Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54202

⸱

22 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Streszczenie

Podczas operacji rekonstrukcyjnych kości, suprafizjologiczne ilości czynników wzrostu są empirycznie ładowane na rusztowania, aby ułatwić udaną fuzję kostną. Duże dawki bardzo silnych czynników biologicznych są wymagane ze względu na niestabilność czynnika wzrostu w wyniku szybkiej degradacji enzymatycznej, a także nieefektywność nośnika w lokalizacji wystarczającej ilości czynnika wzrostu w miejscach implantacji. W związku z tym strategie, które przedłużają stabilność czynników wzrostu, takich jak BMP-2/NELL-1, i kontrolują ich uwalnianie, mogą w rzeczywistości obniżyć ich skuteczną dawkę, a tym samym zmniejszyć zapotrzebowanie na większe dawki podczas przyszłych operacji regeneracji kości. To z kolei zmniejszy skutki uboczne i koszty czynnika wzrostu. Samoorganizujące się PEC zostały wyprodukowane, aby zapewnić lepszą kontrolę dostarczania BMP-2/NELL-1 poprzez wiązanie heparyny i dodatkowo wzmocnić bioaktywność czynnika wzrostu poprzez zwiększenie stabilności in vivo. Poniżej ilustrujemy prostotę wytwarzania PEC, która pomaga w dostarczaniu różnych czynników wzrostu podczas operacji rekonstrukcyjnych kości.

Wprowadzenie

Częstość występowania rzekomej choroby zwyrodnieniowej stawów wynosi od 10 do 45% w zwyrodnieniowych zrostach kręgosłupa i rewizyjnych operacjach kręgosłupa1. Aby zmniejszyć częstość występowania choroby zwyrodnieniowej kości łamiennej kości podczas zespolenia kręgosłupa i innych operacji rekonstrukcyjnych kości, wprowadzono osteogenne czynniki wzrostu, takie jak BMP-2,Nell-1 1 i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), w celu promowania osteogenezy de novo. Wśród nich BMP-2 jest popularnym wyborem do zespolenia kręgosłupa2. Chociaż siła działania BMP-2 w indukowaniu i ułatwianiu tworzenia nowych kości została dobrze ugruntowana3; Klinicznie istotne powikłania, takie jak heterotopowe tworzenie kości, tworzenie się surowicy i krwiaka, reakcja zapalna, zapalenie korzonków nerwowych, osteoliza trzonów kręgów i wytrysk wsteczny nadal stanowią problem ze względu na stosowane suprafizjologiczne ilości4,5.

Dlatego obniżenie dawki BMP-2 pozostaje istotną strategią w próbach zminimalizowania skutków ubocznych. Poza tym potrzebne są wydajne systemy nośników, aby stłumić początkowe uwalnianie BMP-2 obserwowane we współczesnych systemach nośników gąbek kolagenowych i jeszcze bardziej zwiększyć przedłużone i miejscowe dostarczanie tej silnej cytokiny. Samoorganizacja naprzemiennych kationowych i anionowych polielektrolitów warstwa po warstwie może być stosowana jako przestrajalna metoda do budowania kompleksów polielektrolitowych na powierzchni matryc rusztowań lub materiałów do implantacji6. Pod tym względem uznano, że heparyna (znana z najwyższej gęstości ładunku ujemnego ze wszystkich czynników biologicznych) chętnie wiąże się z różnymi czynnikami wzrostu za pośrednictwem domen wiążących elektrostatyki i heparynę. Rzeczywiście, wykazano, że heparyna przedłuża okres półtrwania, a tym samym nasila bioaktywność kilku czynników wzrostu.

Na tej podstawie, nasza grupa dostosowała protokół samoorganizacji warstwa po warstwie, aby wytworzyć kompleks polielektrolitowy na bazie heparyny (PEC), który ładuje i zachowuje bioaktywność osteogennych czynników wzrostu podczas unieruchomienia7,8. Rdzeń mikrokulek alginianowych wytworzono przez sieciowanie reszt α-L-guluronianu (G) alginianu z dwuwartościowymi jonami kationu wapnia lub strontu. Rdzeń alginianowy jest biodegradowalną matrycą rusztowania; który po implantacji ulega resorpcji w łożu fuzyjnym, zapewniając miejsce na wrastanie kości. Poli-L-lizyna (PLL) lub protamina jest używana jako warstwa kationowa do przeplatania się zarówno z matrycą rusztowania (w tym przypadku rdzeniem nośnym mikrokulek alginianowych), jak i ujemnie naładowaną heparyną; podczas gdy warstwa heparyny anionowej działa stabilizująco i lokalizując obciążone czynniki wzrostu. Wykazano, że trójwarstwowy PEC zwiększa nośność czynnika wzrostu w modeluświni 9. Ostatnio wykazano, że nosiciele PEC skutecznie zmniejszają skuteczną dawkę BMP-2 co najmniej 20-krotnie w modelach zrostu rdzeniowego u szczurów10 i świń8.

Tutaj przedstawiamy metody wytwarzania PEC w celu zwiększenia dostarczania czynnika wzrostu w zespoleniu kręgosłupa i innych operacjach rekonstrukcyjnych kości przy użyciu BMP-2 jako modelowego osteogennego czynnika wzrostu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu alginianu

  1. Rozpuścić 20 mg alginianu sodu (nienaświetlanego) lub 40 mg alginianu sodu naświetlanego dawką 8 MRad w 10 ml wody podwójnie destylowanej i mieszać przez 1 h w przypadku alginianu nienaświetlanego oraz przez 15 min w przypadku alginianu naświetlanego. Roztwór alginianu przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Przed wytwarzaniem alginianowych mikrokulek przefiltrować roztwór alginianu za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 µm.

2. Wytwarzanie alginianowych mikrokulek

  1. Zdezynfekować generator elektrostatycznych kulek i pompę strzykawkową 70% etanolem, a następnie umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (Rysunek 1).
  2. Wewnątrz generatora kulek umieścić szklaną kuwetę z magnetycznym mieszadłem.
  3. Ustawić elektrodę ramienia generatora kulek 9 cm nad kuwetą.
  4. Podłączyć kabel elektrody generatora kulek do śruby rzymskiej 2 elektrody ramienia, a następnie wlać do kuwety 80 ml roztworu SrCl2.
  5. Napełnić strzykawkę i gumową rurkę 5 ml przefiltrowanego przez membranę 0,2 µm roztworu alginianu. Po podłączeniu gumowej rurki do elektrody ramienia włączyć pompę strzykawkową z prędkością 5 ml/hr na 2 min, aby usunąć powietrze z rurek i doprowadzić roztwór alginianu do końcówki dyszy. Wyłączyć pompę strzykawkową.
  6. Następnie włączyć enkapsulator, a potem pompę strzykawkową, aby rozpocząć generowanie mikrokulek. Ustawić prędkość przepływu alginianu na 5 ml/hr oraz napięcie 5,8 kV na enkapsulatorze. Odrzucić mikrokulki wytworzone w ciągu pierwszych dwóch minut (lub początkowe 0,5 ml roztworu alginianu wypompowanego ze strzykawki), ponieważ mikrokulki te mają zazwyczaj nieregularny rozmiar i kształt.
  7. Kolejne mikrokulki zbierać w 0,2 M roztworze chlorku stronu. Po wpompowaniu zaplanowanej objętości roztworu alginianu wyłączyć pompę strzykawkową, a następnie enkapsulator (w tej kolejności). Powtórzyć tę procedurę dla kolejnych partii mikrokulek. Po zakończeniu prac najpierw wyłączyć pompę strzykawkową, a następnie enkapsulator.
  8. Przechowywać mikrokulki w 20 ml 0,2 M roztworu chlorku stronu w temperaturze 4 °C przez noc, aby dokończyć proces sieciowania i ustabilizować żel.

3. Pomiar wielkości alginianowych mikrokulek

  1. Pobrać 0,5 ml mikrokulek alginianowych za pomocą plastikowej pipety i umieścić je na szkiełku przedmiotowym. Obejrzeć mikrokulki pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 10X. Wykonać dziesięć zdjęć mikrokulek za pomocą kamery CCD mikroskopu. Zapisać obrazy z paskiem skali (50 µm) w formacie TIFF przy rozdzielczości 2 048 x 1 536.
  2. Za pomocą narzędzi pomiarowych w programie ImageJ zmierzyć rozmiar mikrokulek oraz paska skali (Ryc. 2). Przeliczyć długość mikrokulek z pikseli na mikrometry.
    1. Kliknąć narzędzia liniowe i narysować linię przechodzącą przez środek kulki alginianowej.
    2. Kliknąć „Analyze” na pasku menu i wybrać „Measure”. Pojawi się okno wyskakujące.
    3. Powtórzyć kroki 3.2.1-3.2.2, aby zmierzyć wszystkie kulki alginianowe na obrazie. Zmierzyć pasek skali na obrazie.
    4. Przeliczyć średnicę kulki alginianowej na rzeczywistą długość, korzystając ze wzoru: długość kulki alginianowej / długość paska skali x 50 µm. Na przykład: 1,420 (średnica zmierzona w ImageJ) / 2,657 (długość paska skali zmierzona w ImageJ) * 50 µm = 267 µm.
  3. Przyjąć średnią wielkość 10 mikrokulek (średnia ± odchylenie standardowe) jako reprezentatywny rozmiar każdej partii mikrokulek.

4. Sterylizacja

  1. Zebrać mikrokulki za pomocą nylonowego sita o oczkach 100 µm i przemyć je wodą dwukrotnie destylowaną.
  2. Za pomocą szpatułki przenieść wszystkie mikrokulki przygotowane z 0,1 ml roztworu alginianu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml i przykryć gazą, aby zapobiec wysychaniu.
  3. Na koniec wysterylizować mikrokulki w autoklawie, korzystając z trybu dla cieczy (115 °C, 15 min) lub zgodnie ze specyfikacją producenta. Do komory dodać 1,5 L wody destylowanej, aby zapobiec wysychaniu kulek.

5. Powlekanie protaminą i heparyną

  1. W komorze BSL-2 inkubować sterylne mikrokulki w 1 ml roztworu protaminy o stężeniu 2 mg/ml (sterylizowanego za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm) przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  2. Po 1 h inkubacji mikrokulek (krok 5.1), pobrać 150 µl roztworu protaminy do testu mikro-kwasu bicinchoniniowego (microBCA) (sekcja 6).
  3. Przemyć mikrokulki pokryte protaminą dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną. Odwirować za pomocą wirówki stołowej przy 20 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odessać wodę za pomocą strzykawki.
  4. Inkubować mikrokulki pokryte protaminą w 1 ml roztworu heparyny o stężeniu 0,5 mg/ml (sterylizowanego za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm) przez 30 min w celu utworzenia kompleksu polielektrolitowego (PEC).
  5. Po 30 min inkubacji mikrokulek pokrytych protaminą (krok 5.4), pobrać 40 µl roztworu heparyny w celu oznaczenia zawartości heparyny (sekcja 7).
  6. Po inkubacji usunąć niezwiązaną heparynę z kompleksów PEC, przemywając je dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną.

6. Zawartość protaminy

  1. Przeprowadzić test microBCA zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: do płytki 96-dołkowej dodać 150 µl roztworu protaminy (pobranego przed i po inkubacji z mikrokulkami). Dodać 150 µl roztworu roboczego microBCA.
  2. W charakterze standardów kalibracyjnych zastosować roztwór albuminy (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 i 20 µg/ml).
  3. Mieszaninę inkubować przez 60 min w temperaturze 60 °C. Absorbancję zmierzyć za pomocą spektrofotometru przy 562 nm.
  4. Wykorzystać krzywą standardową do oznaczenia stężenia protaminy w każdej nieznanej próbce zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Wyznaczyć zawartość protaminy w mikrokulkach, odejmując całkowitą ilość protaminy w roztworze powlekającym (przed inkubacją z mikrokulkami) od ilości protaminy pozostałej w roztworze powlekającym (po inkubacji z mikrokulkami).

7. Zawartość heparyny

  1. Przygotować 10 ml roztworu roboczego, rozpuszczając 4 mg błękitu toluidynowego i 20 mg chlorku sodu w 0,01 N kwasie solnym.
  2. Dodać 40 µl próbki (z kroku 5.5) do roztworu roboczego w stosunku 2:3 i mieszać wortexie przez 30 s.
  3. Dodać 60 µl n-heksanu (objętość równą objętości roztworu odczynnika roboczego) i wymieszać wortexie, aby wyekstrahować kompleks błękitu toluidynowego z heparyną.
  4. Po rozdzieleniu faz pobrać strzykawką 20 µl fazy wodnej.
  5. Zmierzyć ilość niewyekstrahowanego błękitu toluidynowego w fazie wodnej za pomocą spektrofotometru przy 631 nm.
  6. Przygotować roztwory standardowe heparyny o stężeniu 0-20 µg/ml.
  7. Wykreślić zależność odczytu przy 631 nm dla każdego standardu heparyny od stężenia heparyny w µg/ml. Wykorzystać krzywą wzorcową do oznaczenia stężenia heparyny w każdej próbce.

8. Obraz konfokalny struktury warstwa po warstwie

  1. Przygotować protaminę, heparynę oraz analogi fluorescencyjne NELL-1/BMP-2: protaminę CF-405 (niebieską), heparynę CF 594 (czerwoną) oraz znakowane FITC NELL-1/znakowane FITC (zielone) BMP-2 + heparynę + protaminę zgodnie z techniczną kartą charakterystyki producenta.
  2. Pokryć 10 µg mikrokulek 30 µl analogu fluorescencyjnego (metoda pokrywania opisana w punktach 5.3-5.6): protaminy CF-405 (niebieskiej) (2 mg/ml, inkubacja przez 1 h), heparyny CF 594 (czerwonej) (0,5 mg/ml, 30 min) oraz znakowanego FITC NELL-1/znakowanego FITC (zielonego) BMP-2 (1,5 mg/ml, przez noc). Przemyć mikrokulki dwukrotnie wodą destylowaną, aby usunąć niezwiązaną fluorescencyjną protaminę, heparynę oraz NELL-1/BMP-2.
  3. Obserwować strukturę warstwa-po-warstwie (Rysunek 3) za pomocą mikroskopu konfokalnego przy powiększeniu 10X.7

9. Pobieranie i uwalnianie BMP-2 oraz NELL-1

  1. Nanieś 13,3 µl roztworu BMP-2 lub NELL-1 o stężeniu 1,5 mg/ml na 10 µg PEC. Inkubuj PEC w temperaturze 4 °C przy wstrząsaniu z prędkością 30 rpm przez 10 h.
  2. Zanurz mikrokulki w 1 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w temperaturze 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu (30 rpm).
  3. Pobieraj 1 ml supernatantu i zastępuj go 1 ml PBS po 1, 3, 6, 10 i 14 dniach.
  4. Oceń wydajność pobierania i uwalniania BMP-2 metodą ELISA zgodnie z protokołem producenta. Oceń wydajność pobierania i uwalniania NELL-1 metodą analizy białek z użyciem karboksybenzoylokinolino-2-karboksaldehydu (CBQCA) zgodnie z protokołem producenta.
  5. Wyznacz skumulowane uwalnianie w czasie (t):
    Skumulowane uwalnianie w czasie (t) = Uwalnianie w czasie (t) + Poprzednie uwalnianie w czasie (t-1).
  6. Przedstaw na wykresie skumulowane uwalnianie BMP-2 i NELL-1 w funkcji czasu.

10. Bioaktywność in vitro NELL-1

Uwaga: Bioaktywność NELL-1 uwalnianego z PEC oceniono poprzez pomiar jego zdolności do zwiększania ekspresji fosfatazy alkalicznej (ALP) w komórkach macierzystych szpiku kostnego królika (rBMSC).

  1. Zasiać 20 00 rBMSCs na studzienkę w płytce 24-dołkowej i hodować przez jeden dzień w 1 ml pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z dodatkiem 10% FBS (Fetal bovine serum) w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  2. Po 24 h wymienić pożywkę na 1 ml pożywki osteogennej (DMEM uzupełnione o 10% FBS, 2% penicyliny i streptomycyny, 50 µg/ml kwasu askorbinowego, 10 mmol/L beta-glicerynfosforanu oraz 10-8 mol/L deksametazonu) na 7 dni w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  3. Umieścić 30 µg PEC-NELL-1 (z kroku 8.2) oraz PEC w insertach do hodowli komórkowej (insert TC), aby oddzielić PEC od komórek (zapobiega to wypłukaniu mikrokulek PEC podczas wymiany pożywki osteogennej). Wstawić insert TC do płytki 24-dołkowej na 14 dni.
  4. Raz na trzy dni odessać 1 ml pożywki osteogennej, umieszczając igłę poza insertem TC, i zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki osteogennej.
  5. Po 7 i 14 dniach inkubacji oznaczyć aktywność ALP za pomocą zestawu do analizy ALP zgodnie z protokołem producenta zestawu.
    1. Zlizować komórki buforem do analizy zawierającym 0,1% TritonX-10 w temperaturze 4 °C przez 10 min. Zebrać przytwierdzone komórki za pomocą skrobaka komórkowego. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C podczas mieszania przez co najmniej 60 min.
    2. Odwirować zawiesinę komórkową przy 2 50 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Zebrać nadsącz do analizy ALP.
    3. Do studzienek płytki 96-dołkowej dodać po 50 µl seryjnie rozcieńczonego roztworu standardu fosfatazy alkalicznej w zakresie od 200 do 0 ng/ml. Końcowe ilości standardu fosfatazy alkalicznej wynoszą odpowiednio 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 i 0 ng/studzienkę.
    4. Dodać nadsącz z kroku 10.5.2 (50 µl/studzienkę) i rozcieńczyć buforem do rozcieńczania.
    5. Do każdej studzienki dodać 50 µl roztworu substratu p-nitrofenylofosforanu (pNPP). Wymieszać odczynniki, delikatnie wstrząsając płytką przez 30 s. Inkubować mieszaninę przez 30 min w ciemności. Zmierzyć absorbancję przy 405 nm za pomocą czytnika płytek.
    6. Obliczyć aktywność ALP, korzystając z krzywej kalibracyjnej.
  6. Oznaczyć zawartość białka za pomocą zestawu do mikroanalizy białek BCA zgodnie z instrukcją producenta. Znormalizować aktywność ALP, dzieląc wartość aktywności ALP przez zawartość białka.

1. Żywotność komórek

  1. Inkubować 20 mg PEC-NELL-1 w 1 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS w temperaturze 37 °C przez 24 h w celu przeprowadzenia testu MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliu).
  2. Zasiać 20 rBMSC na studzienkę (w 100 µl DMEM z 10% FBS) na płytce 96-dołkowej i inkubować przez 1 dzień w 37 °C, 5% CO22.
  3. Zastąp DMEM + 10% FBS przez 100 µl wyciągu PEC-NELL-1/PEC i inkubować w 37 °C, 5% CO22.
  4. Po 1 lub 3 dniach inkubacji dodać 10 µl roztworu MTT o stężeniu 5 mg/ml, a następnie inkubować w 37 °C, 5% CO22 przez 4 h w ciemności.
  5. Dodaj 100 µl roztwór DMSO do każdego dołka w celu rozpuszczenia kryształów formazanu.
  6. Wyznacz absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  7. Oblicz względny wskaźnik wzrostu:
    Wzór na względną szybkość wzrostu, stosunek absorbancji, analiza ekspozycji komórek, eksperyment biologiczny.

12. Pakowanie do rusztowania oraz ładowanie BMP-2 i NELL-1

  1. Wprowadzić PEC do porów biodegradowalnego rusztowania z polikaprolaktonu i fosforanu trójwapniowego klasy medycznej (mPCL-TCP), używając wysterylizowanej szpatułki w komorze BSL-2.
  2. Nanieść roztwór BMP-2 lub NELL-1 o stężeniu 1,5 mg/ml na rusztowanie mPCL-TCP wypełnione PEC i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W naszym nośniku jako zamiennik poli-L-lizyny wybrano protaminę, ponieważ posiada ona podobne właściwości chemiczne i jest zatwierdzona przez FDA jako odtrutka na heparynę. Wyniki badania pod mikroskopem optycznym wykazały, że nienaświetlane mikrokulki miały kształt sferyczny o średnicy 267 ± 14 µm (dysza 0,35 mm, szybkość przepływu 5 ml/hr i 6 kV). Większość naświetlonych mikrokulek ma kształt kropli. Średnica mierzona w zaokrąglonej części naświetlonych mikrokulek wynosiła 212 ± 30 µm (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole tym przedstawiono metodę otrzymywania PEC poprzez samoorganizację warstwa po warstwie. Struktura warstwa po warstwie jest wizualizowana za pomocą fluorescencyjnych analogów protaminy, heparyny, BMP-2 i NELL-1 oraz mikroskopii konfokalnej. Testy wychwytu i uwalniania pokazują, że heparyna na PEC pośredniczy w wychwytywaniu i uwalnianiu osteogennego czynnika wzrostu. Skuteczność absorpcji metodą PEC wynosi: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Nośnik PEC ma lepszą modulację uwalniania NELL-1 (20%) w porówna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy konfliktu interesów.

Podziękowania

Te badania zostały sfinansowane przez National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 i NMRC EDG/0022/2008.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Targi Acrodisc 25 w dziedzinie nauk przyrodniczych  mm Filtr strzykawkowy z 0,2  &mikro; m Membrana SuporPALL PN4612Sterylny roztwór protaminy, heparyny metodą ultrafiltracji
24-dołkowa płytkaCell Star 662160
96-dołkowa płytka Nuclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy bromek), MTTSigma AldrichM5655Pomiar cytotoksyczności PEC-NELL-1
AcetonFisher ScientificA/0600/17Osad CF-405
Oznakowany protamin
Alamar BlueInvitrogen, Life TechnologiesDAL 1025Pomiar cytotoksyczności zestawu do
oznaczania fosfatazy alkalicznej PEC-BMP-2 (ALP)AnaspecAS-72146
Chlorek amonuMerckArt 1145Odczynnik Stop w znakowaniu FITC
Bezwodny dimetylosulfotlenek (DMSO)Invitrogen, Life TechnologiesD12345Rozpuszczalnik do fluorescencyjnego izotiocyjanianu I
Dimetylosulfotlenek ( DMSO)Sigma AldrichRozpuszczać  formazan 
AutoklawHirayamaHU-110Sterylizuj kulki alginianowe parą
Beta-glicerofosforanSigma AldrichG9422
BMP-2 (zestaw do nawożenia przeszczepu kości duży II) Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA7510800Osteogenny czynnik wzrostu, dializa jest potrzebna do usunięcia składnika stabilizującego, który zakłóca sprzężenie FITC
Karboksybenzoilochinolino-2-karboksyaldehyd (CBQCA) Thermo Fisher ScientificA-6222Do ilościowego oznaczania sitka komórkowego białka NELL-1
(100  &mikro; m)BD Science352360Trzymaj PEC do testu ALP
Skrobak do komórek 290  mm Szerokość ostrza 20  mmSPL Life Science90030Odłącz komórkę od płytki 24-dołkowej
CF 405S, Succinimidyl EsterSigma AldrichSCJ4600013Niebieski barwnik fluorescencyjny do znakowania protaminy
CF 594, HydrazideSigma AldrichSCJ4600031Ciemnoczerwony barwnik fluorescencyjny do znakowania heparyny
WirówkaBeckman CoulterMicrofuge 22R
Olimpia FV1000
DeksametazonSigma AldrichD4902Składnik osteogennej pożywki wzrostowej
Kolumny odsalające dekstranPierce (Thermo Scientific) 43230
DMEM Gibco 12320
BMP-2 Zestaw Quantikine ELISA R& D SystemDBP200Określ uwalnianie BMP-2
Płodowa surowica bydlęca FBSHyclonSV30160.03
Izotiocyjanian fluoesceiny, izomer ISigma AldrichF7250Zielony barwnik fluorescencyjny do znakowania NELL-1 i BMP-2
Wkładki do hodowli komórkowych ThinCert,
Do płytek 24-dołkowych, sterylny		Greiner 662630Zapobiega wypłukiwaniu PEC podczas wymiany podłoża osteogennego
Pompa strzykawkowa Havard Appartus (11 plus)Aparat Havarda70-2208
n-heksan (>99%)Sigma Aldrich139386
HeparynaSigma AldrichH3149Wiąże się z czynnikiem wzrostu osteogennym
z domeną wiążącą heparynę
Kwas solny (37%)Merck100317Silnie
inkubatorBinderC8150
MicroBCA Zestaw do oznaczania białekThermoscientific23235
Czytnik mikropłytekTecanInfinite M200Do testów ALP i mikroBCA
Enkapsulator komórekNisco Nisco Engineering IncJednostka do enkapsulacji VAR V1
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusRusztowanie IX71
mPCL-TCP (wielkość porów wynosi 1,3  mm)OsteoporePCL-TCP 0/90Hold PEC dla in vivo badanie
Penicylina-Streptomycyna 10 000 jednostek/ml, 100  mlHodowla komórek hyklonuSV30010antybiotyk
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)VivantisPB0344-1L10x Roztwór, ultra czysty
poli-L-lizyna MW 15 000-30 000Sigma AldrichP2568
Sól siarczanu protaminy polikacji, z łososiaSigma AldrichP4020Wytrząsarka do polikacji
LabnetS2025
Wężowa rurka do dializy 3,500 MWCO 22  mm x 35 stópThermo Fisher Scientific68035Usuń nieprzereagowany FITC przez dializę
Chlorek soduMerck1.06404.1000
Wodorotlenek soduQrecS5158
Wodorowęglan soduUS BiologicznybuforS4000
Węglan soduSigma AldrichS7795-500GBufor
Chlorek strontu HexahydrateSigma Aldrich255521Crosslinker do alginianu
Szpatułka3dia
komórkowych z przechyloną szyjkąCorning730720
Toluidyna BlueSigma Aldrich52040Test
Trypsyna 1xHodowla komórek hyklonowychSH30042.01
Alginian soduNovamatrix (FMC Biopolimer, Princeton, NJ)Pronova UPMVGMateriał rdzenia z mikrogranulek
Mikroskop konfokalny 5 ml strzykawka Terumo 140425R Średnica strzykawki wpływa na szybkość przepływu 75 cm Kolba do hodowli heparyny

Bibliografia

  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
  3. Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
  4. Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
  5. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  6. Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
  7. Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
  8. Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
  9. Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
  10. Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
  11. Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
  12. Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
  13. Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrokulki alginianowemikroskopia konfokalnatest fosfatazy alkalicznejbiałko morfogenetyczne kościcząsteczka podobna do NELLpowłoka z protaminy i heparynyroztwór chlorku strontu
Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.