Artykuł metodologiczny

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

DOI:

10.3791/54168

⸱

11 czerwca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Boston Children’s Hospital, 2Harvard Medical School, 3Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Stem Cell Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology, 6Howard Hughes Medical Institute, 7Division of Hematologic Malignancies, Dana-Farber Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgiczna parabioza dwóch zwierząt o różnym pochodzeniu genetycznym tworzy unikalny scenariusz do badania wewnętrznych i zewnętrznych ról komórek dla interesujących genów kandydujących, zachowań migracyjnych komórek i wydzielanych sygnałów w różnych ustawieniach genetycznych. Ponieważ zwierzęta parabiotyczne mają wspólne krążenie, każda krew lub czynnik krwiopochodny od jednego zwierzęcia będzie wymieniany z jego partnerem i odwrotnie. W ten sposób komórki i czynniki molekularne pochodzące z jednego tła genetycznego mogą być badane w kontekście drugiego tła genetycznego. Parabioza dorosłych myszy jest szeroko stosowana do badań nad starzeniem się, rakiem, cukrzycą, otyłością i rozwojem mózgu. Ostatnio parabioza zarodków danio pręgowanego została wykorzystana do badania biologii rozwojowej hematopoezy. W przeciwieństwie do myszy, przezroczysta natura zarodków danio pręgowanego pozwala na bezpośrednią wizualizację komórek w kontekście parabiotycznym, co czyni ją wyjątkowo potężną metodą badania podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych. Użyteczność tej techniki jest jednak ograniczona przez stromą krzywą uczenia się generowania parabiotycznych zarodków danio pręgowanego. Protokół ten przedstawia krok po kroku metodę, w jaki sposób chirurgicznie połączyć blastule dwóch zarodków danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym w celu zbadania roli genów kandydujących na badanie. Ponadto zarodki parabiotycznych danio pręgowanego są tolerancyjne na szok cieplny, co umożliwia czasową kontrolę ekspresji genów. Metoda ta nie wymaga skomplikowanej konfiguracji i ma szerokie zastosowanie w badaniu migracji komórek, specyfikacji losu i różnicowania in vivo podczas rozwoju embrionalnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie genetycznych mozaik (chimer) między dzikimi i genetycznie modyfikowanymi zwierzętami jest dobrze znaną i klasyczną strategią badania funkcji wewnętrznych i zewnętrznych komórek kandydujących genów1-6. Przeszczep blastuli u danio pręgowanego jest szeroko stosowany do generowania chimerycznych zarodków do badań autonomii komórkowej7-9. Jednak w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, przewidywalne ukierunkowanie komórek dawcy na pożądaną tkankę (np. krew) może być trudne 1-3, 7-9. Genetycy myszy od dawna stosują parabiotyczne metody chirurgiczne do generowania połączonych organizmów ze wspólnym krążeniem 10-14. Ponieważ zwierzęta parabiotyczne mają wspólny krwioobieg, interakcje między komórkami pochodzącymi od jednego zwierzęcia z komórkami drugiego zwierzęcia o innym tle genetycznym można badać 10-16. Niedawno grupa Karimy Kissy elegancko zademonstrowała zdolność do tworzenia zrośniętych zarodków danio pręgowanego, a następnie wykorzystania tego systemu do badania migracji hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC)15. Ponadto parabioza danio pręgowanego została niedawno wykorzystana do zbadania roli kadheryny śródbłonka 5 w powstawaniu i migracji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC),16 oraz do zbadania roli komórek zrębu w niszy HSPC podczas rozwoju danio pręgowanego 17.

W przeciwieństwie do myszy, embriony danio pręgowanego są przezroczyste i pozwalają na bezpośrednią wizualizację komórek podczas rozwoju parabiotyków, co czyni system wyjątkowo potężnym. Użyteczność parabiozy u danio pręgowanego jest jednak ograniczona przez stromą krzywą uczenia się, a chirurgia parabiotyczna na delikatnych zarodkach może być technicznie trudna bez szczegółowych instrukcji i wizualnej demonstracji. Celem tego protokołu jest dostarczenie zestawu jasnych, krok po kroku instrukcji, które będą towarzyszyć samouczkom wideo na temat generowania parabiotycznych zarodków danio pręgowanego do badania czasowych, wewnętrznych lub zewnętrznych funkcji komórki kandydującego genu (genów) poprzez chirurgiczną fuzję rozwijających się blastuli. Uwzględniono kluczowe modyfikacje i dodatkowe zalecenia dotyczące zwiększenia przeżywalności parabiontów i nowych zastosowań eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie. Protokół ten jest modyfikowany w stosunku do wcześniej opublikowanej metody 15.

1. Przygotowanie odczynników (dni lub tygodnie wcześniej)

  1. Przygotuj potrawy pokryte 1,5% agarozą. Dodać 1,5 g agarozy do 100 ml pożywki E3 danio pręgowanego w kolbie Erlenmeyera. Podgrzej, rozpuść agarozę, a następnie wlej około 5 ml do szalek Petriego o średnicy 100 mm x głębokości 20 mm.
    Uwaga: Są one używane do dechorionacji zarodków (Krok 3.1) oraz do chirurgii parabiotycznej (Krok 3.3). Naczynia pokryte agarozą przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni; wyjmij je z lodówki i ogrzej do RT rano w dniu operacji parabiotycznej.
  2. Przygotuj 4% metylocelulozy. Rozpuścić 4 g sproszkowanej metylocelulozy w 100 ml E3 w kolbie Erlenmeyera z mieszadłem. Umieścić kolbę na płytce mieszającej w temperaturze 4 °C, ustawić najniższą prędkość i pozostawić do wymieszania na okres do 2 dni.
    1. Od czasu do czasu używaj szpatułki, aby rozbić białe grudki metylocelulozy. Kryształy metylocelulozy nie rozpuszczają się całkowicie w tym stężeniu. Gdy roztwór stanie się klarowny i stanie się jednorodny i nie pozostaną żadne białe grudki, rozdzielić roztwór do probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
      Uwaga: Można stosować niższe stężenia metylocelulozy; Jednak ta wyższa procentowa, bardziej lepka metyloceluloza przyniosła najlepsze wyniki.
  3. Przygotuj roztwór Ringera o wysokiej zawartości wapnia (HCR). Aby przygotować 400 ml roztworu HCR, wymieszaj 8 ml 5M NaCl (116 mM final), 400 μl 3M KCl (2,9 mM final), 800 μl 5M CaCl2 (10 mM final) i 2ml 1M HEPES (5 mM final) z 390 ml pożywki E3.
    Uwaga: Przechowywać roztwór HCR w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni; ciepło do RT rano w dniu operacji parabiotycznej.
  4. Przygotuj 5 - 6 zmodyfikowanych pipet Pasteura do przenoszenia par blastuli. Krótko podgrzej końcówkę pipety nad palnikiem Bunsena. Następnie, za pomocą dużych kleszczyków, zegnij koniec pipety do około 45 °C, gdy jest jeszcze gorąca.
    1. Aby upewnić się, że nie ma ostrych krawędzi, które mogłyby uszkodzić zarodki, przytrzymaj końcówkę pipety krótko w płomieniu przez około 3 sekundy. Spowoduje to wygładzenie/wypolerowanie końcówki pipety. Ta zmodyfikowana szklana pipeta Pasteura jest używana w połączeniu z pompką do pipet o pojemności 10 ml (rysunek 1) w kroku 3.5 poniżej.
  5. Przygotuj szklane narzędzia igłowe do chirurgicznego zszywania par blastuli. Wyciągnij 2-3 szklane igły, tak jak to jest zrobione do mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego. Użyj folii laboratoryjnej, aby przymocować każdą szklaną igłę do końca igły do drażnienia z drewnianą lub plastikową rękojeścią (Rysunek 1A). Za pomocą kleszczy odłam koniec igły o średnicy około 20 - 30 μm. Użyj mikrometru stage, aby poprowadzić ten krok (Rysunek 1B).
    Uwaga: Rozmiar końcówki igły jest ważny. Jeśli końcówka jest zbyt duża, staje się trudna do precyzyjnego kontrolowania i może spowodować nadmierne uszkodzenia. Jeśli końcówka jest zbyt mała, trudno jest wystarczająco nawinąć zarodki.

2. Ustawianie par hodowlanych danio pręgowanego i zbieranie zarodków (Dzień -1 do Dzień 0)

  1. Stwórz pary hodowlane dorosłego danio pręgowanego. Ustaw ryby na noc przed przeprowadzeniem operacji parabiozy. Użyj przegródek, aby oddzielić samców i samice. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie pożądanych zarodków, ustaw kilka par każdej linii. Okazuje się, że zazwyczaj pojawia się 20-50% par.
  2. Następnego ranka pociągnij przegrody i pozwól na krycie. Zebrać wszystkie zarodki za pomocą sitka do herbaty o drobnych oczkach, a następnie przenieść je na szalkę Petriego zawierającą pożywkę dla zarodkówE3 18.
  3. W razie potrzeby należy mikrowstrzykiwać zarodki (np. z plazmidowym DNA 25 pg, 200 pg mRNA lub z 1 - 6 ng morfolino) w ciągu 1 godziny od pobrania. Pozwól im rosnąć do etapu 256 komórek. Jeśli konstrukt ekspresji DNA zostanie umieszczony pod kontrolą promotora szoku cieplnego (np. hsp70, Figura 4B), kontroluj czas ekspresji genu poprzez szok termiczny parabiontów w temperaturze 37 °C na późniejszym etapie (np. w temperaturze 36 hpf).
    Uwaga: Jako alternatywę dla transgenu fluorescencyjnego, dekstran fluorescencyjny może być dodawany do DNA, RNA lub mieszanki iniekcyjnej morfolino (np. dekstran, błękit kaskadowy w dawce 2 mg/ml). Barwnik dekstranowy nie będzie przeszkadzał w prawidłowym rozwoju i pozwoli na identyfikację wstrzykniętego zarodka pod odpowiednim światłem fluorescencyjnym po fuzji parabiotycznej. Alternatywnie, parabioza szczepu pigmentowanego (np. AB) ze szczepem niepigmentowanym (np. Casper) może być wykorzystana do identyfikacji wstrzykniętego zarodka na późniejszych etapach.
  4. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C. Okresowo monitorować ich rozwój, gdy zbliżają się do stadium rozwojowego 256 komórek (około 2,5 hpf).
    Uwaga: W razie potrzeby przenieś zarodki do różnych temperatur, aby zapewnić dopasowanie etapów między partnerami parabiotycznymi (np. zarodki, którym wstrzyknięto morfolinę, często rozwijają się wolniej niż ich niewstrzyknięte odpowiedniki. Przesunięcie zarodków, którym nie wstrzyknięto zarodków, do RT, podczas gdy zarodki z wstrzyknięciem morfoliny są umieszczane w temperaturze 28,5 °C, spowoduje wyrównanie ich stadiów po kilku godzinach rozwoju).

3. Wytwarzanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego przez chirurgiczną fuzję rozwijających się blastuli

  1. Gdy zarodki zbliżają się do stadium 256 komórek (około 2,5 hpf), przenieś zarodki z każdego tła genetycznego (tj. mutanta genetycznego, linii transgenicznych i/lub manipulacji genetycznej) do oddzielnych szalek pokrytych agarozą (np. jedna szalka dla zarodków wstrzykniętych morfoliną i druga szalka dla zarodków kontrolnych). Alternatywnie, przenieś zarodki do czystych, odpornych na zarysowania szklanych zlewek lub szklanych szalek Petriego.
    Uwaga: Unikaj używania niepowlekanych plastikowych naczyń, ponieważ zarodki przykleją się do plastiku i ulegną uszkodzeniu po wyjęciu z kosmówki.
  2. Zdekantować pożywkę E3 do momentu, gdy pozostanie wystarczająca ilość płynu, aby pokryć zarodki (około 7 - 10 ml). Dodać 200 μl 50 mg/ml mieszaniny proteaz wyizolowanych z płynu zewnątrzkomórkowego Streptomyces griseus (proteazy). Delikatnie obracaj zarodki co kilka minut.
    1. Gdy 50% zarodków wyjdzie z kosmówki, co zwykle trwa 5 - 10 minut, przepłucz je trzykrotnie dużą objętością (około 15 - 20 ml) świeżej pożywki dla zarodków E3.
      1. Usunąć zarodki pozostałe w ich kosmówce, delikatnie wciągając je do zmodyfikowanej szklanej pipety Pasteura, a następnie delikatnie usuwając. Po usunięciu zarodków i umyciu zarodków należy zastąpić pożywkę E3 roztworem HCR. Jako alternatywę dla proteaz należy usunąć kosmówkę ręcznie za pomocą cienkich kleszczy. Dążyć do tego, aby dla każdego warunku doświadczalnego dostępnych było 60 - 100 zarodków z odkorzówką.
        Uwaga: Jest to kilkakrotnie więcej niż ostatecznie zostanie użyte, ale wiele zarodków prawdopodobnie zostanie uszkodzonych podczas obchodzenia się z nimi lub operacji parabiozy. Po dekorionacji zarodków trzymaj je zanurzone i nie pozwól im dotykać powierzchni wody, ponieważ napięcie powierzchniowe spowoduje ich zniszczenie. Należy pamiętać, że stosowanie wyższej dawki proteaz pozwala zarodkom szybciej i w bardziej zsynchronizowany sposób wydostać się z kosmówki. W przypadku stosowania mniejszej dawki proteaz zarodki potrzebują więcej czasu, aby wyłonić się z kosmówki i robią to w mniej synchroniczny sposób, co może spowodować uszkodzenie części zarodków przez długotrwałe narażenie na proteazy.
  3. Rozmrozić metylocelulozę (wykonaną w kroku 1.2 powyżej) i odwirować w wirówce stołowej na maksymalnej prędkości przez 10 minut, aby rozdrobnić nierozpuszczone kryształy, które uszkodzą zarodki lub rozerwą ich żółtka.
    1. Po odwirowaniu użyj klarownej górnej frakcji (około 75% objętości). Przenieś krople metylocelulozy o średnicy 1 - 1,5 cm na 1,5% pokrytą agarozą szalkę Petriego. Uważaj, aby nie wyciągnąć żadnego z granulowanych kryształów z dna probówki.
    2. Użyj markera, aby wstępnie określić położenie każdej kropli na dolnej stronie naczynia. Umieścić 12 - 15 kropli (2 - 3 porcje) metylocelulozy na szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Przygotuj tyle talerzy, ile potrzeba na eksperyment.
      Uwaga: Użyj każdej kropli do fuzji pojedynczej pary blastuli. Znak wyznaczy położenie każdej kropli po dodaniu pożywki - w którym to momencie krople stają się prawie niewidoczne.
  4. Przygotować jedną 40 ml porcji roztworu HCR uzupełnionego antybiotykiem na naczynie pokryte agarozą, przygotowane powyżej w kroku 3.3. Do każdej 40 ml podwielokrotności HCR dodać penicylinę-streptomycynę w stężeniu 50 j./ml, ampicylinę w stężeniu 50 j./ml i kanamycynę w stężeniu 0,5 μg/ml.
    1. Gdy będziesz gotowy do przeprowadzenia fuzji blastuli, ostrożnie napełnij każde z naczyń zawierających kropelki metylocelulozy 40 ml roztworu HCR uzupełnionego antybiotykiem. Jeśli roztwór HCR zostanie dodany zbyt szybko, może zakłócić działanie kropelek.
  5. Podłącz zmodyfikowaną szklaną pipetę Pasteura (wykonaną w kroku 1.4 powyżej) do pompki do pipety o pojemności 10 ml. Pod stereoskopem pobrać po jednym zarodku z dekorionacją z każdego tła (np. jeden zarodek z wstrzykniętą morfoliną i jeden zarodek typu dzikiego).
    1. Przed wydaniem dwóch zarodków użyj pipety Pasteura, aby wykonać małe wgłębienie w środku kropli metylocelulozy, a następnie delikatnie umieść oba zarodki w zagłębieniu.
      Uwaga: Podczas procesu transferu należy obrócić pipetę Pasteura lekko do góry, tak aby zarodki osiadły w zgięciu pipety Pasteura, aby uniknąć kontaktu z powierzchnią płynu na górze lub na dole pipety (co może doprowadzić do ich pęknięcia).
  6. Natychmiast po umieszczeniu zarodków w metylocelulozie, należy użyć drewnianej lub plastikowej igły do drażnienia z końcówką do pipety z żelem na końcu (ryc. 1A), aby ostrożnie przestawić zarodki w metylocelulozie tak, aby ich bieguny zwierzęce stykały się ze sobą.
    1. Wykonuj delikatne ruchy zamiatające przez metylocelulozę w pobliżu zarodków, aby zmienić ich położenie bez bezpośredniego dotykania. Pozostaw zarodki na 5 minut, aby metyloceluloza osiadła wokół nich. W tym czasie załaduj następną parę do innego dropu.
      Uwaga: Unikaj bezpośredniego kontaktu z zarodkami i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotknąć żadnej części woreczka żółtkowego, który łatwo pęknie.
  7. Za pomocą szklanej igły ostrożnie nawiń każdy zarodek w miejscu ich kontaktu. Delikatnym ruchem szycia komórki z pierwszego zarodka mogą zostać wciągnięte do drugiego zarodka, a następnie z powrotem. Pod koniec tego ruchu przytrzymaj igłę w miejscu przez 2 - 3 sekundy, a następnie odciągnij ją bardzo powoli.
    Uwaga: Po zranieniu zarodków następuje okres około 2-3 sekund, w którym dwie tkanki wydają się być bardziej przylegające i bardziej prawdopodobne jest, że przyczepią się do siebie. Dlatego uważamy, że przytrzymanie igły na miejscu przez krótki czas po zranieniu pomaga utrzymać zranione tkanki każdego zarodka w kontakcie przez początkowy okres czasu bezpośrednio po zranieniu.
  8. Pozwól tym zarodkom siedzieć przez 10 - 15 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie kontynuuj zszywanie nowych par w innych kroplach metylocelulozy. Po 10 - 15 minutach oceń, czy pierwsza para pozostała przyczepiona (Rysunek 2A).
    Uwaga: Jeśli zarodki są dłużej przyczepione, powtórz proces szycia tak długo, jak długo zarodki są młodsze niż około 30% stadium epibolii. Zazwyczaj pozwala to na maksymalnie trzy próby zszycia zarodków. Jeśli wydaje się, że zarodki zachowały przyczepienie, ale połączenie nie jest znaczące, wykonaj dodatkowe szwy na krawędzi połączenia, aby je wzmocnić. Unikaj potrząsania lub przesuwania naczyń podczas operacji parabiotycznej i okresów inkubacji.
    Uwaga: Pomimo ich wczesnego etapu rozwoju i postrzeganej kruchości, masy komórkowe zarodków mogą tolerować znaczną ilość manipulacji (tj. zranień i zszywania) i nadal rozwijać się normalnie. Żółtko może jednak pęknąć przy najmniejszym dotknięciu, zabijając zarodek. Podczas zszywania dwóch blastuli szklaną igłą nie należy stykać się z powierzchnią międzyfazową między masą komórkową a żółtkiem każdego zarodka.
  9. Inkubować zarodki O/N w temperaturze 28,5 °C w tym samym naczyniu i pożywce (nie zmieniać pożywki). Następnego ranka zarodki wyjdą z w większości rozpuszczonych kropelek metylocelulozy. Usuń wszystkie zarodki, które nie zostały pomyślnie połączone. Zdekantować pożywkę i zastąpić ją świeżą 25 ml E3.
    Uwaga: Jeśli pracujesz ze szczepem pigmentowanym, dodaj 500 μl 0,15% (50x) fenylotiomocznika (PTU) do końcowego stężenia 0,003%, aby zablokować pigmentację. Zarodki będą musiały stale pozostawać w PTU, aby utrzymać zahamowanie pigmentacji.

4. Konfiguracja mikroskopu, akwizycja, przetwarzanie i analiza obrazu

  1. Przygotuj 0,8% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP): Dodaj 0,8 g agarozy LMP do 100 ml E3 i podgrzewaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Na gorąco podamy 1 ml agarozy LMP do 1,5 ml probówek do mikrofuge w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. Agaroza LMP pozostanie stopiona w temperaturze 37 °C. Dodać 40 μl 4 mg/ml (25x) trikainy o pH 7,0 do każdej 1 ml porcji agarozy LMP w temperaturze 37 °C. Uwaga: W przypadku pracy ze szczepem pigmentowanym dodać 20 μl 0,15% (50x) PTU do każdej podwielokrotności 1 ml.
    1. Pozostałą agarozę LMP przechowywać przez kilka miesięcy w szczelnie zamkniętych probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C.
  2. Znieczulenie zarodków parabiotycznych do obrazowania należy poprzez dodanie 1 ml trikainy o pH 4 mg/ml (25x) do 25 ml E3, w której zarodki już się znajdują
    3. .
  3. Delikatnie zakręć naczyniem, aby zarodki zebrały się w środku. Następnie, za pomocą plastikowej pipety transferowej z szeroką końcówką, wciągnij zarodki w jak najmniejszej ilości płynu. Obróć pipetę do góry pionowej i delikatnie odbij zarodki, aby osiadły na samym dnie pipety.
    1. Umieść zarodki na dnie pipety, przenieś je do 1 ml porcji agarozy LMP, lekko dotykając końcówką pipety powierzchni agarozy. Unikaj przenoszenia nadmiaru płynu, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie agarozy.
  4. Po usunięciu nadmiaru płynu z pipety, za pomocą pipety delikatnie wymieszać zarodki w agarozie, a następnie za pomocą pipety przenieść całą agarozę i zarodki do dołka na szkiełku nakrywkowym (szkiełko nakrywkowe nr 1,5), płytce 6-dołkowej.
    Uwaga: Należy wyrzucić pipetę po przeniesieniu zarodków na płytkę obrazową. Resztki agarozy osadzają się w pipecie, czyniąc ją nieskuteczną do dalszego użycia. Zamiast tego za każdym razem używaj nowej pipety.
  5. Pod stereoskopem użyj końcówki pipety z żelem zamocowanej na końcu igły do drażnienia z drewnianą rękojeścią, aby ustawić zarodki w dół w kierunku szkła nakrywkowego (aby upewnić się, że znajdują się w odległości roboczej obiektywu mikroskopu) i w pożądanej orientacji do obrazowania.
    Uwaga: Zmieniaj położenie w sposób ciągły, aż agaroza całkowicie stwardnieje. Zwróć uwagę, aby zamontować zarodki parabiotyczne, zgodnie z którym zarodek pary ma być zobrazowany. Biorąc pod uwagę losową orientację zrośniętych zarodków, w przypadku niektórych par obrazowanie obu zarodków może być trudne. W tym scenariuszu należy odzyskać zarodki z agarozy za pomocą kleszczy i plastikowej pipety transferowej z szeroką końcówką, a następnie ponownie założyć w celu obrazowania z innej perspektywy.
  6. Gdy agaroza stężeje, zalej 2-3 ml E3 uzupełnionego trikainą (i PTU, jeśli to konieczne).
  7. Zobrazuj zarodki za pomocą odwróconej epi-fluorescencji szerokokątnej, skaningu laserowego konfokalnego lub mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Wybierz obiektyw najbardziej odpowiedni dla żądanego obrazowania. Aby uzyskać pole widzenia całego zarodka, użyj obiektywu 4x. Wybierz większe powiększenie, takie jak obiektyw 20x, aby zobrazować określoną tkankę16, 19,
    Uwaga: Jeśli używasz mikroskopu pionowego, zamontuj agarozę LMP (podobną do powyższej) na szklanym szkiełku nakrywkowym. Odwróć szklane szkiełko nakrywkowe na szklane szkiełko mikroskopowe z pierścieniem smaru próżniowego wypełnionym tym samym E3-trikainą-PTU16, 19.
  8. Przetwarzaj pozyskane obrazy za pomocą bezpłatnych pakietów oprogramowania do analizy obrazu, takich jak NIH Image J/FIJI16, 19.
    Uwaga: Policz liczbę komórek i określ ilościowo dynamikę, taką jak migracja komórek i podział komórek, za pomocą algorytmów segmentacji i śledzenia16, 19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z poprzednio opublikowanymi badaniami15, udana parabiotyczna fuzja zarodków danio pręgowanego zależy od stopnia zaawansowania i orientacji dwóch zarodków oraz stężenia metylocelulozy. Za pomocą zaledwie kilku prostych, niedrogich narzędzi udało się wygenerować chirurgicznie zrośnięte rozwijające się blastule, które wyrosły na parabiotyczne zarodki ze wspólnym krążeniem. Narzędzia te obejmowały zmodyfikowaną pipetę Pasteura, pompkę do pipet o pojemności 10 ml oraz igły d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuzja parabiotyczna jest potężnym narzędziem do badania funkcji komórkowych genów kandydujących w dorosłych modelach mysich i zarodkach piskląt10-14. Niedawno opisano metodę fuzji blastuli do generowania syjamskich zarodków daniopręgowanego 15. W niniejszym protokole wykorzystano samouczki oparte na filmach wideo, aby zademonstrować i lepiej opisać metodologię tworzenia parabiotycznych zarodków danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym w celu zbadania czasowej, wewnętrznej i zewnętrznej rol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Julie R. Perlin za pomocne komentarze na temat manuskryptu. D.I.S. jest wspierany przez granty z American Society of Hematology, Cooley's Anemia Foundation i NIH (K01DK085217 i R03DK100672). E.J.H. jest stypendystką Fundacji Helen Hay Whitney w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. B.L. jest stypendystką Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. jest wspierany przez stypendium Irvington Fellowship z Instytutu Badań nad Rakiem oraz Młodego Badacza Nagroda przyznana przez Fundację Conquer Cancer firmy ASCO. L.I.Z. jest wspierany przez granty NIH (R01CA103846, P01HL032262 i R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute i jest badaczem w Howard Hughes Medical Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MetylocelulozaSigmaM0387
Poszczególne składniki dla E3/HCR:Dla 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4
NaCl (chlorek sodu)Sigma-AldrichS9888
KCl (chlorek potasu)Sigma-AldrichP9541
CaCl2 (dwuwodny chlorek wapnia)Sigma-Aldrich223506
MgSO4 (siedmiowodny siarczan magnezu)Sigma-Aldrich230391
Hepes (1M)ThermoFisher15630-080
NazwaFirmaKatalog Numer
Antybiotyki:
Pen/Strepgibco firmy Life technologies15140-120
Sól sodowa ampicilinySigma Life ScienceA0166
Siarczan kanamycyny ze Streptomyces kanamyceticusSigma Life ScienceK1377
Nazwa Company<strong>Numer katalogowy
50 mg/ml Pronaza ze Streptomyces griseusRoche11459643001
szkło kapilarne stosowane do igieł (Capillary Glass & Filamenty)Instrument Sutter POZYCJA#: BF 100-50-10
Igły do drażnienia z drewnianymi uchwytamiFisher ScientificS07894
Szklane pipety PasteuraFisherbrand13-678-20A Pompka
do pipet 10 ml (zielona) (Pipeta z pompką Pipettor)Novatech InternationalF37898-0000
Plastikowe szalki Petriego o średnicy 100 mm / głębokości 20 mm (SZALKA PETRI, 100/20 MM, PS, PRZEZROCZYSTA, Z OTWORAMI WENTYLACYJNYMI,
HEAVY DESIGN, 15 SZT./WOREK )		Greiner Bio-one664102
Dextran, Cascade Blue, 10 000 MW, Anionowy, Lizyna FixableThermoFisherD-1976
PTU. zapas roboczy wynosi 0.003% (50x to 0.15%). na 500 ml, 0.75 g N-PhenylthiureeaSigma-AldrichP7629
Trikaina (proszek) (Trikaina Methanesulfonato, Tricaine-S)Western Chemical IncMS 222
LMP agaroza (ultraczysta agaroza LMP)Invitrogen16520100
(myślę, że tylko ta z szerokim końcem)Fisherbrand137115AM
6-dołkowe płytki ze szklanym dnem używane do obrazowaniaMatTekP06G1.5-20-F
plastikowa końcówka ładująca żel western zamocowana na końcu igły preparacyjnej z drewnianą rękojeścią (końcówki GELoader)Eppendorf22351656
szkiełka nakrywkowe, szkiełka i smar próżniowy w przypadku montażu do mikroskopu pionowego:
Smar próżniowy ( Dow Corning & reg; smar silikonowy o wysokiej próżni
bezbarwny, waga 5,3 uncji (tuba) )		Dow CorningZ273554
Szkiełka nakrywkowe szklaneNauki przyrodnicze Corning2960-244
Roztwór buforowy Plastikowa pipeta transferowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  2. Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
  3. Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
  4. Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
  5. Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
  6. Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
  7. Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
  8. Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
  9. Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
  10. Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
  11. Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
  12. Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
  13. Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
  14. Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
  15. Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
  16. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
  17. Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375(2015).
  18. Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
  19. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
  20. Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chirurgiczne czenie blastulparabioza embrion w danio pr gowanegobiologia rozwoju hematopoezybadania nad migracj kom rekobrazowanie mikroskopem konfokalnymekspresja gen w indukowana szokiem termicznymtransgeniczne embriony danio pr gowanegopozycjonowanie embrion w w metylocelulozieszycie szklan ig

Powiązane artykuły