Charakterystyka wieloskalowych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii sił atomowych, wgłębień udarowych i reometrii

Podsumowanie

Prezentujemy zestaw technik do scharakteryzowania lepkosprężystych właściwości mechanicznych mózgu w mikro-, mezo- i makro-skali.

Streszczenie

Aby projektować i konstruować materiały inspirowane właściwościami mózgu, czy to do symulacji mechanicznych, czy do badań nad regeneracją tkanek, sama tkanka mózgowa musi być dobrze scharakteryzowana w różnych skalach długości i czasu. Podobnie jak wiele tkanek biologicznych, tkanka mózgowa wykazuje złożoną, hierarchiczną strukturę. Jednak w przeciwieństwie do większości innych tkanek, mózg ma bardzo niską sztywność mechaniczną, a moduły sprężystości Younga E są rzędu 100 s Pa. Ta niska sztywność może stanowić wyzwanie dla eksperymentalnej charakterystyki kluczowych właściwości mechanicznych. W tym miejscu demonstrujemy kilka technik charakterystyki mechanicznej, które zostały przystosowane do pomiaru właściwości elastycznych i lepkosprężystych uwodnionych, podatnych materiałów biologicznych, takich jak tkanka mózgowa, w różnych skalach długości i szybkościach obciążenia. W mikroskali przeprowadzamy eksperymenty z podatnością na pełzanie i relaksacją siły przy użyciu wgłębień z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych. W mezoskali przeprowadzamy eksperymenty z wgłębieniami udarowymi za pomocą wahadłowego wgłębnika instrumentalnego. W makroskali przeprowadzamy równoległą reometrię płytkową w celu ilościowego określenia modułów sprężystości ścinania zależnych od częstotliwości. Omawiamy również wyzwania i ograniczenia związane z każdą metodą. Razem techniki te umożliwiają dogłębną mechaniczną charakterystykę tkanki mózgowej, która może być wykorzystana do lepszego zrozumienia struktury mózgu i inżynierii materiałów inspirowanych biologią.

Wprowadzenie

Większość tkanek miękkich składających się z organów biologicznych jest mechanicznie i strukturalnie złożona, o niskiej sztywności w porównaniu do zmineralizowanej kości lub materiałów inżynieryjnych, i wykazuje nieliniową i zależną od czasu deformację. W porównaniu z innymi tkankami w ciele, tkanka mózgowa jest niezwykle zgodna, z modułami sprężystości E rzędu 100 s Pa ¹. Tkanka mózgowa wykazuje niejednorodność strukturalną z wyraźnymi i międzypalcowymi obszarami istoty szarej i białej, które różnią się również funkcjonalnie. Zrozumienie mechaniki tkanki mózgowej pomoże w projektowaniu materiałów i modeli obliczeniowych naśladujących reakcję mózgu podczas urazu, ułatwi przewidywanie uszkodzeń mechanicznych i umożliwi opracowanie strategii ochronnych. Ponadto takie informacje można wykorzystać do rozważenia celów projektowych w zakresie regeneracji tkanek oraz do lepszego zrozumienia zmian strukturalnych w tkance mózgowej, które są związane z chorobami takimi jak stwardnienie rozsiane i autyzm. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kilka podejść eksperymentalnych, które są dostępne w celu scharakteryzowania właściwości lepkosprężystych tkanek podatnych mechanicznie, w tym tkanki mózgowej, w mikro-, mezo- i makroskali.

W mikroskali przeprowadziliśmy eksperymenty z podatnością na pełzanie i relaksacją siły, używając wgłębień z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych (AFM). Zazwyczaj wgłębienie z włączoną funkcją AFM jest używane do oszacowania modułu sprężystości (lub sztywności chwilowej) próbki ^2-4. Jednak ten sam przyrząd może być również używany do pomiaru właściwości lepkosprężystych w mikroskali (zależnych od czasu lub szybkości) ^5-10. Zasada tych eksperymentów, pokazana na rysunku 1, polega na wcięciu sondy wspornikowej AFM w tkance mózgowej, utrzymaniu określonej wielkości siły lub głębokości wgłębienia i zmierzeniu odpowiednich zmian odpowiednio głębokości wgłębienia i siły w czasie. Korzystając z tych danych, możemy obliczyć odpowiednio podatność na pełzanie J _C i moduł relaksacji G_R.

W mezoskali przeprowadziliśmy eksperymenty z wgłębieniami w płynie, które utrzymują strukturę tkanki i poziom nawodnienia, używając opartego na wahadle instrumentalnego nanoindentera. Układ eksperymentalny przedstawiono na rysunku 2. Gdy wahadło wychyla się w kontakcie z tkanką, przemieszczenie sondy jest rejestrowane w funkcji czasu, aż wahadło oscylacyjne zatrzyma się w tkance. Na podstawie wynikowego tłumionego harmonicznego ruchu oscylacyjnego sondy możemy obliczyć maksymalną głębokość penetracji x_max, zdolność rozpraszania energii K i współczynnik jakości rozpraszania Q (który odnosi się do szybkości rozpraszania energii) tkanki ^11,12.

W makroskali użyliśmy reometru z równoległą płytką do ilościowego określenia modułów sprężystości ścinania zależnych od częstotliwości, określanych jako moduł magazynowania G' i moduł strat G" tkanki. W tym typie reometrii stosujemy harmoniczne odkształcenie kątowe (i odpowiadające mu odkształcenie ścinające) o znanych amplitudach i częstotliwościach oraz mierzymy moment reakcyjny (i odpowiadające mu naprężenie ścinające), jak pokazano na rysunku 3. Na podstawie wynikowej amplitudy i opóźnienia fazowego mierzonego momentu obrotowego oraz zmiennych geometrycznych układu możemy obliczyć G' i G" przy przystosowanych częstotliwościach będących przedmiotem zainteresowania ^13,14.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Szpitala Dziecięcego w Bostonie i są zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Procedury pozyskiwania tkanki mózgowej myszy (dla wcięć z obsługą AFM i wcięć uderzeniowych)

1. Przygotuj mieszaninę ketaminy i ksylazyny, aby znieczulić myszy. Połączyć 5 ml ketaminy (500 mg/ml), 1 ml ksylazyny (20 mg/ml) i 7 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej.
2. Wstrzyknij mysz (Rasa: TSC1; Syn-Cre; plp-eGFP; Wiek: p21; Płeć: mężczyzna lub kobieta) z 7 μl na gram masy ciała roztworu ketaminy/ksylazyny.
3. Gdy mysz jest w pełni znieczulona, o czym świadczy brak reakcji na szczypanie palców u nóg i ogona, należy poddać mysz eutanazji przez ścięcie głowy za pomocą dużych nożyczek preparacyjnych.
4. Usuń czaszkę, przecinając środek za pomocą mniejszych nożyczek do preparowania. Zaczynając od móżdżku, usuń kawałki czaszki za pomocą zakrzywionych kleszczy. Po usunięciu czaszki wyekstrahuj mózg za pomocą płaskiej szpatułki, aby podnieść mózg, zaczynając od móżdżku, i umieść mózg na szalce Petriego. Usuń móżdżek z mózgu za pomocą żyletki.
5. Jeśli używasz całego mózgu do testów wgnieceń uderzeniowych na świeżej tkance, przenieś mózg do rurki z okrągłodenną pożywką z niezależnym od CO₂ pożywką dla dorosłej tkanki nerwowej na lodzie i przejdź do sekcji 4. W przeciwnym razie przejdź do kroku 1.6 dla procedur krojenia.
6. Dostosuj ustawienia wibratomu do prędkości 0.7 mm/s, częstotliwości wibracji 70 Hz i grubości plastra 350 μm. Otocz naczynie wibratomu lodem. Umieść odrobinę superglue na płytce wibratomu i zamontuj mózg tak, aby można było przeciąć plasterki korony, z mózgiem zorientowanym tak, aby najpierw przeciąć stronę grzbietową.
7. Napełnij naczynie z wibratomem wystarczającą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, aby po prostu zanurzyć mózg. Podnieś naczynie na wibratomie tak, aby ostrze było po prostu zanurzone w DPBS.
8. Naciśnij start, aby rozpocząć krojenie koronalnych odcinków mózgu o grubości 350 μm.
9. Używając pędzli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki, przenieś wycinki mózgu z kąpieli wibratomicznej DPBS do probówki z okrągłym dnem z niezależnym od CO₂ pożywką dla dorosłej tkanki nerwowej na lodzie i wykonaj pomiary na świeżej tkance w ciągu 48 godzin. Aby rozpocząć eksperymenty z wcięciami z obsługą AFM, przejdź do sekcji 3.

2. Procedury pozyskiwania tkanki mózgowej świni (dla reologii)

1. Zdobądź pokrojoną w strzałki połowę mózgu świni w ciągu ~1 godziny od złożenia ofiary od lokalnego rzeźnika. Umieść pół mózgu w pożywce niezależnej od CO₂ dla dorosłej tkanki nerwowej i przechowuj na lodzie.
2. Użyj żyletki lub skalpela, aby zrobić wycinek mózgu o grubości ~5 mm i przechowuj w pożywce niezależnej od CO₂ dla dorosłej tkanki nerwowej. Upewnij się, że powierzchnia plastra jest tak płaska, jak to możliwe. Używaj ostrożnych ruchów bocznych brzytwą/skalpelem podczas cięcia.
3. Przechowywać tkankę mózgową świni w pożywce niezależnej od CO₂ dla dorosłej tkanki nerwowej na lodzie i wykonać pomiary reometryczne (sekcja 5) na świeżej tkance w ciągu 48 godzin.

3. Wcięcie z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych

1. Przygotuj szalki Petriego (P60) o średnicy 60 mm z bioklejem pochodzącym z małży zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Przygotować zapas z obojętnego roztworu buforowego składającego się z 0,1 M wodorowęglanu sodu w sterylnej wodzie o optymalnym pH 8,0. Przefiltrować i wysterylizować (0,2 mikrona) bufor wodorowęglanu sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. W okapie z przepływem laminarnym wymieszaj roztwór 6,25% bioadhezji pochodzącej z małży i 3,125% NaOH w buforze wodorowęglanu sodu.
   3. Odpipetować 100 μl roztworu bioadhezji z ppkt 3.1.2 na szalkę Petriego (P60) o średnicy 60 mm i za pomocą końcówki pipety rozprowadzić roztwór na okrąg o średnicy 3-5 cm.
   4. Pozostaw naczynia P60 odkryte w okapie z przepływem laminarnym i pozostaw roztwór do wyschnięcia (~30 min). Myj naczynia 1x PBS i 2x sterylną wodą. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym i przechowuj w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
2. Skalibruj AFM i ustaw próbkę mózgu w AFM.
   UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami kalibracji AFM zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Ostrożnie załadować sondę AFM o nominalnej stałej sprężystości 0,03 N/m i koraliku borokrzemianowym o średnicy 20 μm do uchwytu sondy.
   2. Skalibrować stałą sprężystości i odwróconą czułość dźwigni optycznej (InvOLS) wspornika AFM za pomocą metody strojenia termicznego ^15,16.
      UWAGA: Po obliczeniu stałej sprężystości sondy AFM powinna ona pozostać stała przy wielokrotnym użyciu. Jednak wspornik InvOLS będzie musiał być ponownie kalibrowany za każdym razem, gdy laser jest ponownie ustawiany na wsporniku. Dodatkowo kalibrację należy przeprowadzić na podłożu o kilka rzędów wielkości sztywniejszym niż wspornik, takim jak polistyren.
   3. Włącz grzałkę zamontowaną stage i ustaw temperaturę na 37 °C.
   4. Zamontuj plasterek mózgu na szalkach P60 przygotowanych w sekcji 3.1.
      1. Delikatnie wlać plasterek mózgu o grubości 350 μm, a także pożywkę niezależną od CO₂ z kolby okrągłodennej do naczynia P60 pokrytego bioadhezją pochodzącą z małży.
      2. Delikatnie przechylając szalkę P60, umieść plasterek mózgu na środku naczynia. W razie potrzeby powoli pipetuj pożywkę z pipetera ręcznego, aby rozłożyć wycinek mózgu, który się zagiął, lub lepiej umieścić wycinek mózgu na środku naczynia.
      3. Ostrożnie usuń nadmiar pożywki za pomocą pipetera P1000 (nie używaj odkurzacza).
      4. Przykryj na szalce P60 i pozwól plasterkowi mózgu przylegać przez 20 minut.
   5. Zdejmij głowicę AFM, umieść plasterek mózgu zamontowany w naczyniu P60 na stoliku AFM i dodaj ~ 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki niezależnej od CO₂.
   6. Ostrożnie dodaj kroplę pożywki na sondę AFM, aby chronić ją przed pęknięciem z powodu napięcia powierzchniowego, gdy jest opuszczana do podłoża otaczającego wycinek mózgu.
   7. Umieść głowicę AFM na stoliku i zacznij opuszczać głowicę, aż zostanie zanurzona w nośniku.
   8. Korzystając z kamery CCD z widokiem z góry, zmień położenie lasera na wsporniku.
      UWAGA: Ustawienie lasera na wsporniku zmieni się nieznacznie ze względu na różnicę w współczynniku załamania powietrza i ośrodka.
   9. Odczekaj 5 minut, aż wspornik dostosuje się do zanurzenia w ciepłym płynie, a następnie zresetuj ustawienie lustra do swobodnego odchylenia 0 V.
   10. Uruchom widmo termiczne na sondzie AFM zgodnie z instrukcjami producenta¹⁶. Użyj dopasowania pierwszego piku termicznego, aby ponownie obliczyć InvOLS sondy AFM w mediach.
   11. Za pomocą mikroskopu optycznego przesuń stolik próbki tak, aby obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania znajdował się poniżej sondy AFM.
       UWAGA: Ciało modzelowate będzie wyglądało na ciemne, ponieważ jest bardziej nieprzezroczyste niż otaczająca je istota szara. Kora jest lepsza od ciała modzelowatego.
   12. Zresetować ustawienie lusterka do swobodnego odchylenia 0 V.
   13. Na mierniku sumy i ugięcia w oprogramowaniu AFM kliknij "Włącz", aby włączyć głowicę AFM.
   14. Za pomocą pokrętła pozycji na głowicy AFM opuść głowicę, aż do zetknięcia się wspornika z próbką.
3. (Opcjonalnie) W razie potrzeby zmierzyć moduł sprężystości próbki, jak opisano wcześniej ^4,17,18.
4. Przeprowadzanie eksperymentów z pełzaniem zgodności.
   1. Skonstruuj funkcję przyłożonej siły w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja siły składa się z narastania o 0,1 sekundy do zadanej wartości 5 nN i utrzymywania jej przez 20 sekund, a następnie zmniejszania o 1 sekundę do przyłożonej siły 0 nN.
      1. W panelu Wzorzec wcięć, w sekcji Metoda wcięcia, wybierz "Wczytaj" dla trybu wcięcia; "N" dla jednostek; i "Edytor funkcji" dla funkcji wcięcia.
      2. W edytorze funkcji, w panelu Segment Parms, utwórz segment funkcji przyłożonej siły, który zaczyna się od 0 nN, kończy na 5 nN, z czasem 0,1 sek. Kliknij "Wstaw -->".
      3. W następnym segmencie ustaw początek na 5 nN, koniec na 5 nN, a czas na 20 sekund. Kliknij "Wstaw -->".
      4. Dla ostatniego segmentu ustaw początek na 5 nN, koniec na 0 nN, a czas na 1 sek. Kliknij "Rysuj" i zamknij okno Edytora funkcji.
   2. Na karcie Siła w panelu głównym zaznacz "rampa wgłębnika po wyzwoleniu" i ustaw funkcję przyłożonej siły tak, aby uruchamiała się po osiągnięciu punktu wyzwalania 0,1 V.
   3. Kliknij "Pojedyncza siła" u dołu zakładki Siła w panelu głównym, co uruchomi funkcję siły przyłożonej do konstrukcji w celu zapewnienia zgodności pełzania.
   4. Po zakończeniu wgłębienia z pojedynczą siłą podnieś głowicę AFM tak, aby nie stykała się z próbką, a następnie ponownie włącz głowicę i ponownie wyzeruj swobodne ugięcie.
   5. Zmień położenie stolika na próbkę, aby zlokalizować nowy obszar zainteresowania, i opuść głowicę AFM, aby nawiązać kontakt. UWAGA: Głowica AFM musi być cofnięta z powierzchni próbki, gdy stolik próbki jest przesuwany. Niezastosowanie się do tego może spowodować uszkodzenie delikatnego wspornika AFM.
   6. Powtarzaj kroki 3.4.3-3.4.5, aż zostanie zebrana żądana ilość danych.
5. Przeprowadzaj eksperymenty z relaksacją siły.
   1. Skonstruuj zastosowaną funkcję wcięcia w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja wgłębiania polega na zwiększaniu o 0,1 sekundy wartości zadanej 3 μm i utrzymywaniu jej przez 20 sekund, a następnie zwiększaniu o 1 sekundę do głębokości wgłębienia 0 μm.
      1. W panelu Wzorzec wcięć, w sekcji Metoda wcięcia, wybierz "Wcięcie" dla trybu wcięcia, "m" dla jednostek; i "Edytor funkcji" dla funkcji wcięcia.
      2. W edytorze funkcji, w panelu Segment Parms, utwórz segment funkcji przyłożonej siły, który zaczyna się od 0 μm, a kończy na 3 μm, z czasem 0,1 sek. Kliknij "Wstaw -->".
      3. W następnym segmencie ustaw początek na 3 μm, koniec na 3 μm, a czas na 20 sekund. Kliknij "Wstaw -->".
      4. Dla ostatniego segmentu ustaw początek na 3 μm, koniec na 0 μm, a czas na 1 sek. Kliknij "Rysuj" i zamknij okno Edytora funkcji.
   2. Na karcie Siła w panelu głównym zaznacz "rampa wgłębnika po wyzwoleniu" i ustaw funkcję przyłożonej siły tak, aby uruchamiała się po osiągnięciu punktu wyzwalania 0,1 V.
   3. Kliknij "Pojedyncza siła" na dole zakładki Siła w panelu głównym, co uruchomi funkcję wcięcia zastosowanego w konstrukcji w celu rozluźnienia siły.
   4. Po zakończeniu wgłębienia z pojedynczą siłą podnieś głowicę AFM tak, aby nie stykała się z próbką, a następnie ponownie włącz głowicę i ponownie wyzeruj ugięcie.
   5. Zmień położenie stolika, aby zlokalizować nowy obszar zainteresowania, i opuść głowę, aby nawiązać kontakt.
   6. Powtarzaj kroki 5.3-5.5, aż zostanie zebrana żądana ilość danych.
6. Zakończ eksperymenty i posprzątaj.
   1. Po zakończeniu eksperymentów podnieś głowicę AFM i wyjmij ją z próbki.
   2. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby ostrożnie usunąć nadmiar płynu bez dotykania wspornika.
   3. Ostrożnie wyczyść uchwyt wspornikowy AFM za pomocą niewielkiej ilości etanolu. Nie wystawiaj delikatnej elektroniki na uchwycie wspornika na działanie etanolu. Wyjmij wspornik AFM i umieść w pojemniku do przechowywania.
   4. Próbkę tkanki mózgowej należy usunąć, postępując zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa biologicznego.
7. Korzystając z MATLAB, oblicz podatność pełzania i moduły relaksacji siły przy użyciu geometrii wgłębnika, zgodnie z rozwiązaniem uzyskanym przez Lee i Radoka, 1960 ¹⁹.
   1. Oblicz siłę F i głębokość wcięcia na podstawie danych dotyczących położenia wspornika z, ugięcia d i stałej sprężystości, k_c
      
      i .
   2. Zlokalizuj punkt kontaktowy wzdłuż krzywej wcięcia za pomocą algorytmu opisanego w Lin et al. ²⁰.
   3. Zdefiniuj okno zainteresowania dla analizy danych. Oknem zainteresowania jest obszar, w którym siła (w celu zapewnienia podatności pełzania) lub głębokość wcięcia (w celu rozluźnienia siły) jest utrzymywana na poziomie wartości zadanej (tj. Region 3, jak pokazano na rysunku 1C,D).
   4. W przypadku eksperymentów z podatnością pełzania należy obliczyć eksperymentalny moduł podatności pełzania, J_c(t), w odpowiedzi na obciążenie skokowe :
      ,
      gdzie H(t) jest funkcją krokową Heavyside, a R jest promieniem sondy sferycznej.
   5. W przypadku eksperymentów z relaksacją siły należy obliczyć eksperymentalny moduł relaksacji siły, G_R(t), w odpowiedzi na głębokość wcięcia kroku :
      .

4. Wcięcie uderzeniowe

1. Skalibruj oprzyrządowany nanoindenter i dostosuj ustawienia domyślne, aby umożliwić eksperymenty dynamicznego wpływu na uwodnione tkanki mózgowe zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Zamontuj sondę sferyczną, wsuwając ją na wahadło za pomocą pęsety.
   2. Przyklej stopioną próbkę kwarcu do słupka próbki, który jest przykręcony do stolika translacyjnego.
   3. Przejdź do menu Kalibracja i wybierz "Liquid Cell". Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby nawiązać kontakt ze stopioną próbką kwarcu.
   4. Wybierz "Normalny" dla typu wgłębu i użyj domyślnej wartości 0,05 mN dla obciążenia wgłębnika. Kliknij "Kontynuuj", aby przeprowadzić kalibrację dla normalnej konfiguracji wgłębnika.
   5. Przesuń stolik na próbkę do tyłu o co najmniej 5 mm. Zamontuj ramię dźwigni, które umożliwia opuszczenie sondy do kuwety cieczowej, i powtórz kalibrację ogniwa cieczowego w nowej konfiguracji, wybierając "Liquid Cell" (Płynna komórka) dla typu wgłębnika. Kliknij "Kontynuuj", aby uzyskać współczynnik kalibracji ogniw cieczowych.
   6. Aktywuj opcję oprogramowania Liquid Cell, przechodząc do menu Eksperyment i wybierając "Opcje specjalne". Użyj najnowszej wartości kalibracji.
   7. Zwiększ odstępy między płytkami kondensatorów, ponieważ doprowadzi to do większej maksymalnej mierzalnej głębokości, co jest konieczne podczas testowania materiałów o wysokiej zgodności.
      1. W menu System wybierz "Ustawienia niechronione" i "Parametry maszyny", aby zmienić szybkość obciążenia testu wahadła, szybkość obciążenia zerowego i przesunięcie rampy czuwania odpowiednio na 0.5 mN/s, 0.1 mN/s i 3 V.
      2. Za pomocą klucza przekręć trzy nakrętki sterujące rozstawem płytek kondensatora zgodnie z ruchem wskazówek zegara w małych krokach.
      3. Po każdym pełnym skręcie w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara wybierz "Regulacja skrzynki mostkowej" w menu Konserwacja i uzyskaj dobry test wahadła, który będzie wymagał odsunięcia ciężarka przeciwwagi od wahadła.
      4. Powtarzaj kroki 4.1.7.2-4.1.7.3, aż przybliżona kalibracja głębokości wskaże wartość 70 000 nm/V lub wyższą.
   8. Umieść nowy ogranicznik w dolnej części wahadła, który można włączać i wyłączać za pomocą zasilacza. Cofnij pierwotny ogranicznik znajdujący się za wahadłem, aby usunąć potencjalną przeszkodę w ruchu wahadła i umożliwić wyższe prędkości uderzenia, a także większe głębokości penetracji w zgodnych próbkach.
   9. Pozwól szafie osiągnąć równowagę termiczną (zajmuje to około 1 godziny).
   10. Gdy szafa się zrównoważy, wróć do menu System i wybierz "Ustawienia niechronione" i "Parametry maszyny". Ustaw prędkość kontaktu kalibracji głębokości (dcal) na 1 μm/s, prędkość kontaktu z wgłębieniem pierwotnym na 3 μm/s, a prędkość styku przy bardzo niskim obciążeniu na 1 μm/s.
   11. W menu Calibration (Kalibracja) wykonaj standardową kalibrację głębokości w tej nowej konfiguracji.
   12. Włącz zasilanie elektrozaworu i ustaw go na 10 V. Przejdź do menu Eksperyment i wybierz "Uderzenie" i "Dostosuj przemieszczenie impulsu". Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania (automatyczne monity), aby skalibrować odległość wychylenia wahadła.
2. Zamontuj tkankę mózgową myszy w płynnej komórce.
   1. Po pobraniu całego mózgu z kroku 1.5 należy go natychmiast przechowywać w pożywce niezależnej od CO₂ dla pożywki dla dorosłych pożywek tkankowych na lodzie.
   2. Gdy konfiguracja wgłębień udarowych jest w pełni zakończona, ostrożnie przenieś mózg na szalkę Petriego wraz z pożywką niezależną od CO₂. Pokrój mózg na sekcje o grubości 6 mm z płaskimi powierzchniami po obu stronach.
   3. Przyklej pokrojoną tkankę do aluminiowego słupka próbki za pomocą cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego.
   4. Nasuń ciekłą kutankę na drugi O-ring na słupku próbki i napełnij płynną kuwetę 5 ml pożywki niezależnej od CO₂, aby całkowicie zanurzyć tkankę. Ten przykładowy słupek jest następnie ostrożnie montowany na stoliku translacyjnym wewnątrz oprzyrządowanego nanoindentera.
3. Zmierz reakcję tkanki mózgowej na uderzenie.
   1. W razie potrzeby wyjmij sondę sferyczną i zastąp ją sondą będącą przedmiotem zainteresowania bez zdejmowania ramienia dźwigni.
   2. W menu System wybierz "Non Protected Settings" (Ustawienia niechronione) i "Machine Parameters (Parametry maszyny)". Zmień prędkość kontaktu udarowego na 5 μm/s.
   3. Gdy kąpiel próbki jest nisko (kierunek -z) i daleko od wahadła (kierunek +x), poruszaj się w kierunku -x, aż końcówka ramienia dźwigni znajdzie się prawidłowo nad wanną. Poruszać w kierunku +z, aż końcówka zostanie całkowicie zanurzona w kąpieli i przed próbką.
   4. Korzystając z okienka kontrolnego stolika na próbkę, ostrożnie nacisnąć kontakt, a następnie cofnąć stolik od powierzchni próbki o około 30 μm.
   5. W menu Eksperyment kliknij "Wpływ", aby skonfigurować eksperyment dotyczący wpływu. Wybierz konkretne obciążenie impulsowe, które będzie bezpośrednio odnosiło się do wynikowej prędkości uderzenia w oparciu o kalibrację odległości wymachu. Uruchom zaplanowany eksperyment.
   6. Gdy wahadło odchyli się do tyłu, a powierzchnia próbki będzie nadal przesuwać się do płaszczyzny pomiarowej, wyłącz wyłącznik dolnego ogranicznika.
   7. Obserwuj, jak wahadło wychyla się do przodu, aby uderzyć w próbkę. Przemieszczenie sondy w funkcji czasu zostanie zarejestrowane przez oprogramowanie.
   8. Gdy pojawi się okno sceny xyz, ponownie włącz przełącznik ogranicznika.
   9. Powtórz kroki 3.4-3.8, aby przetestować tyle różnych obciążeń i lokalizacji, ile potrzeba.
4. Przeanalizuj uzyskane przemieszczenie w funkcji czasu reakcji wahadła za pomocą niestandardowych skryptów MATLAB, aby określić maksymalną głębokość penetracji x_max, zdolność rozpraszania energii K i współczynnik jakości rozpraszania Q. ¹¹
   1. Przejdź do menu Analiza i wyeksportuj dane w pliku tekstowym.
   2. Weź pochodną czasową profilu przemieszczenia, aby uzyskać prędkość w funkcji czasu. Ustaw zerowe przemieszczenie jako punkt kontaktowy x_o1,
      UWAGA: Prędkość uderzenia v_in to maksymalna prędkość bezpośrednio przed kontaktem. x_max odpowiada odkształceniu, przy którym prędkość sondy najpierw spada do zera. x_O2, co jest równoważne x_r, jest pozycją wymaganą do ponownego zainicjowania kontaktu z odkształconą próbką w następnym cyklu. Prędkość odbicia v_{na zewnątrz} to prędkość przy przemieszczeniu x_r.
   3. Zdefiniuj K (bez jednostek) jako energię rozproszoną przez próbkę znormalizowaną przez sumę energii odzyskanej i rozproszonej próbki podczas pierwszego cyklu uderzenia. Oblicz K na podstawie wewnętrznych właściwości wahadła ²¹ (takich jak sztywność obrotowa i współczynnik tłumienia), x_o1, x_max, x_r, v_in i v_out.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji, można zapoznać się z pracą Kalcioglu et al., 2011.
   4. Ponieważ przemieszczenie można opisać jako tłumiony harmoniczny ruch oscylacyjny, dopasuj funkcję zaniku wykładniczego do maksimów krzywej przemieszczenia w funkcji czasu.
   5. Oblicz Q (bez jednostek) pomnożone przez π liczbę cykli wymaganych do zmniejszenia amplitudy oscylacji o współczynnik e. Wyższa wartość Q oznacza niższy współczynnik rozpraszania energii.

5. Reologia

1. Ustaw i skalibruj reometr zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Zainicjuj reometr, otwierając urządzenie/panel sterowania. Na karcie panelu sterowania kliknij "zainicjuj".
   2. Zamontuj płytkę pomiarową o średnicy 25 mm (PP25) i układ termiczny.
   3. (Opcjonalnie) Aby zmniejszyć poślizg między płytkami reometru a tkanką, wytnij samoprzylepne plastry papieru ściernego, które pasują do kształtu górnej płytki reometru i przyklej papier ścierny do górnej i dolnej płyty.
   4. Nawiąż kontakt między górną a dolną płytą, klikając "ustaw zerową szczelinę" na panelu sterowania.
   5. Wyzeruj przetwornik siły normalnej, klikając "resetuj siłę normalną".
   6. Przeprowadź test bezwładności, otwierając zakładkę serwis na panelu sterowania, klikając "system pomiarowy", a następnie klikając "test bezwładności". Zapisz starą i nową bezwładność. Sprawdź, czy bezwładność mieści się w dopuszczalnym limicie dla sondy, podanym przez producenta.
2. Załaduj próbkę do reometru.
   1. Po pobraniu tkanki i pokrojeniu segmentu koronalnego mózgu świni do grubości ~5 mm, przechowuj go na lodzie w podłożu niezależnym od CO₂.
   2. Umieść mózg między dwiema płytkami. Usuń duże kropelki wody z górnej i dolnej powierzchni próbki, aby zapobiec poślizgowi, ale nie wysuszaj próbki.
   3. Powoli opuszczaj płytkę pomiarową, aż płytka znajdzie się w pełnym kontakcie z górną powierzchnią tkanki, a zmierzona normalna siła będzie stała na poziomie 0,01 mN po 5-10 minutowym okresie relaksacji.
      1. W panelu sterowania należy w polu pozycji pomiaru wprowadzać kolejno niższe wysokości i kliknąć "pozycja pomiaru", aby powoli opuścić płytkę pomiarową.
      2. W odległości milimetra od kontaktu z tkanką należy obniżyć płytkę pomiarową w odstępach co 0,1 mm, aż płytka całkowicie zetknie się z górną powierzchnią tkanki. Upewnij się, że zmierzona siła normalna wynosi stale 0,01 mN po 5-10 minutowym okresie relaksacji.
      3. Zapisz początkową zmierzoną siłę normalną. Powtarzane pomiary powinny być wykonywane przy tych samych naprężeniach ściskających/odkształceniach.
   4. Przyciąć próbkę plastikowym ostrzem, jeśli próbka przekracza średnicę płytki. Odpipetować niewielką objętość (~1-2 ml) pożywki na krawędziach próbki, aby uwodnić tkankę.
   5. (Opcjonalnie) Opuść pokrywę termiczną. Na panelu sterowania ustaw temperaturę na 37 °C i kliknij "ustaw".
3. Wykonaj przemiatanie amplitudy, aby ustalić liniowy zakres lepkosprężystości materiału (tj. odkształcenia ścinające, przy których G' i G'' są stałe) przy interesujących nas częstotliwościach (np. 1 rad/s).
   1. Wybierz "plik/nowy". W zakładce żelu wybierz "Przemiatanie amplitudy: zakres LVE". Wybierz okno i kliknij "Pomiar 1: Przemiatanie amplitudy". Kliknij dwukrotnie pole oscylacji. Wprowadź odkształcenie początkowe i końcowe (np. 0,01 do 105), częstotliwość (np. 1 rad/s) i liczbę punktów na dekadę (np. 6 punktów/dec). Wybierz "ok" i kliknij start."
   2. Powtórz tę procedurę dla kilku warstw z powtarzającymi się próbami, aby zapewnić spójność liniowego zakresu sprężystości. Ściskanie osiowe próbki powinno pozostać stałe między próbkami.
4. Przeprowadź przemiatanie częstotliwości tkanki przy odkształceniu w liniowym zakresie lepkosprężystym tkanki (np. 1% odkształcenia) ²² i w interesującym zakresie częstotliwości (np. 0,1-100 rad/s).
   1. Kliknij "plik/nowy" i w zakładce żelu wybierz "Przemiatanie częstotliwości". Kliknij okno/Pomiar 1: Przemiatanie częstotliwości. Kliknij dwukrotnie pole oscylacji. Wprowadź zakres częstotliwości (np. od 0,1 do 100 rad/s), szczep (np. 1% szczepu) i liczbę punktów na dekadę (np. 6 punktów/dec). Wybierz "ok" i kliknij "start", aby rozpocząć przemiatanie częstotliwości.
5. Powtórz przemiatanie częstotliwości (krok 5.4) w dwóch lub trzech powtórzeniach.
6. Przejrzyj dane, które są automatycznie obliczane i eksportowane przez reometr: G' i G" w funkcji częstotliwości (przemiatanie częstotliwości) lub odkształcenia ścinającego (przemiatanie amplitudy). UWAGA: G' i G'' są obliczane na podstawie (maksymalnej) amplitudy reakcyjnego momentu obrotowego próbki T'₀ i kąta przemieszczenia obrotowego (lub kąta odchylenia) , oraz opóźnienia fazowego , odpowiedzi próbki na przyłożone odkształcenie oscylacyjne (Rysunek 3):
   
   
   gdzie R i h są promieniem i wysokością próbki.

Wyniki

Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne wcięcia i reakcje siły w stosunku do czasu (Rysunek 4B,E) dla eksperymentów z podatnością pełzania i relaksacją siły, biorąc pod uwagę odpowiednio przyłożoną siłę lub głębokość wcięcia (Rysunek 4A,D). Korzystając z tych danych i geometrii systemu, można obliczyć podatność na pełzanie J_c(t) i moduły relaksacji siły G_R(t) dla różnych obszarów mózgu (rysunek 4...

Dyskusja

Każda technika przedstawiona w tym artykule mierzy różne aspekty właściwości mechanicznych tkanki mózgowej. Podatność na pełzanie i moduły relaksacji naprężeń są miarą właściwości mechanicznych zależnych od czasu. Moduły magazynowania i strat reprezentują właściwości mechaniczne zależne od szybkości. Wgłębienie udarowe również mierzy właściwości mechaniczne zależne od szybkości, ale w kontekście rozpraszania energii. Przy charakteryzowaniu właściwości mechanicznych tkanek powszechnie stosowanymi metodami są zarówno wgłęb...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Xylazine	Lloyd Laboratoried		lek na receptę
Ketamina	AnaSed Zastrzyki		lek na receptę
Vibratome (mikrotom z wibracyjnym ostrzem)	Leica	VT1200
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	2-independent neurow do tkanek dorosłych
Mikroskop sił atomowych, MFP-3D-BIO	Azyl	Research-Podgrzewacz
do naczyń Petriego	Asylum	Research-AFM
Sonda, 0.03 N/m, 10  &mikro; m promień kula borokrzemianowa	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	bioadhezyjny bioadhezyjny pochodzący z małży
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761	alternatywni dostawcy mogą być użyci
Wodorotlenek sodu, 1 N	Sigma-Aldrich	59223C	alternatywni dostawcy mogą być użyci
Oprzyrządowany wgłębnik, NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	końcówka sondy musi być obrabiana (stalowy płaski stempel, 1  mm średnicy, 4-5  mm długości)
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
Reometr płytkowy równoległy MCR501	Anton-Parr-PP25
	Płaska płytka pomiarowa	Anton-Parr-25
Samoprzylepny papier ścierny	McMaster-Carr	4184A48	można stosować alternatywnych dostawców
Można stosować klej błyskawiczny Loctite 4013	Henkel	20268	alternatywnych dostawców