Model zwłóknienia wątroby wywołanego dimetylonitrozoaminą u szczura

Podsumowanie

Opisujemy metodę tworzenia zwierzęcego modelu zwłóknienia wątroby u szczura i oceniamy stopień zwłóknienia poprzez badanie histologiczne wątroby. Model może być wykorzystany do badania rozwoju chorób wątroby, a także do testowania skuteczności potencjalnych środków przeciwzwłóknieniowych.

Streszczenie

Cztero- do sześciotygodniowych samców szczurów rasy Wistar wykorzystano do produkcji zwierzęcych modeli zwłóknienia wątroby. Proces ten wymaga czterech tygodni podawania 10 mg/kg dimetylonitrozoaminy (DMN), podawanej dootrzewnowo przez trzy kolejne dni w tygodniu. Iniekcje dootrzewnowe wykonywano w dygestorium, ponieważ DMN jest znaną hepatoksyną i czynnikiem rakotwórczym. Model ma kilka zalet. Po pierwsze, zmiany w wątrobie mogą być badane sekwencyjnie lub w określonych stadiach zainteresowania. Po drugie, stopień zaawansowania choroby wątroby można monitorować poprzez pomiar enzymów aminotransferazy alaninowej (ALT) i aminotransferazy asparaginianowej (AST) w surowicy. Po trzecie, stopień uszkodzenia wątroby na różnych etapach można potwierdzić poprzez uśmiercenie zwierząt w wyznaczonych punktach czasowych, a następnie badanie histologiczne tkanek wątroby barwionych trichomami Massona. Po czterech tygodniach dawkowania DMN, typowy wynik zwłóknienia wynosi od 5 do 6 w skali Ishaka. Model ten może być konsekwentnie odtwarzany i jest szeroko stosowany do oceny skuteczności potencjalnych środków przeciwzwłóknieniowych.

Wprowadzenie

DMN jest silną toksyną specyficzną dla wątroby. Jego metabolizm, rozmieszczenie tkanek i zdolność do powodowania uszkodzeń wątroby szczurów zostały opisane przez Magee¹, a mechanizm uszkodzenia hepatocytów i śmierci komórek przez apoptozę został opisany przez Pritcharda i Butlera². Okresowe podawanie tego związku powodowało zwłóknienie wątroby u psów i szczurów^3,4.

Mechanizmy i zmiany morfologiczne zwłóknienia wątroby zostały dokładnie zbadane przy użyciu tego modelu. We wczesnych badaniach z udziałem szczurów 3-tygodniowe leczenie DMN powodowało dośrodkową martwicę krwotoczną, a następnie mikroguzkową marskość wątroby bez stłuszczenia⁵. Wykazano, że we wczesnym zwłóknieniu utworzony kolagen był bardziej usieciowany, przy czym typ III był bardziej widoczny niż typ I⁶. Podobnie jak inne przyczyny, zmiany zwłóknieniowe wywołane przez DMN wiązały się ze wzrostem liczby komórek Kupffera; makrofagi wątrobowe, które znajdują się w sinusoidach. Komórki te przekształcają się w miofibroblasty i wytwarzają nadmierne ilości macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest głównym problemem w zwłóknieniu⁷.

Jeśli chodzi o sygnalizację komórkową, Nakamura i in. wykazali, że TGF-β odgrywa kluczową rolę w postępie zwłóknienia wątroby⁸. Wykorzystali adenowirusa wykazującego ekspresję skróconego receptora TGF-β typu II, aby specyficznie hamować sygnalizację TGF-β. Zwłóknienie wątroby u tych szczurów zostało spektakularnie zatrzymane podczas leczenia DMN w porównaniu z grupami kontrolnymi. Inne badania potwierdziły, że supresja TGF-β prowadzi do złagodzenia rozwoju zwłóknienia wątroby^9,10. Model został również wykorzystany w globalnym badaniu profilowania genów w celu zidentyfikowania innych markerów i białek zwłóknienia, które mogą być wykorzystane jako cele leków w terapii przeciwzwłóknieniowej¹¹.

Inne środki chemiczne używane do wywoływania zwłóknienia wątroby to tioacetamid (TAA) i czterochlorek węgla (_{CCl 4}). TAA stosowano najpierw u szczurów, a później u myszy¹². Do zalet tego modelu należą: łatwość podawania chemicznego w wodzie pitnej, odtwarzalność modelu z charakterystyczną mikroguzkową marskością wątroby oraz zmianami biochemicznymi. Wady obejmują: długi okres 3 miesięcy rozwoju zwłóknienia wątroby oraz brak zrozumienia molekularnego mechanizmu indukcji zwłóknienia wątroby. Jeśli chodzi o_{CCl 4}, jego stosowanie zmniejszyło się z następujących powodów: nie naśladuje on choroby wątroby u ludzi, ma szkodliwy wpływ na warstwę ozonową, powoduje ból i niepokój u zwierząt, jest bardzo toksyczny dla ludzi i wymaga dodatkowych środków ostrożności przy obchodzeniu się z nim i jego usuwaniu^13,14.

Przedłużona niedrożność dróg żółciowych (przez interwencję chirurgiczną) jako eksperymentalny model marskości wątroby została po raz pierwszy opisana przez Kountouras et al.¹⁵. Ta metoda jest nietoksyczna dla ludzi i zwierząt. Jednak czas potrzebny do rozwoju zwłóknienia wątroby jest różny. Przegląd 30 raportów autorstwa Marquesa i wsp.¹⁶, stwierdzono, że rozwój zwłóknienia wątroby trwał od siedmiu dni do czterech tygodni po operacji. Opisane zmiany patologiczne naśladują zmiany występujące w przewlekłym zwłóknieniu dróg żółciowych u ludzi, a model byłby bardziej odpowiedni dla badaczy zainteresowanych tą dziedziną.

Podsumowując, przerywane podawanie stałej dawki DMN szczurowi przez 4 tygodnie powoduje zwłóknienie wątroby, które naśladuje ludzką chorobę. Szczury, którym podawano dawkę, wykazują postępujący rozwój uszkodzenia wątroby i zwłóknienia miąższu^4,17. Postęp i nasilenie choroby można monitorować za pomocą próbek krwi lub uśmiercania zwierząt w określonych punktach czasowych, a efekt jest wysoce powtarzalny¹⁸. W związku z tym model ten jest szeroko stosowany do badania mechanizmów zwłóknienia wątroby i marskości wątroby, a także do badań przesiewowych pod kątem potencjalnych środków przeciwzwłóknieniowych^10,19,20.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w Szkole Nauk Stosowanych Politechniki Temasek.

1. Przygotowanie DMN

1. Pobrać pipetą 200 μl DMN (1 g/ml roztworu podstawowego) i dodać 19,8 ml PBS, aby przygotować 10 mg/ml roztworu DMN do wstrzykiwań.
   Uwaga: DMN jest rakotwórczy. Użyj dygestoria, aby przygotować DMN i wykonać zastrzyki dla zwierząt.

2. Dootrzewnowe wstrzyknięcie DMN

1. Użyj samców szczurów Wistar o średniej wadze 150 - 200 g. Aklimatyzuj szczury na 4 - 7 dni przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Utrzymuj szczury w temperaturze pokojowej 22 ± 1 °C, z 12-godzinnymi cyklami światła i 12-godzinnymi cyklami ciemności. Zapewnij karmę dla szczurów i wodę ad libitum.
3. Codziennie mierz spożycie pokarmu i wody. Mierz masę ciała raz w tygodniu.
4. Obliczyć ilość DMN dla każdego szczura na podstawie dawki 10 mg/kg masy ciała. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 25 należy pobrać do strzykawki obliczoną objętość roztworu DMN.
5. Unieruchomić szczura do wstrzyknięcia dootrzewnowego²¹.
6. Gdy szczur jest odpowiednio unieruchomiony, wprowadzić igłę do prawego dolnego kwadrantu brzucha, cofnąć tłok strzykawki (nic nie powinno być odsysane), aby sprawdzić, czy igła jest prawidłowo umieszczona w przestrzeni brzusznej i powoli wstrzyknąć roztwór DMN.
7. Po podaniu dawki DMN powoli wyjąć igłę i wyrzucić do pojemnika na ostre przedmioty.
8. Wykonuj dootrzewnowe wstrzyknięcia DMN przez 3 kolejne dni w tygodniu przez 4 tygodnie. Zastrzyki należy podawać codziennie o tej samej porze. Ponownie obliczyć dawkę na podstawie masy ciała na początku każdego tygodnia wstrzyknięć.
9. Co tydzień pobieraj krew z żyły ogonowej, aby zmierzyć parametry biochemiczne: aminotransferazę alaninową (ALT) i aminotransferazę asparaginianową (AST)²².
10. Zmierz AlAT i AspAT w surowicy za pomocą komercyjnego analizatora biochemicznego testu weterynaryjnego.

3. Ogólne badanie i pobieranie wątroby

1. Poddać szczury eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu w dawce 100 mg/kg masy ciała. Upewnij się, że śmierć nie ma miejsca na bicie serca.
2. Przygotuj się do sekcji zwłok i oceń stan zwierzęcia zgodnie z opisem Parkinsona i wsp.²³ Umieść martwe szczury na desce preparacyjnej w pozycji grzbietowej z odwłokiem skierowanym do góry.
3. Zdezynfekuj i zwilż skórę 70% etanolem.
4. Za pomocą nożyczek naciąć skórę na całej długości brzusznej od odbytu do podbródka i odbić skórę. Nożyczkami naciąć ścianę brzucha od odbytu do chrząstki mieczykowatej, aby odsłonić wnętrzności brzucha.
5. Zbadaj narządy jamy brzusznej in situ, aby sprawdzić, czy nie ma żadnych nieprawidłowości. Zwróć uwagę na wszelkie zmiany w kolorze, wielkości, lokalizacji narządów i obecności płynu w jamie otrzewnej. Zbadaj konsystencję narządów i zwróć uwagę na obecność wszelkich zapachów.
6. Za pomocą nożyczek i kleszczy wypreparuj całą wątrobę bez więzadeł i przyczepów.
   1. Zacznij od wnęki, w której jest przymocowany do przepony i pracuj, aby uwolnić wszystkie płaty wątroby od przyczepów. Ostrożnie przetnij wszystkie więzadła i naczynia krwionośne.
7. Przenieś wątrobę na szalkę Petriego i zważ wątrobę.
8. Za pomocą skalpela wytnij odcinki płatów wątroby o grubości 2 - 5 mm. Aby zachować spójność, zawsze pobieraj próbki z tego samego płata wątroby. Weź klin o średnicy około 5 mm grubości, od prawego płata bocznego²⁴ około 1 cm od krawędzi płata. Natychmiast umieść w 10% buforowanej formalinie w celu utrwalenia. Upewnij się, że objętość tkanki do formaliny wynosi 1:10 lub więcej.
9. W tym momencie należy zebrać i natychmiast zamrozić porcje (przy użyciu ciekłego azotu) płatów wątroby, jeśli jest to wymagane do innych badań. Jeśli chodzi o (3.8), pobrać próbkę z tego samego płata wątroby w celu uzyskania spójności.

4. Przetwarzanie, osadzanie i cięcie wątroby

1. Utrwal próbki wątroby w 10% buforowanej formalinie na co najmniej 24 godziny.
2. Po utrwaleniu przyciąć wątrobę, umieścić w kasetach i załadować je do kosza automatycznego procesora tkanek.
3. Umieść kosz z kasetami w pierwszej stacji, która zawiera 10% buforowanej formaliny. Upewnij się, że kasety są całkowicie zanurzone. Mogą pozostać w tej komorze do 12 godzin, aż do rozpoczęcia cyklu.
4. Zaprogramuj procesor tkanek tak, aby obracał kasety przez 1 godzinę każdą, przez kolejne stacje zawierające następujące roztwory: etanol w stężeniach 50%, 70%, 90%, 100% (2 stacje), ksylen (2 stacje) i ciekła parafina (2 stacje).
5. Przenieść próbki wątroby do łaźni woskowej stacji zatapiania. Upewnij się, że maszyna do zatapiania jest włączona co najmniej godzinę wcześniej.
6. Za pomocą wstępnie podgrzanych kleszczyków (65 °C) wyjmij każdą kasetę z kąpieli woskowej i umieść na ciepłej płycie (65 °C) maszyny do zatapiania. Wlej odpowiednią ilość ciekłej parafiny do formy bazowej ze stali nierdzewnej (podgrzanej do 65 °C) do połowy pełnej. Przenieś część wątroby z kasety do formy. Upewnij się, że próbka jest umieszczona tak, aby powierzchnia cięcia (do zbadania mikroskopowego) była płaska na dnie formy.
7. Całkowicie napełnij formę płynną parafiną, zamontuj pustą kasetę na górze i umieść formę na płycie o temperaturze 4 °C maszyny do zatapiania do ostygnięcia przez co najmniej 30 minut.
8. Sprawdź, czy wosk ostygł i zastygł, a następnie usuń blok parafiny z formy. Blok powinien łatwo wyskoczyć i nie przyklejać się ani pękać. Jeśli tak się stanie, rozpuść blok i powtórz ten krok. Blok parafinowy można podzielić na sekcje po zestaleniu. Bloki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez wiele lat.
9. Umieścić blok parafinowy w mikrotomie i ciąć z prędkością 10 μm do momentu, gdy warstwa wosku zostanie usunięta na tyle, aby osadzona tkanka wątroby była widoczna
.
10. Zmień ustawienie mikrotomu, aby ciąć z grubością 5 μm. Za pomocą kleszczy podnieś dobrze przycięty odcinek, trzymając go za krawędź i ostrożnie zanurz go w łaźni wodnej w temperaturze 40 °C.
11. Delikatnie umieść czyste szkiełko pod sekcją pływającą i podnieś je na powierzchnię szkiełka. Umieścić szkiełko na szkiełku podstawowym w podgrzewaczu o temperaturze 37 °C na noc.

5. Barwienie trichromowe Masson

1. Przed nałożeniem plam należy potraktować szkiełka w celu usunięcia wosku i ponownego nawilżenia tkanek w następujący sposób:
   1. Zanurz sekcje w ksylenie na 5 minut. Powtórz 2x.
   2. Zanurz sekcje w 100% etanolu na 3 min. Powtórz 1x.
   3. Zanurz sekcje na 1 minutę każda w następujących roztworach etanolu: 90%, 80% i 70%.
2. Opłucz szkiełko pod bieżącą wodą, aby usunąć istniejący etanol ze szkiełka.
3. Zanurz szkiełka w żelaznej hematoksylinie na 10 minut, aby zabarwić jądro.
4. Opłucz szkiełka wodą, aby usunąć nadmiar plamy ze szkiełka.
5. Zanurz szkiełka w Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin na 2 minuty, aby zabarwić cytoplazmę.
6. Opłucz szkiełka wodą.
7. Umieść szkiełka w roztworze kwasu fosfowolframowego/fosfomolibdenowego na 10 minut, aby przyspieszyć wchłanianie błękitu anilinowego. Zmień roztwór kwasu fosfowolframowego/fosfomolibdynowego po 2 rundach użytkowania.
8. Umieść szkiełka w roztworze błękitu anilinowego na 10 minut, aby zabarwić włókna kolagenowe.
9. Nadmiar plamy spłucz wodą i umieść szkiełka w 1% roztworze kwasu octowego na 1 minutę, aby umożliwić różnicowanie, aby kolor szkiełka był delikatniejszy i bardziej przezroczysty.
10. Opłucz szkiełka wodą i przystąp do odwadniania skrawków tkanki. Etapy odwadniania są następujące:
11. Zanurzaj szkiełka kolejno na 10 sekund za każdym razem, w następujących stężeniach etanolu: 70%, 80%, 95% i 100%.
12. Zanurz szkiełka na 30 sekund w 100% etanolu. Powtórz 1x.
13. Przepłucz szkiełka przez 3 stacje ksylenu przez 5 minut każda, aby usunąć etanol.
14. Zamontuj szklaną szkiełko nakrywkowe na próbce z nośnikiem montażowym (np. mocowaniem DPX) i pozostaw do wyschnięcia.
    Uwaga: DPX to żywica syntetyczna, która szybko schnie, konserwuje plamy i chroni wycinek tkanki.

6. Punktacja zwłóknienia na wybarwionych włoskami odcinkach wątroby Massona

1. Poproś patologa weterynaryjnego, aby ocenił nasilenie zwłóknienia zgodnie z wynikiem zwłóknienia²⁵. Byłoby optymalnie, gdyby ocena zwłóknienia była wykonywana przez dwóch lub trzech patologów niezależnie w sposób zaślepiony. W takim scenariuszu uzyskaj ostateczny wynik po dyskusji i przeglądzie grupowym, aby uporządkować wszelkie różnice w punktacji.

wynik	opis
0	Brak zwłóknienia
1	Włókniste rozszerzanie się niektórych obszarów wrotnych, z krótkimi przegrodami włóknistymi lub bez
cyfra arabska	Włókniste rozszerzanie się większości obszarów wrotnych, z krótkimi przegrodami włóknistymi lub bez
3	Włókniste rozszerzanie się większości obszarów portalowych, sporadyczne mostkowanie od portalu do portalu (P-P)
4	Włókniste rozszerzanie się obszarów portalowych z zaznaczonym mostkiem (portal do portalu (P-P) oraz portal do centrali (P-C)
5	Wyraźne mostkowanie (P-P i/lub P-C) z okazjonalnymi guzkami (niepełna marskość wątroby)
6	Marskość wątroby, prawdopodobna lub określona

Tabela 1: Wynik zwłóknienia używany do odczytu wycinków wątroby barwionych włoskami Massona²⁵.

Wyniki

Szczury traktowane DMN tracą na wadze i stają się mniej energiczne, z potarganą sierścią. Odnotowano znaczący spadek średniej masy ciała szczurów traktowanych DMN; po raz pierwszy wykryty po 2 tygodniach podawania DMN, a różnica ta utrzymuje się w 3. i 4. tygodniu po zakończeniu kuracji (Rycina 1a). W miarę podawania DMN w kolejnych tygodniach, uszkodzenie wątroby powoduje jej zmniejszenie. Indeks wątroby, czyli stosunek masy wątroby do końcowej masy ciała wyrażony w proc...

Dyskusja

Opisaliśmy metodę tworzenia zwierzęcego modelu zwłóknienia wątroby i oceny ciężkości zwłóknienia wątroby. Ważne jest, aby dostarczyć odpowiednią dawkę DMN i przestrzegać harmonogramu cotygodniowych wstrzyknięć dootrzewnowych. W miarę postępu eksperymentu ważne jest, aby zważyć szczury i ponownie obliczyć dawkę na początku każdego tygodnia wstrzyknięć DMN. Należy pamiętać, że DMN jest toksyczny i musi być obsługiwany w komorze wyciągowej. Iniekcje dootrzewnowe wykonujemy również w komorze wyciągowej. W przypadku konieczno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dimetylonitrozoamina	Wako	147-03781
Formalina	Chemikalia Sinopharm	F63257009
Etanol	Sigma	64-17-5
Ksylen	Fisher	1330-20-7
Barwienia trichomami
Masson Anilina	Niebieski Mikroskopia elektronowa Nauki	#42755
Mikroskopia elektronowa	kwasowa Fuschin	RT42685
Nauki o szkarłatnoczerwonej	mikroskopii elektronowej	#26905
Hydrat kwasu fosfowolframowego	ALFA AESAR	ALFA40116.4
Hydrat kwasu fosfomolibdenowego	Sigma	SG 221856-25G
Hematoksyna żelaza Weigerta	Merck	1.15973.0002
Medium montażowe DPX	Merck	HX066873
Procesor tkanek	Leica	Leica TP 1020
Maszyna do osadzania	Sakura	Sakura Tissue Tek TEC5 System osadzania

Mikrotom Leica Leica RM 2235 Analizator testów weterynaryjnych Idexx Vet Test 8008