Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

Podsumowanie

Izolowane modele pracującego serca mogą być używane do pomiaru wpływu warunków obciążenia, tętna i leków na wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Opisano metody przygotowania modelu pracy lewego serca gryzonia, który pozwala na badanie wydolności skurczowej i rozkurczowej oraz zużycia tlenu w różnych warunkach.

Streszczenie

Izolowane modele pracującego serca zostały wykorzystane do zrozumienia wpływu warunków obciążenia, częstości akcji serca i leków na wydajność mięśnia sercowego w sposób, który nie może być osiągnięty in vivo. Na przykład leki inotropowe często wpływają również na obciążenie wstępne i następcze, co wyklucza niezależną od obciążenia ocenę ich wpływu na mięśnia sercowego in vivo. Dodatkowo model ten pozwala na pobieranie próbek ścieków z zatok wieńcowych bez zanieczyszczenia z ogólnoustrojowego powrotu żylnego, co pozwala na ocenę zużycia tlenu przez mięsień sercowy. Co więcej, pojawienie się zminiaturyzowanych cewników ciśnieniowo-objętościowych pozwoliło na precyzyjne określenie ilościowe markerów zarówno skurczowej, jak i rozkurczowej wydajności. Opisujemy model, w którym lewa komora może być badana podczas wykonywania zarówno pracy objętościowej, jak i ciśnieniowej w kontrolowanych warunkach.

W tej technice, serce i płuca szczura Sprague-Dawley (waga 300-500 g) są usuwane en bloc w znieczuleniu ogólnym. Aorta jest wycinana bez preparacji i kaniulowana w celu perfuzji wstecznej za pomocą natlenionego buforu Krebsa. Tętnice i żyły płucne są podwiązane, a płuca są usuwane z preparatu. Lewy przedsionek jest następnie nacinany i kaniulowany za pomocą oddzielnej kaniuli żylnej, przymocowanej do bloku obciążenia wstępnego. Po ustaleniu, że jest to wolne od wycieków, lewe serce jest obciążane, a perfuzja wsteczna zostaje zatrzymana, tworząc model pracującego serca. Tętnica płucna jest nacinana i kaniulowana w celu zebrania ścieków wieńcowych i określenia zużycia tlenu przez mięsień sercowy. Cewnik ciśnieniowo-objętościowy umieszcza się w lewej komorze wstecznie lub przez nakłucie wierzchołkowe. W razie potrzeby można umieścić przewody stymulujące przedsionki, aby uzyskać bardziej precyzyjną kontrolę tętna. Model ten pozwala na precyzyjną kontrolę napięcia wstępnego (za pomocą bloku ciśnienia w lewym przedsionku), obciążenia następczego (za pomocą bloku obciążenia następczego), tętna (za pomocą przewodów stymulacyjnych) oraz napięcia tlenu (za pomocą mieszanin tlenu w perfuzacie).

Wprowadzenie

Badanie izolowanych narządów pozwala na kontrolę warunków fizjologicznych wykraczających poza to, co jest możliwe in vivo. Preparaty nasercowe ex vivo zostały po raz pierwszy opisane przez Otto Langendorffa^{, który} opisał izolowany model z perfuzją wsteczną. Następnie inni opisali model "pracującego serca", w którym mięsień sercowy wykonuje zarówno pracę ciśnieniową, jak i objętościową. ² Takie preparaty odegrały zasadniczą rolę w wyjaśnieniu mechanizmów działania mięśnia sercowego,3 metabolizmu mięśnia sercowego,4-6 i skutków leków kardiotonicznych. ^7-9

Stosowanie leków zwiększających kurczliwość mięśnia sercowego jest powszechne u pacjentów w stanie krytycznym. Dostępnych jest jednak niewiele danych porównujących względny wpływ tych leków na kurczliwość i zużycie tlenu w mięśniu sercowym, dane, które mogą być przydatne w opiece nad pacjentami z klinicznymi objawami niewydolności serca lub w warunkach pooperacyjnych. ¹⁰ Ponieważ jednak większość leków kardiotonicznych wpływa nie tylko na mięsień sercowy, ale także na opór tętniczek, pojemność żylną¹¹ i tempo metabolizmu ^pacjenta12, izolowane modele serca ex vivo pozostają optymalnym sposobem badania wpływu takich leków na właściwy mięsień sercowy.

Opisujemy użycie modelu ex vivo do niezależnego od obciążenia badania leków inotropowych na czynność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Serca szczurów Sprague Dawley kaniulowano przy użyciu modelu pracującego serca lewej komory i perfuzjono za pomocą zmodyfikowanego perfuzatu Krebs Henseleit. Ciśnienie w aorcie i lewym przedsionku było kontrolowane. Cewniki o impedancji ciśnieniowo-objętościowej umieszczono w lewej komorze poprzez nakłucie wierzchołkowe w celu ciągłego monitorowania funkcji skurczowej i rozkurczowej. Zużycie tlenu mierzono w sposób ciągły jako indeksowaną różnicę w zawartości tlenu między perfuzatem lewego przedsionka a ściekiem z tętnicy płucnej. Leki, które miały być testowane, podawano w infuzji do bloku lewego przedsionka, a zmiany w wydajności serca i metabolizmie tlenu mierzono i porównywano z bezpośrednio poprzedzającą wartością wyjściową.

Protokół

Ten protokół jest wykonywany zgodnie z aktualnym protokołem w ramach komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania zwierząt.

1. Przygotowanie do badania

1. Włączyć łaźnię wodną, aby podgrzać zbiornik buforowy Krebs-Henseleit (KHB) (ustawiony na 42 °C).
2. Przygotować 16 l KHB zawierającego (w mM) 128 NaCl, 5,7 KCl, 1,3_MgSO4, 25 NaHCO₃, 2,7 CaCl₂, 0,53 EDTA, 0,54 NaC,₃H₃O₃ i 10,8 dekstrozy. ¹³ Masy substratu są następujące: 27,584 g NaCl, 1,58 g KCl, 0,578 g_MgSO4, 8,401 g_NaHCO3, 1,47 g CaCl₂, 0,744 g EDTA, 0,22 g NaC₃H₃O₃ i 7,208 g dekstrozy.
   Uwaga: składniki te mogą być przechowywane w stożkowych probówkach w postaci sproszkowanej w celu ich roztworzenia w dniu eksperymentu.
   1. Przefiltruj 4 l wody dejonizowanej przez filtr 0,22 mikrona.
   2. Dodaj 3,7 l tej wody do zlewki o pojemności 4 l. Dodać do wody wszystkie składniki z wyjątkiem CaCl₂.
   3. Rozpuścić CaCl₂ w pozostałych 300 ml wody, używając oddzielnej zlewki.
   4. Natleniać roztwór 95%_O2 / 5% CO₂ w stężeniu 1 l/min (l/min) przez 5 min. To koryguje pH do 7,40 i zwiększa rozpuszczanie CaCl₂.
   5. Dodaj CaCl₂ do pozostałej części KHB.
   6. Dodaj gotowy KHB do zbiornika i cyrkuluj przez wszystkie rurki przez 30 minut. Upewnij się, że system jest wolny od makroskopowych pęcherzyków. Natleniać 95%_O2 / 5% CO₂ przy 0,5 l/min.
      UWAGA: KHB można przechowywać przez noc w lodówce nie dłużej niż 1 - 2 dni, przywrócić do temperatury pokojowej i ponownie przefiltrować do użycia. Nie używaj ponownie KHB między eksperymentami.
   7. Przygotuj 2 czyste zlewki o pojemności 50 ml z lodowatym KHB i umieść je w wiadrze z lodem w pobliżu stacji rozwarstwiania. Upewnij się, że KHB jest lodowato zimny (a nie schłodzony) przed wysadzeniem serca.
   8. Umieść cewnik mikrociśnieniowo-objętościowy (PV) w strzykawce o pojemności 10 ml wypełnionej przefiltrowanym KHB na 30 minut przed kalibracją, zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Temperatura KHB używana do namaczania cewnika PV powinna być jak najbardziej zbliżona do 37 °C.
3. Przygotuj stację anestezjologiczną i preparacyjną dla zwierzęcia.
   1. Zapewnić odpowiednią ilość izofluranu w zbiorniku. Pobrać 500 j. heparyny do strzykawki o pojemności 1 ml; Umieścić igłę o rozmiarze 26 (1/2") na tej strzykawce. Przygotuj maskę do znieczulenia zwierzęcia.
4. Ustaw ciśnienie perfuzji bloku aorty na 80 mmHg, a ciśnienie perfuzji bloku lewego przedsionka (LA) na 10 mmHg. Otwórz zarówno blok aorty, jak i blok LA, aby umożliwić wypłynięcie ciepłego KHB. Kiedy będziesz gotowy do sekcji zwierzęcia, otwórz blok aorty, aby umożliwić równomierne, powolne kapanie KHB.
5. Skalibruj cewnik PV zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Przygotowanie i sekcja zwierząt

UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, upewnij się, że waga zwierzęcia wynosi od 300 do 500 g; stwierdziliśmy, że waga zwierzęcia między 425 a 450 g jest idealna dla naszego systemu.

1. Znieczulić zwierzę w komorze za pomocą izofluranu (1 - 2%) do momentu utraty przytomności. Przenieś zwierzę do stacji preparacyjnej i umieść na zwierzęciu maskę anestezjologiczną z izofluranem i tlenem. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby ocenić poziom sedacji. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
2. Wstrzyknąć heparynę, 500 jednostek dootrzewnowo do jamy brzusznej. Odczekaj 10 minut, aby heparyna się wchłonęła. Zabezpiecz kończyny zwierzęcia taśmą, aby poprawić wizualizację klatki piersiowej.
3. Rozwarstwienie serca.
   1. Po upewnieniu się, że nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, podnieś skórę od jamy brzusznej za pomocą kleszczy, a następnie użyj nożyczek, aby naciąć jamę otrzewnej, podążając za krzywizną przepony z powrotem do tylnego kąta żeber.
   2. Gdy przepona jest widoczna, za pomocą małych nożyczek przetnij wzdłuż przedniej powierzchni przepony zgodnie z kierunkiem wcześniejszych nacięć, aby umożliwić wejście do klatki piersiowej. Każde cięcie wzdłuż linii pachowej rozciągnąć obustronnie do pachy.
      UWAGA: Kolejne kroki należy wykonywać wydajnie, ponieważ wentylacja będzie zakłócona po nacięciu membrany.
   3. Cofnij klatkę piersiową do przodu od wyrostka mieczykowatego za pomocą kleszczy. Naciąć osierdzie i opłucną.
   4. Zidentyfikuj żyłę główną dolną (IVC) i aortę tuż nad przeponą i cofnij je en bloc do przodu za pomocą kleszczy.
   5. Używając dużych, zakrzywionych nożyczek, szybko wykonaj nacięcie w poprzek IVC i aorty, wyciągając serce i płuca z klatki piersiowej en bloc. Przeciąć przełyk, tchawicę, tętnice ramienno-głowowe i żyły głowowe, aby usunąć serce i płuca z klatki piersiowej. Wytnij tkankę grasicy za pomocą tego bloku tkanki. Uważaj, aby nie przeciąć bliższej części aorty wstępującej.
   6. Natychmiast zanurz serce i płuca w lodowatym KHB i przejdź do aparatu Langendorffa, wcześniej ustawionego zgodnie z opisem w kroku 1.

3. Kaniulacja aorty

1. Umieść kompleks płuco-serce w płaskim naczyniu i ustaw serce tak, aby grasica i wielkie naczynia były skierowane w stronę eksperymentatora, a tylna część płuc była skierowana w stronę stołu. Rozsuń dwa płaty grasicy i zidentyfikuj start tętnic ramienno-głowowych z aorty.
   1. Ułóż aortę na krawędzi naczynia i przeciąć aortę małymi nożyczkami około 5 mm powyżej zastawki aortalnej, tuż obok startu prawej tętnicy podobojczykowej.
      UWAGA: Nacięcie powinno dać czysty okrągły okrąg — aorta w przekroju. Jeśli jest pod kątem (tj. szeroki owal) lub niekompletny, powtórz cięcie, aby osiągnąć pożądany efekt. Ułatwi to sprawną kaniulację aorty.
2. Używając 2 par zakrzywionych kleszczyków po obu stronach aorty, poprowadź aortę nad kaniulą aorty (która powinna powoli ociekać KHB). Zastawka aortalna powinna znajdować się 1-2 mm poniżej końcówki kaniuli.
   1. Po kanneulacji aorty ustaw kleszcze prostopadle w poprzek aorty, aby utrzymać aortę na miejscu. Alternatywnie, umieść mały zacisk w poprzek aorty, aby utrzymać kompleks płuco-serce na miejscu, umożliwiając jednemu eksperymentatorowi ukończenie tego modelu.
3. Poproś asystenta, aby przesunął jedwabny szew 4-0 tuż pod kleszczami i zawiązał na miejscu, zapętlając się wokół kaniuli i zawiązując wiele razy zarówno przed, jak i za sercem. Całkowicie otwórz kaniulę, aby rozpocząć pełny wsteczny przepływ aorty. Obserwuj energiczne bicie serca.
   UWAGA: Jeśli serce nie zaczyna bić szybko (~ 200 uderzeń na minutę) i energicznie, opaska lub kaniula może zamykać jedną lub obie tętnice wieńcowe. Jeśli istnieje podejrzenie, usuń opaskę i przenieś ją z dala od tętnic wieńcowych. Jeśli serce rozszerza się i nie bije, kaniula może znajdować się w poprzek zastawki aortalnej. Jeśli tętnica wieńcowa przecieka (KHB rozpyla się z korzenia aorty), przesuń kaniulę bliżej zastawki aortalnej (zjawisko to może wystąpić, jeśli tętnica ramienno-głowowa jest kanulatowana w miejscu aorty wstępującej).

4. Niedrożność żyły płucnej i przygotowanie tętnicy płucnej do kaniulacji

UWAGA: Celem tego kroku jest stworzenie zamkniętego systemu lewego przedsionka, aby zapewnić, że cała objętość i ciśnienie z bloku lewego przedsionka są przekazywane do struktur lewego serca. Brak całkowitego zamknięcia żył płucnych może spowodować niedobór napięcia wstępnego i może zafałszować wyniki lub spowodować niestabilną pracę preparatu serca.

1. Usuń grasicę, aby poprawić odsłonięcie tętnicy płucnej (PA).
2. Ręcznie obróć kaniulę aorty tak, aby tylna część serca była skierowana w stronę operatora. Wypreparuj naczynia prowadzące do prawego płuca. Zawieś prawą tkankę płucną za pomocą kleszczy, aby dokładniej wyznaczyć te naczynia. Za pomocą średnio-dużych klipsów chirurgicznych (lub szwów) zamknij prawą tętnicę płucną oraz żyłę i oskrzela za pomocą jednego klipsa. Wyciąć prawe płuco dystalnie do klipsa.
   UWAGA: Ze względu na trudności w swobodnym wycięciu tętnicy płucnej, naszą praktyką jest zamykanie żył płucnych w celu rozciągnięcia tętnicy płucnej, co ułatwia nacinanie bez uszkadzania pobliskich struktur w modelu bijącego serca.
3. Powtórz krok 4.2 na lewym płucu.
   UWAGA: Potencjalne pułapki i rozwiązywanie problemów: Gdy obie tętnice płucne zostaną zamknięte, prawy przedsionek widocznie się rozszerzy, a serce może stać się bradykardią. Dzieje się tak, ponieważ prawa komora ulega ciśnieniu. Jeśli tak się nie stanie, prawdopodobnie żyły płucne nie są całkowicie zamknięte, a obciążenie wstępne będzie niewystarczające do pracy w trybie serca. Jeśli serce nie jest w stanie utrzymać rzutu serca po kaniulacji lewego przedsionka (LA) i próbie przejścia do pracy serca (patrz poniżej), rozważ umieszczenie dodatkowych klipsów lub opaski wokół kikutów żyły płucnej, aby zatkać wszelkie resztki wycieku. Jednak po zamknięciu PA należy natychmiast wykonać Krok 5, aby zminimalizować niedokrwienie mięśnia sercowego. Należy pamiętać, że niektórzy badacze nacinają tętnicę płucną przed podwiązaniem żył płucnych, aby uniknąć ucisku w prawej komorze.
4. Nacięcie tętnicy płucnej
   1. Obróć kaniulę aorty tak, aby przednia część serca była skierowana w stronę operatora. Zidentyfikuj tętnicę płucną. Ponownie, ta tętnica może być rozdęta. Za pomocą małych nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie około 3 mm powyżej zastawki płucnej.
      UWAGA: Spowoduje to natychmiastowe zmniejszenie ciśnienia, a tętno może wzrosnąć. Ponieważ kaniula ta jest łatwa do usunięcia, kanniulacja tętnicy płucnej po zakończeniu kaniulacji lewego przedsionka.

5. Kaniulacja lewego przedsionka

1. Obróć kaniulę aorty tak, aby lewe przedsionki były skierowane w stronę operatora. Za pomocą małych nożyczek wykonaj 2-3 mm nacięcie w górnej części lewego przedsionka, około 3 mm powyżej rowka przedsionkowo-komorowego.
   1. Ustaw lewą kaniulę przedsionkową prostopadle do płaszczyzny zastawki mitralnej i skierowaną w stronę przegrody przedsionkowej.
   2. Otwórz kaniulę LA, aż KHB zacznie płynąć. Upewnij się, że KHB jest ciepły w dotyku (szybko się ochładza, gdy siedzi się w dowolnym drenach bez osłony), aby uniknąć dysfunkcji mięśnia sercowego z powodu hipotermii po przejściu do trybu pracy. Przejście na szybkość kroplowania podczas kaniulacji.
2. Używając kleszczy do przytrzymania przeciwbieżności, włóż kaniulę przedsionkową do korpusu lewego przedsionka, uważając, aby nie używać nadmiernej siły, która może rozerwać przedsionek.
   UWAGA: Kaniula LA powinna być umieszczona tak, aby znajdowała się na środku przedsionka bez żadnego napięcia na ścianie przedsionka.
3. Przełóż jedwabny szew 4-0 wokół korpusu lewego przedsionka i zawiąż węzeł, aby stworzyć uszczelnienie przedsionka wokół kaniuli. Zwróć uwagę, aby upewnić się, że tylna strona lewego przedsionka jest objęta szwem. W razie potrzeby dodaj dodatkowe szwy. Po uszczelnieniu pociągnij kaniulę do tyłu o 1-2 mm, tak aby znajdowała się na środku przedsionka, a nie na przegrodzie międzyprzedsionkowej.
   UWAGA: Najczęstszym powodem, dla którego serce ulega nieprawidłowemu uszkodzeniu po przejściu do trybu pracy serca, jest to, że kaniula LA przylega do przegrody przedsionkowej, która zasłania dopływ lewego przedsionka. Śledzenie LA często zmienia się, aby zademonstrować prawidłową falę A i falę V, gdy kaniula jest we właściwej pozycji (patrz rysunek 2E).
4. Otwórz całkowicie zawór kaniuli LA, aby podać pełne obciążenie wstępne do lewego przedsionka. Monitoruj szybkość wycieku z serca (która pochodzi ze ścieków wieńcowych). Upewnij się, że szybkość kapania nie zmienia się, gdy kaniula LA jest otwarta. Jeśli tak się stanie, należy załatać przedsionek wokół kaniuli zgodnie z opisem w kroku 6.4, ponieważ oznacza to nieszczelność systemu.

6. Kanituacja tętnicy płucnej i przejście do trybu pracy serca

1. W przypadku pomiaru zużycia tlenu przez mięsień sercowy (lub innych substancji w ściekach wieńcowych, takich jak poziomy leków lub cytokin), włóż elastyczną rurkę 1/32" do wcześniejszego nacięcia w tętnicy płucnej.
   UWAGA: Zużycie tlenu mierzy się jako różnicę w zawartości tlenu między perfuzatem lewego przedsionka a ściekami z tętnicy płucnej. ^{cyfra arabska}
   1. Do ciągłego pomiaru zużycia tlenu przez mięsień sercowy należy użyć elektrody tlenowej in-line, aby porównać ściek z lewego przedsionka i zatoki wieńcowej.
   2. Zbierz ściek z zatok wieńcowych (zarówno z tętnicy płucnej, jak i kapiący z serca) w cylindrze z podziałką w celu ilościowego określenia przepływu wieńcowego w czasie.
   3. Oblicz zużycie tlenu w mięśniu sercowym, jak opisano wcześniej. ^{cyfra arabska}
2. Przejście do trybu pracy serca poprzez wyłączenie wstecznej pompy aortalnej.
   UWAGA: Po wykonaniu tej czynności ciśnienie LA staje się ciśnieniem obciążenia wstępnego, a rezystor, który wcześniej zapewniał opór pompie wstecznej w trybie Langendorffa, teraz zapewnia opór rzutu serca, tworząc średnie ciśnienie tętnicze. Jeśli średnie ciśnienie tętnicze spadnie poniżej ~ 80 mmHg, przyczyna jest prawdopodobnie związana z obciążeniem wstępnym lub funkcją mięśnia sercowego. Najbardziej prawdopodobnym problemem jest kaniula lewego przedsionka, którą należy wyregulować po ponownym uruchomieniu pompy wstecznej.

7. Wprowadzenie cewnika objętościowego do lewej komory

UWAGA: Cewnik PV może być umieszczony albo wstecznie (przez zastawkę aortalną), albo przez nakłucie wierzchołkowe. Zaletą retrogradacji jest to, że pozycja jest bardziej spójna i eliminuje potrzebę nakłucia wierzchołkowego i towarzyszące mu ryzyko uszkodzenia naczyń wieńcowych lub utraty obciążenia wstępnego. Jednak umieszczenie wstecz może być czasami bardzo trudne, dlatego opisujemy tutaj obie techniki.

1. Podłącz francuski cewnik ciśnieniowo-objętościowy 1,4 do systemu pętli objętości ciśnienia. Skalibruj system w ciepłym KHB zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że przebieg jest widoczny w czasie rzeczywistym. Przyłóż cewnik i do powierzchni lewej komory napowietrznej, aby nie przesunąć jej po umieszczeniu.
2. W celu umieszczenia wstecznego otwórz regulowany zawór i delikatnie przesuwaj cewnik PV przez zastawkę aortalną, aż zostanie zidentyfikowany stabilny przebieg ciśnienia i objętości. Unikaj nadmiernego użycia siły, która może uszkodzić zastawkę aortalną lub przebić wierzchołek komory.
   UWAGA: Stwierdziliśmy, że ważne jest, aby zminimalizować długość rurki i liczbę zwojów, po których cewnik PV musi się poruszać, aby zbliżyć się do AV. Pomocne może być przecięcie przewodów dołączonych do systemu.
3. W celu umieszczenia wierzchołkowego użyj angiocewnika 24 G, aby utworzyć nakłucie wierzchołkowe w LV. Upewnij się, że unikasz lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej. Skieruj igłę w kierunku zastawki aortalnej z wierzchołka komory. Wsuń cewnik ciśnieniowo-objętościowy do korpusu LV. Zatrzymaj przesuwanie cewnika, gdy tylko zostanie zidentyfikowany przebieg ciśnienia i objętości lewej komnaty.
4. Po umieszczeniu cewnika ciśnieniowo-objętościowego przesuń płaszcz wodny na miejsce wokół serca. Przymocuj cewnik do ściany płaszcza wodnego za pomocą małego kawałka taśmy.
5. Zapewnić co najmniej 30-minutowy okres stabilności przed rozpoczęciem jakichkolwiek pomiarów lub interwencji.

8. Napar leków

1. (Opcjonalnie) Wlej leki (np. dopaminę) do bloku lewego przedsionka za pomocą standardowej pompy do leków.
   UWAGA: Dozowaliśmy leki w zależności od masy ciała całego zwierzęcia, ponieważ przepływ równy całej pojemności minutowej serca przechodzi przez blok przedsionkowy; Tylko niewielka część z nich przechodzi przez krążenie wieńcowe, tak jak ma to miejsce in vivo. Alternatywnie, drugi zestaw perfuzatu może być utworzony z ustalonym stężeniem leku i użyty do perfuzji serca.
   UWAGA: W naszym protokole podajemy leki w infuzji przez 12 minut, zbierając dane fizjologiczne podczas ostatnich 10 minut każdej infuzji i porównując je z bezpośrednio poprzedzającym 10-minutowym punktem odniesienia.

9. Manipulacje fizjologiczne

1. tętno
   1. (Opcjonalnie) zszyj dwa druty stymulacyjne na prawej ścianie przedsionka i przymocuj do tymczasowego urządzenia stymulacyjnego.
      UWAGA: Pozwala to na precyzyjną kontrolę częstości akcji serca (powyżej natywnej częstości ssawek) i zrozumienie związku między częstością akcji serca a kurczliwością niezależnie od leku kardiotonicznego.
2. Obciążenie wstępne
   1. Zmień obciążenie wstępne (zdefiniowane jako objętość rozkurczowa końca lewej komory) poprzez zmianę wysokości kolumny zasilającej lewy blok przedsionkowy.
3. Ciśnienie krwi
   1. Manipuluj ciśnieniem krwi (głównym wyznacznikiem obciążenia następczego w tym modelu) za pomocą zaworów ciśnieniowych w IH-51.
4. Zawartość tlenu w naczyniach wieńcowych
   1. Osiągnij różne stopnie niedotlenienia mięśnia sercowego poprzez perfuzję serca za pomocą KHB nasyconego różnymi mieszaninami gazów. Należy to zrobić, używając oddzielnych zbiorników z płaszczem (każdy z własną mieszaniną gazów), aby zapewnić równowagę między gazem a KHB.
   2. Osiągnij niedokrwienie naczyń wieńcowych poprzez podwiązanie szwem dystalnej tętnicy wieńcowej.
      UWAGA: Podwiązanie proksymalnych tętnic wieńcowych w trybie pracy serca może spowodować śmiertelną dysfunkcję mięśnia sercowego.
   3. Wywołanie globalnego niedokrwienia naczyń wieńcowych poprzez przerwanie lub opóźnienie perfuzji wstecznej na określony czas.

Wyniki

Schemat w pełni oprzyrządowanego serca w perfuzji wstecznej (Rysunek 1A) i w lewej komorze serca pracującego (Rysunek 1B). Typowe pomiary ciśnienia i objętości w aorcie, lewym przedsionku i lewej komorze przedstawiono na rycinie 2A - D. Typowe końcowe ciśnienie rozkurczowe wynosi w tym modelu około 3 - 5 mmHg, a szczytowe ciśnienie skurczowe wynosi około 100 mmHg. Rysunek 2E przedstawia zmianę w śledzeniu lewego przedsionka, gdy kaniula LA jest odsuwana od przegrody przedsionkowej podczas umieszczania i pozycjonowania kaniuli. W tych eksperymentach ciśnienie w aorcie ustawiono na 90 mmHg, a ciśnienie LA ustawiono na 10 mmHg.

Aby przetestować działanie katecholamin, każdy parametr fizjologiczny (pochodzący głównie z cewnika ciśnieniowo-objętościowego i związanego z nim oprogramowania) został porównany z bezpośrednio poprzedzającym okresem bazowym. W przedstawionym przykładzie dopamina była podawana w dawce 15 μg/kg/min do bloku lewego przedsionka. Chociaż końcowe ciśnienie rozkurczowe jest identyczne w tych dwóch warunkach (biorąc pod uwagę stałe ciśnienie przedsionkowe w tym modelu), końcowa objętość rozkurczowa lewej komory zmniejsza się o 2,5%, a objętość skurczowa końca lewej komory zmniejsza się o 4,9%, co daje zwiększoną objętość wyrzutową (ryc. 3A). W porównaniu z wlewami placebo, udar lewej komory, identyfikowany jako obszar w obrębie krzywej ciśnienie-objętość, zwiększył się o 32% podczas leczenia dopaminą (Figura 3B, P < 0,001, test t, n = 10 na grupę). Wiązało się to z większym wzrostem zużycia tlenu w mięśniu sercowym w porównaniu z wlewami placebo (Figura 3C). W ten sposób względna siła działania i koszty energetyczne różnych leków i dawek kardiotonicznych mogą być porównywane ze sobą niezależnie od ich wpływu na warunki obciążenia.

Rysunek 1: Schemat przepływu w pełni oprzyrządowanym sercu w trybie wstecznej perfuzji i pracy serca. (Panel A: tryb Langendorffa; Panel B: tryb pracy serca. W trybie wstecznym KHB jest podawany do korzenia aorty przy ustalonym ciśnieniu perfuzji. Ten tryb jest wykorzystywany do odzyskiwania mięśnia sercowego po czasie niedokrwienia i podczas oprzyrządowania. W trybie pracy serca perfuzat przepływa przez lewe serce przed perfuzją krążenia wieńcowego. W tym trybie mięsień sercowy musi wytworzyć własne ciśnienie perfuzyjne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne ślady ciśnienia i objętości uzyskane podczas pomiarów linii podstawowej. (A) wyświetlane jest ciśnienie w korzeniu aorty, (B) ciśnienie w lewym przedsionku, (C) ciśnienie w lewej komorze i (D) ślady objętości lewej komory podczas pomiaru podstawowego. Objętość wyrzutowa, praca udarowa, pojemność minutowa serca, tau i inne parametry mogą być automatycznie obliczane i wyświetlane w czasie rzeczywistym przez oprogramowanie. śledzenie lewego przedsionka (E) związane ze słabym rzutem serca w trybie pracy serca może być wskazówką, że kaniula jest nieprawidłowo ustawiona w lewym przedsionku. Należy zauważyć, że wyraźny załamek v w dobrze umieszczonym śledzeniu ciśnienia w lewym przedsionku jest powszechny, prawdopodobnie z powodu zmniejszonej podatności lewego przedsionka u w pełni oprzyrządowanego zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wpływ dopaminy na krzywą ciśnienie-objętość. Wlew dopaminy powoduje przesunięcie krzywej PV (A) w lewo, w tym zwiększenie objętości wyrzutowej, zmniejszenie końcowej objętości skurczowej w porównaniu z pomiarami wyjściowymi. Należy zauważyć, że kształt niektórych składowych tych krzywych PV różni się od tych zwykle mierzonych in vivo (patrz rysunek 4) ze względu na brak elastki tętniczej i żylnej. (B) W porównaniu z bezpośrednio poprzedzającą wartością wyjściową, praca po udarze zwiększyła się znacznie bardziej podczas infuzji dopaminy niż placebo (**, P = 0,0017, test t), podobnie jak zużycie tlenu w mięśniu sercowym (*, P = 0,013, test t, C). Korzystając z tego modelu, średnie zużycie tlenu w mięśniu sercowym na początku badania wynosiło 0,22 ± 0,02 mmol_O2/gram tkanki/minutę, przy szacowanej zawartości rozpuszczonego tlenu 165 μmol/l w soli fizjologicznej w temperaturze 40 °C. Takie pomiary można wykorzystać do porównania zużycia tlenu w mięśniu sercowym przez różne leki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza pętli objętości ciśnienia. Przedstawiona teoretyczna pętla ciśnienie-objętość opisuje normalny cykl pracy serca. Po zamknięciu zastawki aortalnej (AV) (1) dochodzi do skurczu izowolemicznego (1 - 2), gdy ciśnienie komorowe spada poniżej ciśnienia przedsionkowego. Czas trwania tej fazy jest reprezentowany przez Tau. Zastawka mitralna (MV) otwiera się równocześnie ze skurczem przedsionkowym, wypełniając komorę (2 - 3). Następnie skurcz rozpoczyna się skurczem izowolemicznym (3 - 4), aż ciśnienie komorowe przekroczy rozkurczowe ciśnienie tętnicze, w którym to czasie przedsionkowo-komorowy otwiera się. Objętość wyrzutowa to różnica między liniami 1 - 2 i 3 - 4. Praca z pociągnięciami to obszar w obrębie krzywej 1 - 2 - 3 - 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ten działający model serca umożliwia ocenę wydolności komór z pełną kontrolą obciążenia wstępnego i następczego komór, ciśnienia tlenu perfuzatu, a także częstości akcji serca. Pozwala między innymi na ocenę wewnętrznego wpływu leków inotropowych na mięśnia sercowego niezależnie od obciążenia następczego i obciążenia wstępnego, co nie jest możliwe przy użyciu modelu in vivo . Ponieważ model ten wykorzystuje perfuzat krystaloidowy, umożliwia ocenę mięśnia sercowego bez ingerencji hemoglobiny, upraszczając na przykład analizę spektroskopową stanów energetycznych mięśnia sercowego. ¹⁴ W tym modelu prawe przedsionek nie jest kaniulowany jako część naszego oprzyrządowania, chociaż jest to możliwe. Celowo zdecydowaliśmy się tego nie robić, aby ułatwić pobieranie próbek przepływu z zatok wieńcowych w celu oceny zużycia tlenu przez mięsień sercowy. Co jednak ważne, prawe serce nadal wykonuje pracę ciśnieniową i objętościową w tym modelu, pompując przepływ z zatoki wieńcowej do kaniuli tętnicy płucnej. Zapewnienie pewnego obciążenia wstępnego prawej komory poprawia ustawienie przegrody komorowej i poprawia wydajność lewej komory i jest ważnym elementem tego modelu. ¹⁵

Istnieje kilka eksperymentalnych pułapek, o których należy wspomnieć. Pierwszą z nich jest początkowa kaniulacja wsteczna, którą należy wykonać celowo (tj. w czasie krótszym niż 2 minuty), aby zminimalizować okres niedokrwienia. Najważniejszą umiejętnością, którą należy opanować, jest skuteczna izolacja, przygotowanie i obsługa aorty wstępującej. Ważne jest, aby kikut aorty nie był nadmiernie przycięty, pozostawiając niewystarczającą ilość miejsca na kaniulację powyżej zastawki aortalnej. Jednak ważne jest również, aby kikut aorty nie był zbyt długi, co może powodować moment obrotowy aorty wokół kaniuli. Ważne jest również, aby kaniula aorty i korzeń aorty były odpowiednio dopasowane pod względem wielkości. Zbyt duża aorta na małej kaniuli może również prowadzić do momentu dokręcenia korzenia aorty na kaniuli. Prawa tętnica podobojczykowa zazwyczaj startuje z aorty wstępującej około 7 mm powyżej zastawki aortalnej. Identyfikacja naczyń ramienno-głowowych (o średnicy około 1 mm) podczas preparowania i przycinania aorty służy jako ważne punkty orientacyjne dla poprzecznego nacięcia aorty. Wskazane jest przycinanie aorty tuż poniżej startu pierwszej tętnicy ramienno-głowowej. Włączenie tego naczynia do przyciętego korzenia aorty zwykle prowadzi do wycieku KHB i utraty ciśnienia w korzeniu aorty po przejściu w tryb pracy serca.

Innym technicznie trudnym aspektem kaniulacji jest kaniulacja lewego przedsionka. Chociaż możliwa jest kaniulacja uszka lewego przedsionka, stwierdziliśmy, że kaniula często utknęła w wyrostku i nie przechodzi łatwo do ciała lewego przedsionka. Dlatego wolimy wykonać nacięcie w ciele lewego przedsionka, około 2 mm powyżej rowka przedsionkowo-komorowego. Ważne jest, aby przed założeniem ułożyć kaniulę lewego przedsionka w odpowiedniej płaszczyźnie, aby uniknąć rozerwania cienkościennego przedsionka podczas mocowania kaniuli.

Stwierdziliśmy, że idealny rozmiar nacięcia lewego przedsionka wynosił około 3 mm. Wykonanie zbyt małego nacięcia może również utrudnić umiejscowienie kaniuli lewego przedsionka i może doprowadzić do rozerwania lewego przedsionka. Używamy prostego, 8 mm, skośnego odcinka rurki nieprzepuszczalnej dla tlenu (średnica wewnętrzna 2,9 mm) na lewym bloku przedsionkowym. Odkryliśmy, że użycie tego, zamiast kaniuli ze ściętą krawędzią, prowadzi do najbardziej spójnej kaniulacji przedsionków i ułatwia proces zabezpieczania bloku lewego przedsionka. Niezależnie od zastosowanego drenu, ważne jest, aby upewnić się, że koniec rurki nie jest zasłonięty przez przegrodę przedsionkową lub zastawkę mitralną (jak pokazano powyżej, stwierdziliśmy, że śledzenie ciśnienia w lewym przedsionku było pomocne w tym względzie), ponieważ nawet subtelny ruch kaniuli przedsionkowej może znacząco zmienić obciążenie wstępne lewej komory i wynikające z tego pomiary hemodynamiczne. Z tego samego powodu ważne jest, aby upewnić się, że lewy przedsionek nie przecieka po otwarciu bloku lewego przedsionka. Ważne jest, niezależnie od rodzaju użytego przewodu, aby zapewnić, że rurka w tym systemie jest nieprzepuszczalna dla tlenu, aby zapewnić odpowiednie dostarczanie tlenu do serca.

Kolejnym technicznie trudnym aspektem procedury było umieszczenie cewnika ciśnieniowo-objętościowego (PV). Początkowo opowiadaliśmy się za wstecznym umieszczeniem cewnika przez blok aorty. Chociaż jest to technicznie wykonalne, stwierdziliśmy, że znacznie prostsze i celowe jest umieszczenie cewnika PV poprzez przezwierzchołkowe nakłucie. Należy zachować ostrożność w celu monitorowania położenia cewnika przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ czasami cewnik może przesuwać się do lub na zewnątrz lewej komory. Można to zrobić, monitorując śledzenie ciśnienia i objętości w czasie.

Na koniec należy zadbać o to, aby roztwór KHB był tworzony na świeżo dla każdego eksperymentu. Możliwe jest odważenie składników KHB i przechowywanie ich z wyprzedzeniem w stożkowych probówkach w postaci sproszkowanej. W dniu eksperymentu można je zmieszać ze sterylną, przefiltrowaną wodą, dwutlenkiem węgla/tlenem, a następnie dodać do mieszaniny wapń. Ważne jest również, aby myć system aktywnym enzymatycznie detergentem w proszku, takim jak Tergazyme (lub podobnym) i regularnie wymieniać filtr perfuzyjny.

Należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń tego eksperymentalnego preparatu. Po pierwsze, podobnie jak wszystkie perfuzjonowane krystaloidami preparaty Langendorffa, KHB i inne perfuzaty asanguiniczne mają znacznie zmniejszoną zdolność przenoszenia tlenu w stosunku do krwi. Chociaż jest to częściowo kompensowane przez rozszerzenie naczyń wieńcowych i suprafizjologiczny przepływ wieńcowy, z tego powodu preparat nie jest całkowicie fizjologiczny. Po drugie, ze względu na prawie nieskończoną podatność komory Windkessel zastosowanej w tym instrumencie, ciśnienie skurczowe i rozkurczowe są oddzielone tylko w minimalnym stopniu (patrz rysunek 2A), a zatem ciśnienie perfuzji wieńcowej jest niefizjologiczne. Problem ten może zostać rozwiązany w przyszłych modelach poprzez włączenie komponentu elascyjności do bloku obciążenia następczego. Po trzecie, podobnie jak w przypadku wszystkich izolowanych preparatów nasercowych, serce przechodzi określony okres (2-3 min) ciepłego niedokrwienia, które może spowodować uszkodzenie lub dysfunkcję mięśnia sercowego. Zminimalizowanie tego urazu poprzez ćwiczenie techniki ma ogromne znaczenie dla reprezentatywnych wyników. Ponadto, chociaż jest to konieczne dla dobrostanu zwierząt, wziewne środki znieczulające mogą służyć jako środek tłumiący mięsień sercowy na wczesnym etapie procesu reperfuzji, chociaż oczekuje się, że efekt ten zostanie szybko zniesiony, gdy serce zostanie ponownie zinfekowane KHB.

Opisany działający układ serca pozwala na szeroką gamę badań fizjologicznych istotnych dla opieki nad pacjentem, badań i nauczania. Dzięki kilku dodatkowym modyfikacjom system może być również wykorzystywany do symulacji ważnych elementów fizjologicznych związanych z wrodzonymi wadami serca, w tym nadciśnienia płucnego i fizjologii pojedynczej komory. Ograniczenia obejmują to, że jest to preparat ex vivo , że serce jest perfundowane przez bufor, a nie przez krew o wyższej zawartości tlenu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761	8.401 g/4 L
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	E6758	0.744 g/4 L
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9333	1.580 g/4 L
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M7506	0.578 g/4 L
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	P2256	0,220 g/ 4 l
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014	27,584 g/4 l
Dekstroza	Sigma-Aldrich	D9434	7,208 g/4 l
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma-Aldrich	C7902	1,470 g/4 l
Dwukomorowy model pracy serca	Aparat Harvard	IH-51
Cewnik objętościowy ciśnieniowy	Millar, Inc	SPR-944-1	Zastosowano cewnik o rozstawie 6 mm
LabChart Pro 8	AD Instruments	Wersja 8.1