Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Podsumowanie

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Streszczenie

Podczas operacji rekonstrukcyjnych kości, suprafizjologiczne ilości czynników wzrostu są empirycznie ładowane na rusztowania, aby ułatwić udaną fuzję kostną. Duże dawki bardzo silnych czynników biologicznych są wymagane ze względu na niestabilność czynnika wzrostu w wyniku szybkiej degradacji enzymatycznej, a także nieefektywność nośnika w lokalizacji wystarczającej ilości czynnika wzrostu w miejscach implantacji. W związku z tym strategie, które przedłużają stabilność czynników wzrostu, takich jak BMP-2/NELL-1, i kontrolują ich uwalnianie, mogą w rzeczywistości obniżyć ich skuteczną dawkę, a tym samym zmniejszyć zapotrzebowanie na większe dawki podczas przyszłych operacji regeneracji kości. To z kolei zmniejszy skutki uboczne i koszty czynnika wzrostu. Samoorganizujące się PEC zostały wyprodukowane, aby zapewnić lepszą kontrolę dostarczania BMP-2/NELL-1 poprzez wiązanie heparyny i dodatkowo wzmocnić bioaktywność czynnika wzrostu poprzez zwiększenie stabilności in vivo. Poniżej ilustrujemy prostotę wytwarzania PEC, która pomaga w dostarczaniu różnych czynników wzrostu podczas operacji rekonstrukcyjnych kości.

Wprowadzenie

Częstość występowania rzekomej choroby zwyrodnieniowej stawów wynosi od 10 do 45% w zwyrodnieniowych zrostach kręgosłupa i rewizyjnych operacjach kręgosłupa¹. Aby zmniejszyć częstość występowania choroby zwyrodnieniowej kości łamiennej kości podczas zespolenia kręgosłupa i innych operacji rekonstrukcyjnych kości, wprowadzono osteogenne czynniki wzrostu, takie jak BMP-2,^{Nell-1 1} i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), w celu promowania osteogenezy de novo. Wśród nich BMP-2 jest popularnym wyborem do zespolenia kręgosłupa². Chociaż siła działania BMP-2 w indukowaniu i ułatwianiu tworzenia nowych kości została dobrze ugruntowana³; Klinicznie istotne powikłania, takie jak heterotopowe tworzenie kości, tworzenie się surowicy i krwiaka, reakcja zapalna, zapalenie korzonków nerwowych, osteoliza trzonów kręgów i wytrysk wsteczny nadal stanowią problem ze względu na stosowane suprafizjologiczne ilości^4,5.

Dlatego obniżenie dawki BMP-2 pozostaje istotną strategią w próbach zminimalizowania skutków ubocznych. Poza tym potrzebne są wydajne systemy nośników, aby stłumić początkowe uwalnianie BMP-2 obserwowane we współczesnych systemach nośników gąbek kolagenowych i jeszcze bardziej zwiększyć przedłużone i miejscowe dostarczanie tej silnej cytokiny. Samoorganizacja naprzemiennych kationowych i anionowych polielektrolitów warstwa po warstwie może być stosowana jako przestrajalna metoda do budowania kompleksów polielektrolitowych na powierzchni matryc rusztowań lub materiałów do implantacji⁶. Pod tym względem uznano, że heparyna (znana z najwyższej gęstości ładunku ujemnego ze wszystkich czynników biologicznych) chętnie wiąże się z różnymi czynnikami wzrostu za pośrednictwem domen wiążących elektrostatyki i heparynę. Rzeczywiście, wykazano, że heparyna przedłuża okres półtrwania, a tym samym nasila bioaktywność kilku czynników wzrostu.

Na tej podstawie, nasza grupa dostosowała protokół samoorganizacji warstwa po warstwie, aby wytworzyć kompleks polielektrolitowy na bazie heparyny (PEC), który ładuje i zachowuje bioaktywność osteogennych czynników wzrostu podczas unieruchomienia^7,8. Rdzeń mikrokulek alginianowych wytworzono przez sieciowanie reszt α-L-guluronianu (G) alginianu z dwuwartościowymi jonami kationu wapnia lub strontu. Rdzeń alginianowy jest biodegradowalną matrycą rusztowania; który po implantacji ulega resorpcji w łożu fuzyjnym, zapewniając miejsce na wrastanie kości. Poli-L-lizyna (PLL) lub protamina jest używana jako warstwa kationowa do przeplatania się zarówno z matrycą rusztowania (w tym przypadku rdzeniem nośnym mikrokulek alginianowych), jak i ujemnie naładowaną heparyną; podczas gdy warstwa heparyny anionowej działa stabilizująco i lokalizując obciążone czynniki wzrostu. Wykazano, że trójwarstwowy PEC zwiększa nośność czynnika wzrostu w modelu^{świni 9}. Ostatnio wykazano, że nosiciele PEC skutecznie zmniejszają skuteczną dawkę BMP-2 co najmniej 20-krotnie w modelach zrostu rdzeniowego u szczurów¹⁰ i świń8.

Tutaj przedstawiamy metody wytwarzania PEC w celu zwiększenia dostarczania czynnika wzrostu w zespoleniu kręgosłupa i innych operacjach rekonstrukcyjnych kości przy użyciu BMP-2 jako modelowego osteogennego czynnika wzrostu.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu alginianu

1. Rozpuścić 200 mg alginianu sodu (nienapromienionego) lub 400 mg napromieniowanego alginianu sodu 8 MRad w 10 ml podwójnie destylowanej wody i wstrząsać przez 1 godzinę w przypadku alginianu nienapromieniowanego i 15 minut w przypadku alginianu napromienionego. Roztwór alginianu przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Przefiltrować roztwór alginianu sterylnym filtrem strzykawkowym 0,2 μm przed wytworzeniem mikrogranulek alginianu.

2. Wytwarzanie mikrokulek alginianowych

1. Zdezynfekuj generator kulek elektrostatycznych i pompę strzykawkową 70% etanolem i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (rysunek 1).
2. Umieść szklaną miskę z magnetycznym mieszadłem wewnątrz generatora kulek.
3. Ustaw elektrodę ramienia generatora koralików 9 cm nad umywalką.
4. Podłącz elektrody generatora koralików do radełkowanej 2 elektrody ramienia i wlej 80 ml roztworu SrCl₂ do miski.
5. Załadować 5 ml przefiltrowanego roztworu alginianu o stężeniu 0,2 μm do strzykawki i gumowej rurki. Po podłączeniu gumowej rurki do elektrody ramienia, włącz pompę strzykawkową z prędkością 5 ml/h na 2 minuty, aby usunąć powietrze z rurki i dostarczyć roztwór alginianu do końcówki dyszy. Wyłączyć pompę strzykawkową.
6. Następnie włącz enkapsulator, a następnie pompę strzykawkową, aby rozpocząć wytwarzanie mikrogranulek. Ustaw natężenie przepływu alginianu na 5 ml/h, a napięcie na 5,8 kV na enkapsulatorze. Wyrzuć mikrogranulki wytworzone w ciągu pierwszych dwóch minut (lub początkowe 0,5 ml roztworu alginianu wypompowane ze strzykawki), ponieważ te mikrogranulki mają zwykle nieregularny rozmiar i kształt.
7. Zebrać kolejne mikrogranulki w 0,2 M roztworze chlorku strontu. Wyłączyć zarówno pompę strzykawkową, jak i enkapsulator (w tej kolejności) po przepompowaniu wcześniej zaplanowanej objętości roztworu alginianu. Powtórz to dla kolejnych partii wytwarzania mikrogranulek. Po zakończeniu należy najpierw wyłączyć pompę strzykawkową, a następnie enkapsulator.
8. Przechowywać mikrogranulki w 20 ml 0,2 M roztworu chlorku strontu w temperaturze 4 °C przez noc w celu zakończenia sieciowania i ustabilizowania żelu.

3. Pomiar wielkości mikrogranulek alginianowych

1. Zebrać 0,5 ml mikrogranulek alginianowych za pomocą plastikowej pipety i umieścić na szkiełku podstawowym. Zobacz mikrogranulki pod mikroskopem optycznym w 10-krotnym powiększeniu. Wykonaj dziesięć zdjęć mikrokulek za pomocą mikroskopowej kamery CCD. Zapisz obrazy z podziałką liniową (500 μm) w formacie TIFF w rozdzielczości 2 048 x 1 536.
2. Korzystając z narzędzi do pomiaru długości w narzędziu ImageJ, zmierz rozmiar mikrokulek i podziałki liniowej (Rysunek 2). Przelicz długość mikrokulek z piksela na mikrometr.
   1. Kliknij narzędzia linii i narysuj linię w poprzek środka koralika alginianowego.
   2. Kliknij "Analizuj" na pasku menu i wybierz "Zmierz". Pojawi się wyskakujące okienko.
   3. Powtórz kroki 3.2.1-3.2.2, aby zmierzyć wszystkie kulki alginianowe na obrazie. Zmierz podziałkę liniową na obrazie.
   4. Przelicz średnicę koralika alginianowego na rzeczywistą długość, korzystając ze wzoru:długość koralika alginianowego/długość skali x 500 μm. Na przykład 1,420 (średnica mierzona za pomocą ImageJ) / 2,657 (długość skali mierzona przez ImageJ) * 500 μm = 267 μm.
3. Rozważ średnią wielkość 100 mikrogranulek (średnia ± odchylenie standardowe) jako reprezentatywną wielkość każdej partii mikrogranulek.

4. Sterylizacja

1. Zbierz mikrogranulki za pomocą nylonowego sitka o wielkości 100 μm i umyj je wodą podwójnie destylowaną.
2. Za pomocą szpatułki przenieś wszystkie mikrogranulki wykonane z 0,1 ml roztworu alginianu do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml i przykryj gazą, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Na koniec wysterylizuj mikrogranulki w autoklawie w trybie płynnym (115 °C, 15 min) lub zgodnie ze specyfikacją producenta. Dodaj 1,5 l wody destylowanej do komory, aby zapobiec wysychaniu kulek.

5. Powłoka protaminowa i heparynowa

1. Wewnątrz okapu BSL-2 inkubować sterylne mikrogranulki z 1 ml roztworu protaminy o stężeniu 2 mg/ml (sterylizowanego przy użyciu filtra strzykawkowego 0,2 μm) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Po inkubacji mikrogranulek przez 1 godzinę (etap 5.1) zebrać 150 μl roztworu protaminy do testu z użyciem kwasu mikrobicinchoninowego (microBCA) (sekcja 6).
3. Umyj mikrogranulki pokryte protaminą dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną. Wirować za pomocą wirówki stołowej o sile 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać wodę za pomocą strzykawki.
4. Inkubować mikrogranulki pokryte protaminą z 1 ml roztworu heparyny o stężeniu 0,5 mg/ml (sterylizowanego przy użyciu filtra strzykawkowego 0,2 μm) przez 30 minut w celu wytworzenia kompleksu polielektrolitowego (PEC).
5. Po inkubacji mikrogranulek pokrytych protaminą przez 30 minut (krok 5.4) zebrać 400 μl roztworu heparyny w celu oznaczenia zawartości heparyny (sekcja 7).
6. Po inkubacji zmyć niezwiązaną heparynę z PEC przez dwukrotne przemycie wodą podwójnie destylowaną.

6. Zawartość protaminy

1. Wykonaj test microBCA zgodnie z instrukcjami producenta. Na krótko dodać 150 μl roztworu protaminy (zebranego przed i po inkubacji z mikrogranulkami) do płytki 96-dołkowej. Dodać 150 μl roztworu roboczego microBCA.
2. Jako wzorce kalibracyjne należy użyć roztworu albuminy (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 i 200 μg/ml).
3. Inkubować mieszaninę przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru przy długości fali 562 nm.
4. Użyj krzywej standardowej, aby określić stężenie protaminy w każdej nieznanej próbce zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Oznaczyć zawartość protaminy w mikrogranulkach, odejmując całkowitą ilość protaminy w roztworze powlekającym (przed inkubacją z mikrogranulkami) od ilości protaminy pozostałej w roztworze powlekającym (po inkubacji z mikrogranulkami).

7. Zawartość heparyny

1. Przygotować 10 ml roztworu roboczego, rozpuszczając 4 mg błękitu toluidynowego i 20 mg chlorku sodu w 0,01 N kwasie solnym.
2. Dodać 400 μl próbki (z kroku 5.5) do roztworu roboczego w stosunku 2:3 i wirować przez 30 sekund.
3. Dodać 600 μl n-heksanu (objętość równoważna roboczemu roztworowi odczynnika) i zwirować mieszaninę w celu ekstrakcji kompleksu niebieskiej heparyny toluidynowej.
4. Odessać 200 μl fazy wodnej za pomocą strzykawki po oddzieleniu faz.
5. Zmierzyć ilość nieekstrahowanego błękitu toluidynowego zawartego w fazie wodnej za pomocą spektrofotometru o długości fali 631 nm.
6. Przygotować roztwory wzorcowe heparyny o stężeniu 0-20 μg/ml.
7. Wykreślić odczyt 631 nm każdego wzorca heparyny w funkcji stężenia heparyny w μg/ml. Użyj krzywej wzorcowej, aby określić stężenie heparyny w każdej próbce.

8. Konfokalny obraz struktury warstwa po warstwie

1. Wytwarzaj protaminę, heparynę i fluorescencyjny analog CF-405 protamin (niebieski), heparynę CF 594 (czerwoną) i FITC oznaczoną NELL-1/FITC (zieloną) BMP-2 + heparynę + protaminę z oznaczeniem FITC i FITC zgodnie z kartą techniczną producenta.
2. Pokryj 100 μg mikrogranulek 300 μl analogu fluorescencyjnego (metoda powlekania opisana w 5.3-5.6) CF-405 protamina (niebieska) (2 mg / ml, 1 godzina inkubacji), CF 594 heparyna (czerwona) (0,5 mg / ml, 30 min) i FITC znakowana NELL-1 / FITC (zielona) BMP-2 (1,5 mg / ml, przez noc). Umyj mikrogranulki dwukrotnie wodą destylowaną, aby wyeliminować niezwiązaną fluorescencyjną protaminę, heparynę i NELL-1/BMP-2.
3. Obserwuj strukturę warstwa po warstwie (ryc. 3) za pomocą mikroskopu konfokalnego przy 10-krotnym powiększeniu. ⁷

9. BMP-2 i NELL-1 Pobieranie i uwalnianie

1. Załadować 13,3 μl 1,5 mg/ml roztworu BMP-2 lub NELL-1 na 100 μg PEC. Inkubować PEC w temperaturze 4 °C poniżej 30 obr./min, wytrząsając przez 10 godzin.
2. Zanurzyć mikrogranulki w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 37 °C, stale wstrząsając (30 obr./min).
3. Zebrać 1 ml supernatantu i zastąpić go 1 ml PBS po 1, 3, 6, 10 i 14 dniach.
4. Ocenić skuteczność wychwytu i uwalniania BMP-2 za pomocą metody ELISA zgodnie z protokołem producenta. Ocenić skuteczność wychwytu i uwalniania NELL-1 przy użyciu metody oznaczania białek karboksybenzoilochinolino-2-karboksyaldehydu (CBQCA) zgodnie z protokołem producenta.
5. Określ łączne uwalnianie w czasie (t):
   Łączne wydanie w czasie (t) = Zwolnienie w czasie (t) + Poprzednie wydanie w czasie (t-1).
6. Wykres skumulowanego uwolnienia BMP-2 i NELL-1 w czasie.

10. Bioaktywność in vitro NELL-1

Uwaga: Bioaktywność NELL-1 uwolnionego z PEC została oceniona poprzez pomiar jego zdolności do zwiększania ekspresji fosfatazy alkalicznej (ALP) w komórkach macierzystych szpiku kostnego królika (rBMSC).

1. Wysiewaj 20 000 rBMSC na studzienkę na 24-dołkowej płytce i pozwól im rosnąć przez jeden dzień za pomocą 1 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Dragon's Eagle's Medium (DMEM) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę 1 ml pożywki osteogennej (DMEM uzupełniony 10% FBS, 2% penicyliny streptomycyny, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 10 mmol/l beta-glicerofosforanu i ^10-8 mol/l deksametazonu) na 7 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Umieść 300 μg PEC-NELL-1 (od kroku 8.2) i PEC we wkładkach do hodowli komórkowych (wkładka TC), aby utrzymać PEC oddzielnie od komórek (pozwala to uniknąć wypłukiwania mikrogranulek PEC podczas zmiany pożywki osteogennej). Umieść wkładkę TC w płytce 24-dołkowej na 14 dni.
4. Raz na trzy dni odsysać 1 ml pożywki osteogennej, umieszczając igłę na zewnątrz wkładki TC i zastąpić 1 ml świeżej pożywki kościopochodnej.
5. Po 7 i 14 dniach inkubacji należy oznaczyć aktywność ALP za pomocą zestawu do oznaczania ALP zgodnie z protokołem producenta zestawu.
   1. Lizować komórki za pomocą buforu testowego zawierającego 0,1% TritonX-100 w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zeskrobać przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania przez co najmniej 60 minut.
   2. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 2 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać supernatant do testu ALP.
   3. Dodać 50 μl seryjnie rozcieńczonego roztworu wzorcowego fosfatazy alkalicznej o stężeniu 200 do 0 ng/ml do studzienek na płytce 96-dołkowej. Końcowe ilości wzorca fosfatazy alkalicznej to 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 i 0 ng / studzienkę.
   4. Dodać supernatant z etapu 10.5.2 (50 μl/basenik) i rozcieńczyć buforem rozcieńczającym.
   5. Dodać 50 μl roztworu substratu fosforanu p-nitrofenylu (pNPP) do każdej studzienki. Wymieszaj odczynniki, delikatnie potrząsając płytką przez 30 sekund. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w ciemności. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika płytek.
   6. Oblicz aktywność ALP za pomocą krzywej kalibracyjnej.
6. Oznacz zawartość białka za pomocą zestawu do oznaczania białek microBCA zgodnie z instrukcjami producenta. Normalizuj aktywność ALP, dzieląc aktywność ALP przez zawartość białka.

11. Żywotność komórek

1. Inkubować 200 mg PEC-NELL-1 z 1 ml DMEM +10% FBS w temperaturze 37 °C przez 24 godziny dla testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT).
2. Wysiewać 2 000 rBMSC na studzienkę (w 100 μl DMEM z 10% FBS) na 96-dołkowej płytce i inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
3. Zastąp DMEM + 10% FBS 100 μl ekstraktu PEC-NELL-1/PEC i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
4. Po 1 dniu lub 3 dniach inkubacji dodać 10 μl 5 mg/ml roztworu MTT i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 4 godziny w ciemności.
5. Dodaj 100 μl roztworu DMSO do każdej studzienki, aby rozpuścić kryształy formazanu.
6. Oznaczyć absorbancję przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
7. Oblicz względną szybkość wzrostu:
   

12. Pakowanie na rusztowanie i załadunek BMP-2 i NELL-1

1. Umieść PEC w porach bioresorbowalnego rusztowania polikaprolaktonu - fosforanu trójwapniowego klasy medycznej (mPCL-TCP) za pomocą wysterylizowanej szpatułki w komorze BSL-2.
2. Dodać 1,5 mg/ml roztwór BMP-2 lub NELL-1 na rusztowanie mPCL-TCP wypełnione PEC i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

Wyniki

W naszym nośniku, protamina została wybrana jako substytut poli-L-lizyny, ponieważ ma podobne właściwości chemiczne i jest zatwierdzona przez FDA jako antidotum na heparynę. Wyniki badań mikroskopem optycznym wykazały, że nienapromieniowane mikrokulki miały kulisty kształt o średnicy 267 ± 14 μm (dysza 0,35 mm, przepływ 5 ml/h i 5,8 kV). Większość napromieniowanych mikrogranulek ma kształt łzy. Średnica zmierzona na okrągłej części napromieniowanych mikrokulek wynosiła 212 ± 30 μm (dysza ...

Dyskusja

W protokole tym przedstawiono metodę otrzymywania PEC poprzez samoorganizację warstwa po warstwie. Struktura warstwa po warstwie jest wizualizowana za pomocą fluorescencyjnych analogów protaminy, heparyny, BMP-2 i NELL-1 oraz mikroskopii konfokalnej. Testy wychwytu i uwalniania pokazują, że heparyna na PEC pośredniczy w wychwytywaniu i uwalnianiu osteogennego czynnika wzrostu. Skuteczność absorpcji metodą PEC wynosi: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Nośnik PEC ma lepszą modulację uwalniania NELL-1 (20%) w porówna...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Targi Acrodisc 25 w dziedzinie nauk przyrodniczych  mm Filtr strzykawkowy z 0,2  &mikro; m Membrana Supor	PALL	PN4612	Sterylny roztwór protaminy, heparyny metodą ultrafiltracji
24-dołkowa płytka	Cell Star	662160
96-dołkowa płytka Nuclon Delta Surface	Thermo Fisher Scientific	167008
(3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy bromek), MTT	Sigma Aldrich	M5655	Pomiar cytotoksyczności PEC-NELL-1
Aceton	Fisher Scientific	A/0600/17	Osad CF-405 Oznakowany protamin
Alamar Blue	Invitrogen, Life Technologies	DAL 1025	Pomiar cytotoksyczności zestawu do
oznaczania fosfatazy alkalicznej PEC-BMP-2 (ALP)	Anaspec	AS-72146
Chlorek amonu	Merck	Art 1145	Odczynnik Stop w znakowaniu FITC
Bezwodny dimetylosulfotlenek (DMSO)	Invitrogen, Life Technologies	D12345	Rozpuszczalnik do fluorescencyjnego izotiocyjanianu I
Dimetylosulfotlenek ( DMSO)	Sigma Aldrich		Rozpuszczać  formazan
Autoklaw	Hirayama	HU-110	Sterylizuj kulki alginianowe parą
Beta-glicerofosforan	Sigma Aldrich	G9422
BMP-2 (zestaw do nawożenia przeszczepu kości duży II)	Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA	7510800	Osteogenny czynnik wzrostu, dializa jest potrzebna do usunięcia składnika stabilizującego, który zakłóca sprzężenie FITC
Karboksybenzoilochinolino-2-karboksyaldehyd (CBQCA)	Thermo Fisher Scientific	A-6222	Do ilościowego oznaczania sitka komórkowego białka NELL-1
(100  &mikro; m)	BD Science	352360	Trzymaj PEC do testu ALP
Skrobak do komórek 290  mm Szerokość ostrza 20  mm	SPL Life Science	90030	Odłącz komórkę od płytki 24-dołkowej
CF 405S, Succinimidyl Ester	Sigma Aldrich	SCJ4600013	Niebieski barwnik fluorescencyjny do znakowania protaminy
CF 594, Hydrazide	Sigma Aldrich	SCJ4600031	Ciemnoczerwony barwnik fluorescencyjny do znakowania heparyny
Wirówka	Beckman Coulter	Microfuge 22R
	Olimpia	FV1000
Deksametazon	Sigma Aldrich	D4902	Składnik osteogennej pożywki wzrostowej
Kolumny odsalające dekstran	Pierce (Thermo Scientific)	43230
	DMEM Gibco	12320
BMP-2 Zestaw Quantikine ELISA R	& D System	DBP200	Określ uwalnianie BMP-2
Płodowa surowica bydlęca FBS	Hyclon	SV30160.03
Izotiocyjanian fluoesceiny, izomer I	Sigma Aldrich	F7250	Zielony barwnik fluorescencyjny do znakowania NELL-1 i BMP-2
Wkładki do hodowli komórkowych ThinCert, Do płytek 24-dołkowych, sterylny	Greiner	662630	Zapobiega wypłukiwaniu PEC podczas wymiany podłoża osteogennego
Pompa strzykawkowa Havard Appartus (11 plus)	Aparat Havarda	70-2208
n-heksan (>99%)	Sigma Aldrich	139386
Heparyna	Sigma Aldrich	H3149	Wiąże się z czynnikiem wzrostu osteogennym z domeną wiążącą heparynę
Kwas solny (37%)	Merck	100317	Silnie
inkubator	Binder	C8150
MicroBCA Zestaw do oznaczania białek	Thermoscientific	23235
Czytnik mikropłytek	Tecan	Infinite M200	Do testów ALP i mikroBCA
Enkapsulator komórek	Nisco Nisco Engineering Inc	Jednostka do enkapsulacji VAR V1
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	Rusztowanie IX71
mPCL-TCP (wielkość porów wynosi 1,3  mm)	Osteopore	PCL-TCP 0/90	Hold PEC dla in vivo badanie
Penicylina-Streptomycyna 10 000 jednostek/ml, 100  ml	Hodowla komórek hyklonu	SV30010	antybiotyk
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Vivantis	PB0344-1L	10x Roztwór, ultra czysty
poli-L-lizyna MW 15 000-30 000	Sigma Aldrich	P2568
Sól siarczanu protaminy polikacji, z łososia	Sigma Aldrich	P4020	Wytrząsarka do polikacji
	Labnet	S2025
Wężowa rurka do dializy 3,500 MWCO 22  mm x 35 stóp	Thermo Fisher Scientific	68035	Usuń nieprzereagowany FITC przez dializę
Chlorek sodu	Merck	1.06404.1000
Wodorotlenek sodu	Qrec	S5158
Wodorowęglan sodu	US Biologiczny	bufor	S4000
Węglan sodu	Sigma Aldrich	S7795-500G	Bufor
Chlorek strontu Hexahydrate	Sigma Aldrich	255521	Crosslinker do alginianu
Szpatułka	3dia
komórkowych z przechyloną szyjką	Corning	730720
Toluidyna Blue	Sigma Aldrich	52040	Test
Trypsyna 1x	Hodowla komórek hyklonowych	SH30042.01
Alginian sodu	Novamatrix (FMC Biopolimer, Princeton, NJ)	Pronova UPMVG	Materiał rdzenia z mikrogranulek