Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

24.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54164

⸱

24 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Regenerative & Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine, 2First Department of Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 3Faculty of Health Science, Tokoha University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Streszczenie

W badaniu patogenezy wirusowego zapalenia mózgu, metoda infekcji jest krytyczna. Pierwszą z dwóch głównych dróg zakaźnych do mózgu jest droga krwiotwórcza, która obejmuje zakażenie komórek śródbłonka i perycytów mózgu. Druga to droga śródmózgowiowo-komorowa (ICV). Po dotarciu do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wirusy mogą rozprzestrzeniać się do przestrzeni podpajęczynówkowej, opon mózgowych i splotu naczyniówkowego przez płyn mózgowo-rdzeniowy. W modelach eksperymentalnych najwcześniejsze etapy dystrybucji wirusa w OUN nie są dobrze scharakteryzowane i nie jest jasne, czy początkowo zakażone są tylko niektóre komórki. W tym miejscu przeanalizowaliśmy rozkład cząsteczek wirusa cytomegalii (CMV) podczas ostrej fazy infekcji, zwanej wiremią pierwotną, po ICV lub wstrzyknięciu donaczyniowym (IV) do mózgu noworodka myszy. W modelu iniekcji ICV 5 μl mysiego CMV (MCMV) lub fluorescencyjnych mikrogranulek wstrzyknięto do komory bocznej w punkcie środkowym między uchem a okiem za pomocą strzykawki o pojemności 10 μl z igłą 27 G. W modelu iniekcji dożylnej zastosowano strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 35 G. Do wizualizacji żyły skroniowej (twarzowej) noworodka użyto transiluminatora. Wprowadziliśmy 50 μl MCMV lub fluorescencyjnych mikrogranulek do powierzchownej żyły skroniowej. Mózgi zostały pobrane w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu. Genomy MCMV wykryto przy użyciu metody hybrydyzacji in situ. Mikrokulki fluorescencyjne lub białko fluorescencyjne z ekspresją rekombinowanych cząstek MCMV obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Techniki te można zastosować do wielu innych patogenów w celu zbadania patogenezy zapalenia mózgu.

Wprowadzenie

Podczas badania wirusowego zapalenia mózgu, początkowy rozkład cząsteczek wirusa jest bardzo ważny dla zrozumienia patogenezy choroby i identyfikacji celów wirusowych w mózgu. Większość wirusów ma rozmiar od 20 do 300 nm, chociaż Pandorawirus ma ponad 700 nm w rozmiarze1. Rozmieszczenie cząstek wirusa w ostrej fazie infekcji może zależeć od wielkości cząstek, rozmieszczenia receptorów komórkowych lub powinowactwa receptorów komórkowych do wirusów. W modelach zwierzęcych do badania patogenezy wirusowego zapalenia mózgu wykorzystano zakażenia śródmózgowo-komorowe (ICV), dootrzewnowe, bezpośrednie łożyskowe i dożylne (IV). Inokulacja wirusem ICV jest często stosowana w celu wykrycia infekcji ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u myszy. Badania z wykorzystaniem tej techniki donoszą o rozległym zakażeniu, szczególnie komórek w strefach okołokomorowych i w obszarach mózgu mających bezpośredni kontakt z płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF), podobnie jak w przypadku wirusowego zapalenia komór mózgowych. Niewielki rozmiar cząsteczek wirusa związanego z adenowirusem (AAV) (o średnicy 20 - 25 nm) ułatwia ich rozprzestrzenianie się w całym mózgu w infekcjach ICV2-4. Iniekcje dootrzewnowe5, bezpośrednie łożysko6 i iniekcje dożylne7 reprezentują hematogenne podanie ogólnoustrojowe. Przenikanie cząsteczek wirusa przez barierę krew-mózg (BBB) pozwala im dotrzeć do miąższu mózgu noworodka, reprezentującego rozlane guzki mikrogleju8,9.

Wirus cytomegalii (CMV) to powszechny wirus należący do rodziny wirusów opryszczki. W Stanach Zjednoczonych od 50% do 80% osób przeszło zakażenie CMV przed 40 rokiem życia. Zakażenia CMV rzadko są szkodliwe, ale mogą powodować choroby u pacjentów z obniżoną odpornością i płodów. Spośród wszystkich porodów 0,2% - 2% rodzi się z CMV10, co skutkuje ciężkimi objawami, takimi jak małogłowie, zwapnienie okołokomorowe, hipoplazja móżdżku, mikroftalmia i zanik nerwu wzrokowego11,12. Ponadto upośledzenie umysłowe, odbiorczy ubytek słuchu, wady wzroku, drgawki i padaczka występują u około 10% niemowląt zakażonych CMV, które nie zakończyły się zgonem13,14. Dysfunkcja OUN jest najczęstszym charakterystycznym objawem wrodzonej anomalii CMV. Każdego roku więcej dzieci jest trwale niepełnosprawnych z powodu wrodzonego CMV niż z powodu zespołu Downa, alkoholowego zespołu płodowego lub rozszczepu kręgosłupa15. Obecnie nie ma dostępnych szczepionek przeciwko CMV, co wymaga bezpiecznej i skutecznej szczepionki. Badanie interakcji cząsteczek CMV z ich receptorami w najwcześniejszej fazie infekcji jest ważne dla zrozumienia wpływu szczepienia.

Zapalenie komór mózgowych i rozlane guzki mikrogleju to dwie główne patologiczne cechy CMV zapalenie mózgu16. Nie jest pewne, w jaki sposób cząsteczki CMV (150 - 300 nm) rozprzestrzeniają się w mózgu w ostrej fazie infekcji i w jaki sposób rozmieszczenie receptorów komórkowych i ich powinowactwo do wirusów przyczyniają się do rozprzestrzeniania się wirusa. Kawasaki i wsp. ocenili zakażenia ICV i IV z perspektywy rozmieszczenia cząstek i ich receptorów (integryny β1) w najwcześniejszej fazie infekcji. Odkryliśmy, że rozprzestrzenianie się cząstek CMV i ekspresja integryny β1 są dobrze skorelowane w najwcześniejszej fazie infekcji zarówno w zakażeniach ICV, jak i dożylnych8. Zakażenie ICV jest modelem zapalenia komór mózgowych, a zakażenie dożylne jest modelem rozlanych guzków mikrogleju. Badanie dynamiki cząstek wirusowych lub fluorescencyjnych dostarczyłoby użytecznych informacji na temat wpływu wielkości cząstek, interakcji wirusa z receptorami komórkowymi oraz mechanizmu przenikania BBB do mózgu. Poniższy protokół może być wykorzystany do zbadania każdej infekcji wirusowej i wektora wirusowego w OUN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Medycznego w Hamamatsu.

1. Przygotowanie MCMV (szczep Smitha) i rekombinowanego białka zielonej fluorescencji wzmocnionej M32 (EGFP)-MCMV

  1. Wygenerować rekombinowany M32-EGFP-MCMV zgodnie z następującą metodą (1.2 - 1.9) i zgodnie z wcześniejszym opisem8.
  2. Należy stosować rekombinowane wirusy pochodzące ze szczepu Smith MCMV typu dzikiego (numer dostępu: U68299). Wstawić EGFP (4 361 par zasad; bp) między 37 089 a 41 450 pz (locus M32 - M31) w genomie MCMV przez rekombinację homologiczną.
  3. Amplifikować w reakcji łańcuchowej polimerazy MCMV M32 (41 450 - 39 286 pz, sekwencja lewostronna i M31 (37 089 - 39 246 pz, loci genu sekwencji prawej flanki przy użyciu następujących starterów: M32, 5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTGTATT-3′ (starter do przodu), 5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3′ (starter odwrotny); M31, 5′-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTCTCTCCTCACAA-3′ (starter do przodu), 5′-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTTTA-3′ (starter odwrotny).
  4. Wstaw locus M32 do wektora wyrażającego EGFP za pomocą miejsc restrykcyjnych NheI i BamHI. Wstawić locus M31 do plazmidu rekombinowanego M32-EGFP za pomocą miejsc AflII i XbaI. Rozszczepić sekwencję M32-EGFP-M31 za pomocą NheI i AflII z plazmidu rekombinacji M32-EGFP-M31 i rozpuścić wH2O.
  5. Transfekować rozszczepiony konstrukt do jąder komórek NIH3T3 zakażonych MCMV (szczepem Smitha) 24 godziny po zakażeniu (hpi) za pomocą systemu elektroporacji w celu wywołania rekombinacji homologicznej.
  6. Po 3 dniach od zakażenia należy przeprowadzić kohodowlę komórek z niezakażonymi mysimi fibroblastami embrionalnymi (MEF) w stosunku 1/1000 na płytkach sześciodołkowych i przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem ognisk ekspresji EGFP w zakażonych komórkach.
  7. Zebrać supernatanty zawierające wirusa ze studzienek zawierających zielone ogniska fluorescencyjne i rozcieńczyć dziesięciokrotnie. Do oczyszczania wybierz studzienki, które wyświetlają pojedyncze zielone ogniska fluorescencyjne.
  8. Gdy wszystkie ogniska powstałe w wyniku zakażenia rozcieńczeniem ograniczającym wykazują ekspresję EGFP, preparat wirusa jest czysty, co wskazuje, że nie pozostał żaden wirus typu dzikiego. Określić ilościowo wirusa metodą testu płytki nazębnej, jak opisano wcześniej17.
  9. Traktuj MCMV w certyfikowanych komorach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 w rękawiczkach i masce.
  10. Pasaż MCMV (szczep Smitha) i rekombinowany MCMV w MEF przygotowanych z 12-dniowych zarodków myszy ICR, jak opisano wcześniej17.
  11. Usunąć komórki z supernatantów zakażonych kultur MEF przez odwirowanie w temperaturze 3 000 × g przez 20 minut w temperaturze 16 °C.
  12. Ultraodwirować supernatanty przez 40 minut przy 70 000 × g. Zawiesić granulki zawierające wiriony w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris i przenieść na wstępnie uformowany liniowy gradient sorbitolu (25% - 70%). Ponownie ultrawirować przy 70 000 x g przez 60 minut18.
  13. Zbierz pasmo zawierające wirion za pomocą strzykawki. Zebrane wiriony należy otoczać w granulki w dodatkowym etapie ultrawirowania w ilości 70 000 × g przez 40 minut.
  14. Zawiesić osad w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu eksperymentów z zakażeniem.
  15. Określić ilościowo miano wirusa metodą testu płytkiowego, jak opisano wcześniej19.
  16. Wizualizacja ekspresji EGFP rekombinowanych cząstek MCMV (wzbudzenie przy 489 nm, emisja przy 508 nm) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (rysunek 1A) oraz strukturę cząstek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)8 (Rysunek 1B).

2. Przygotowanie mikrokulek fluorescencyjnych czerwieni nilowej

  1. Kup karboksylowo-fluorescencyjne mikrokulki czerwieni nilowej i umieść 500 μl mikrokulek w probówkach w zależności od średnicy (0,04 - 0,06 μm, około 3,63 × 1012 cząstek; 0,1 - 0,3 μm, około 5,75 × 1010 cząstek; i 1,7 - 2,2 μm, około 6,85 × 107 cząstek).
  2. Kulki należy traktować 500 μl 0,1 M NaOH przez około 1 dzień w celu usunięcia wszelkich endotoksyn i ponownie zawiesić kulki w sterylnej wodzie o temperaturze pokojowej.
  3. Przed użyciem zaadsorbuj kulki O / N za pomocą 10% mysiej surowicy uzyskanej z myszy C57BL / 6 w temperaturze pokojowej.
  4. Aby oddzielić agregaty, przed użyciem należy wymieszać kulki i dokładnie poddać sonikacji.

3. Wstrzyknięcie ICV MCMV i fluorescencyjnych mikrogranulek nowonarodzonym myszom

  1. Utrzymuj normalne ciężarne myszy ICR w obiekcie o kontrolowanej temperaturze w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Noworodki oznaczane są jako P 0,5 w dniu urodzenia.
  2. Wysterylizuj strzykawkę 10 μl i igłę 27 G 70% alkoholem.
  3. Umieścić roztwór do wstrzykiwań (5 μl) zawierający MCMV lub mikrogranulki fluorescencyjne do igły, ostrożnie pociągając za tłok strzykawki.
  4. Unieruchomić noworodka myszy (P 0,5), kładąc ją na lodzie na 3 - 4 minuty. Gdy zwierzę znajdzie się pod narkozą, użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia.
  5. Oznaczyć miejsce wstrzyknięcia nietoksycznym pisakiem laboratoryjnym w miejscu około 0,7 - 1,0 mm po bokach szwu strzałkowego i 0,7 - 1,0 mm ogonowo od węzła noworodka (ryc. 2A).
  6. Wprowadzić igłę na głębokość 2 mm, prostopadle do powierzchni czaszki w zaznaczonym miejscu wstrzyknięcia. Dla porównania, zaznacz 2 mm od końcówki igły nietoksycznym maszyną.
  7. Powoli wstrzyknąć 5 μl MCMV (około 5 × 105 PFU) do komory bocznej bez otwierania skóry głowy (ryc. 2B).
  8. Innej grupie myszy wstrzyknąć 5 μl roztworu zawierającego mikrogranulki fluorescencyjne (0,1 - 0,3 μm, około 5,75 × 108 cząstek) tą samą metodą.
  9. Powoli wyjmować igłę 10 - 20 sekund po zaprzestaniu ruchu tłoka, aby zapobiec cofaniu się igły.
  10. Aby wyzdrowieć, trzymaj myszy przez 5-10 minut w ciepłym pojemniku, aż ruch i ogólna reakcja zostaną przywrócone.
  11. Pobrać mózgi zgodnie z opisem w punkcie 5 w różnych punktach czasowych (3, 12, 24, 48 i 72 godziny) po wstrzyknięciu.

4. IV Wstrzykiwanie MCMV lub mikrogranulek fluorescencyjnych noworodkom

myszy
  1. Unieruchomić noworodka myszy (P 0,5), kładąc ją na lodzie na 3 - 4 minuty.
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 35 G należy wykonać dożylne wstrzyknięcie MCMV u noworodków z grupy P 0,5.
  3. Użyj transiluminatora (szukacza żył), aby uwidocznić powierzchowną żyłę skroniową (twarzową). Przed wstrzyknięciem należy przymocować noworodka do transiluminatora za pomocą taśmy chirurgicznej (Ryc. 2C).
  4. Nosząc szkła powiększające (1,5x), powoli wlewaj 50 μl MCMV (około 5,45 × 109 cząstek) lub mikrogranulek fluorescencyjnych (0,04 - 0,06 μm, około 3,63 × 1011 cząstek; 0,1 - 0,3 μm, około 5,75 × 109 cząstek; i 1,7 - 2,2 μm, około 6,85 × 106 cząstek) do powierzchownej żyły skroniowej (ryc. 2D).
  5. Po wyjęciu igły należy użyć gazy zawierającej 70% alkoholu, aby uciskać miejsce wstrzyknięcia, aż do ustania krwawienia.
  6. Daj noworodkowi około 5 minut w ciepłym pojemniku, aby doszedł do siebie przed powrotem do klatki.
  7. Pobrać mózg zgodnie z opisem w punkcie 5 w różnych punktach czasowych (3, 12, 24 i 72 godziny) po wstrzyknięciu.

5. Przygotowanie próbki tkanki mózgowej do sekcji parafinowych

  1. Umieść wstrzyknięte noworodki w małym plastikowym naczyniu na pokruszonym lodzie.
  2. Gdy zwierzę znajdzie się pod narkozą, użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia.
  3. Wykonaj jedno środkowe lub dwukońcowe poziome nacięcia końcowe przez klatkę piersiową, aby otworzyć klatkę piersiową.
  4. Wykonaj cięcie w przedsionku ostrymi nożyczkami. Wlej 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) do przedsionka. Zatrzymaj perfuzję, gdy zaobserwuje się spontaniczny ruch (taniec PFA) i rozjaśnienie koloru wątroby. Nie wykrwawiać się.
  5. Wypreparuj noworodka (jak opisano wcześniej20), najpierw usuwając głowę za pomocą nożyczek.
  6. Wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż powłoki od szyi do nosa, aby odsłonić czaszkę.
  7. Umieść ostry koniec nożyczek do tęczówki w otworze wielkim po jednej stronie, ostrożnie przesuwając się po wewnętrznej powierzchni czaszki.
  8. Wykonaj cięcie sięgające do dystalnej krawędzi tylnej powierzchni czaszki i wykonaj identyczne cięcie po stronie przeciwnej. Oczyść czaszkę wokół móżdżku.
  9. Ostrożnie odklej czaszkę z jednej strony, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu. Powtórz tę procedurę po drugiej stronie mózgu.
  10. Za pomocą szpatułki odetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu.
  11. Delikatnie oddziel mózg od głowy, przycinając oponę twardą, która nadal łączy mózg z czaszką, za pomocą nożyczek i usuń mózg.
  12. Umieścić mózg w fiolce z utrwalaczem zawierającym 4% PFA co najmniej 10 razy większą od objętości mózgu przez 24 godziny w temperaturze 4°C.
  13. Odwodnić tkankę przez serię stopniowanych kąpieli etanolowych w celu wyparcia wody, a następnie naciekać woskiem parafinowym, tworząc blok. Pokrój blok parafiny za pomocą mikrotomu na plastry o grubości 4 μm21.
  14. Odparafinować i ponownie nawodnić szkiełka zainfekowanych mózgów22. Przejdź do hybrydyzacji in situ dla sekcji zatopionych w parafinie.

6. Przygotowanie próbki tkanki mózgowej do zamrożonych skrawków

  1. Usuń mózg, postępując zgodnie z krokami opisanymi w 5.1 - 5.11.
  2. Aby obserwować fluorescencyjne mikrogranulki i M32-EGFP-MCMV, umieść wycięty mózg na krioformach z płaskim dnem. Dodaj pożywkę do zatapiania, aby całkowicie pokryć próbkę mózgu. Zamroź krioformy w wstępnie schłodzonym n-heksanie (-80 ºC), używając kleszczyków do przytrzymania krawędzi krioform przed przymocowaniem ich do uchwytu.
  3. W celu przekrojenia przymocuj zamrożony blok tkanki do wstępnie schłodzonego uchwytu kriostatu. Przenieść zamrożoną tkankę za pomocą uchwytu do komory kriostatu i obniżyć temperaturę do poziomu od -10 do -20 °C, a następnie pokroić plastry o grubości około 8 - 10 μm23.
  4. Przymocuj skrawki cytofiksantem (mieszanina alkoholu izopropylowego i glikolu polietylenowego) przez natryskiwanie. Suszyć skrawki na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej bezpośrednio po rozpyleniu i przechowywać w temperaturze -80 ºC do dalszego użycia.
  5. Wyrównaj sekcje z powrotem do RT i umyj trzy razy PBS.
  6. Wybarwić skrawki izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) izolektyną Griffonia simplicifolia izolektyną B4 w stężeniu 1:100 przez 10 minut w PBS w RT (ryc. 5) lub przeciwciałem CD31 sprzężonym z PE w stężeniu 1:100 przez 30 min w PBS w RT (ryc. 6).
  7. Umyj sekcje trzykrotnie PBS.
  8. Po umyciu wybarwić skrawki 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI), aby uwidocznić jądra komórkowe. Zamontuj skrawki w odczynniku zapobiegającym blaknięciu i obrazie DAPI (wzbudzenie przy 345 nm, emisja przy 455 nm), EGFP (wzbudzenie przy 489 nm, emisja przy 508 nm) i czerwieni nilowej (wzbudzenie przy 553 nm, emisja przy 637 nm) za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 3, 5, 6).

7. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) dla sekcji zatopionych w parafinie

  1. Przygotować sondę FISH znakowaną bezpośrednio fluoroforem do hybrydyzacji DNA in situ przez translację nick przy użyciu bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego cały genom DNA MCMV (pSM3fr)19. Stężenie sondy FISH wynosi 0,1 μg/μl.
  2. Odparafinować i ponownie nawodnić szkiełka zainfekowanych mózgów22.
  3. Potraktuj skrawki tkanki RNazą (100 μg/ml w PBS) w celu wykrycia DNA wirusa.
  4. Pobrać antygen za pomocą 0,05% NP40, 0,01 M buforu cytrynianowego (pH 6,0) w temperaturze 95 - 98°C przez 20 minut. Schłodzić szkiełka do temperatury RT przez 20 minut.
  5. W szklanym słoiku do barwienia Coplin umyj szkiełka w czystej wodzie trzy razy przez 2 minuty za każdym razem. Wykonać dodatkowy etap pobierania antygenu z 0,06% roztworem pepsyny, 0,01 N HCl przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Spłucz szkiełka trzy razy w czystej wodzie przez 2 minuty za każdym razem w szklanym słoiku do barwienia Coplin.
  7. Ponownie odwodnić skrawki tkanki, przenosząc szkiełka z 70% etanolu na 85% etanolu, a następnie na 100% etanolu.
  8. W celu przygotowania 10 ml buforu hybrydyzacyjnego zmieszać 1,25 ml soli hybrydyzacyjnych in situ (3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM fosforanu sodu o pH 6,8, 50 mM EDTA) z 5 ml dejonizowanego formamidu, 2,5 ml 50% siarczanu dekstranu, 250 μl 50x roztwór Denhardta, 125 μl 100 mg/ml tRNA, i 875 μl H2O.
  9. Rozcieńczyć sondę DNA bezpośrednio znakowaną fluoroforami, które losowo rozpoznają cały genom MCMV w buforze hybrydyzacyjnym. Ostateczna objętość powinna wynosić 10 μl (7 μl buforu do hybrydyzacji, 1 μl sondy (0,1 μg/μl) i 2 μl wody destylowanej).
  10. Dodać mieszankę sondy (10 μl) do każdego szkiełka i przykryć szkiełkiem nakrywkowym (15 × 15 mm). Uszczelnij szkiełko nakrywkowe cementem gumowym. Denaturować mieszaninę sondy przez 5 minut w temperaturze 85 °C i zakończyć etap hybrydyzacji O/N w temperaturze 42 °C.
  11. Myć szkiełka 0,3% NP40, 0,4x SSC w temperaturze 73°C przez 2 min; 0,1% NP40, 0,4x SSC w temperaturze 73 °C przez 1 min; i dwukrotnie 2x SSC.
  12. Wybarwić jądra przeciw DAPI (10 ng/ml) i przykryć szkiełko szkiełkiem nakrywkowym.
  13. Zamontuj skrawki w odczynniku zapobiegającym blaknięciu i obrazie DAPI (wzbudzenie przy 345 nm, emisja przy 455 nm) i EGFP (wzbudzenie przy 489 nm, emisja przy 508 nm) za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W badaniach nad patogenezą zapalenia mózgu pochodzenia wirusowego istotna jest metoda zakażania. Droga krwiopochodna odzwierciedla ostrą infekcję komórek śródbłonka i perycytów mózgu, natomiast droga dokomorowa (ICV) odzwierciedla ostrą infekcję rozprzestrzeniającą się poprzez płyn mózgowo-rdzeniowy w przestrzeni podpłonkowej, docierającą do opon mózgowych i splotów naczyniowych. Aby przeanalizować pierwotny rozkład cząsteczek w ostrym zapaleniu mózgu, in situ wykorzystano hybryd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W modelach zwierzęcych do badania patogenezy wirusowego zapalenia mózgu wykorzystano zakażenia ICV, wewnątrzotrzewnowe, bezpośrednie łożysko i dożylne. Skupiliśmy się na modelach iniekcji ICV i dożylnych u noworodków myszy ze względu na prostotę procedur i korzyści płynące z bezpośredniego wstrzykiwania cząstek do obszaru docelowego. Chociaż zakażenie dootrzewnowe jest łatwą metodą, cząsteczki wirusa rozprzestrzeniają się ogólnoustrojowo w procesie pośrednim5,24. Bezpośrednie zakażenie łożyska jest dobrą metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Panu Masaaki Kaneta, Pani Hiromi Suzuki i Pani Mitsue Kawashima (Wydział Patologii Regeneracyjnej i Zakaźnej, Hamamatsu University School of Medicine) za ich doskonałą pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki, KAKENHI Grant Number 23590445.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tris; tris(hydroksymetylo)-aminometanSigma-AldrichT-6791
HClSigma-AldrichH-1758
pEGFP-N1 wektor Clontech#6085-1
D-sorbitolSigma-AldrichS-1876
SPHERO TM Polistyren fluorescencyjny Czerwień Nilowa 0,04 - 0,06Spherotech, Inc.FP-00556-2
SPHERO TM Polistyren fluorescencyjny Nil Red 0,1 - 0,3Spherotech, Inc.FP-0256-2
SPHERO TM Polistyren fluorescencyjny Czerwień Nilowa 1,7 - 2,2Spherotech, inc. FP-2056-2
10% serum mysieDAKO Mysz X0910
C57BL/6SLC, Inc.
Mysz ICRSLC, Inc.
Zmodyfikowane strzykawki mikrolitrowe (seria 7000)Firma
Igła o rozmiarze 35Saito Medical
A Wee Sight TransilluminatorPhillips Healthcare1017920
O.C.T.CompoundSakura Finetek4583
RNase ASigma-AldrichR4642
Nonidet(R) P-40Nacalai25223-04
bufor cytrynianowy (pH 6) x 10Sigma-AldrichC9999-100ml
pepsynaSigma-AldrichP6887
EDTAdojindoN001
FormamidTCIF0045
Sól sodowa siarczanu dekstranuSigma-Aldrich42867-5G
Denhardt's Roztwór (50x)ThermoFishcer sceintific750018
drożdżowe tRNA (10 mg/ml)ThermoFishcer sceintificAM7119
SSC 20xSigma-AldrichS6639
DAPIThermoFishcer sceintificD1306
n-HexaneSigma-Aldrich296090
superfrost plus szkłoThermoFishcer sceintific12-55-18
Cytokeep IINippon Shoji Co.
Sprzężona z FITC izolektyna Griffonia simplicifolia B4Vector laboratories, Inc.L1104
Anty-Myszy CD31 (PECAM-1) PEebioscience12-0311
ProLonger  Złotyzegarek ThermoFishcerP36934
BIOREVOKEYENCEBZ-9000E
Hamilton

Bibliografia

  1. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  2. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
  3. Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  4. McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
  5. Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
  6. Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
  8. Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
  9. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
  10. Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
  11. Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
  12. Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
  13. Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
  14. Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
  15. Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
  16. Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
  17. Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
  18. Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13(2010).
  19. Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492(2011).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
  22. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308(2007).
  23. Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
  24. Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
  25. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863(2014).
  26. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iniekcja dokomorowadystrybucja cz steczek wirusowychcytomegalowirus mysim zg myszy noworodkahybrydyzacja in situmikroskopia fluorescencyjnay a skroniowa powierzchownakomora boczna
Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.