI uzupełnione 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 50 μg/ml gentamycyny, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM buforu HEPES i 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (suplement 1). Przy 70% konfluencji podziel komórki w stosunku 1:5.
  2. Ludzkie fibroblasty okrężnicy (komórki CCD-18Co)24,41.
    1. Hodowla komórek w pożywce Basal Eagle wzbogacona o suplement 1. Przy zbieganiu podziel komórki w stosunku 1:3.
  3. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)24,42.
    1. Hodowla komórek w pożywce Endothelial Basal Medium (EBM) wzbogacona o 100 μg/ml heparyny, 3 μg/ml suplement wzrostu komórek śródbłonka (ECGS) i suplement 1. Przy 70% konfluencji podziel komórki w stosunku 1:2.
  4. Limfocyty/monocyty
    1. Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) z krwi przez wirowanie w gradiacji gęstości przy użyciu standardowych technik43.
      1. Krótko, używając pipety o pojemności 10 ml, ostrożnie dodać 30 ml rozcieńczonej krwi (krew 1:1: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki wirowej o dużej gęstości. Po etapie wirowania limfocyty i monocyty będą znajdować się w "białej" warstwie między pożywką wirującą o gęstości a warstwami osocza.
      2. Zebrać białą warstwę za pomocą pipety transferowej. Unikaj zanieczyszczenia granulocytów, ograniczając zbieranie pożywki wirowej o dużej gęstości. Po umyciu43 należy użyć PBMC w takim stanie, w jakim jest, lub w stanie kriokonserwowanym w płynie N2,
        Uwaga: Należy podkreślić, że PBMC w dużej mierze składa się z limfocytów i monocytów, z niewielkim udziałem komórek dendrytycznych i innych typów komórek.
  5. Hodować wszystkie komórki w standardowych warunkach hodowli w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5% CO2 .

3. Przygotowanie komórek osadzonych w kolagenie

  1. Określ liczbę potrzebnych wkładek na podstawie liczby warunków eksperymentalnych, które należy ustawić. Umieść odpowiednią liczbę wkładek w dołkach płytki 6-dołkowej.
  2. Przygotować zawiesinę HUVEC i fibroblastów:
    1. Przemyć kolby dwukrotnie w PBS i odłączyć komórki za pomocą trypsyny, 0,25% (1x) z 0,05% etylenodiaminotetraoctanu trypsyny i tetrasodu (Trypsin-EDTA). Dodaj tyle roztworu trypsyny, aby pokryć całą powierzchnię hodowli komórkowej. Oderwanie następuje zwykle w ciągu 5 do 15 minut
    2. Zebrać oderwane komórki w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml pożywki Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) -30% pożywki FBS.
    3. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 10 minut.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 30 ml pożywki DMEM-30% FBS.
    5. Policz całkowitą liczbę żywotnych komórek, rozcieńczając 20 μl zawieszonych komórek 20 μl barwnika błękitu trypanowego. Załaduj hemocytometr mieszaniną komórek. Żywotne PBMC będą białe czyste; nieżywotny PBMC uzyska barwnik i stanie się niebieski.
      1. Ponownie zawiesić każdy typ komórek w pożywce DMEM-30% FBS o stężeniu 5 - 8 x 107 komórek ml- 1.
  3. Przygotuj komórkowe żele kolagenowe
    nuta: Każde naczynie będzie wymagało przygotowania ~5 ml żelu kolagenowego zawierającego komórki.
    1. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml przygotuj mieszaninę kolagenu, dodając 1 x pożywkę DMEM, uzupełnioną 50 μg/ml gentamycyny, 2 mM L-glutaminy i 10% inaktywowanego termicznie FBS oraz 3 mg/ml kolagenu bydlęcego-I, 10 μg/ml lamininy, 40 μg/ml kolagenu IV, 10 μg/ml fibronektyny, 2 μg/ml proteoglikanu siarczanu heparyny i 15 mM NaOH (w celu osiągnięcia fizjologicznego pH).
    2. Zamknij probówkę i wymieszaj, odwracając kilka razy, aż mieszanina będzie w pełni homogenizowana. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.
      WAŻNE: Trzymaj mieszaninę na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.
      1. Krok krytyczny: Jeśli mieszanina ma kwaśny wygląd (żółtawy kolor), dodaj kilka kropli sterylnego 1 N NaOH, aby zneutralizować mieszaninę.
    3. Do mieszaniny wzbogaconego kolagenu (opisanej powyżej) dodać odpowiednio skoncentrowany HUVEC i fibroblasty o gęstości 1,0 - 1,2 i 1,5 - 2,0 x 106 komórek/ml. Zamknij probówki i wymieszaj, odwracając kilka razy, aż mieszanina będzie w pełni homogenizowana. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. WAŻNE: Trzymaj mieszaninę na lodzie, aby zapobiec żelowaniu.
    4. Dodaj 4 - 5 ml komórkowego żelu kolagenowego do każdej wkładki, uprzednio załadowanej do płytki 6-dołkowej i pozostaw do żelowania w kapturze z niewielkim lub żadnym ruchem przez 1 godzinę.
    5. Po 1 godzinie przenieść 6-dołkową płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na dodatkowe 1-2 godziny.
    6. Umieść 6-dołkową płytkę z powrotem w kapturze i za pomocą sterylnych kleszczyków i skalpela aseptycznie odetnij membranę od wkładki, odrywając od niej żel zawierający komórki. Pokrój oderwany żel na małe kwadraty (~5 x 5 mm).
    7. Dodaj małe kwadraty zawierające komórki do 50-mililitrowego HARV za pomocą portu napełniania.
  4. Przygotować zawiesinę komórek nabłonka HCT-8:
    1. Umyć kolby dwukrotnie w PBS i odłączyć komórki za pomocą trypsyny, 0,25% (1x) z traktowaniem Trypsyny-EDTA. Dodaj tyle roztworu trypsyny, aby pokryć całą powierzchnię hodowli komórkowej. Oderwanie następuje zwykle w ciągu 10 do 15 minut.
    2. Zebrać oderwane komórki w 30 ml pożywki DMEM-30% FBS.
    3. Wirówka DMEM-30% FBS zawierająca probówkę o pojemności 500 x g przez 10 min.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 30 ml pożywki DMEM-30% FBS.
    5. Policz całkowitą liczbę żywotnych komórek, jak opisano w ppkt 3.2.5.
    6. Zawiesić komórki nabłonkowe HCT-8 w pożywce DMEM-30% FBS w stężeniu 107 komórek ml-1.
    7. Dodać 1 ml skoncentrowanych komórek nabłonka HCT-8 do 50 ml HARV za pomocą portu napełniania.
  5. Korzystając z portu napełniania, dodaj dodatkową pożywkę hodowlaną 3D, aż naczynie będzie prawie pełne (~20 ml).
  6. Załóż korek i przetrzyj krawędź portu napełniania 70% etanolem.
  7. Umieścić strzykawkę w każdym porcie strzykawki RWV: umieścić strzykawkę o pojemności 5 ml zawierającą 3-4 ml pożywki 3-D w jednym porcie, a pustą strzykawkę o pojemności 5 ml w drugim porcie.
  8. Usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki, wciągając do pustej strzykawki, podczas gdy mniej więcej taka sama objętość pożywki jest wstrzykiwana przez drugi port strzykawki.
  9. Umieść naczynia w bioreaktorze, włącz zasilanie i ustaw prędkość na około 13 do 14 obrotów na minutę.
    Uwaga: Krok krytyczny: Szybkość rotacji może być konieczna kilkukrotna regulacja podczas eksperymentu, aby utrzymać komórki krążące w naczyniu, unikając w ten sposób kontaktu ze ściankami naczynia.
  10. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w warunkach mikrograwitacji, dostarczana przez bioreaktor RWV.
  11. Zmieniaj pożywkę co 3-4 dni, zastępując około 30 ml świeżą pożywką 3-D.
  12. Po 4 dniach (±1 dniu) wyjmij naczynia z bioreaktora i dodaj limfocyty/monocyty do naczyń (2 x 107/naczynie).
  13. Umieścić naczynia z powrotem w bioreaktorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na dodatkowe 5 dni (±1 dzień).
  14. Po dodatkowych 5 dniach (9 dzień hodowli) dodaj limfocyty/monocyty do naczyń (2 x 107 / naczynie) i kontynuuj hodowle przez maksymalnie 12 dodatkowych dni.
  15. Zmieniaj pożywkę co 3-4 dni, zastępując około 30 ml świeżą pożywką 3-D.

4. Pobieranie kultur 3D do badań histologicznych

  1. Za pomocą pipety transferowej zebrać każdy mały fragment żelu, zwany teraz "konstruktem", do sześciodołkowej płytki zawierającej 10 ml 10% buforu formaliny. Pozostawić na 3 godziny w temperaturze pokojowej lub na 12 - 16 godzin w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj kasety do przetwarzania tkanek i zatapiania, etykietując i dodając dwa kawałki podkładek piankowych do biopsji do każdej kasety.
  3. Zanurz kasety w 10% buforze formalinowym.
  4. Za pomocą kleszczy umieść stałe konstrukcje między dwiema piankowymi podkładkami.
  5. Zanurz kasety w 10% buforze formalinowym.
  6. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami osadzania, dzielenia i barwienia44.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednio opracowaliśmy wielokomórkowy, trójwymiarowy model organotypowy błony śluzowej ludzkiego jelita, składający się z linii komórek nabłonka jelitowego oraz pierwotnych ludzkich limfocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów hodowanych w warunkach mikrograwitacji24 (Rysunek 1). Fibroblasty i komórki śródbłonka osadzono w matrycy kolagenu I wzbogaconej o dodatkowe białka błony podstawnej jelita45 (tj. lamininę, kolagen IV, fibronektynę i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie opisujemy rozwój bioinżynieryjnego modelu błony śluzowej jelita ludzkiego składającego się z wielu typów komórek, w tym pierwotnych ludzkich limfocytów, fibroblastów i komórek śródbłonka, a także linii komórkowych nabłonka jelitowego24. W tym modelu 3D komórki są hodowane w bogatej w kolagen macierzy zewnątrzkomórkowej w warunkach mikrograwitacji24.

Jak opisano wcześniej, głównymi cechami tego modelu są: (i) zdolność do naśladowania org...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że w Urzędzie Patentów i Znaków Towarowych Stanów Zjednoczonych złożono nietymczasowe zgłoszenie patentowe w USA (numer: 13/360,539).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez NIAID, NIH, DHHS federalne granty badawcze R01 AI036525 i U19 AI082655 (CCHI) dla MBS oraz przez grant NIH DK048373 dla AF. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowych Instytutów Zdrowia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bioreaktor z poczwórnym rotatorem/niezależnym naczyniem o obrotowych ściankach (RWV) SyntheconRCCs-4DQDo 4 zbiorników. Dostępne są również modele z większą lub mniejszą liczbą naczyń.
Jednorazowe naczynie 50 mlSyntheconD-405Pudełko z 4 naczyniami
HCT-8 komórek nabłonkowych Fibroblasty ATCCCCL-244
CCD-18Co ATCCCRL-1459
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowejATCCCRL-1730
Czynnik wzrostu fibroblastów HUVEC-Basic SigmaF0291bFGF
Czynnik komórek macierzystych SigmaS7901SCF
Czynnik wzrostu hepatocytów SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Wyizolowany z mysiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego guza Engelbreth-Holm-Swarm
 SigmaV7259
Czynnik hamujący białaczkę VEGF Santa Cruzsc-4377(LIF
AdeninaSigmaA2786
InsulinaSigmaI-6634
3,3',5-trijodo-L-tyronina SigmaT-6397T3
ToksynaSigmaC-8052
FibronektynaBD354008Wyizolowana z ludzkiego osocza
apo-TransferynaSigmaT-1147
HeparynaSigmaH3149
Siarczan heparanu  proteoglycanSigmaH4777Izolowany z błony podstawnej myszy  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IVSigmaC5533Wyizolowany z ludzkiego łożyska
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca Invitrogen10437-028
D-MEM, puderInvitrogen12800-017
10% formalina– PBS Fisher ScientificSF100-4
Kolagen bydlęcy typu I InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Pirogronian soduInvitrogen11360-070
Gentamycyna Invitrogen15750-060
Penicylina/streptomincyna Invitrogen15140-122
L-glutaminaInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Śródbłonek Basal MediumLonzaCC-3156EBM-2
Suplement na wzrost komórek śródbłonkaMillipore02-102ECGS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
  3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
  4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
  5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
  6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
  7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
  8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
  10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
  11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
  14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
  15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
  16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
  17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
  19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
  20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
  21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
  22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
  23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
  24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
  25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
  26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
  27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
  28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
  29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
  30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
  31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
  32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
  33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
  34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651(2014).
  35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
  36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
  37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814(2014).
  38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
  39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
  40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
  41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
  42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
  43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
  44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064(2014).
  45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
  46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
  47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
  48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
  49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
  50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
  51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Intestinal MucosaMicrogravity CultureRotating Wall Vessel3D Organotypic ModelMulticellular CultureCollagen Gel PreparationCell Isolation TechniqueDual Syringe MethodHistological EmbeddingVillus like Features

Related Articles