Artykuł metodologiczny

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54203

⸱

29 czerwca 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, New York University School of Medicine, 2Department of Pathology, New York University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Streszczenie

Ogólnie rzecz biorąc, adhezja limfocytów T jest kluczowym składnikiem funkcji, przyczyniając się do odrębnych procesów rekrutacji komórek do miejsc zapalenia i interakcji z komórkami prezentującymi antygen (APC) w tworzeniu synaps immunologicznych. Te dwa konteksty adhezji limfocytów T różnią się tym, że interakcje limfocytów T z APC można uznać za statyczne, podczas gdy interakcje limfocytów T z naczyniami krwionośnymi są kwestionowane przez naprężenie ścinające generowane przez samą cyrkulację. Interakcje limfocytów T-APC są klasyfikowane jako statyczne, ponieważ dwaj partnerzy komórkowi są statyczni względem siebie. Zwykle ta interakcja zachodzi w węzłach chłonnych. Gdy limfocyt T oddziałuje ze ścianą naczynia krwionośnego, komórki zatrzymują się i muszą oprzeć się generowanemu naprężeniu ścinającemu. 1,2 Różnice te podkreślają potrzebę lepszego zrozumienia adhezji statycznej i adhezji w warunkach przepływu jako dwóch odrębnych procesów regulacyjnych. Regulację adhezji limfocytów T można najzwięźlej opisać jako kontrolowanie stanu powinowactwa cząsteczek integryny wyrażanych na powierzchni komórki, a tym samym regulowanie interakcji integryn z ligandami cząsteczek adhezyjnych wyrażonymi na powierzchni oddziałującej komórki. Nasza obecna wiedza na temat regulacji stanów powinowactwa integryny wywodzi się z często uproszczonych systemów modelowych in vitro. Opisany tutaj test adhezji przy użyciu warunków przepływu pozwala na wizualizację i dokładne określenie ilościowe interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi w czasie rzeczywistym po bodźcu. Test adhezji pod przepływem można zastosować do badań sygnalizacji adhezji w limfocytach T po leczeniu substancjami hamującymi lub stymulującymi. Ponadto test ten można rozszerzyć poza sygnalizację limfocytów T na dowolną populację leukocytów adhezyjnych i dowolną parę cząsteczek adhezyjnych integryny.

Wprowadzenie

T pośredniczy w wielu różnych procesach w zdrowym układzie odpornościowym,3 odgrywając kluczową rolę w transporcie limfocytów T i prezentacji antygenu. Niezależnie od tego, czy chodzi o nadzór immunologiczny, czy aktywną odpowiedź immunologiczną, te dwie szerokie role adhezji mają kluczowe znaczenie. 4 Fizjologiczne zdarzenia sygnalizacyjne interakcji limfocytów T ze śródbłonkiem różnią się od interakcji limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC) i dlatego wymagają odrębnych metod badań, aby jak najlepiej zrozumieć zaangażowane kaskady sygnałowe. Mocne przyleganie limfocytów T do ściany naczynia krwionośnego podczas wynaczynienia limfocytów wymaga szybkiej i dynamicznej aktywacji integryny. Ścisła interakcja między integryną w stanie aktywnym a cząsteczkami adhezyjnymi wzdłuż śródbłonka prowadzi do adhezji odpornej na przepływ krwi, umożliwiając limfocytom T czołganie się po powierzchni w poszukiwaniu obszaru umożliwiającego przejście komórek. 5 Pełzanie limfocytu T dwukierunkowo wzdłuż ściany naczynia krwionośnego zależy od spolaryzowanej adhezji, z wyraźnym adhezyjnym przednim końcem limfocytu T. 6 Co najważniejsze, mocne przyleganie i transmigracja wymagają odporności na siłę ścinającą generowaną przez krążący przepływ krwi.

Podczas projektowania eksperymentów do badania adhezji limfocytów, należy zwrócić uwagę na konkretny bodziec, który nas interesuje. Podczas gdy aktywacja integryny jest powszechnym i krytycznym składnikiem wszystkich form adhezji limfocytów T, kaskady aktywacji mogą być unikalne za poszczególnymi receptorami i koreceptorami. Podobnie pary cząsteczek integryny i adhezji funkcjonują w wyspecjalizowanych mikrośrodowiskach i w określonych subpopulacjach. W ten sposób pary te mogą być regulowane w zupełnie inny sposób. Przedstawiony model idealnie nadaje się do badania kaskad sygnalizacyjnych prowadzących do aktywacji integryny zachodzącej w warunkach naprężeń ścinających. 7 Oddziaływania te nie mogą być odpowiednio zrozumiane w statycznym systemie adhezyjnym ze względu na wpływ, jaki siły te mają bezpośrednio na zachowanie limfocytów T. 8 Chociaż przedstawiono tutaj limfocyty T i komórki CHO (jajnik chomika chińskiego) zmodyfikowane do ekspresji ludzkiego ICAM-1 (komórki CHO-ICAM), system można łatwo zmodyfikować w celu badania różnych populacji leukocytów lub cząsteczek adhezyjnych.

Ten test dostarcza metody ilościowego określania adhezji limfocytów T i aktywacji integryny za pomocą naprężenia ścinającego, dostarczając model dla etapu mocnej adhezji wynaczynienia leukocytów. Dzięki zastosowaniu komórek CHO-ICAM można badać powinowactwo LFA-1 do jego liganda w żywych komórkach w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na różne bodźce będące przedmiotem zainteresowania. Technika ta wymaga łatwo dostępnych, dostępnych na rynku komór mikroprzepływowych w połączeniu z pompą strzykawkową, co znacznie upraszcza sprzęt niezbędny do modelowania przepływu krwi i naprężeń ścinających w porównaniu z innymi modelami. 9 Kolejną ważną zaletą tego testu jest to, że specyficzne kaskady sygnałowe i wynikający z nich stan aktywacji poszczególnych integryn można czysto badać za pomocą zmodyfikowanych komórek CHO wyrażających interesujące nas ludzkie cząsteczki adhezyjne. Dodatkowo istotną zaletą tej metody jest połączenie danych ilościowych z obrazowaniem żywych komórek. Ogólnie rzecz biorąc, chociaż opisano szereg testów statycznej adhezji limfocytów T, które ładnie modelują interakcje limfocytów T z APC, modele te są niewystarczające do uchwycenia dynamicznego procesu adhezji nabłonka limfocytów T. Z tego powodu przy wyborze testu adhezyjnego należy wziąć pod uwagę dany bodziec.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Posiewanie komórek CHO-ICAM

Uwaga: Celem tego etapu jest umieszczenie komórek CHO-ICAM w komorach przepływowych w celu wzrostu przez noc w celu wytworzenia zlewającej się monowarstwy.

  1. Komórki CHO-ICAM należy utrzymywać w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych poddanych kulturze tkankowej w 10 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (kompletne pożywki hodowlane CHO-ICAM) w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  2. Aby zebrać komórki, dodaj 1 ml 0,5% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę z delikatnym wstrząsaniem. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 4 ml pożywki.
  3. Policz komórki CHO-ICAM za pomocą hemacytometru i oblicz 0,75 x 105 komórek na komorę. Uwaga: W tym eksperymencie: 2,25 x 105 komórek będzie potrzebnych do zasiania 3 komór.
  4. Odwirować 0,75 x 105 komórek CHO-ICAM w komorze przez 5 minut przy 500 x g, temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 30 μl na komorę kompletnej pożywki hodowlanej CHO-ICAM.
    Uwaga: W tym eksperymencie 90 μl będzie potrzebne do zasiania 3 komór.
  5. Powoli wsypuj ogniwa do jednego zbiornika komory przepływowej. Pozostawić komórki na 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. Dodać 200 μl kompletnych pożywek hodowlanych do dwóch zbiorników każdej komory. Naprzemiennie dodawaj między nimi, aby uniknąć ruchu komórek w miarę równowagi systemu.
  7. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

2. Przygotowanie limfocytów T

Uwaga: Ten test można wykonać na pierwotnych ludzkich limfocytach T lub linii komórek T. Protokół izolacji limfocytów T z krwi został opisany wcześniej. 10 Jeśli używasz pierwotnych ludzkich limfocytów T, użyj świeżo wyizolowanych komórek, aby uzyskać najlepsze wyniki. Jeśli używasz linii komórek T, postępuj zgodnie z protokołem hodowli określonym przez źródło komórek. W celu wykrycia komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, limfocyty T znakuje się estrem sukcynimidylu karboksylowo-fluoresceinowym (CFSE).

  1. Policz limfocyty T za pomocą hemacytometru i oblicz 2 x 106 komórek na komorę. Uwaga: W tym eksperymencie 6 x 106 komórek będzie potrzebnych na 3 komory.
  2. Odwirować 2 x 106 limfocytów T na komorę przez 5 minut w temperaturze 500 x g i ponownie zawiesić komórki w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% glukozy lub 2% FBS.
  3. Dodać CFSE w rozcieńczeniu 1:1,000 (zapas do 5 mM). Przykryć przed światłem i inkubować przez 8 minut w temperaturze pokojowej
  4. Wirować z prędkością 500 x g przez 5 minut, RT.
  5. Zawiesić osad komórkowy z 240 μl na warunek (patrz sekcja 4 "Uwaga") pożywki RPMI pozbawionej surowicy. W tym eksperymencie ponownie zawieś osad ogniwa w 720 μl zwykłego RPMI. Podziel komórki na puste probówki o pojemności 1,5 ml oznaczone dla każdej komory, po 240 μl na probówkę. Przechowuj komórki w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C do czasu użycia.

3. Konfiguracja pompy przewożącej i strzykawkowej wejścia/wyjścia

  1. Ogrzać komorę obrazowania na żywo mikroskopu do 37 °C.
  2. Przygotuj wąż wejściowy:
    1. Napełnij szklaną butelkę o pojemności 500 ml wodą i zrób 2 otwory w pokrywce. Oznacz otwory "do wewnątrz" i "na zewnątrz". Będzie to działać jak łaźnia wodna do podgrzewania dla mediów wejściowych.
    2. Przeprowadź wąż wejściowy przez otwory w pokrywie i do łaźni wodnej. Upewnij się, że strona węża, która łączy się ze strzykawką, przechodzi przez otwór "wejściowy", a strona, która będzie łączyć się ze zbiornikiem wejściowym, przechodzi przez otwór "wyjściowy".
    3. Przepłukać wąż wejściowy 60 ml wody, aby usunąć powietrze z systemu.
    4. Zalać wąż wejściowy pożywką RPMI bez surowicy podgrzanej do 37 °C. Napełnić strzykawkę o pojemności 60 ml i przepchnąć przez nią pożywkę, aż wąż zostanie całkowicie zalany i nie będzie w nim pęcherzyków powietrza.
      Uwaga: W zależności od długości użytych przewodów, objętość wymagana do zalania będzie się różnić.
      1. Oblicz objętość pożywki potrzebną do eksperymentu, mnożąc natężenie przepływu (tutaj 0,3 ml/min) przez liczbę minut (5 min) przez liczbę komór w doświadczeniu (tutaj 3); w tym doświadczeniu użyj pożywki o objętości 4,5 ml. Uwaga: Zalecamy, aby po zalaniu w strzykawce pozostało 5 ml dodatkowej objętości (w tym przypadku łącznie 9,5 ml).
    5. Umieść cały zestaw wejściowy w obudowie mikroskopu do obrazowania na żywo, aby utrzymać temperaturę 37 °C. Wyprowadzić wąż i strzykawkę z obudowy i załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej.
  3. Przygotuj wąż wyjściowy:
    1. Zrób otwór w wieczku butelki o pojemności 250 ml, aby wykorzystać go jako odpad wyjściowy.
    2. Przeprowadź rurkę wyjściową przez otwór i do butelki. Luźno zabezpiecz pokrywę, nie zamykając się do końca.
    3. Umieść zestaw wyjściowy w obudowie do obrazowania na żywo mikroskopu.
  4. Obliczyć natężenie przepływu (ml/min) niezbędne do wytworzenia pożądanego naprężenia ścinającego (dyn/cm2). Naprężenie ścinające różni się w różnych przedziałach naczyniowych, dlatego przy podejmowaniu decyzji o poziomie naprężenia ścinającego należy wziąć pod uwagę ogólny model, w tym typy komórek, które mają być badane, oraz metody leczenia.
    Uwaga: Eksperymenty te przeprowadza się przy 0,4 dyn/cm2, aby ściśle naśladować ustawienie małej żyły.
    1. Przy obliczaniu naprężenia ścinającego należy uwzględnić wymiary komory. Dla zastosowanych tutaj komór przepływowych należy zastosować następujący wzór (dostarczony przez producenta11) (patrz tabela materiałów): T = η * 176,1 * ø, gdzie T = naprężenie ścinające, η = lepkość dynamiczna, ø = natężenie przepływu. Uwaga: Lepkość dynamiczna mediów RPMI w temperaturze 37 °C wynosi 0,007.

4. Ładowanie komór przepływowych i stymulacja komórek

Uwaga: Aby zainicjować adhezję, limfocyty T muszą być stymulowane. W poniższym eksperymencie komórki albo pozostaną niestymulowane, albo są stymulowane SDF-1α12 lub octanem mirystynianu forbolu (PMA; kontrola pozytywna)13. W celu prawidłowej prezentacji chemokiny limfocytom T, komórki CHO-ICAM są wstępnie inkubowane z SDF-1α (po czym następuje seryjne płukanie), co pozwala na prezentację na powierzchni komórki. PMA jest estrem forbolu, który jest strukturalnie podobny do drugiego przekaźnika diacyloglicerolu (DAG); Tutaj jest używany jako kontrola pozytywna. Limfocyty T są bezpośrednio traktowane PMA przed załadowaniem do komory przepływowej.

  1. Umieść szkiełko z komorą przepływową na mikroskopie i ustaw płaszczyznę ogniskową na monowarstwie CHO-ICAM za pomocą obiektywu 20X.
  2. Utrzymuj limfocyty T barwione CFSE dla wszystkich innych warunków w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. Przygotować limfocyty CHO-ICAM lub T w następujący sposób bezpośrednio przed testem dla tego stanu:
    1. W stanie niestymulowanym (komora 1) należy trzymać jedną rurkę/komorę przepływową nieleczoną, aby służyła jako negatywna kontrola stymulacji.
    2. W przypadku stymulacji PMA (komora 2) należy stymulować jedną rurkę limfocytów T PMA (10 ng / ml), aby służyła jako kontrola pozytywna; leczyć bezpośrednio przed załadowaniem do komory przepływowej.
    3. W przypadku stymulacji SDF-1α (komora 3) należy stymulować trzecią komorę przepływu SDF-1α (100 ng / ml), usuwając jednorazowo 70 μl 3 razy z górnego zbiornika (zbiornika wyjściowego), a następnie dodając 70 μl SDF-1α (100 ng / ml) do dolnego zbiornika (zbiornika wejściowego). Inkubować przez 5 minut.
  3. Wyjąć i wyrzucić jednorazowo 30 μl ze zbiornika wyjściowego jednej komory.
  4. Dodać 70 μl wstępnie poddanej obróbce (w stosownych przypadkach) zawiesiny limfocytów T do zbiornika wejściowego 3 razy. Odczekaj 5 minut, aby komórki mogły przesunąć się z wlotu komory ("In") i dotrzeć do bliższego wylotu ("Out") komory.
  5. W tym czasie zobrazuj 5 pól dla limfocytów T barwionych CFSE. Wybierz pola, które są rozproszone po środku komory (Rysunek 1). Stosować następujące warunki wzbudzenia/emisji: długość fali lasera wzbudzenia: 488 nm; Filtr zbierający emisje: 500 - 540 nm. Obrazy te będą służyć jako zliczanie komórek przed przepływem.
  6. Podłącz jednocześnie rurkę wejściową i wyjściową do zbiorników komory przepływowej.
    Uwaga: Jednoczesne podłączenie rurki ma kluczowe znaczenie, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do komory i utrzymać ogólną równowagę w komorze.
  7. Rozpocznij przepływ od 0,3 ml/min (0,4 dyn/cm2), wizualizując limfocyty T barwione CFSE. Gdy zaczyna się przepływ, zwłaszcza w pierwszej komorze, często występuje opóźnienie między zainicjowaniem przepływu a obserwacją toczenia się limfocytów T, dlatego rozpocznij czas 5 minut na początku ruchu limfocytów T.
  8. Zakończ przepływ po 5 minutach i zobrazuj 5 pól w kanale CFSE. Wybierz pola losowo rozproszone w środku komory przepływowej (rysunek 1). Obrazy te będą służyć jako zliczanie komórek po przepływie.

5. Określanie procentu przylegających komórek

Uwaga: Określenie liczby komórek w pozyskanych obrazach odbywa się obiektywnie za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania. Do naszych badań użyliśmy oprogramowania Volocity (wersja 6.2.1), ale zastosowanie ma również inne oprogramowanie, takie jak ImageJ (wersja 1.48V).

  1. Określ liczbę komórek na pole przepływu wstępnego dla każdego warunku. Średnia z 5 pól to "średnia liczba komórek przed przepływem". 7
  2. Określ liczbę komórek na pole po przepływie dla każdego warunku. Średnia z 5 pól to "średnia liczba komórek po przepływie"7
    3. .
  3. Oblicz procent przylegających komórek, korzystając z następującego wzoru: Procent przylegających komórek = (średnia liczba komórek po przepływie)/(średnia liczba komórek przed przepływem) x 100%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywne wyniki testu adhezji w przepływie z wykorzystaniem komórek Jurkat oraz pierwotnych ludzkich limfocytów T CD3+, zgodnie z oznaczeniem, stymulowanych SDF-1α. Kontrolami negatywnymi we wszystkich pokazanych eksperymentach są komórki niestymulowane. Progowy podstawowy procent adhezji komórek niestymulowanych wynosi od 5 do 10%; adhezja podstawowa znacznie przekraczająca ten zakres wskazuje na problematyczny przebieg eksperymentu i sugeruje, że populacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby prawidłowo przeanalizować adhezję limfocytów T, przy wyborze metody in vitro należy wziąć pod uwagę stymulant, który ma zostać włączony do badania. Chociaż istnieje kilka testów do badania sygnałów prowadzących do aktywacji LFA-1 i wiązania ICAM-1, wszystkie metody nie są wymienne. Statyczny test adhezji10 najlepiej nadaje się do badania interakcji limfocytów T z APC; alternatywnie, opisana tutaj metoda naprężeń ścinających jest idealna do modelowania interakcji komórek T - komórek nabłonkowych. <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Fundacja Badań Reumatologicznych i Hirschil Trust wsparły tę pracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Próbki limfocytów T (linia komórkowa lub pierwotna)ATCCTIB-152Obwodowe ludzkie limfocyty T
Komórki CHO-ICAM-1ATCCCRL-2093
µ-Slide VI 0,4 ibiTreatibidi80606
500 ml szklana butelkaFisherFB800500
250 mlFisherFB800250
Silikon rurka 0,8 mmibidi10841
Mikroskop konfokalny z komorą inkubatoraZiess700Dowolny mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu
widzenia Pompa strzykawkowaNew Era Pump SystemsNE-300
60 ml strzykawkaBD309653
CFSEeBioscience65-0850
SDF-1αR& D350-NS-010/CF
RPMILonza12-702F/12
PBS Wirówka mikrowirowa Lonza17-516F
Eppendorf 5424
D-GlucoseSigma AldrichG8270 
PMASigma Aldrich16561-29-8
Oprogramowanie VolocityPerkin ElmerWersja 6.2.1
Oprogramowanie ImageJNIH Wersja 1.48V
Naczynia hodowlane poddane kulturom tkankowymFalcon353003
Trypsin-EDTA (0,25%) Czerwień fenolowaGibco25200114
Inaktywowany termicznie FBSDenvilleFB5001-H
Penicylina/StreptomycynaFisher BP295950

Bibliografia

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
  4. Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
  5. Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
  6. Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
  7. Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
  8. Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
  9. Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
  10. Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
  11. Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
  12. van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
  13. Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
  14. Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
  15. Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
  16. Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  17. Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza napr enia cinaj cegosystem komory przep ywowejaktywacja integrynadhezja kom rek w przep ywiekom rki CHO ICAMznakowanie CFSEstymulacja PMASDF 1 alfaobrazowanie w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły