Opracowaliśmy metodę uszkodzenia nerwów, aby wiarygodnie badać reinerwację mięśni, a tym samym regenerację połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy. Technika ta polega na uszkodzeniu wspólnego nerwu strzałkowego za pomocą prostej i wysoce powtarzalnej operacji. Renerwacja mięśni jest następnie oceniana poprzez całkowite zamontowanie mięśnia prostownika długiego palca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) ulega szkodliwym zmianom strukturalnym i funkcjonalnym w wyniku starzenia się, urazów i chorób. Dlatego konieczne jest zrozumienie zmian komórkowych i molekularnych związanych z utrzymaniem i naprawą NMJ. W tym celu opracowaliśmy metodę wiarygodnego i spójnego badania regenerujących się NMJ u myszy. Ta metoda uszkodzenia nerwu polega na zmiażdżeniu wspólnego nerwu strzałkowego, gdy przechodzi on przez boczną głowę ścięgna mięśnia brzuchatego łydki w pobliżu kolana. Wykorzystując 70-dniowe samice myszy, wykazaliśmy, że aksony motoryczne zaczynają unerwiać poprzednie cele postsynaptyczne w ciągu 7 dni po zmiażdżeniu. Całkowicie ponownie zajmują swoje poprzednie obszary synaptyczne przez 12 dni. Aby określić wiarygodność tej metody urazu, porównaliśmy wskaźniki reinerwacji między poszczególnymi 70-dniowymi samicami myszy. Odkryliśmy, że liczba zreinerwiowanych miejsc postsynaptycznych była podobna u myszy po 7, 9 i 12 dniach od zmiażdżenia. Aby ustalić, czy ten test uszkodzeń można również wykorzystać do porównania zmian molekularnych w mięśniach, zbadaliśmy poziomy podjednostki gamma mięśniowego receptora nikotynowego (gamma-AChR) i kinazy specyficznej dla mięśni (MuSK). Podjednostka gamma-AChR i MuSK są silnie regulowane w górę po denerwacji i wracają do normalnego poziomu po reinerwacji NMJ. Znaleźliśmy ścisły związek między poziomami transkryptów dla tych genów a stanem unerwienia mięśni. Wierzymy, że ta metoda przyspieszy nasze zrozumienie zmian komórkowych i molekularnych związanych z naprawą NMJ i innych synaps.
Wprowadzenie
U młodych dorosłych i zdrowych zwierząt, połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest bardzo stabilnym połączeniem między presynapsą, zakończeniem nerwowym aksonu α-motorycznego, a postsynapsą, wyspecjalizowanym regionem pozafuzyjnego włókna mięśniowego, gdzie nikotynowe receptory acetylocholiny (AChR) selektywnie agregują1. Prawie idealne ułożenie aparatów pre- i postsynaptycznych jest niezbędne do prawidłowego przekaźnictwa nerwowego, przetrwania neuronów α-ruchowych i włókien mięśniowych oraz funkcji motorycznych. Niestety, na funkcjonowanie NMJ niekorzystnie wpływa starzenie się, choroby takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroby autoimmunologiczne oraz urazy mięśni i nerwów obwodowych2-5. Urazy te często skutkują zwyrodnieniem presynaptycznych zakończeń nerwowych, pozostawiając mięśnie odnerwione i znacząco zmieniając zdolności motoryczne. Z tego powodu identyfikacja cząsteczek, które działają w celu utrzymania i naprawy NMJ, stała się priorytetem. Ponieważ nerwy obwodowe regenerują i unerwiają cele, modele uszkodzeń nerwów obwodowych zostały wykorzystane do identyfikacji zmian molekularnych związanych z regeneracją NMJ.
Modele uszkodzeń nerwów obwodowych często polegają na całkowitym przecięciu lub zmiażdżeniu określonych gałęzi nerwowych6. Po przecięciu rurka wewnętrzna musi zostać zreformowana, co opóźnia regenerację aksonów i ponowne unerwienie komórek i tkanek docelowych. Dotkliwość tego typu urazu powoduje również, że aksony odchylają się od swojej pierwotnej ścieżki, co powoduje, że nie docierają do pierwotnych celów. Jest to przeciwieństwo nerwów uszkodzonych w wyniku zmiażdżenia, w których endonerium pozostaje przyległe, zapewniając ścieżkę do wydajnego i prawidłowego odrastania regenerujących się aksonów. Pozwala również aksonom znaleźć i unerwić swoich pierwotnych partnerów z włókien mięśniowych. Niezależnie od modelu urazu, istnieje szereg zmian komórkowych i molekularnych, które muszą wystąpić, aby aksony mogły się zregenerować i ponownie unerwić cele. Po urazie segment nerwowy bliższy celowi jest rozbijany i usuwany w procesie zwanym zwyrodnieniem Wallera7. Proces ten polega na przeprogramowaniu i odróżnicowaniu komórek Schwanna w komórki niemielinizujące, które wydzielają czynniki regeneracyjne, oczyszczają mielinę i rekrutują makrofagi do miejsca uszkodzenia8. Makrofagi z kolei uzupełniają usuwanie mieliny i resztek aksonalnych, które w przeciwnym razie utrudniałyby wzrost regenerującego się aksonu9. Równolegle neurony ruchowe i czuciowe aktywują mechanizmy potrzebne do wspomagania regeneracji ich odciętych aksonów. Gdy regenerujący się akson dotrze do celu, musi przekształcić się ze stożka wzrostu w zakończenie nerwowe zdolne do prawidłowego przekazywania (w przypadku aksonów ruchowych) lub odbierania (w przypadku aksonów czuciowych) informacji10. W związku z tym aksony motoryczne alfa przechodzą szereg dobrze zaaranżowanych zmian, których kulminacją jest różnicowanie się ich stożka wzrostu w pełni funkcjonalne zakończenie nerwu presynaptycznego, które prawie idealnie przeciwstawia się miejscu postsynaptycznemu na docelowym włóknie mięśniowym11.
Nerwy kulszowe, piszczelowe i dodatkowe były głównymi wyborami do badania regeneracji aksonów i NMJ12-14. Istnieje jednak szereg wad związanych z używaniem tych modeli do badania zmian komórkowych i molekularnych związanych z regeneracją NMJ między zwierzętami i w różnych warunkach. Po pierwsze, nerw kulszowy zaopatruje większość mięśni kończyny tylnej, a uraz znacznie ogranicza zarówno ruch, jak i czucie. W związku z tym nie jest możliwe zastosowanie tej metody do badania wpływu ćwiczeń samych lub w połączeniu z innymi czynnikami. Dodatkowo nerw kulszowy jest dość grubą strukturą i dlatego wymaga dużej siły ściskającej, aby w pełni uszkodzić wszystkie aksony. To z kolei może skutkować całkowitą transsekcją bardziej powierzchownych aksonów, pozostawiając nienaruszoną rurkę endoneurialną głębiej leżących aksonów, wprowadzając znaczną zmienność w tempie i wierności regeneracji między tymi aksonami. Całkowita transsekcja tego nerwu jest jeszcze mniej pożądana, biorąc pod uwagę, że wiele aksonów nie będzie w stanie ponownie połączyć się z tymi samymi włóknami mięśniowymi. Sprawę komplikuje fakt, że nerw kulszowy posiada wewnętrzną zmienność anatomiczną, zarówno pod względem liczby, jak i miejsca pochodzenia jego końcowych gałęzi nerwowych. Dlatego bardzo trudno jest zmienić kolor w tym samym miejscu. Chociaż nerw piszczelowy jest mniejszy i bardziej podatny na urazy zmiażdżenia, nie ma również łatwo dostępnego punktu orientacyjnego, który służyłby jako miejsce uszkodzenia tej gałęzi nerwowej.
Dodatkowa gałąź nerwowa (część nerwu czaszkowego XI), która zaopatruje mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, była również wykorzystywana do badania regeneracji NMJ15. Nerw ten jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ NMJ w mięśniu mostkowo-obojczykowo-sutkowym można łatwiej zobrazować u żywych zwierząt w porównaniu z NMJ w innych mięśniach. Ale podobnie jak w przypadku nerwu kulszowego i piszczelowego, nie ma konkretnego punktu orientacyjnego, który można by wykorzystać do uszkodzenia tego nerwu w tym samym miejscu, ograniczając go jako model do porównywania regeneracji NMJ wśród poszczególnych zwierząt z kohorty eksperymentalnej. Niespójne miejsce zmiany wprowadza zmienność w tempie reinerwacji NMJ. Ze względu na te niedociągnięcia, przedstawiona tutaj procedura wykorzystuje uszkodzenie innej gałęzi nerwu obwodowego do zbadania regenerujących się NMJ.
Wspólny nerw strzałkowy, zwany również wspólnym nerwem strzałkowym, zawiera wiele cech, które czynią go niezawodnym nerwem do badania regeneracji NMJ między zwierzętami i w różnych terapiach. Wspólny nerw strzałkowy ma przewidywalny przebieg anatomiczny, ponieważ przebiega przez ścięgno bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki w kolanie, a skrzyżowanie służy jako stabilny punkt orientacyjny dla zmian chorobowych. Dostęp do nerwu odbywa się przez małe i minimalnie inwazyjne nacięcie w pobliżu, ale anatomicznie oddzielone od mięśni będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawione tutaj odkrycia pokazują, że regenerujące się aksony ruchowe zaczynają reformować NMJ w mięśniu prostownika długiego palca (EDL) 8 dni po zmiażdżeniu nerwu strzałkowego u 70-dniowych młodych dorosłych samic myszy. Co ważne, wzorzec i tempo reinerwacji są spójne u zwierząt w tym samym wieku i tej samej płci, a zatem zapewniają wiarygodny model urazu, który znacznie przyspieszy nasze zrozumienie zmian komórkowych i molekularnych wymaganych do utrzymania i naprawy NMJ.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH i protokołami na zwierzętach zatwierdzonymi przez Virginia Tech Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowanie zwierząt do operacji
- Znieczulić myszy mieszaniną ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) poprzez podskórne wstrzyknięcie pachwinowe za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml. Roztwór nośnika zawiera mieszaninę 0,9% soli fizjologicznej, 17,4 mg/ml ketaminy i 2,6 mg/ml ksylazyny. Umieść zwierzęta z powrotem w klatkach w oczekiwaniu na działanie leków.
UWAGA: Jeśli dawka nasycająca nie zapewnia wystarczającego znieczulenia na czas trwania zabiegu, można wstrzyknąć dodatkowe 25% dawki nasycającej. - Monitorować zwierzęta po wstrzyknięciu, aby sprawdzić, czy częstość oddechów jest stabilna i czy poziom pobudzenia jest odpowiedni. Sprawdź poziom pobudzenia za pomocą uszczypnięcia tylnej stopy, które nie powinno wywołać żadnej reakcji, gdy jest odpowiednio znieczulone.
UWAGA: Zwykle zajmuje to 3-5 minut w przypadku młodej dorosłej myszy o średniej wadze od 25 do 30 g. Jeśli zwierzę nadal reaguje na leczenie po 10 minutach od wstrzyknięcia, można wstrzyknąć dodatkowe 25% dawki nasycającej środka znieczulającego. - Nałóż wazelinę i lekką maść okulistyczną z olejem mineralnym na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Wyjmij zwierzęta z klatki i umieść je na czystej, płaskiej powierzchni. Ogol żądaną kończynę tylną od stopy do miednicy za pomocą elektrycznego trymera do włosów, odsłaniając tylko boczną stronę kończyny.
- Nałóż chemiczny środek do usuwania włosów na ogolone miejsce na 1 minutę. Ręcznie usuń włosy za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Oczyść depilowany obszar chusteczką laboratoryjną nasączoną etanolem.
2. Zabieg chirurgiczny
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie lub inną odpowiednią metodą. Oczyścić pole operacyjne i tablicę chirurgiczną 80% etanolem/H20. Zdezynfekuj miejsce operowane prowiodem. Umieść mysz na desce operacyjnej i wyrównaj z ograniczeniami kończyn. Utrzymuj docelową kończynę tylną w anatomicznie naturalnej pozycji z lekko wyprostowanym stawem kolanowym bez rotacji wewnętrznej lub zewnętrznej.
- Umieść zwierzę i deskę pod mikroskopem operacyjnym. Zorientuj się we właściwym miejscu nacięcia poprzez badanie palpacyjne powierzchownych punktów orientacyjnych, w szczególności kostnego stawu kolanowego i grzbietu między mięśniem piszczelowym przednim a mięśniem brzuchatym łydki.
- Wykonaj około 3 cm nacięcie przez skórę za pomocą skalpela lub nożyczek sprężynowych, używając ogólnych kleszczy do chwytania. Wykonaj nacięcie prostopadłe do leżącego poniżej przebiegu wspólnego nerwu strzałkowego.
- Kontynuuj nacięcie przez powięź powierzchowną, odsłaniając mięśnie dwugłowe udowe i obszerne mięśnie boczne. Oddziel te mięśnie, przecinając łączącą powięź głęboką. Cięcie 1-2 cm powinno wystarczyć.
- Cofnij mięsień dwugłowy uda doogonowo za pomocą mechanicznych zwijaczy, odsłaniając wspólny nerw strzałkowy.
- Śledź nerw proksymalnie, aż zostanie znalezione jego przecięcie ze ścięgnem bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki. Uwaga: Narażenie może wymagać dodatkowej manipulacji cofniętą skórą i mięśniami. To skrzyżowanie służy jako stabilny punkt orientacyjny dla uszkodzenia nerwu.
- Chwyć nerw cienkimi kleszczami, wyrównując końcówki równolegle do bocznej granicy ścięgna brzuchatego łydki. Zmiażdż wspólny nerw strzałkowy, wywierając stały, mocny nacisk przez 5 sekund.
- Potwierdź pełne zmiażdżenie nerwu przez oględziny przez lunetę chirurgiczną. Będzie wyglądał na półprzezroczysty w miejscu urazu. W przypadku używania myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w aksonach obwodowych, fluorescencja zniknie z miejsca urazu.
- Usuń retraktory i wyrównaj mięśnie w ich anatomicznych pozycjach. Zamknij miejsce nacięcia jedwabnymi szwami 6-0. Wystarczy 1-3 proste szwy przerywane. Umieść regenerującą mysz na poduszce grzewczej w czystej klatce.
- Monitoruj wszystkie zwierzęta przez 2 godziny po operacji, aby sprawdzić oddech i wszelkie niepożądane reakcje na znieczulenie. Początkową dawkę buprenorfiny 0,05-0,10 mg/kg mc. należy podać we wstrzyknięciu podskórnym do pachwiny natychmiast po powrocie do zdrowia po operacji. Podawać 3 dodatkowe dawki co 12 godzin przez następne 48 godzin. Po pełnym wyzdrowieniu zwróć myszy do placówki opieki nad zwierzętami.
3. Izolacja i barwienie mięśni prostownika długiego długiego (EDL)
- Składanie ofiar ze zwierząt za pomocą izofluranu. Dozuj 0,5 ml płynnego izofluranu do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej chłonnymi chusteczkami laboratoryjnymi. Umieść niezakorkowaną rurkę ze zwierzęciem w szczelnie zamkniętej komorze o długości 2 500 cm3. Wystarczające są co najmniej 4 minuty ekspozycji. Przetestuj pod kątem utraty obustronnych odruchów palebowych, szczypania palców u nóg i szczypania ogona, aby upewnić się, że każde zwierzę jest nieprzytomne przed przystąpieniem do perfuzji.
- Perfuzja przezsercowa16 zwierząt najpierw za pomocą 10 ml 0,1 M PBS, a następnie 25 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparyna (30 jednostek/20 g masy ciała) może być dodawana do PBS (10 jednostek/ml) w celu zapobiegania krzepnięciu krwi w małych naczyniach włosowatych, poprawiając wyniki perfuzji.
- Usuń skórę pokrywającą kończyny tylne za pomocą nożyczek, aby przeciąć poprzecznie skórę na obwodzie brzucha. Złudź skórę poza tylnymi kończynami i stopami za pomocą kleszczy.
- Usuń powierzchowną powięź kończyn tylnych, chwytając i obierając kleszczami. Jeśli używasz myszy eksprymujących białka fluorescencyjne w aksonach obwodowych, po utrwaleniu całych myszy przez noc w 4% PFA w probówkach o pojemności 50 ml. Spłucz trzykrotnie PBS.
UWAGA: Myszy stacjonarne można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C. Jeśli nie, pomiń ten krok i przejdź do kroku 3.6 bez naprawiania zwierząt. - Wypreparuj mięśnie EDL18 z tylnych kończyn myszy, upewniając się, że ścięgna proksymalne i dystalne są tak nienaruszone, jak to możliwe.
- Inkubować mięśnie EDL w buforze blokującym (1x PBS zawierający 0,5% Triton X-100, 3% BSA i 5% koziej surowicy) przez co najmniej 1 godzinę.
- Aby uwidocznić aksony ruchowe i ich zakończenia nerwowe, umieść mięśnie w rurkach zawierających przeciwciała neurofilamentu (1:1000) i synaptotagminy-2 (1:250) rozcieńczone w buforze blokującym przez 3 dni. Umyj mięśnie trzy razy za pomocą 1x PBS i za każdym razem 10 minut. Uwaga: Pomiń ten krok, jeśli używasz myszy eksprymujących białka fluorescencyjne (XFP) w aksonach obwodowych.
- Zabarwić kontralateralny, nieuszkodzony EDL jako pozytywną kontrolę całkowitego unerwienia NMJ. Kontrole ujemne powinny obejmować EDL uzyskany po 4 dniach od urazu, w momencie, w którym NMJ jest całkowicie odnerwiony, a także EDL wybarwiony wyłącznie przeciwciałami drugorzędowymi.
- Inkubuj mięśnie z odpowiednimi fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi, aby wykryć neurofilament i synaptotagminę-2 przez 1 dzień. Umyj mięśnie trzy razy za pomocą 1x PBS i za każdym razem 10 minut. Uwaga: Ten krok można wykonać razem z krokiem 3.10. Pomiń ten krok, jeśli używasz myszy eksprymujących białka fluorescencyjne w aksonach obwodowych.
- Aby uwidocznić region postsynaptyczny NMJ, inkubuj mięśnie z 5 μg/ml sprzężonej alfa-bungarotoksyny Alexa-555 rozcieńczonej w buforze blokującym przez co najmniej 2 godziny. Umyj mięśnie trzykrotnie 1x PBS i 10 minut za każdym razem.
- Aby zamontować całe mięśnie na dodatnio naładowanych szkiełkach podstawowych, umieść mięsień bezpośrednio na szkiełku, dodaj kilka kropli podłoża montażowego na bazie glicerolu na szkiełko i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka, aby spłaszczyć mięsień. Nasącz media montażowe z obwodu szkiełka i szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Nałóż lakier do paznokci, aby uszczelnić krawędzie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.
4. Obrazowanie i analiza danych
- Aby przeanalizować strukturę NMJ, należy zobrazować mięsień EDL za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w wzbudzenie światła o długości fali 488, 555 i 633 nm oraz wychwycić emitowane światło za pomocą obiektywów 20X i 40X.
- Aby zobrazować całe NMJ, utwórz obrazy projekcyjne o maksymalnej intensywności sekcji optycznych oddalonych od siebie o 1 do 2 μm, rozciągających się od najniższych do najwyższych widocznych obszarów NMJ. Twórz projekcje o maksymalnej intensywności za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do obrazowania.
- Aby określić tempo reinerwacji, skategoryzuj NMJ jako: 1) całkowicie odnerwione = miejsce postsynaptyczne jest całkowicie pozbawione kontaktu z aksonem, mniej niż 5% kolokalizacja między aksonem a AChR. 2) Częściowo unerwiony = akson częściowo zachodzi na postsynapsę, 5-95% kolokalizacja między aksonem a AChRs. 3) Pełne unerwienie = prawie idealne ułożenie między pre- i postsynapsą, większa niż 95% kolokalizacja między aksonem a AChR. Wyklucz NMJ, które leżą prostopadle do płaszczyzny obrazowania lub nie są w pełni uwidocznione na obrazie. Uwaga: We wszystkich tych eksperymentach przebadano co najmniej 3 zwierzęta i 50 NMJ na zwierzę. Wyniki uznano za istotne przy użyciu testu t-studenta o wartości P mniejszej niż 0,05.
- Aby oślepić operatora, oddzielne osoby mogą przeprowadzić operację i analizę obrazu. Bez wiedzy na temat grup leczonych analizator może być obiektywny dzięki punktacji NMJ. Alternatywnie, obrazy mogą być randomizowane i prezentowane operatorowi do analizy bez wiedzy o zwierzęciu źródłowym.
5. Ilościowy PCR
- Składanie ofiar ze zwierząt za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy. Usuń skórę i powierzchowną powięź pokrywającą mięśnie nóg zgodnie z krokiem 3.3. Rozciąć mięśnie piszczelowe przednie i EDL zgodnie z krokiem 3.4.
- Błyskawicznie zamroź całe mięśnie piszczelowe przednie i EDL w probówce o pojemności 1,5 ml nad ciekłym azotem. Wyjmij tkankę z probówki i umieść we wstępnie schłodzonej moździerzu częściowo zanurzonej w ciekłym azocie. Zmiel zamrożone mięśnie na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka.
- Rozpuść zamrożony proszek mięśniowy w dostępnym na rynku odczynniku do ekstrakcji RNA i wykonaj ekstrakcję RNA i usunięcie genomowego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą dostępnej na rynku mieszanki odwrotnej transkryptazy zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wykonaj qPCR przy użyciu dostępnego na rynku zestawu, używając odpowiednich genów porządkowych (patrz tabela materiałów). Do przeprowadzenia PCR należy użyć dostępnego w handlu ilościowego termocyklera PCR (patrz tabela materiałów).
- Ustawić temperaturę wyżarzania na 58 °C. Dostosuj dodatkowe parametry cykliczne do specyfikacji producenta mieszanki polimerazy taq/zielonej mieszanki SYBR. Uwzględnij końcowy krok krzywej topnienia w programie termocyklera składający się ze stopniowego zwiększania temperatury o 0,5 °C od 65 °C do 95 °C w celu przetestowania specyficzności startera i tworzenia dimerów startera.
- Określ względne poziomy ekspresji mRNA metodą 2-ΔΔCT 21 przy użyciu 18S RNA jako genu kontrolnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nerw strzałkowy wspólny, nazywany również wspólnym nerwem peronealnym, odgałęzia się od nerwu kulszowego powyżej dołu podkolanowego, gdzie opasuje głowę kości strzałkowej, przechodząc na przednią powierzchnię podudzia (Rycina 1A). Tam dzieli się na nerw strzałkowy powierzchowny i głęboki, które wspólnie unerwiają mięśnie zginacze grzbietowe stopy i palców (mięsień piszczelowy przedni, mięsień prostownik długi i krótki palców oraz mięsień prostownik długi palucha) oraz mię...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda przedstawiona w niniejszej pracy daje unikalne możliwości identyfikacji mechanizmów zaangażowanych w naprawę połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Metoda ta polega na zmiażdżeniu wspólnego nerwu strzałkowego, gdy przechodzi on przez ścięgno mięśnia brzuchatego łydki w pobliżu kolana. Pokazujemy, że już po 5 sekundach ucisku nerwu kleszczami, całkowite zwyrodnienie obserwuje się w ciągu 4 dni po urazie. U młodych dorosłych myszy aksony motoryczne alfa zaczynają reinerwiać poprzednie miejsca synaptyczne w mięśniu pros...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują członkom laboratorium Valdez za intelektualny wkład w eksperymenty i komentarze do manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ketamina | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorfina | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Chusteczki Nair | Nair | ||
| Kim | Kimtech | 34155 | |
| Elektryczna maszynka do golenia | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviodine | |||
| 1 ml Strzykawka | |||
| Nożyczki sprężynowe | Vannas | 91500-09 | |
| Skalpel nr 15 | Kleszcze Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Dumont | 11252-00 | ||
| 6-0 jedwabny szew na odwrotnej igle tnącej | Szew Ekspresowy | 752B | |
| Poduszka grzewcza dla gryzoni | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 sprzężone | sondy molekularne | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Mikroskop stereo zmiennoogniskowy | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Mikroskop konfokalny | Zeiss | ||
| Pompa perfuzyjna perystaltyczna o zmiennym przepływie | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Maść weterynaryjna | Puralube | 1621 | |
| Przeciwciała Synaptotagmin-2-Online | ABIN401605 | ||
| Przeciwciała przeciwko neurofilamentom-Online | ABIN2475842 |
Bibliografia
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Front. Neurosci. 8, 252(2014).
- Apel, P. J., Alton, T., et al. How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats. J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).
- Balice-Gordon, R. J. Age-related changes in neuromuscular innervation. Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PloS one. 7 (4), e34640(2012).
- Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Pre-existing pathways promote precise projection patterns. Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).
- Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration. Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).
- Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
- Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury. Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).
- Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Geuna, S. The sciatic nerve injury model in pre-clinical research. J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).
- Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).
- Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
- Feng, G., Mellor, R. H., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Bowen, D. C., Park, J. S., et al. Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction. Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).
- Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle. Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
