Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka wieloskalowych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii sił atomowych, wgłębień udarowych i reometrii

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54201

⸱

6 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy zestaw technik do scharakteryzowania lepkosprężystych właściwości mechanicznych mózgu w mikro-, mezo- i makro-skali.

Streszczenie

Aby projektować i konstruować materiały inspirowane właściwościami mózgu, czy to do symulacji mechanicznych, czy do badań nad regeneracją tkanek, sama tkanka mózgowa musi być dobrze scharakteryzowana w różnych skalach długości i czasu. Podobnie jak wiele tkanek biologicznych, tkanka mózgowa wykazuje złożoną, hierarchiczną strukturę. Jednak w przeciwieństwie do większości innych tkanek, mózg ma bardzo niską sztywność mechaniczną, a moduły sprężystości Younga E są rzędu 100 s Pa. Ta niska sztywność może stanowić wyzwanie dla eksperymentalnej charakterystyki kluczowych właściwości mechanicznych. W tym miejscu demonstrujemy kilka technik charakterystyki mechanicznej, które zostały przystosowane do pomiaru właściwości elastycznych i lepkosprężystych uwodnionych, podatnych materiałów biologicznych, takich jak tkanka mózgowa, w różnych skalach długości i szybkościach obciążenia. W mikroskali przeprowadzamy eksperymenty z podatnością na pełzanie i relaksacją siły przy użyciu wgłębień z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych. W mezoskali przeprowadzamy eksperymenty z wgłębieniami udarowymi za pomocą wahadłowego wgłębnika instrumentalnego. W makroskali przeprowadzamy równoległą reometrię płytkową w celu ilościowego określenia modułów sprężystości ścinania zależnych od częstotliwości. Omawiamy również wyzwania i ograniczenia związane z każdą metodą. Razem techniki te umożliwiają dogłębną mechaniczną charakterystykę tkanki mózgowej, która może być wykorzystana do lepszego zrozumienia struktury mózgu i inżynierii materiałów inspirowanych biologią.

Wprowadzenie

Większość tkanek miękkich składających się z organów biologicznych jest mechanicznie i strukturalnie złożona, o niskiej sztywności w porównaniu do zmineralizowanej kości lub materiałów inżynieryjnych, i wykazuje nieliniową i zależną od czasu deformację. W porównaniu z innymi tkankami w ciele, tkanka mózgowa jest niezwykle zgodna, z modułami sprężystości E rzędu 100 s Pa 1. Tkanka mózgowa wykazuje niejednorodność strukturalną z wyraźnymi i międzypalcowymi obszarami istoty szarej i białej, które różnią się również funkcjonalnie. Zrozumienie mechaniki tkanki mózgowej pomoże w projektowaniu materiałów i modeli obliczeniowych naśladujących reakcję mózgu podczas urazu, ułatwi przewidywanie uszkodzeń mechanicznych i umożliwi opracowanie strategii ochronnych. Ponadto takie informacje można wykorzystać do rozważenia celów projektowych w zakresie regeneracji tkanek oraz do lepszego zrozumienia zmian strukturalnych w tkance mózgowej, które są związane z chorobami takimi jak stwardnienie rozsiane i autyzm. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kilka podejść eksperymentalnych, które są dostępne w celu scharakteryzowania właściwości lepkosprężystych tkanek podatnych mechanicznie, w tym tkanki mózgowej, w mikro-, mezo- i makroskali.

W mikroskali przeprowadziliśmy eksperymenty z podatnością na pełzanie i relaksacją siły, używając wgłębień z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych (AFM). Zazwyczaj wgłębienie z włączoną funkcją AFM jest używane do oszacowania modułu sprężystości (lub sztywności chwilowej) próbki 2-4. Jednak ten sam przyrząd może być również używany do pomiaru właściwości lepkosprężystych w mikroskali (zależnych od czasu lub szybkości) 5-10. Zasada tych eksperymentów, pokazana na rysunku 1, polega na wcięciu sondy wspornikowej AFM w tkance mózgowej, utrzymaniu określonej wielkości siły lub głębokości wgłębienia i zmierzeniu odpowiednich zmian odpowiednio głębokości wgłębienia i siły w czasie. Korzystając z tych danych, możemy obliczyć odpowiednio podatność na pełzanie J C i moduł relaksacji GR.

W mezoskali przeprowadziliśmy eksperymenty z wgłębieniami w płynie, które utrzymują strukturę tkanki i poziom nawodnienia, używając opartego na wahadle instrumentalnego nanoindentera. Układ eksperymentalny przedstawiono na rysunku 2. Gdy wahadło wychyla się w kontakcie z tkanką, przemieszczenie sondy jest rejestrowane w funkcji czasu, aż wahadło oscylacyjne zatrzyma się w tkance. Na podstawie wynikowego tłumionego harmonicznego ruchu oscylacyjnego sondy możemy obliczyć maksymalną głębokość penetracji xmax, zdolność rozpraszania energii K i współczynnik jakości rozpraszania Q (który odnosi się do szybkości rozpraszania energii) tkanki 11,12.

W makroskali użyliśmy reometru z równoległą płytką do ilościowego określenia modułów sprężystości ścinania zależnych od częstotliwości, określanych jako moduł magazynowania G' i moduł strat G" tkanki. W tym typie reometrii stosujemy harmoniczne odkształcenie kątowe (i odpowiadające mu odkształcenie ścinające) o znanych amplitudach i częstotliwościach oraz mierzymy moment reakcyjny (i odpowiadające mu naprężenie ścinające), jak pokazano na rysunku 3. Na podstawie wynikowej amplitudy i opóźnienia fazowego mierzonego momentu obrotowego oraz zmiennych geometrycznych układu możemy obliczyć G' i G" przy przystosowanych częstotliwościach będących przedmiotem zainteresowania 13,14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami w Boston Children's Hospital i są zgodne z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowania.

1. Procedury pozyskiwania tkanki mózgowej myszy (do wgniatania z wykorzystaniem AFM oraz wgniatania udarowego)

  1. Przygotuj mieszaninę ketaminy i ksylazyny w celu znieczulenia myszy. Połącz 5 ml ketaminy (500 mg/ml), 1 ml ksylazyny (20 mg/ml) oraz 7 ml roztworu soli fizjologicznej 0,9%.
  2. Wstrzyknij myszy (Rasa: TSC1; Syn-Cre; plp-eGFP; Wiek: p21; Płeć: Męska lub żeńska) 7 µl roztworu ketaminy i ksylazyny na każdy gram masy ciała.
  3. Gdy mysz będzie całkowicie znieczulona, co potwierdzi brak reakcji na ucisk palców stóp i ogona, uśmierć ją przez obcięcie głowy dużymi nożycami anatomicznymi.
  4. Usuń czaszkę, przecinając ją wzdłuż środka mniejszymi nożycami anatomicznymi. Począwszy od móżdżku, usuwaj fragmenty czaszki za pomocą zakrzywionych szczypczyków. Po usunięciu czaszki wydobyj mózg, podnosząc go płaską łopatką, zaczynając od móżdżku, i umieść mózg w szalce Petriego. Usuń móżdżek z mózgu za pomocą ostrza brzytwy.
  5. Jeśli do testów wgniecenia z użyciem całych mózgów stosuje się świeżą tkankę, przenieś mózg do rurki o zaokrąglonym dnie zawierającej pożywkę niezależną od CO2 dla dorosłej tkanki nerwowej, umieszczonej na lodzie, a następnie przejdź do sekcji 4. W przeciwnym razie przejdź do kroku 1.6 w celu przeprowadzenia sekcji.
  6. Ustaw parametry wibratomu na prędkość 0,7 mm/s, częstotliwość wibracji 70 Hz oraz grubość przekroju 350 µm. Umieść wokół zbiornika wibratomu lód. Nałóż kroplę kleju szybkoschnącego na płytkę wibratomu i zamocuj mózg tak, aby można było wykonywać przekroje koronalne, ustawiając mózg tak, by najpierw przecinać stronę grzbietową.
  7. Wypełnij zbiornik wibratomu roztworem soli fosforanowej Dulbecco (DPBS) w ilości wystarczającej do całkowitego zanurzenia mózgu. Podnieś zbiornik na wibratomie, tak aby ostrze było ledwo zanurzone w DPBS.
  8. Naciśnij przycisk uruchomienia, aby rozpocząć cięcie koronalnych przekrojów mózgu o grubości 350 µm.
  9. Korzystając z pędzli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki, przenieś przekroje mózgu z kąpieli DPBS w wibratomie do rurki o zaokrąglonym dnie zawierającej pożywkę niezależną od CO2 dla dorosłej tkanki nerwowej, umieszczonej na lodzie, i przeprowadź pomiary na świeżej tkance w ciągu 48 godzin. Aby rozpocząć eksperymenty z wgnieceniem z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych (AFM), przejdź do sekcji 3.

2. Procedury pozyskiwania tkanki mózgu świni (do reometrii)

  1. Uzyskaj strzałkowo przepołowy goleną półmóżdżek świński w ciągu około 1 godziny po zabiciu od lokalnego rzeźnika. Umieść półmóżdżek w pożywce niezależnej od CO2 przeznaczonej dla dorosłych tkanek nerwowych i przechowuj na lodzie.
  2. Użyj brzytwy lub skalpela, aby wykonać około 5 mm grubą przekrojową warstwę mózgu i przechowuj ją w pożywce niezależnej od CO2 przeznaczonej dla dorosłych tkanek nerwowych. Upewnij się, że powierzchnia przekroju jest jak najbardziej płaska. Podczas cięcia stosuj ostrożne ruchy boczne brzytwą/skalpelem.
  3. Przechowuj tkankę mózgową świni w pożywce niezależnej od CO2 przeznaczonej dla dorosłych tkanek nerwowych na lodzie i wykonaj pomiary reometrii (sekcja 5) na świeżej tkance w ciągu 48 godzin.

3. Wgniatanie z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych

  1. Przygotuj szalki Petriego o średnicy 60 mm (P60) z bioadhezyjnym środkiem pochodzącym z małży zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Przygotuj zapas roztworu buforowego obojętnego składającego się z 0,1 M wodorowęglanu sodu w wodzie sterylnej o optymalnym pH 8,0. Przefiltruj i zesterilizuj (0,2 mikrona) bufor wodorowęglanu sodu i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    2. W szafce laminarnej wymieszaj roztwór zawierający 6,25% bioadhezyjnego środka pochodzącego z małży i 3,125% NaOH w buforze wodorowęglanu sodu.
    3. Pipetą nanieś 100 μl roztworu bioadhezyjnego z punktu 3.1.2 na szalkę Petriego o średnicy 60 mm (P60) i za pomocą końcówki pipety rozprowadź roztwór w okrąg o średnicy 3–5 cm.
    4. Pozostaw szalki P60 odkryte w szafce laminarnej i pozwól roztworowi wyschnąć (~30 min). Odpłucz szalki jednokrotnie PBS, a następnie dwukrotnie wodą sterylną. Pozwól szalkom wyschnąć na powietrzu w szafce laminarnej i przechowuj w zamkniętym plastikowym worku w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
  2. Skalibruj AFM i przygotuj próbkę mózgu w mikroskopie AFM.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami kalibracji AFM podanymi przez producenta.
    1. Delikatnie załaduj sondę AFM o nominalnej stałej sprężystości 0,03 N/m i kulce borokrzemianowej o średnicy 20 μm do uchwytu sondy.
    2. Skalibruj stałą sprężystości i odwrotną czułość dźwigni optycznej (InvOLS) belki AFM metodą termicznego strojenia 15,16.
      UWAGA: Po obliczeniu stałej sprężystości sondy AFM powinna ona pozostawać stała przy powtarzalnym użyciu. Jednak odwrotna czułość dźwigni (InvOLS) musi być skalibrowana ponownie za każdym razem, gdy laser zostanie ponownie ustawiony na belce. Dodatkowo kalibrację należy przeprowadzać na podłożu o sztywności o kilka rzędów wielkości większej niż belka, np. polistyrenie.
    3. Włącz nagrzewane ramię stołu i ustaw temperaturę na 37 °C.
    4. Zamocuj przekrój mózgu na szalce P60 przygotowanej w sekcji 3.1.
      1. Delikatnie wlej 350 μm grubą warstwę tkanki mózgu oraz ośrodek niezależny od CO2 z kolby o dnie okrągłym do szalki P60 pokrytej bioadhezyjnym środkiem pochodzącym z małży.
      2. Delikatnie przechylając szalkę P60, ustaw przekrój mózgu w środku szalki. W razie potrzeby powoli pipetuj ośrodek ręczną pipetą, aby rozprostować przekrój mózgu, który się złożył, lub lepiej ustawić go w środku szalki.
      3. Delikatnie usuń nadmiar ośrodka za pomocą pipety P1000 (nie używaj próżni).
      4. Zamknij szalkę P60 pokrywką i pozostaw przekrój mózgu do przylegania przez 20 min.
    5. Usuń głowicę AFM, umieść szalkę P60 z przekrojem mózgu na stole AFM i dodaj ~2 ml wcześniej podgrzanego ośrodka niezależnego od CO2.
    6. Delikatnie dodaj kroplę ośrodka na sondę AFM, aby chronić ją przed pęknięciem spowodowanym napięciem powierzchniowym podczas opuszczania jej w ośrodek otaczający przekrój mózgu.
    7. Ponownie umieść głowicę AFM na stole i zacznij ją opuszczać, aż zostanie zanurzona w ośrodku.
    8. Korzystając z kamery CCD z widoku od góry, ponownie ustaw laser na belce.
      UWAGA: Ustawienie lasera na belce nieco się zmieniło z powodu różnicy współczynnika załamania powietrza i ośrodka.
    9. Poczekaj 5 min, aby belka dostosowała się do zanurzenia w ciepłej cieczy, a następnie ponownie ustaw ustawienie lustra na swobodne odchylenie 0 V.
    10. Wykonaj analizę widma termicznego sondy AFM zgodnie z instrukcjami producenta16. Użyj dopasowania pierwszego szczytu termicznego do ponownego obliczenia InvOLS sondy AFM w ośrodku.
    11. Korzystając z mikroskopu optycznego, przesuń stół próbki tak, aby interesujący region mózgu znalazł się pod sondą AFM.
      UWAGA: Ciało modzelowate będzie wyglądać na ciemne, ponieważ jest bardziej nieprzezroczyste niż otaczająca szara masa. Kora znajduje się powyżej ciała modzełowatego.
    12. Ponownie ustaw ustawienie lustra na swobodne odchylenie 0 V.
    13. W oknie Sum i Deflection Meter w oprogramowaniu AFM kliknij „Engage”, aby zaangażować głowicę AFM.
    14. Korzystając z pokrętła pozycji na głowicy AFM, opuść głowicę, aż dojdzie do kontaktu między belką a próbką.
  3. (Opcjonalnie) W razie potrzeby zmierz moduł sprężystości próbki, zgodnie z wcześniejszym opisem 4,17,18.
  4. Przeprowadź eksperymenty zgodności pełzania.
    1. Utwórz funkcję przyłożonej siły w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja siły składa się z rampy 0,1 s do wartości zadanej 5 nN, utrzymywanej przez 20 s, a następnie rampy 1 s do siły przyłożonej 0 nN.
      1. Na panelu głównym wcięć, w metodzie wcięcia, wybierz „Load” jako tryb wcięcia; „N” jako jednostki; oraz „Function editor” jako funkcję wcięcia.
      2. W edytorze funkcji, w panelu Segment Parms, utwórz segment funkcji siły, który zaczyna się od 0 nN, kończy na 5 nN, z czasem 0,1 s. Kliknij „Insert –>”.
      3. Dla następnego segmentu ustaw początek na 5 nN, koniec na 5 nN i czas na 20 s. Kliknij „Insert –>”.
      4. Dla ostatniego segmentu ustaw początek na 5 nN, koniec na 0 nN i czas na 1 s. Kliknij „Draw” i zamknij okno edytora funkcji.
    2. Na karcie Force w panelu głównym zaznacz „indenter ramp after trigger” i ustaw funkcję przyłożonej siły, aby uruchomiła się po osiągnięciu punktu wyzwalającego 0,1 V.
    3. Kliknij „Single Force” u dołu karty Force w panelu głównym, co spowoduje uruchomienie skonstruowanej funkcji siły dla zgodności pełzania.
    4. Po zakończeniu pojedynczego wcięcia siły podnieś głowicę AFM, aby nie była w kontakcie z próbką, a następnie ponownie zaangażuj głowicę i ponownie wyzeruj swobodne odchylenie.
    5. Przesuń stół próbki, aby znaleźć nowy obszar zainteresowania, i opuść głowicę AFM, aby nawiązać kontakt. UWAGA: Głowica AFM musi być cofnięta z powierzchni próbki podczas przesuwania stołu próbki. Nieprzestrzeganie tego może spowodować uszkodzenie delikatnej belki AFM.
    6. Powtarzaj kroki 3.4.3–3.4.5, aż zostanie zebrana pożądana ilość danych.
  5. Przeprowadź eksperymenty relaksacji siły.
    1. Utwórz funkcję przyłożonego wcięcia w edytorze funkcji oprogramowania. Funkcja wcięcia składa się z rampy 0,1 s do wartości zadanej 3 μm, utrzymywanej przez 20 s, a następnie rampy 1 s do głębokości wcięcia 0 µm.
      1. Na panelu głównym wcięć, w metodzie wcięcia, wybierz „Indentation” jako tryb wcięcia; „m” jako jednostki; oraz „Function editor” jako funkcję wcięcia.
      2. W edytorze funkcji, w panelu Segment Parms, utwórz segment funkcji siły, który zaczyna się od 0 µm, kończy na 3 µm, z czasem 0,1 s. Kliknij „Insert –>”.
      3. Dla następnego segmentu ustaw początek na 3 µm, koniec na 3 µm i czas na 20 s. Kliknij „Insert –>”.
      4. Dla ostatniego segmentu ustaw początek na 3 µm, koniec na 0 µm i czas na 1 s. Kliknij „Draw” i zamknij okno edytora funkcji.
    2. Na karcie Force w panelu głównym zaznacz „indenter ramp after trigger” i ustaw funkcję przyłożonej siły, aby uruchomiła się po osiągnięciu punktu wyzwalającego 0,1 V.
    3. Kliknij „Single Force” u dołu karty Force w panelu głównym, co spowoduje uruchomienie skonstruowanej funkcji wcięcia dla relaksacji siły.
    4. Po zakończeniu pojedynczego wcięcia siły podnieś głowicę AFM, aby nie była w kontakcie z próbką, a następnie ponownie zaangażuj głowicę i ponownie wyzeruj odchylenie.
    5. Przesuń stół, aby znaleźć nowy obszar zainteresowania, i opuść głowicę, aby nawiązać kontakt.
    6. Powtarzaj kroki 5.3–5.5, aż zostanie zebrana pożądana ilość danych.
  6. Zakończ eksperymenty i posprzątaj.
    1. Po zakończeniu eksperymentów podnieś głowicę AFM i usuń ją z próbki.
    2. Użyj ręcznika laboratoryjnego, aby ostrożnie usunąć nadmiar cieczy, nie dotykając belki.
    3. Delikatnie wyczyść uchwyt belki AFM niewielką ilością etanolu. Nie narażaj delikatnej elektroniki uchwytu belki na etanol. Usuń sondę AFM i umieść ją w pojemniku do przechowywania.
    4. Usuń próbkę tkanki mózgu zgodnie z odpowiednimi protokołami biosafety.
  7. Korzystając z MATLAB, oblicz moduły zgodności pełzania i relaksacji siły, używając geometrii wcięcia, zgodnie z rozwiązaniem opracowanym przez Lee i Radoka, 1960 19.
    1. Oblicz siłę F i głębokość wcięcia równanie statycznej równowagi, symbol δ, wzór edukacyjny, narzędzie do nauki fizyki z danych dotyczących pozycji belki z, odchylenia d i stałej sprężystości kc

      Równanie statycznej równowagi δ=d−z, wzór matematyczny do analizy równowagi i położenia. i Wzór na siłę sprężystości, \(F=k_cd\), równanie do analizy statycznej równowagi.. 
    2. Zlokalizuj punkt kontaktu wzdłuż krzywej wcięcia, korzystając z algorytmu opisanego przez Lina et al. 20.
    3. Wybierz okno analizy danych. Okno analizy to region, w którym siła (dla zgodności pełzania) lub głębokość wcięcia (dla relaksacji siły) jest utrzymywana na wartości zadanej (tj. Region 3 pokazany na ryc. 1C,D).
    4. Dla eksperymentów zgodności pełzania oblicz eksperymentalny moduł zgodności pełzania, Jc(t), jako odpowiedź na skokową obciążenie Funkcja skokowa Heaviside’a, F(t) = F₀H(t), wzór w analizie matematycznej.:
      Wzór dynamiki płynów Jc(t)=16√R/3Fo δ^(3/2)(t); równanie do analizy dynamicznej.,
      gdzie H(t) to funkcja skokowa Heaviside’a, a R to promień sondy kulistej.
    5. Dla eksperymentów relaksacji siły oblicz eksperymentalny moduł relaksacji siły, GR(t), jako odpowiedź na skokową głębokość wcięcia Równanie równowagi funkcji delta, δ(t)=δ₀(t); koncepcja wzoru.:
      Wzór statycznej równowagi G_R(t)=(3/16√Rδ₀^(5/2))F(t); diagram do analizy siły..

4. Wgniatanie udaremne

  1. Kalibrowanie instrumentowanego nanoindenta i dostosowanie ustawień domyślnych w celu umożliwienia dynamicznych eksperymentów z uderzeniem na nawilżonych tkankach mózgowych zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Umieść sondę kulistą, wsuwając ją na wahadło za pomocą pęsety.
    2. Przyklej próbkę kwarcu stopionego do trzpienia próbki, który jest przykręcany do stołu translacyjnego.
    3. Przejdź do menu Kalibracja i wybierz opcję „Ciekła komora”. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby nawiązać kontakt z próbką kwarcu stopionego.
    4. Wybierz „Normalny” jako typ indentera i użyj domyślnej wartości 0,05 mN dla obciążenia indentera. Kliknij „Kontynuuj”, aby wykonać kalibrację dla standardowej konfiguracji indentera.
    5. Przesuń stół próbki z powrotem o co najmniej 5 mm. Zamontuj ramię dźwigni, które pozwala opuścić sondę do komory ciekłej, i powtórz kalibrację komory ciekłej w nowej konfiguracji, wybierając „Ciekła komora” jako typ indentera. Kliknij „Kontynuuj”, aby uzyskać współczynnik kalibracji komory ciekłej.
    6. Aktywuj opcję oprogramowania komory ciekłej, przechodząc do menu Eksperyment i wybierając „Opcje specjalne”. Użyj najnowszej wartości kalibracji.
    7. Zwiększ odstęp między płytami kondensatora, ponieważ spowoduje to zwiększenie maksymalnej mierzalnej głębokości, co jest konieczne podczas testowania wysoce podatnych materiałów.
      1. W menu System wybierz „Ustawienia niechronione” i „Parametry maszyny”, aby zmienić szybkość obciążenia testowego wahadła, szybkość obciążenia zerowego oraz przesunięcie rampy w stanie gotowości odpowiednio na 0,5 mN/sek, 0,1 mN/sek i 3 V.
      2. Używając klucza, obróć trzy nakrętki regulujące odstęp między płytami kondensatora o niewielkie kąty w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
      3. Po każdym pełnym obrocie w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara wybierz opcję „Regulacja skrzynki mostkowej” w menu Konserwacja i wykonaj poprawny test wahadła, który będzie wymagał przesunięcia ciężarka równoważącego z dala od wahadła.
      4. Powtarzaj kroki 4.1.7.2–4.1.7.3, aż przybliżona kalibracja głębokości wskaże wartość 70 000 nm/V lub wyższą.
    8. Umieść nowy ogranicznik ruchu na dole wahadła, który może być włączany i wyłączany za pomocą zasilacza. Wycofaj oryginalny ogranicznik znajdujący się z tyłu wahadła, aby usunąć potencjalną przeszkodę w ruchu wahadła i umożliwić wyższe prędkości uderzenia oraz większe głębokości penetracji w próbkach podatnych.
    9. Pozwól szafce osiągnąć równowagę termiczną (trwa to około 1 godziny).
    10. Podczas gdy szafka osiąga równowagę, wróć do menu System i wybierz „Ustawienia niechronione” i „Parametry maszyny”. Ustaw prędkość kontaktu kalibracji głębokości (dcal) na 1 µm/sek, prędkość kontaktu podstawowego wgniatania na 3 µm/sek, a prędkość kontaktu przy bardzo niskim obciążeniu na 1 µm/sek.
    11. W menu Kalibracja wykonaj standardową kalibrację głębokości w tej nowej konfiguracji.
    12. Włącz zasilacz dla elektrozaworu i ustaw go na 10 V. Przejdź do menu Eksperyment i wybierz „Uderzenie” i „Dostosuj przemieszczenie impulsu”. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania (automatyczne monity), aby skalibrować odległość摆ania wahadła.
  2. Umocuj tkankę mózgu myszy w komorze ciekłej.
    1. Po pobraniu całego mózgu z kroku 1.5 natychmiast przechowuj go w pożywce niezależnej od CO2 dla dorosłych tkanek nerwowych, na lodzie.
    2. Gdy konfiguracja do wgniatania z uderzeniem jest całkowicie gotowa, ostrożnie przenieś mózg do szalki Petriego wraz z pożywką niezależną od CO2. Pokrój mózg na sekcje o grubości 6 mm z płaskimi powierzchniami z obu stron.
    3. Przyklej pokrojoną tkankę do aluminiowego trzpienia próbki cienką warstwą kleju cyjanoakrylowego.
    4. Przesuń komorę ciekłą przez drugie pierścień uszczelniający na trzpieniu próbki i napełnij ją 5 ml pożywki niezależnej od CO2, aby całkowicie zanurzyć tkankę. Następnie ostrożnie zamontuj ten trzpień próbki na stole translacyjnym wewnątrz instrumentowanego nanoindentera.
  3. Zmierz odpowiedź tkanki mózgowej na uderzenie.
    1. W razie potrzeby usuń sondę kulistą i zastąp ją sondą badawczą, nie usuwając ramienia dźwigni.
    2. W menu System wybierz „Ustawienia niechronione” i „Parametry maszyny”. Zmień prędkość kontaktu podstawowego uderzenia na 5 µm/sek.
    3. Gdy łaźnia próbki znajduje się nisko (kierunek -z) i daleko od wahadła (kierunek +x), przesuń się w kierunku -x, aż czubek na ramieniu dźwigni będzie odpowiednio ustawiony nad łaźnią. Przesuń się w kierunku +z, aż czubek będzie całkowicie zanurzony w łaźni i przed próbką.
    4. Korzystając z okna sterowania stołem próbki, ostrożnie nawiąż kontakt, a następnie odsuń stół od powierzchni próbki o około 30 µm.
    5. W menu Eksperyment kliknij „Uderzenie”, aby skonfigurować eksperyment z uderzeniem. Wybierz określone obciążenie impulsowe, które będzie bezpośrednio związane z wynikającą prędkością uderzenia na podstawie kalibracji odległości摆ania. Uruchom zaplanowany eksperyment.
    6. Gdy wahadło wraca do tyłu, a powierzchnia próbki nadal porusza się w kierunku płaszczyzny pomiarowej, wyłącz przełącznik dolnego ogranicznika.
    7. Obserwuj, jak wahadło摆ia się do przodu, aby uderzyć w próbkę. Przemieszczenie sondy jako funkcja czasu będzie rejestrowane przez oprogramowanie.
    8. Gdy pojawi się okno stołu xyz, ponownie włącz przełącznik ogranicznika.
    9. Powtarzaj kroki 3.4–3.8, aby przetestować tyle różnych obciążeń i lokalizacji, ile jest potrzebne.
  4. Przeanalizuj uzyskane dane przemieszczenia w funkcji czasu wahadła za pomocą niestandardowych skryptów MATLAB, aby określić maksymalną głębokość penetracji xmax, pojemność rozpraszania energii K oraz współczynnik jakości rozpraszania Q.11
    1. Przejdź do menu Analiza i wyeksportuj dane do pliku tekstowego.
    2. Oblicz pochodną czasową profilu przemieszczenia, aby uzyskać prędkość jako funkcję czasu. Ustaw zerowe przemieszczenie jako punkt kontaktu xo1.
      UWAGA: Prędkość uderzenia vin to maksymalna prędkość bezpośrednio przed kontaktem. xmax odpowiada odkształceniom, przy których prędkość sondy po raz pierwszy spada do zera. xo2, równoważne xr, to pozycja wymagana do ponownego nawiązania kontaktu z odkształconą próbką w kolejnym cyklu. Prędkość odbicia vout to prędkość przy przemieszczeniu xr.
    3. Zdefiniuj K (bez jednostki) jako energię rozproszoną przez próbkę znormalizowaną przez sumę odzyskanej i rozproszonej energii próbki podczas pierwszego cyklu uderzenia. Oblicz K na podstawie wewnętrznych właściwości wahadła 21 (takich jak sztywność obrotowa i współczynnik tłumienia), xo1, xmax, xr, vin oraz vout.
      UWAGA: Więcej informacji można znaleźć w pracy Kalcioglu et al., 2011.
    4. Ponieważ przemieszczenie można opisać jako tłumione drgania harmoniczne, dopasuj funkcję wykładniczego zaniku do maksimów krzywej przemieszczenia w funkcji czasu.
    5. Oblicz Q (bez jednostki) jako π pomnożone przez liczbę cykli potrzebnych, aby amplituda drgań zmniejszyła się o czynnik e. Wyższa wartość Q oznacza niższą szybkość rozpraszania energii.

5. Reologia

  1. Skonfiguruj i skalibruj reometr zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Włącz reometr, otwierając urządzenie/panel sterowania. Na karcie panelu sterowania kliknij przycisk „initialize”.
    2. Zamontuj płytkę pomiarową o średnicy 25 mm (PP25) oraz system termiczny.
    3. (Opcjonalnie) Aby zmniejszyć poślizg między płytami reometru a tkanką, wytnij kawałki samoprzylepnego papieru ściernego odpowiadającego kształtowi górnej płyty reometru i przyklej papier ścierny do górnej oraz dolnej płyty.
    4. Uzyskaj kontakt między górną a dolną płytką, klikając „ustaw zerową szczelinę” na panelu sterowania.
    5. Wyzeruj przetwornik siły normalnej, klikając „reset normal force”.
    6. Przeprowadź test bezwładności, otwierając kartę serwisową na panelu sterowania, klikając „system pomiarowy”, a następnie „test bezwładności”. Zanotuj starą i nową wartość bezwładności. Sprawdź, czy wartość bezwładności mieści się w dopuszczalnych granicach dla sondy, podanych przez producenta.
  2. Wprowadź próbkę do reometru.
    1. Po pobraniu tkanki i przekrojeniu mózgu świni w płaszczyźnie koronalnej na odcinek o grubości około 5 mm przechowuj go na lodzie w CO2niezależna ośrodek
    2. Umieść mózg pomiędzy dwiema płytami. Usuń duże krople wody z powierzchni górnej i dolnej próbki, aby zapobiec poślizgowi, ale nie wysuszaj próbki.
    3. Powoli opuść płytę pomiarową, aż osiągnie ona pełny kontakt z powierzchnią tkanki, a mierzona siła normalna ustali się na poziomie 0,01 mN po okresie relaksacji trwającym 5–10 minut.
      1. W panelu sterowania wprowadzaj kolejno niższe wartości wysokości w polu pozycji pomiarowej i klikaj „pozycja pomiarowa”, aby powoli opuszczać płytę pomiarową.
      2. Gdy płytka pomiarowa znajdzie się w odległości jednego milimetra od tkanki, opuszczaj ją o 0,1 mm, aż zostanie całkowicie zetknięta z powierzchnią górnej tkanki. Upewnij się, że zmierzona siła normalna utrzymuje się stabilnie na poziomie 0,01 mN po okresie relaksacji trwającym 5–10 minut.
      3. Zanotuj początkową zmierzoną siłę normalną. Powtarzane pomiary powinny być wykonywane przy tych samych naprężeniach/sciskaniach.
    4. Przytnij próbkę plastikowym nożem, jeśli jej średnica przekracza średnicę płytki. Pobierz małą objętość (około 1–2 ml) pożywki na krawędzie próbki, aby nawilżyć tkankę.
    5. (Opcjonalnie) Opuszczanie osłony termicznej. Na panelu sterowania ustaw temperaturę na 37 °C i kliknij „ustaw”.
  3. Wykonaj pomiar amplitudy w celu ustalenia liniowego zakresu lepkosprężystego materiału (czyli odkształcenia ścinające, w których G' i G'' są stałe) w interesujących częstotliwościach (np. 1 rad/s
    1. Wybierz „plik/nowy”. W zakładce żel wybierz „Zakres skanowania amplitudy: zakres LVE”. Wybierz okno i kliknij „Pomiar 1: Skanowanie amplitudy”. Kliknij dwukrotnie na pole oscylacji. Wprowadź początkową i końcową wartość odkształcenia (np. 0,01 do 105), częstotliwość (np. 1 rad/s) oraz liczba punktów na dekadę (np. 6 punktów/dec). Wybierz „ok” i kliknij przycisk uruchom.
    2. Powtórz tę procedurę dla kilku plasterków, przeprowadzając wielokrotne próby, aby zapewnić spójność zakresu sprężystości liniowej. Osiewa kompresja próbki powinna pozostać stała między poszczególnymi próbkami.
  4. Przeprowadź pomiar zależności częstotliwościowej tkanki przy odkształceniu w zakresie liniowym lepkosprężystym tkanki (np. 1% odkształcenie) 22, w zakresie częstotliwości będącym przedmiotem zainteresowania (np., 0,1–100 rad/s).
    1. Kliknij „plik/nowy” i w zakładce żel wybierz „Zakres częstotliwości”. Kliknij okno/Pomiar 1: Zakres częstotliwości. Kliknij dwukrotnie na pole oscylacji. Wprowadź zakres częstotliwości (np., 0,1 do 100 rad/s), odkształcenie (np., odkształcenie 1%) oraz liczba punktów na dekadę (np., 6 punktów/dzies.). Wybierz „ok” i kliknij „start”, aby rozpocząć skanowanie częstotliwości.
  5. Powtórz pomiar częstości (krok 5.4) w duplikatach lub tryplikatach.
  6. Przejrzyj dane automatycznie obliczane i eksportowane przez reometr: G' i G" w funkcji częstotliwości (pomiary częstotliwościowe) lub odkształcenia ścinającego (pomiary amplitudowe). UWAGA: G' i G'' są obliczane na podstawie amplitudy momentu skręcającego (maksymalnego) próbki T'0, kąt przemieszczenia obrotowego (lub kąt ugięcia) Symbol φ₀ oznacza początkowy kąt fazowy w równaniach falowych, stosowany w diagramach fizycznych i inżynierskich.i przesunięcie fazowe Symbol phi, równowaga statyczna; istotny w równaniach fizycznych; diagram do celów edukacyjnych., odpowiedzi próbki na przyłożone oscylacyjne odkształcenie (Rycina 3):
    Wzór na lepko-sprężystość, G'=2T0h/(πφ0R⁴)cosΦ, związany z analizą odkształcenia materiału.
    Równanie właściwości reologicznej G'' z parametrami T₀, h, φ₀, R; odnosi się do analizy lepkosprężystej.
    gdzie R i h to promień i wysokość próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 4 przedstawia reprezentatywne wyniki wciskania oraz zależności siły od czasu (ryc. 4B,E) dla eksperymentów dotycz&x0105;cych podatno&x015B;ci p&x0142;askiej i relaksacji si&x0142;y przy zadanej sile lub g&x0142;&x0119;boko&x015B;ci wciskania (ryc. 4A,D). Korzystaj&x0105;c z tych danych i geometrii uk&x0142;adu, mo&x017C;na obliczy&x0107; podatno&x015B;&x0107; p&x0142;ask&x0105; Jc(t) oraz modu&x0142;y relaksacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Każda technika przedstawiona w tym artykule mierzy różne aspekty właściwości mechanicznych tkanki mózgowej. Podatność na pełzanie i moduły relaksacji naprężeń są miarą właściwości mechanicznych zależnych od czasu. Moduły magazynowania i strat reprezentują właściwości mechaniczne zależne od szybkości. Wgłębienie udarowe również mierzy właściwości mechaniczne zależne od szybkości, ale w kontekście rozpraszania energii. Przy charakteryzowaniu właściwości mechanicznych tkanek powszechnie stosowanymi metodami są zarówno wgłęb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie tej pracy przez National Multiple Sclerosis Society i Simons Center for the Social Brain. BQ dziękuje za wsparcie ze strony programu stypendialnego dla absolwentów U.S. National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
XylazineLloyd Laboratoriedlek na receptę
KetaminaAnaSed Zastrzykilek na receptę
Vibratome (mikrotom z wibracyjnym ostrzem)LeicaVT1200
Hibernate-A MediumGibcoA12475012-independent neurow do tkanek dorosłych
Mikroskop sił atomowych, MFP-3D-BIOAzylResearch-Podgrzewacz
do naczyń PetriegoAsylumResearch-AFM
Sonda, 0.03 N/m, 10  &mikro; m promień kula borokrzemianowaNovascanPT.
Cell-TakCorning354240bioadhezyjny bioadhezyjny pochodzący z małży
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761alternatywni dostawcy mogą być użyci
Wodorotlenek sodu, 1 NSigma-Aldrich59223Calternatywni dostawcy mogą być użyci
Oprzyrządowany wgłębnik, NanoTest VantageMicro Materials Ltd.-końcówka sondy musi być obrabiana (stalowy płaski stempel, 1  mm średnicy, 4-5  mm długości)
NanoTest Liquid CellMicro Materials Ltd.-
Reometr płytkowy równoległy MCR501Anton-Parr-PP25
 Płaska płytka pomiarowaAnton-Parr-25
Samoprzylepny papier ściernyMcMaster-Carr4184A48można stosować alternatywnych dostawców
Można stosować klej błyskawiczny Loctite 4013Henkel20268alternatywnych dostawców
COGS mm

Bibliografia

  1. van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling. Mechanosensitivity of the Nervous System. , 249-281 (2009).
  2. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911(2011).
  3. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317(2014).
  4. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497(2013).
  5. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21, 445101(2010).
  6. Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical Journal. 88 (3), 2224-2233 (2005).
  7. Lu, H., Wang, B., Ma, J., Huang, G., Viswanathan, H. Measurement of creep compliance of solid polymers by nanoindentation. Mechanics Time-Dependent Materials. 7 (3/4), 189-207 (2003).
  8. Cheng, L., Xia, X., Scriven, L. E., Gerberich, W. W. Spherical-tip indentation of viscoelastic material. Mechanics of Materials. 37, 213-226 (2005).
  9. Kalcioglu, Z., Qu, M., Van Vliet, Multiscale characterization of relaxation times of tissue surrogate gels and soft tissues. 7th Army Science Conference Proceedings. , (2010).
  10. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation microscopy: Imaging local stress in cells. Journal of Biomechanics. 43 (2), 349-354 (2010).
  11. Kalcioglu, Z. I., Qu, M., et al. Dynamic impact indentation of hydrated biological tissues and tissue surrogate gels. Philosophical Magazine. 91 (7-9), 1339-1355 (2011).
  12. Kalcioglu, Z. I., Ra Mrozek, R. a, Mahmoodian, R., VanLandingham, M. R., Lenhart, J. L., Van Vliet, K. J. Tunable mechanical behavior of synthetic organogels as biofidelic tissue simulants. Journal of Biomechanics. 46 (9), 1583-1591 (2013).
  13. Janmey, P. A., Georges, P. C., Hvidt, S. Basic rheology for biologists. Methods in Cell Biology. 83, 3-27 (2007).
  14. Miller, K., Kurtcuoglu, V. Biomechanics of the Brain. , Springer Science & Business Media. (2011).
  15. Lévy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13 (1), 33-37 (2002).
  16. Fuierer, R. Basic Operation Procedures for the Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope. MFP-3D Procedureal Operation "Manualette". , Asylum Research. (2006).
  17. Elkin, B. S., Ilankovan, A., Morrison, B. Age-dependent regional mechanical properties of the rat hippocampus and cortex. Journal of Biomechanical Engineering. 132, 011010(2010).
  18. Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. Journal of Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
  19. Lee, E. H., Radok, J. R. M. The Contact Problem for Visooelastic Bodies. Journal of Applied Mechanics. 27 (3), 438-444 (1960).
  20. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  21. Constantinides, G., Kalcioglu, Z. I., McFarland, M., Smith, J. F., Van Vliet, K. J. Probing mechanical properties of fully hydrated gels and biological tissues. Journal of Biomechanics. 41 (15), 3285-3289 (2008).
  22. Shen, F., Tay, T. E., et al. Modified Bilston Nonlinear Viscoelastic Model for Finite Element Head Injury Studies. Journal of Biomechanical Engineering -- Transactions of the ASME. 128 (5), 797-801 (2006).
  23. van Dommelen, J. aW., vander Sande, T. P. J., Hrapko, M., Peters, G. W. M. Mechanical properties of brain tissue by indentation: Interregional variation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 3 (2), 158-166 (2010).
  24. Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open biology. 4 (5), 140046(2014).
  25. Du, P., Lu, H., Zhang, X. Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation. Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222 (c), (2009).
  26. Elkin, B. S., Morrison, B. Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507(2013).
  27. Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials. 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. , 313-320 (1999).
  28. Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear. Biorheology. 45 (6), 663-676 (2008).
  29. Pogoda, K., Chin, L., et al. Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells. New Journal of Physics. 16 (7), 075002(2014).
  30. Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue. Biorheology. 34 (2), 127-138 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka tkanki m zgowejw a ciwo ci wiskoelastycznecharakterystyka mechanicznapodatno pe zaniarelaksacja si ypomiar cz stotliwo ciowytkanka uwodniona
Charakterystyka wieloskalowych właściwości mechanicznych tkanki mózgowej za pomocą mikroskopii sił atomowych, wgłębień udarowych i reometrii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.