Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) są obiecującymi kandydatami do zastosowania w terapiach komórkowych. W większości przypadków odpowiedź terapeutyczna wydaje się być zależna od dawki komórkowej. Ludzkie łożysko donoszone jest bogate w MSC i jest fizycznie dużą tkanką, która jest zwykle wyrzucana po urodzeniu. Łożysko jest idealnym materiałem wyjściowym do produkcji na dużą skalę wielokomórkowych dawek allogenicznego MSC. Łożysko jest narządem płodu-matki, z którego można wyizolować tkankę płodową lub matczyną. W tym artykule opisano anatomię łożyska i procedurę rozwarstwiania tkanki decidua (matczynej), kosmków kosmówkowych (płodowych) i płytki kosmówkowej (płodowej). Protokół następnie określa, w jaki sposób wyizolować MSC z każdego wypreparowanego regionu tkanki i zapewnia reprezentatywną analizę rozszerzonego MSC pochodzącego z odpowiednich typów tkanek. Metody te są przeznaczone do przedklinicznej izolacji MSC, ale zostały również przystosowane do klinicznego wytwarzania łożyskowego MSC do stosowania terapeutycznego u ludzi.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) stają się obiecującym kandydatem do zastosowania w terapiach komórkowych ¹. Wydaje się, że większość aplikacji jest ukierunkowana na naprawę tkanek za pośrednictwem MSC lub regulację immunologiczną ². W wielu z tych zastosowań allogeniczny MSC może być równie skuteczny jak autologiczny MSC ³. Zastosowanie allogenicznego MSC ma tę zaletę ekonomiczną, że jest kompatybilne z produkcją na dużą skalę wielu dawek komórkowych z jednej tkanki źródłowej ⁴ w celu leczenia wielu pacjentów.

Historycznie, badania przedkliniczne i kliniczne wykorzystywały MSC pochodzące ze szpiku kostnego ⁴. Szpik kostny jest zwykle pobierany z grzebienia biodrowego dawcy ochotnika. Proces ten jest inwazyjny i tylko niewielka objętość szpiku (~20 ml) jest pobierana przez pojedyncze nakłucie. Wygenerowanie klinicznie znaczącej liczby MSC wymaga rozległej ekspansji in vitro. Potencja komórek zmniejsza się wraz z pasażem numer ³, tworząc paradoks, w którym teoretyczna liczba komórek wymagana do skuteczności klinicznej jest tym większa, im bardziej rozszerza się populacja komórek. W przeciwieństwie do aspiratów szpiku kostnego, łożysko donoszone jest fizycznie dużą tkanką wyjściową (zwykle 500-750 g ⁴), którą można pobrać w sposób aseptyczny podczas cesarskiego cięcia bez ryzyka dla dawcy. MSC pochodzące z łożyska mają długotrwałą proliferację ⁵ i zdolność immunomodulacyjną ⁶, przewyższając MSC pochodzące ze szpiku kostnego. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że łożysko z pojedynczą terminologią zawierało wystarczającą ilość MSC do wytworzenia do 7 000 dawek klinicznych ⁴. Te cechy sprawiają, że łożysko jest idealną tkanką źródłową do produkcji allogenicznego MSC.

Łożysko to narząd płodowo-matczyny składający się zarówno z tkanki płodu^{, jak} i matki7, a zatem MSC pochodzenia płodowego lub matczynego może być teoretycznie izolowany. Poniższe piśmiennictwo zawiera szczegółowe informacje na temat rozwoju i patologii, a także badania mikroskopowego i makroskopowego ludzkiego łożyska i przydatków ^8,9. Łożysko właściwe składa się głównie z naczyń krwionośnych płodu oraz komórek wydzielniczych i podporowych zwanych trofoblastami, tworzących kosmki kosmówkowe pokryte kosmówką czołową (płytką) ⁸. Rozgałęzione kosmki łożyskowe są skąpane w matczynej krwi dostarczanej ze spiralnych tętnic macicy, umożliwiając wymianę składników odżywczych, hormonów i gazów między płodem a matką. Łożysko jest zakotwiczone w błonie śluzowej macicy za pośrednictwem matczynych komórek zrębu liściastego, a trofoblasty zewnątrzkosmkowe płodu są przeplatane w macierzy zewnątrzkomórkowej ⁸. Kosmki zbiegają się na płytce kosmówkowej płodu, gdzie tworzą pępowinę ⁸.

Wynikiem pierwszych Międzynarodowych Warsztatów na temat Komórek Macierzystych pochodzących z Łożyska (2008) było docenienie potrzeby standaryzacji izolacji i charakterystyki komórek z ludzkiego łożyska ¹⁰. Ze względu na anatomię łożyska, rozwarstwienie różnych tkanek, izolacja MSC i przewidywane wyniki hodowli mogą być przytłaczające dla nowicjuszy w tej dziedzinie. W tym protokole pobieranie tkanek kosmówkowych łożyska, a następnie izolacja i ekspansja MSC jest szczegółowo opisane. Charakterystyka MSC za pomocą cytometrii przepływowej i różnicowania in vitro jest uważana za rutynową ^5,11-13, a zatem tylko pokrótce opisana tutaj.

Jak podkreślono w niedawnym systematycznym przeglądzie literatury ¹⁴, MSC uzyskane z łożyskowych kosmków kosmówkowych są ogólnie uważane za płodowe. Chociaż tylko 18% badań dotyczyło pochodzenia uzyskanego MSC, a spośród nich tylko połowa badań dotyczyła MSC płodu, a druga połowa zgłaszała populacje matczyne lub mieszane MSC. Każdy z trzech opisanych tutaj składników tkankowych (kosmki kosmówkowe, płytka kosmówkowa i decidua basalis) składa się głównie z błony/kosmków płodu i niewielkiej części komórek matczynych pochodzących z macicy, które pozostają przyczepione do dostarczonego łożyska. Przedstawiamy dane wskazujące, że wyizolowanie MSC od matczynej strony łożyska, a nie od strony płodu łożyska, jak wcześniej informowaliśmy ^5,11, jest bardziej odpowiednim materiałem wyjściowym, jeśli pożądane jest MSC matki. Protokół ten opisuje również zastosowanie XY FISH do walidacji wkładu płodu lub matki w hodowle komórkowe. Chociaż jest to standardowy protokół producenta, analiza ta jest często zaniedbywana, a jej znaczenie niedoceniane ¹⁴.

Protokół

Komisje Etyczne ds. Badań Naukowych na Ludziach w Mater Health Services, Royal Brisbane and Women's Hospital, Queensland University of Technology i University of Queensland zatwierdziły badania i pobieranie próbek ludzkiego łożyska wykorzystanych w badaniu. Wszystkie protokoły były zgodne z krajowymi wytycznymi badawczymi. Pacjenci wyrazili świadomą pisemną zgodę na wykorzystanie tkanek do celów badawczych.

Łożyska w trzecim trymestrze ciąży uzyskano od zdrowych matek po rutynowych porodach przez cesarskie cięcie (CS) w terminie z wyżej wymienionych szpitali w Brisbane w Australii. W tym badaniu wykorzystano niezgodne ciąże męskie w próbkach donoszonych w celu odróżnienia komórek płodu od komórek matczynych. Płeć płodu została określona za pomocą badania ultrasonograficznego przed urodzeniem i/lub oględzin noworodka po urodzeniu przez personel kliniczny. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ chromosomów X i Y (FISH) została wykorzystana do dalszej walidacji płci i pochodzenia płodowego lub matczynego tkanki zachowanej z oryginalnych łożysk.

1. Przed zbiorem przygotuj następujące

Uwaga: Podczas sporządzania roztworów enzymatycznych należy przestrzegać szczegółowych wymagań i stężeń podanych przez producenta dla każdego produktu. Enzymy są często dostarczane jako surowa mieszanka białek, dlatego podobne enzymy różnych firm mogą mieć różne działania/stężenia. Z tego powodu należy zapoznać się z zaleceniami producenta i może być konieczne odpowiednie zmodyfikowanie przygotowania roztworu.

1. Przygotuj lub kup od 1,5 do 2 litrów całkowicie sterylnego roztworu soli Hanka (HBSS) dla tego protokołu.
2. Przygotować roztwór podstawowy kolagenazy I, odważając kolagenazę typu I i rozpuścić 1 mg/ml w HBSS i delikatnie odwirować, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Określić objętość HBSS (zawierającą wapń i magnez) potrzebną do doprowadzenia roztworu kolagenazy do 100 jednostek (U)/μl (1000x roztwór podstawowy), a następnie przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Porcję objętości 1 ml rozlać do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
3. Przygotować roztwór podstawowy dypazy, rozpuszczając niesterylną mieszaninę dyspazy w stężeniu 10 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco bez wapnia i magnezu. Dalej rozcieńczyć DPBS bez wapnia i magnezu do końcowego stężenia 2,4 U/ml. Filtr sterylizować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Podaniec objętość 1 ml w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
4. Przygotować roztwór podstawowy dezoksyrybonukleazy (DNazy)-I, rozpuszczając DNazę-I w stężeniu 10 mg/ml w 0,15 M NaCl. Przefiltruj przez filtr strzykawkowy 0,2 μm. Podaniec objętość 1 ml w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
5. Przygotować roboczy roztwór wytrawiający przez połączenie 100 j./ml kolagenazy typu I, I,5 μg/ml DNazy I i 2,4 μg/ml dypazy w DMEM bez surowicy. Świeżo rozmrozić i rozcieńczyć wywary enzymatyczne bezpośrednio przed użyciem. W przybliżeniu wymagany jest stosunek objętości roztworu trawiącego do objętości tkanki wynoszący 1:1 (np. 10 ml tkanki, odmierzonej w probówce o pojemności 50 ml, wymaga 10 ml roztworu wytrawiającego).
6. Przygotuj roztwór 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS i dostosuj do pH 7,4 ¹⁵. Przechowywać 25 ml porcji w temperaturze -20 °C przez długi czas lub w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
7. Przygotuj pożywkę hodowlaną MSC z DMEM-Low Glucose (DMEM-LG) uzupełnioną 1x roztworem antybiotykowym i przeciwgrzybiczym oraz 10% nieinaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą. FBS klasy MSC można kupić u wielu dostawców FBS.
8. Autoklaw sterylizuje sprzęt do preparacji z wyprzedzeniem zgodnie z wytycznymi instytucji. Należą do nich nożyczki, kleszcze, skalpele i duża metalowa taca do sekcji. Zebrać dodatkowe sterylne naczynia z tworzyw sztucznych do hodowli tkankowych i materiały eksploatacyjne (np. ostrza skalpela, probówki o pojemności 50 ml i 15 ml, pipety o pojemności 25 ml, 10 ml i 5 ml oraz kolby do hodowli komórkowych^{o długości 75} lub 175 cm2).
9. Stosować standardowy sprzęt laboratoryjny do pierwotnych hodowli komórkowych: komorę bezpieczeństwa biologicznego klasy II odpowiednią do pierwotnej izolacji komórek, inkubator do hodowli komórkowych ustawiony na 5 % CO₂ i temperaturze 37 °C, kołyskę w inkubatorze o temperaturze 37 °C oraz wirówkę o pojemności probówek 50 ml.
10. Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej: fartuch laboratoryjny, 2 pary rękawic (przez cały czas), okulary ochronne i obuwie z zakrytymi palcami zgodnie z wytycznymi instytucji.
11. Przygotuj z wyprzedzeniem odpowiednie roztwory odkażające dla próbek krwi ludzkiej zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i pojemnikami na płynne odpady biologiczne.

2. Izolacja łożyska MSC

1. Przygotowanie łożyska
   1. Ubierz się w wymagane środki ochrony osobistej. Ustawić komorę bezpieczeństwa biologicznego z wymaganymi materiałami, roztworami i pojemnikami na odpady w celu przeprowadzenia procedury aż do mineralizacji enzymatycznej (sekcja 2.5.6).
   2. Uzyskaj łożysko za świadomą zgodą i aprobatą etyczną. Pobrać łożysko przez cesarskie cięcie w aseptycznych warunkach chirurgicznych i zapakować w sterylną torbę lub wiadro do transportu do laboratorium.
   3. Podczas transportu i przed sekcją łożysko należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
      Uwaga: Tkanka może być przechowywana do 6 godzin bez wpływu na wydajność hodowli komórkowych.
      1. Tam, gdzie to możliwe, należy ograniczyć czas między pobraniem łożyska a przetworzeniem tkanki. Zalecenie to opiera się na kwestiach praktycznych. W niektórych przypadkach opóźniliśmy proces izolacji komórek nawet o 6 godzin po urodzeniu. W takich przypadkach łożyska były przechowywane w temperaturze pokojowej lub 4 °C (w laboratorium lub w punkcie pobierania nabrań). Nie zaobserwowano żadnych wykrywalnych różnic, poza ogólną zmiennością dawcy, w MSC uzyskanym z łożysk, gdy były one przechowywane w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej.
   4. Umieścić pojemnik z łożyskiem w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz pojemnik i przenieś łożysko do sterylnej tacy.
   5. Otworzyć błony płodowe (worek owodniowy lub laeve owodniowo-kosmówkowe) ⁸. Orientuj się w częściach łożyska. Po stronie płodu znajduje się pępowina, która na ogół jest centralnie umieszczona w łożysku. Strona matczyna (wyłożona decidua basalis), która jest przeciwna do strony płodu, ma wyraźne liścienie (lub płaty).
   6. Aby rozpocząć preparację, ułóż łożysko tak, aby pępowina była skierowana do góry w sterylnej tacy.
      Uwaga: Protokół ten ma na celu uzyskanie wystarczającej liczby komórek do wysiewu do jednej kolby T175 z każdego z trzech typów tkanek. Każde trawienie rozpoczyna się od około 10 g tkanki. Jest to podobna liczba początkowa kolb, jak w przypadku hodowli MSC rozpoczętych z 20 ml aspiratu szpiku kostnego. Jeśli pożądanych jest więcej komórek, można pobrać więcej tkanki, a protokół można skalować liniowo. Rozmiary tkanki, które mają zostać pobrane, wskazują jedynie na to, co jest praktyczne w przypadku tkanki łożyska. W kosmkach łożyskowych jest kilka cech charakterystycznych, które można wykorzystać jako punkt odniesienia. Wskazane wymiary służą jako szacunkowe, a pępowina służy jako punkt orientacyjny na powierzchni płodu.
2. Rozwarstwienie tkanki dziesiętnej (D)
   1. Odwróć łożysko tak, aby powierzchnia matczyna (decidua basalis) była skierowana do góry. Upewnij się, że strona płodu z punktem wprowadzenia pępowiny jest skierowana w dół.
   2. Wytnij kawałki o grubości 0,5 cm od matczynej strony łożyska (zawierające tkankę decidua basalis).
   3. Umieść kawałki tkanek na szalce Petriego zawierającej HBSS podczas sekcji, aby utrzymać nawodnienie fragmentów tkanki.
   4. Przenieść wystarczającą ilość tkanki do napełnienia probówki do oznaczenia 10 ml w probówce o pojemności 50 ml (jest to około 10 g tkanki).
3. Rozwarstwienie tkanki płytki kosmówkowej (CP)
   1. Mechanicznie usunąć błonę owodniową z płodowej powierzchni łożyska (nie z worka owodniowego), pozostawiając nienaruszony liść kosmówkowy (płytkę kosmówkową).
   2. Wytnij kawałki o szerokości ~1 cm i głębokości 0,5 cm od płytki kosmówkowej. Zbierz płytkę kosmówkową z obszaru najbliższego pępowinowi, z dala od krawędzi łożyska.
   3. Umieść kawałki tkanek na szalce Petriego zawierającej HBSS podczas sekcji, aby utrzymać je nawodnione.
   4. Przenieś wystarczającą ilość tkanki, aby wypełnić probówkę o pojemności 50 ml do oznaczenia 10 ml (~10 g tkanki).
4. Rozwarstwienie tkanki kosmówki kosmówkowej (CV)
   1. Wypreparować tkankę CV ~1 cm o wymiarach² x 0,5-1 cm głębokości z tkanki łożyska, z której CP został już usunięty. Ponownie zbierz CV z obszaru najbliższego pępowinowi, z dala od krawędzi łożyska. Staraj się zachować co najmniej 1 cm odległości od matczynej strony łożyska (zawierającej tkankę decidua basalis); Celem jest pobranie tkanki z wnętrza tkanki kosmków łożyskowych.
   2. Umieść kawałki tkanek na szalce Petriego zawierającej HBSS podczas sekcji, aby utrzymać ich nawodnienie.
   3. Przenieś wystarczającą ilość tkanki, aby wypełnić probówkę o pojemności 50 ml do oznaczenia 10 ml (~10 g tkanki).
5. Mielenie i trawienie enzymatyczne tkanek łożyska D, CP i CV
   1. Ponieważ w trzech różnych probówkach o pojemności 50 ml znajduje się ~10 g tkanek D, CP lub CV, napełnij każdą probówkę około 40 ml HBSS i kilkakrotnie odwróć probówkę w celu umycia tkanki (powtarzaj przez ~10 sekund).
   2. Zdekantować supernatant i powtórzyć ten etap płukania 2-3 razy, aż roztwór będzie w dużej mierze wolny od krwi. Użyj pipety o pojemności 10 ml lub długiej pęsety, aby upewnić się, że kawałki tkanki nie zostaną utracone z probówki (probówek) podczas dekantacji supernatantu.
   3. Umieść kawałki tkanki na 10-centymetrowej szalce Petriego przy minimalnym przenoszeniu płynu. Posiekaj/zmiel tkankę na drobne kawałki o grubości około 1-5 mm³ za pomocą nożyczek lub żyletki.
   4. Przenieść zmielone tkanki z powrotem do odpowiednio oznakowanych (D, CP lub CV) probówek o pojemności 50 ml.
   5. Dodać świeżo przygotowaną pożywkę trawienną w stosunku co najmniej 1:1 z tkanką (np. 10 ml tkanki plus 10 ml pożywki trawiennej). Załóż nakrętkę na każdą probówkę i odwróć probówki kilka razy, aby wymieszać.
   6. Inkubować tkanki w probówkach z pożywką trawiącą przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C. Na tym etapie nie jest konieczna nawilżona atmosfera i 5%_CO2.
      Uwaga: Szybkie wstrząsanie jest wymagane w celu skutecznego oddzielenia komórek od tkanki i maksymalizacji wydajności MSC. Ograniczony plon będzie widoczny w przypadku bardzo małej liczby komórek przyłączonych do kolby hodowlanej po 48 godzinach i czasie pierwszego pasażu dłuższym niż 1-2 tygodnie. Czas inkubacji i metoda wytrząsania zależą od inkubatora o temperaturze 37 °C dostępnego w laboratorium i mogą wymagać optymalizacji.
      1. W przypadku inkubatora z szybkim i kontrolowanym mechanizmem wytrząsania, należy umieścić tkankę i pożywkę trawiącą w probówce o pojemności 50 ml lub sterylnej kolbie stożkowej, umieścić w inkubatorze i ustawić prędkość wytrząsania na 250 obr./min. Spowoduje to pełne strawienie tkanki w ciągu 1 godziny.
      2. Alternatywnie, w przypadku inkubatora z delikatnym mechanizmem kołysania lub bez mechanizmu kołysania, ręcznie potrząsaj rurką szybko i energicznie ręcznie przez 10 sekund co 30 minut przez 1,5 do 2 godzin. Okres inkubacji enzymów to odpowiedni czas na wyrzucenie odpadów, oczyszczenie szafy bezpieczeństwa biologicznego z niepotrzebnych przedmiotów, zmianę fartucha laboratoryjnego, jeśli jest zabrudzony i przygotowanie się do kolejnej części procedury.
6. Pobieranie komórek jednojądrzastych i posiewanie do kolb
   Uwaga: Z poprzedniego kroku są trzy probówki o pojemności 50 ml (D, CP lub CV) z kawałkami tkanek trawiących. Kiedy roztwór trawienia tkankowego rozwija mętny wygląd, a w tkance widoczne są białe naczynia krwionośne, trawienie jest zakończone.
   1. Dodać 30 ml pożywki MSC zawierającej FBS do każdej probówki w celu dezaktywacji enzymów zawartych w roztworze wytrawiającym.
   2. Aby oddzielić komórki jednojądrzaste od dużych, niestrawionych szczątków, należy odwirować pulsacyjnie probówkę o pojemności 50 ml. Na krótko pozwól wirówce osiągnąć 340 x g przez 5 sekund, a następnie zatrzymaj się. Zmusi to duże zanieczyszczenia do osadzania się na dnie probówki, pozostawiając komórki jednojądrzaste w płynnej zawiesinie.
      Uwaga: Komórki jednojądrzaste pozostaną w fazie ciekłej, jeśli probówka zostanie tylko krótko (pulsacyjnie) odwirowana. Jeśli wirowanie zostanie przedłużone, komórki jednojądrzaste również osadzą się na dnie probówki z kawałkami tkanki, powodując niepożądaną utratę komórek.
   3. Zebrać supernatant zawierający komórki jednojądrzaste i przenieść go do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety.
   4. Dodać 30 ml pożywki lub HBSS do pozostałych resztek tkanki łożyska i energicznie wstrząsnąć. Pozwoli to na zawieszenie pozostałych oderwanych komórek jednojądrzastych i umożliwi ponowne pobranie przypuszczalnego MSC z tkanki.
   5. Pulsacyjnie odwirować probówkę po raz drugi i ponownie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml. Powtórz ten krok po raz trzeci, aby zmaksymalizować wydajność zbierania komórek jednojądrzastych z każdego źródła tkanki.
   6. Zebrać supernatanty z każdego z poszczególnych typów tkanek w dwóch probówkach o pojemności 50 ml. Daje to w sumie 6 probówek (po 2 probówki z każdego D, CP i CV). Wirować każdą probówkę przez 5 minut przy 340 x g. Ten krok spowoduje osadzenie komórek jednojądrzastych na dnie probówek.
   7. Ostrożnie zdekantować lub odpipetować supernatant do odpadów. Nie ma potrzeby usuwania każdej kropli supernatantu.
      Uwaga: Osad komórkowy będzie kruchy z powodu dużej liczby czerwonych krwinek. Uważaj, aby przypadkowo nie wyrzucić granulatu, jeśli dekantujesz bezpośrednio z probówki o pojemności 50 ml.
   8. Po usunięciu większości supernatantu delikatnie przesunąć probówkę kilka razy palcem, aby usunąć osad komórkowy. Połączyć granulki tak, aby na każdą tkankę D, CP lub CV przypadała pojedyncza probówka i ponownie zawiesić je w 35 ml pożywki MSC.
   9. Opcjonalnie: Przefiltrować frakcję jednojądrzastą przez sitko o siatkowej siatce 100 μm umieszczone w probówce o pojemności 50 ml w celu usunięcia grudek komórek lub materiału włóknistego.
      Uwaga: Należy zachować ostrożność, ponieważ filtry mogą się łatwo zapychać i przepełniać. Dodatkowo pęcherzyki powietrza mogą utrudniać opróżnianie filtrów. W takim przypadku powoli wyjmij filtr z rurki, aby umożliwić przepływ powietrza pod filtrem, przemyj filtr pożywką do hodowli komórkowych lub wymień na nowy filtr. Wydaje się, że wyłączenie etapu filtracji nie wpływa na wydajność ani jakość kolejnych kultur MSC.
      1. Opcjonalnie na tym etapie można przeprowadzić lizę krwinek czerwonych (RBC) lub wirowanie w gradiacji gęstości ¹⁵. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że erytrocyty nie zakłócają przyłączania się ani proliferacji MSC, a zatem liza RBC nie jest konieczna. Komórki jednojądrzaste można by policzyć na tym etapie, gdyby przeprowadzono usunięcie RBC ¹⁵. Chociaż zdecydowana większość komórek na tym etapie nie będzie MSC, ale będą trofoblastami pochodzenia płodowego, komórkami śródbłonka i komórkami krwiotwórczymi, a także komórkami krwiotwórczymi pochodzenia matczynego i komórkami zrębu dziesiętnego.
   10. Przenieść zawiesinę komórkową dla każdej tkanki D, CP lub CV do pojedynczej kolby T175 i wyhodować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
7. Ekspansja komórki po izolacji
   1. Po upływie 48 godzin od początkowej izolacji usunąć pożywkę z każdej z kolb (D, CP i CV) i zastąpić ją 35 ml świeżej pożywki MSC. Zużyte podłoże i oderwane komórki można wyrzucić, ponieważ przypuszcza się, że przypuszczalne MSC są przyłączone do kolby do hodowli tkankowej ¹⁶. Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze na kolejne 24 godziny.
   2. Po dodatkowych 24 godzinach hodowli przemyć kolby dwukrotnie DPBS (25 ml) w celu usunięcia zanieczyszczeń i erytrocytów. Zamieszać płyn wokół dna kolby, aby usunąć erytrocyty. Użyj pipety, aby usunąć płyn i zanieczyszczenia. Dodać 35 ml pożywki MSC do kolb i umieścić kolby z powrotem w inkubatorze.
   3. Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu i inkubuj kultury, aż monowarstwy komórek zlewają się w 80-90%. Ta początkowa ekspansja trwa od 4 do 14 dni, w zależności od jakości tkanki, ilości materiału wyjściowego oraz wydajności i czasu inkubacji z roztworem trawiącym.

3. Subkultura pMSCs

1. Gdy kultury są w 80-90% zlewne, przemyj dwukrotnie 20 ml 1x HBSS lub DPBS i wyrzuć mycie. Dodać substytut trypsyny do każdej kolby (tj. użyć 5 ml dla kolby T175).
2. Inkubować kolby przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu uwolnienia MSC z powierzchni hodowli tkankowej. Postukaj w boki kolby co ~2 minuty, aby ułatwić odłączenie.
3. Po oderwaniu komórek od powierzchni i umieszczeniu ich w zawiesinie pojedynczej komórki, należy je przemyć z kolby pożywką MSC i zebrać komórki w probówkach. Pożywka MSC rozcieńczy i dezaktywuje substytut trypsyny (użyć ~15 ml pożywki MSC na kolbę T175).
4. Przenieść zawartość każdej kolby do hodowli tkankowej do probówki o pojemności 50 ml.
5. Odwiruj probówki o masie 340 x g przez 5 minut, aby granulować komórki.
6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 1 ml pożywki MSC.
7. Rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek w 10 μl błękitu trypanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz całkowitą liczbę komórek ¹⁵.
8. Przenieść komórki do nowych kolb w ilości 1 150 komórek/^cm2 w świeżych pożywkach MSC i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych. Przy tej gęstości wysiewu wysiewaj 200 000 MSC do każdej nowej kolby T175 w 35 ml pożywki MSC. Odżywiaj komórki dwa razy w tygodniu, aż do 80-90% zlewania się. Wysiewać kolejne pasaże przy 1 150 komórkach/^cm2 lub 200 000 MSC do każdej kolby T175.
9. Gdy komórki Pasażu 1 (P1) lub P2 zlewają się, należy zakonserwować większość komórek do wykorzystania w przyszłości i ponownie zasadzić tylko jedną kolbę T175 w celu dalszej propagacji i charakteryzacji. Rozmnożone komórki można wykorzystać w P3 lub P4 do testów różnicowania mezodermalnego i charakterystyki komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
   Uwaga: We wczesnych pasażach może być bardzo mało słabo oddzielonych kolonii, ale lokalne zagęszczenie komórek w każdej kolonii może być bardzo wysokie. Nie jest to idealne rozwiązanie, ponieważ miejscowe gęste upakowanie komórek spowoduje zahamowanie kontaktu, opóźniając wzrost i zmniejszając wydajność hodowli. Zalecamy, aby w przypadku zaobserwowania gęstych kolonii komórki zostały zebrane i ponownie wysiane do nowej kolby. Ten proces redystrybucji zapewnia komórkom miejsce do proliferacji, a ogólna wydajność hodowli ulegnie poprawie.
10. Aby dokonać kriokonserwacji MSC, należy zebrać ~1 x 10⁶ komórek w 1 ml 90% FCS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i zamrozić przy użyciu standardowych protokołów.
    Uwaga: W sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych znajdują się opisy charakterystyki MSC za pomocą cytometrii przepływowej, różnicowania mezodermalnego i analizy XY FISH w celu określenia płci trzech różnych (D, CP i CV) rozszerzonych populacji komórek. W naszym badaniu łożyska pochodziły od dzieci płci męskiej; w ten sposób wszystkie komórki płodowe można rozróżnić jako męskie (chromosom Y), a wszystkie komórki matczyne można rozróżnić jako żeńskie (tylko chromosom X).

Wyniki

Procedura izolacji łożyska MSC jest podsumowana na rysunku 1. Trzy obszary anatomii łożyska, z których wyizolowano MSC, przedstawiono na rycinie 2. Są to decidua matki, a także głównie tkanki płodowe płytki kosmówkowej i kosmków kosmówkowych. Wiele podręczników, artykułów i zasobów internetowych szczegółowo opisuje rozwój i funkcjonalną rolę różnych tkanek łożyska (patrz odnośnik ⁸).

Morfologia kultur 48 godzin po izolacji i usunięciu resztek tkanki.
Po 48 godzinach hodowli MSCs przyczepią się do plastiku z kulturą tkankową, podczas gdy erytrocyty i większość innych szczątków komórkowych nie zostaną przyklejone. W tym czasie pożywkę należy zastąpić 35 ml świeżej pożywki hodowlanej. Przed tą wymianą pożywki trudno jest dokonać precyzyjnych obserwacji ze względu na dużą liczbę erytrocytów, które utrudniają ocenę wizualną. Wygląd supernatantu hodowli może się znacznie różnić w zależności od dawcy łożyska. Tę różnicę można zobaczyć wizualnie w przykładach 1 i 2 (rysunek 3A). Te dwie izolacje MSC, które wydawały się być bardzo różne, zostały przeprowadzone jednocześnie z dwóch różnych łożysk. Jednak po umyciu obie kultury wydawały się podobne (patrz umyty przykład 3, rysunek 3A).

Pod mikroskopem, po 48-godzinnej wymianie pożywki, tylko kilka komórek zostanie podłączonych do kolby (Rysunek 3B), a komórki będą wyglądały znacznie inaczej niż bardziej rozbudowane MSC. Niektóre szczątki i erytrocyty będą widoczne jako pływające lub przyczepione grudki, które nie będą przeszkadzać we wzroście MSC. Dłuższe komórki fibroblastyczne przylegające do dna kolby mogą być mieszanką komórek, w tym MSC, komórek krwiotwórczych, trofoblastycznych lub śródbłonka. Ponownie, komórki inne niż MSC nie zagrażają hodowlom MSC, ponieważ komórki te na ogół nie przetrwają więcej niż 1-2 pasaże w warunkach hodowli MSC. Pomimo pewnych różnic w początkowym wyglądzie kultur, późniejsze wyniki ekspansji są na ogół spójne.

Morfologia kultur MSC na przestrzeni czasu.
W tym reprezentatywnym przykładzie, siedem dni po izolacji, widoczne były małe fibroblastyczne kolonie MSC, chociaż komórki inne niż MSC mogą być również widziane jako okrągłe lub luźno przyczepione komórki (Figura 4A). Przyłączone komórki są tym, co pierwotnie nazywano "fibroblastem tworzącym jednostkę kolonijną" (CFU-F) ¹⁷, a później nazwano MSC ¹⁸. Trzynaście dni po izolacji fibroblastyczne kolonie MSC były duże (ryc. 4B). Ogólnie rzecz biorąc, monowarstwa będzie w tym momencie zlewać się w 80-90%, a komórki powinny być pasażowane. Począwszy od przejścia 2, łożyskowa monowarstwa MSC rozwinie charakterystyczną morfologię podobną do wiru podczas zbiegu (ryc. 4C). O ile komórki nie są pasażowane w niskiej gęstości, tworzenie się CFU-F nie będzie już obserwowane. Przy niskiej gęstości MSC pochodzące z łożyska mają mniejszy, bardziej kwadratowy wygląd niż MSC ¹ pochodzące ze szpiku kostnego u dorosłych. Podczas gdy MSC pochodzące z łożyska i MSC ze szpiku kostnego wykazują podobne tempo proliferacji, komórki pochodzące z łożyska są mniej podatne na szybkie starzenie się5.

Charakterystyka łożyskowego MSC in vitro.
Każda rozszerzona populacja komórek musi być scharakteryzowana w celu zapewnienia, że spełnia standardowe kryteria MSC ¹⁶, w tym (1) przyleganie plastyczne, (2) obecność mezenchymalnych markerów powierzchniowych i brak markerów powierzchni hematopoetycznej oraz (3) zdolność do różnicowania mezodermalnego.

Łożyskowe MSC przylegają do plastiku.
Jak pokazano na rycinie 4, MSCs w kulturze przylegają do plastiku i mają morfologię podobną do fibroblastów; potwierdza to, że komórki spełniają pierwsze kryteria definiujące MSC ¹⁶.

Placental MSC display mezenchymal surface markers.
Drugą cechą charakterystyczną MSC jest obecność mezenchymalnych markerów powierzchniowych i brak markerów powierzchni hematopoetycznej ¹⁶. Ponieważ nie ma pojedynczego markera zdolnego do definitywnej identyfikacji MSC, panele markerów są zwykle wykorzystywane w połączeniu z analizą cytometrii przepływowej w celu identyfikacji komórek, które są mezenchymalne, ale nie krwiotwórcze. W reprezentatywnym zestawie danych dostarczonym tutaj (Figura 5A) oceniliśmy ekspresję komórkową markerów mezenchymalnych CD73, CD105, CD90, CD146 i CD44, markerów krwiotwórczych CD45 i CD34 oraz HLA-DR, a także markera śródbłonka CD31. Wszystkie przeciwciała wykorzystywane w tym procesie charakterystyki łożyskowego MSC są wymienione w Tabeli Materiałów/Wyposażenia. Barwienie przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta, przy użyciu metod analizy opisanych tutaj ¹⁹.

Komórki były dodatnie dla markerów mezenchymalnych CD73, CD105, CD44 i ujemne dla markerów powierzchniowych komórek CD45, CD34, HLA-DR i CD31, zgodnie z oczekiwaniami ^5,20. Około 37% i 57% komórek w naszym reprezentatywnym zestawie danych było dodatnich odpowiednio dla CD90 i CD146 ²¹. Zarówno CD90, jak i CD146 są powszechnie stosowanymi markerami MSC ²¹. Profile markerów powierzchniowych komórek MSC mogą się różnić w zależności od źródła tkanki MSC, składu podłoża lub pasażu o numerze ²². W naszym wieloletnim doświadczeniu nie zaobserwowaliśmy długotrwałego zanieczyszczenia MSC pochodzącego z łożyska komórkami niemezenchymalnymi po 1-2 pasażach ^5,11.

Łożyskowy MSC wyświetla mezenchymalny potencjał różnicowania
Z definicji MSC musi posiadać zdolność do różnicowania mezodermalnego in vitro ^5,13. Potencjał różnicowania mezodermalnego jest zwykle oceniany za pomocą testów różnicowania trój- lub dwuliniowego. Testy dwuliniowe na ogół oceniają zdolność różnicowania osteogennego i adipogennego, podczas gdy testy trójliniowe dodatkowo oceniają zdolność różnicowania chondrogennego. W przedstawionych tutaj reprezentatywnych wynikach pokazujemy, że rozszerzone populacje MSC tworzą zarówno złogi wapnia, wskazujące na różnicowanie osteogenne, jak i wakuole lipidowe, wskazujące na adipogenezę (ryc. 5B).

Aby scharakteryzować opisywane tutaj populacje MSC, wysialiśmy komórki do 24 dołków hodowlanych po 6 x 10⁴ komórki w 1 ml pożywki indukcyjnej. Średnie komponenty są wymienione w Tabeli materiałów/wyposażenia. Podczas gdy preparaty z pożywką indukcyjną są powszechne w literaturze, istnieje znaczna zmienność w opublikowanych preparatach. Z tego powodu pokrótce wymieniamy tutaj nasze preparaty pożywek indukcyjnych i podejścia do barwienia. Pożywka do indukcji osteogennej zawierała DMEM-HG, 10% FBS, 1x antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy, 10 mM fosforanu β-glicerolu, 100 nM deksametazonu i 50 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego. Pożywka indukcyjna adipogenna zawierała DMEM-HG, 10% FBS, 1x antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy, 10 μg/ml insuliny, 100 nM deksametazonu, 200 μM indometacyny i 500 μM 3-izobutylo-1-metyloksantyny. W tym przypadku kultury utrzymywano w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%_CO2 i hodowano przez 14 dni. Pożywkę indukcyjną wymieniano dwa razy w tygodniu przez cały okres hodowli. Po 14 dniach indukcji scharakteryzowano kultury pod kątem macierzy kostnej (osteogeneza) lub wakuoli lipidowych (adipogeneza), zgodnie z naszą poprzednią publikacją ⁵. Analizę osadzania się osteogennej matrycy wapniowej uzyskano poprzez najpierw odessanie pożywki, utrwalenie kultur 4% paraformaldehydem przez 20 minut, przemycie monowarstwy DPBS, a następnie barwienie Alizarin Red S zgodnie z instrukcją producenta. Indukcję adipogenną oceniano poprzez odsysanie pożywki, utrwalanie kultur 4% paraformaldehydem przez 20 minut, mycie monowarstwy i barwienie roztworem czerwieni olejowej O zgodnie z instrukcjami producenta. Poplamione osady wapnia i wakuole olejowe zostały następnie zobrazowane za pomocą mikroskopu świetlnego, a obrazy zachowane do wykorzystania w przyszłości.

W poprzednich publikacjach scharakteryzowaliśmy potencjał różnicowania MSC pochodzenia łożyskowego ^{bardziej szczegółowo 4,5}. Osteogeneza MSC pochodząca z łożyska jest podobna do MSC pochodzącej ze szpiku kostnego, podczas gdy adipogeneza jest na ogół mniej wydajna w MSC ⁵ pochodzącym z łożyska. Nie przeprowadzamy rutynowo różnicowania chondrogennego z kilku powodów, chociaż zostało to już wcześniej zgłoszone przez nas w przypadku łożyska-MSC ⁵. Po pierwsze, podczas gdy zdolność do różnicowania mezodermalnego jest cechą definiującą MSC, prawdopodobnie ma ona drugorzędne znaczenie ^23-25, zwłaszcza gdy korzyść terapeutyczna może wynikać z wydzielin parakrynnych MSC ²⁶. Po drugie, chociaż Dominici i wsp. zaproponowali minimalne kryteria klinicznej produkcji MSC ¹⁶ pochodzącego z dorosłego szpiku kostnego, nowsze badania wskazują, że MSC z różnych nisz mają różne wrodzone właściwości i zdolności różnicowania ^5,13,27-32. W rzeczywistości Parolini i in. zaproponowali, że MSC pochodzące z łożyska powinno różnicować się w "jedną lub więcej linii mezodermalnych", a nie we wszystkie trzy ^linie. Wreszcie, wiele badań MSC wyklucza różnicowanie chondrogenne, ponieważ zachodzi ono poprzez podobny wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy jak osteogeneza (szlak rodziny TGFβ) ^33-35.

Łożyskowe MSC są pochodzenia matczynego przy użyciu tej metody hodowli, pomimo anatomicznego umiejscowienia materiału wyjściowego.
W wielu publikacjach zakłada się, że komórki wyizolowane z kosmówki płodu dają MSC płodu po posiewie ¹⁴. Jednak, jak informowaliśmy ^wcześniej5, wszystkie kultury pochodzące z kosmówki płodu, przy użyciu tego protokołu, szybko wzbogacają się w przypadku matczynego MSC, czego intuicyjnie można by oczekiwać w przypadku matczynych dziesiętnych kultur MSC. W tych reprezentatywnych wynikach wykorzystaliśmy tkankę łożyska pochodzącą od niemowląt płci męskiej, aby możliwe było łatwe określenie udziału komórek płodu i matki w rozszerzonych populacjach komórek. Do tych badań użyliśmy zestawu XY FISH wymienionego w Tabeli Materiałów/Wyposażenia i postępowaliśmy zgodnie z instrukcjami producenta.

W reprezentatywnych danych podanych tutaj, hodowle pochodzące z matczynych decidua stanowiły ~90% komórek matczynych (XX) i ~10% komórek płodowych (XY) w punkcie 0 (Rysunek 6). Przez pasaż 2 populacje komórek pochodzące z tkanek matczynych były ~100% komórkami matczynymi (XX), a komórki płodowe (XY) były niewykrywalne. Sugeruje to, że fizyczna sekcja tkanki matczynej doprowadziła do wzbogacenia komórek matczynych w kolejnych hodowlach. Jednak bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę wyniki posiewu z kosmków kosmówkowych płodu i kultur pochodzących z płytki kosmówkowej. W pasażu 0 zarówno kosmki kosmówkowe płodu, jak i kultury pochodzące z płytki kosmówkowej wynosiły ~ 85% XY, czyli pochodzenia płodowego, co wskazuje, że ukierunkowana sekcja wzbogacona o komórki płodu (ryc. 6). W pasażu 0 obie hodowle zawierały ~15% zanieczyszczenia komórek matczynych (XX). Co zaskakujące, w pasażu 2 obie kultury płodowe były wypełnione ~100% komórkami matczynymi (XX), a komórki płodowe (XY) nie były już wykrywalne. Analiza XY FISH ujawnia, że komórki matczyne (chromosomy XX) szybko i konsekwentnie przejmują hodowle pochodzące z tkanek kosmówkowych płodu. Jest to krytyczna obserwacja kulturowa, która jest często pomijana ⁵. Szczegóły tej analizy są zawarte w tym protokole, ponieważ pokazują one bardzo ważną obserwację, że komórki matczyne szybko zasiedlają wszystkie hodowle, gdy DMEM uzupełniony 10% FBS jest stosowany bez dodatkowych czynników mających na celu wspieranie populacji pochodzących od płodu.

Rycina 1: Podsumowanie procedury izolacji łożyska MSC. (Krok 1) Zorientuj się w anatomii łożyska. (Krok 2) Ręcznie wypreparuj 10 g tkanki z decidua, kosmków kosmówkowych lub płytki kosmówkowej za pomocą nożyczek. (Krok 3) Rozdrobnić wypreparowane części decidua, kosmków kosmówkowych lub tkanek płytki kosmówkowej na drobne kawałki nożyczkami lub skalpelem.
(Krok 4) Uwolnij komórki z drobnych kawałków poprzez 1-2 godzinne trawienie w dyspazie i kolagenazie I.
(Krok 5) Oddzielić komórki od tkanki włóknistej przez pulsacyjne wirowanie i/lub przemycie ich przez sitko do komórek. Zebrać i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej i umieścić w kolbach hodowlanych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) zostaną wybrane na podstawie ich skłonności do przylegania plastyczności oraz zdolności do przetrwania i namnażania się w pożywce. Wreszcie, w sekcji wyników, rozszerzony MSC może być scharakteryzowany i przechowywany do wykorzystania w przyszłych eksperymentach.

Rycina 2: Anatomia ludzkiego łożyska i tkanek wyizolowanych w tej procedurze. Pierwszą tkanką, która ma zostać pobrana, jest decidua matczyna. Decidua to tkanka, która pozostaje jako cienka warstwa na powierzchni łożyska po jego zrzuceniu ze ściany macicy (decidua jest identyfikowana za pomocą zielonych znaczników). Drugą tkanką, która zostanie pobrana z wnętrza łożyska, są kosmki kosmówkowe płodu (niebieskie markery). Trzecią tkanką, która ma zostać pobrana, jest płytka kosmówkowa płodu (czerwone znaczniki) (na podstawie pozycji ³⁶). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Morfologia kultur 48 godzin po izolacji i usunięciu resztek tkanki. (A) Wygląd supernatantu z hodowli może się znacznie różnić w zależności od dawcy łożyska przed zmyciem szczątków. Przykładowe kultury 1 i 2 pokazują tę zmienność. Te dwie izolacje wykonano równocześnie, ale z dwóch różnych łożysk. Po umyciu kultury będą wolne od erytrocytów i resztek tkankowych, jak pokazano w przykładzie 3. Późniejsze wyniki ekspansji są na ogół spójne. (B) Po 48-godzinnej wymianie pożywki tylko kilka komórek zostanie podłączonych do kolby. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Morfologia kultur MSC w czasie. (A) Siedem dni po izolacji widoczne są małe fibroblastyczne kolonie MSC, chociaż komórki inne niż MSC będą również obecne jako okrągłe lub luźno przyczepione komórki. (B) 13 dni po izolacji, fibroblastyczne kolonie MSC są duże i często monowarstwa MSC zlewa się i jest gotowa do przejścia. (C) Począwszy od przejścia 2, monowarstwa MSC rozwinie charakterystyczną morfologię podobną do wiru podczas zbiegu. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Charakterystyka MSC za pomocą cytometrii przepływowej i różnicowania mezodermalnego. (A) MSC pochodzące z kosmków kosmówkowych łożyska wykazują klasyczny profil markera MSC w analizie cytometrii przepływowej, chociaż dla tych markerów powierzchni komórek ekspresja jest podobna dla wszystkich typów ludzkich MSC. Każdy histogram pokazuje intensywność sygnału (oś x) w funkcji znormalizowanej liczby komórek na osi y (% Max). W tym reprezentatywnym zestawie danych komórki były dodatnie dla CD73, CD105 i CD44 oraz ujemne dla markerów krwiotwórczych CD45 i CD34 oraz HLA-DR. (B) Łożyskowe MSC na ogół ulegają silnemu różnicowaniu osteogennemu, jednak (C) różnicowanie adipogenne może być mniej efektywne niż w przypadku MSC pochodzącego ze szpiku kostnego. Zdjęcia w podpisach B i C zostały zrobione w 40-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 6: MSC łożyskowe są pochodzenia matczynego przy użyciu tej metody hodowli, pomimo anatomicznego umiejscowienia materiału wyjściowego. Wykresy pokazują ilościowe określenie składu komórek płodu (mężczyzna, XY) i matki (samica, XX) w łożyskowych hodowlach MSC wyizolowanych z tkanek dziesiętnych, kosmówek kosmówkowych i płytki kosmówkowej co drugi pasaż. Komórki matczyne (XX) szybko i powtarzalnie przejmują hodowle pochodzące z tkanek kosmówkowych płodu. Płód = mężczyzna = chromosomy XY wykryte w pojedynczej komórce, matczyne = żeńskie = chromosomy XX wykryte w pojedynczej komórce. Przedstawione tutaj dane pochodziły z N = 3 łożysk niezależnych dawców od niemowląt płci męskiej, z co najmniej 100 komórkami wybarwionymi na obecność XY FISH i policzonymi dla każdego punktu danych. Słupki reprezentują średnie, a słupki błędów odzwierciedlają jedno odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Łożysko jest fizycznie dużym narządem płodu-matki, z którego można wyizolować płód lub matkę MSC ²². W tym artykule przedstawiliśmy szczegółowy przegląd anatomii łożyska i instrukcje, jak dokładnie wypreparować tkankę decidua (matczyną), kosmówkę kosmówkową (płodową) i płytkę kosmówkową (płodową) (krok 2.2-2.4). Następnie nakreśliliśmy solidny protokół, który umożliwia izolację MSC z każdej z tych trzech tkanek (Krok 2.5-2.6). Ekspansja MSC łożyska jest wydajna, a posiewy wyglądają podobnie do kultur MSC pochodzących ze szpiku kostnego (ryc. 3 i 4). Różnicowanie osteogenne jest wiarygodne (ryc. 5B), podczas gdy różnicowanie adipogenne jest na ogół mniej efektywne (ryc. 5C) ⁵.

Wielu nowicjuszy w tej dziedzinie zakłada, że posiewy pochodzące z kosmków kosmówkowych płodu lub tkanek płytki kosmówkowej zostaną wzbogacone o MSC płodu. Jednak w naszych rękach wzbogacanie komórek płodowych jest przejściowe tylko wtedy, gdy stosuje się standardowe podłoże ekspandujące MSC, takie jak DMEM-LG + 10% FBS ⁵. W tym miejscu przedstawiamy reprezentatywne wyniki przy użyciu tkanek łożyska pochodzących od dziecka płci męskiej. Wykorzystując tkankę łożyska od dziecka płci męskiej, komórki płodu można łatwo zidentyfikować jako posiadające chromosomy XY, podczas gdy komórki matczyne można zidentyfikować jako posiadające chromosomy XX. Rysunek 6 przedstawia wyniki XY FISH dla reprezentatywnej hodowli. Podczas gdy płodowe MSC (XY) są wzbogacone (do 80%) w początkowych hodowlach pochodzących z płodowych kosmków kosmówkowych lub tkanek płytki kosmówkowej, te same kultury są szybko wyprzedzane (~100%) przez matczyne (XX) MSC w ciągu pierwszych dwóch pasaży. W standardowej pożywce, składającej się z DMEM-LG + 10% FBS, kilka MSC pochodzących od matki, które zanieczyszczają tkanki płodu, konkuruje z komórkami pochodzącymi od płodu w hodowli.

Kluczowym krokiem nakreślonym w tym protokole jest docenienie anatomii łożyska i miejsca, z którego można najskuteczniej pobrać tkanki płodowe i matczyne. Jak opisano w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników, rozwarstwienie tkanki płodu umożliwia przejściowe wzbogacenie MSC pochodzącego z płodu. Ulepszenia w formułowaniu pożywek ekspandujących, poprzez suplementację specyficznymi pożywkami egzogennych czynników wzrostu, powinny pozwolić na selektywną ekspansję populacji MSC pochodzących od płodu i wytwarzanie produktu komórkowego, który jest wzbogacony o komórki płodu, a nie matki (nasza grupa opracowuje obecnie takie preparaty pożywki). Wytwarzanie płodowych populacji MSC może mieć wiele zalet, ponieważ uważa się, że płodowe MSC mają większe właściwości angiogenezę i immunosupresję niż równoważne populacje MSC matki ³⁷.

W każdym z opisanych protokołów izolacji użyliśmy około 10 g tkanki. Całe łożysko waży zwykle 500-750 g, a w poprzednich pracach wykazaliśmy, że dzięki zautomatyzowanemu trawieniu tkanek i procesom bioreaktora do ekspansji komórek, powinno być możliwe wyprodukowanie ponad 7000 klinicznych dawek komórek z jednego łożyska ⁴. Liczby te podkreślają potencjalną przydatność MSC pochodzącego z łożyska w allogenicznych terapiach MSC oraz znaczenie tej metody niezależnie od pochodzenia MSC (płodowego lub matczynego). Z terapeutycznego punktu widzenia niezwykle ważne jest, aby użytkownicy mieli pełne zrozumienie produktu komórkowego i zdolność do niezawodnego wytwarzania tego produktu komórkowego. Mamy nadzieję, że nasz film pomoże naukowcom zrozumieć anatomię łożyska, wyizolować MSC z łożyska i przewidzieć prawdopodobny skład komórek płodu lub matki w ich hodowlach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
HBSS	Gibco/Invitrogen	14185-052	Długa nazwa: Hanks Zrównoważony roztwór soli
FBS	Gibco/Invitrogen		Długa nazwa: Substytut trypsyny w surowicy bydlęcej płodu
	Gibco/Invitrogen	12563-029	Długa nazwa: TrypLE Select
DMEM-LG	Gibco/Invitrogen	11885-092	Długa nazwa: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-Low Glucose
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Długa nazwa: Dulbecco' s Zmodyfikowana glukoza Eagles Medium-HIgh (4,5 g/L)
PBS (bez Mg+Ca+)	Gibco/Invitrogen	14190-250	Długa nazwa: Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, bez magnezu i wapnia
Anti-anti-anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Długa nazwa: roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy x100
proszek paraformaldehydu lub 4% roztwór	dowolny
Collagenase I	Invitrogen	17100-017	2 500 U/ml
Dnaza I	Sigma	D5025	10 mg/ml w  0,15 M NaCl
Dispase	Invitrogen	17105-041	10 mg/ml w wodzie (20 000 U/ml).
Materiał< / mocny>	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jednorazowe:
50 ml probówki wirówkowe	Falcon lub dowolnej marki
, szalki Petriego, sterylne placyki (średnica 25 cm i 10 cm)	Nunc
Sitka do komórek (100 μ m)	Becton Dickinson	352340
175 i 75 cm2 (T175 i T75) kolby do hodowli tkankowych	Nunc
5 ml, 10 ml, 25 ml sterylne pipety serolgiczne	dowolnej marki
Materiał<<	silny>silny>Firma	Numer katalogowy	Uwagi
< mocny>Sprzęt:< / mocny>
Wirówka
Inkubator do hodowli tkankowych 37 & Deg; C, 5% CO2
Szafa
Sterylne nożyczki i pęsety
Stojaki na probówki
Pipetery typu Gilson lub równoważne
sterylnymi końcówkami 1 000 i mikro; l, 200 i mikro; l, 20 &mikro;l.
inkubator kołyszący lub wstrząsający (37 & C)
ochrony
roztwory czyszczące (odpowiednie do krwi),
pojemniki na odpady, odpowiednie pojemniki na tkanki/krew
odczynniki do charakterystyki MSC
przeciwciało (identyfikator klonu)	Producent	Nr katalogowy	Isotype
CD73 (AD2)	Miltenyi Biotec	130-095-183	Mysz IgG1
CD105 (43A4E1)	Miltenyi Biotec	130-094-941	Mysz IgG1
CD90/Thy-1 (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-403	Mysz IgG1
CD45 (5B1)	Miltenyi Biotec	130-080-202	Mysz IgG2a
CD34 (AC136)	Miltenyi Biotec	130-090-954	Mysz IgG2a
HLA-DR (AC122)	Miltenyi Biotec	130-095-298	Mysz IgG2a
CD31 (PECAM-1)	BD Pharmingen	555446	Mysz IgG1
CD146 (541-10B2)	Miltenyi Biotec	130-092-849	Mysz IgG1
CD44 (DB105)	Miltenyi Biotec	130-095-180	Mysz IgG1
Isotype Controls (Clone ID)	Producent	Nr katalogowy
Izotyp myszy IgG1 (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-214
Izotyp myszy IgG1 (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-212
Izotyp myszy IgG1 (IS5-21F5)	Miltenyi Biotec	130-092-213
Mysz IgG2a (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-091-837
Mysz IgG2a (S43.10)	Miltenyi Biotec	130-098-849
Bufor MACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
Różnicowanie osteogenne	Producent	Numer katalogowy
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Długa nazwa: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g / L)
FBS	Gibco/Invitrogen		Długa nazwa: Płodowa surowica bydlęca
Anti-anti-anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Długa nazwa: roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy x100
Deksametazon	Sigma	D4902
β-Glycerol Phophate	Sigma	50020
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan	Sigma	A8960-5G
Alizarin Red S	Sigma	A5533-25G	Do barwienia matrycy wapniowej
Dyferencjacja adipogeniczna	Producent	Nr katalogowy
DMEM-HG	Gibco/Invitrogen	11965118	Długie imię: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g / L)
FBS	Gibco/Invitrogen		Długa nazwa: Płodowa surowica bydlęca
Anti-anti-anti-Gibco	/Invitrogen	15240-062	Długa nazwa: roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy x100
insulina	Sigma	I2643
Deksametazon	Sigma	D4902
Indometacyna	Sigma	I7378
3-izobutylo-1-metyloksantyna	Sigma	I5879
Olej Czerwony roztwór O	Sigma	O1391-250ML	Do barwienia wakuoli lipidowej
XY FISH do określania płodowego lub matczynego pochodzenia komórek
XY chomosomu zestaw FISH	Vysis (Abbott Molecular)	07J20-050	Długa nazwa: X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Zestaw sondy fluorescencyjnej DNA znakowanej bezpośrednio