Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54210

⸱

6 lipca 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Streszczenie

Coxiella burnetii, czynnik wywołujący gorączkę Q, jest wewnątrzkomórkowym patogenem, który opiera się na systemie wydzielania Dot/Icm typu IV, aby stworzyć niszę replikacyjną. Kohorta efektorów jest translokowana przez ten system do komórki gospodarza w celu manipulowania procesami gospodarza i umożliwienia ustanowienia unikalnej wakuoli pochodzącej z lizosomów do replikacji. Przedstawiona tutaj metoda polega na połączeniu dwóch dobrze znanych technik: specyficznego wyciszania genów za pomocą siRNA i pomiaru translokacji efektorowej za pomocą substratu opartego na FRET, który opiera się na aktywności β-laktamazy. Stosując te dwa podejścia, możemy zacząć rozumieć rolę czynników gospodarza w funkcjonowaniu bakteryjnego systemu wydzielania i translokacji efektorowej. W tym badaniu zbadaliśmy rolę Rab5A i Rab7A, obu ważnych regulatorów szlaku transportu endocytarnego. Wykazaliśmy, że wyciszenie ekspresji któregokolwiek z białek powoduje spadek wydajności translokacji efektorowej. Metody te można łatwo modyfikować w celu zbadania innych patogenów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, które również wykorzystują systemy wydzielnicze. W ten sposób można uzyskać globalny obraz czynników gospodarza zaangażowanych w translokację efektorową bakterii.

Wprowadzenie

Coxiella burnetii to unikalny wewnątrzkomórkowy patogen, który powoduje odzwierzęcą infekcję człowieka gorączką Q. Choroba ta wiąże się z szerokim spektrum objawów klinicznych, począwszy od bezobjawowej serokonwersji do zagrażającej życiu przewlekłej infekcji, która często objawia się zapaleniem wsierdzia wiele lat po ekspozycji1. Do zakażenia człowieka dochodzi głównie poprzez wdychanie skażonych aerozoli z przeżuwaczami, które są głównym rezerwuarem infekcji, w szczególności krów mlecznych, owiec i kóz. Chociaż zakażenie Coxiella u tych zwierząt jest zazwyczaj subkliniczne, zakażenie może wywołać poronienie, a znaczne obciążenie bakteryjne w płynie porodowym i łożysku może zanieczyścić lokalne środowisko1. Przykładem ogromnego obciążenia, jakie takie zanieczyszczenie może stanowić zarówno dla zdrowia publicznego, jak i dla przemysłu rolnego, była niedawna epidemia gorączki Q, która miała miejsce w Holandii2. W latach 2007-2010 zdiagnozowano ponad 4000 przypadków gorączki Q u ludzi, a wybuch epidemii był związany ze znacznym zanieczyszczeniem ferm kóz3. Ponadto Coxiella jest potencjalną bronią biologiczną, zgodnie z klasyfikacją amerykańskich Centrów Kontroli i Prewencji Chorób, ze względu na stabilność środowiskową bakterii i niską dawkę zakaźną niezbędną do spowodowania ciężkiej zachorowalności i śmiertelności4.

Coxiella istnieje w dwóch fazach: organizmy fazy I, wyizolowane z naturalnych źródeł, są niezwykle zjadliwe, a organizmy fazy II są bardzo osłabione in vivo. Na przykład, po kilku pasażach in vitro organizmów Coxiella burnetii Nine Mile Phase I, wyprodukowano bakterie fazy II, które zawierają nieodwracalną delecję chromosomalną skutkującą skróceniem lipopolisacharydu (LPS)5. Szczep ten, C. burnetii NMII, jest fenotypowo podobny do fazy I w modelach hodowli tkankowych i stanowi bezpieczniejszy model dla naukowców do badania patogenezy Coxiella w laboratoriach5. W ostatnich latach kilka przełomowych odkryć przyczyniło się do szybkiego postępu w dziedzinie genetyki Coxiella. Przede wszystkim rozwój pożywki aksenowej (zakwaszonej pożywki cysteinowej cytrynianowej - ACCM-2) umożliwił bezkomórkowy wzrost Coxiella zarówno w cieczy, jak i na pożywkach stałych6,7. Zaowocowało to bezpośrednim ulepszeniem narzędzi genetycznych dostępnych dla Coxiella, w tym indukowalnego systemu ekspresji genów, wektorów wahadłowych i losowych systemów transpozonów8-11. Ostatnio opracowano również dwie metody celowanej inaktywacji genów, torując drogę do badania określonych kandydatów na geny wirulencji12.

Po internalizacji przez makrofagi pęcherzykowe, Coxiella replikuje się do dużej liczby w obrębie błony komórkowej komory zwanej wakuolą zawierającą Coxiellę (CCV). CCV wymaga transportu endocytarnego gospodarza przez wczesne i późne endosomy, aż dojrzeje do organelli pochodzącej z lizosomów13. W trakcie tego procesu CCV nabywa czynniki gospodarza, które albo pojawiają się przejściowo, albo pozostają związane z wakuolą, w tym między innymi Rab5, Rab7, CD63 i LAMP-113-15. Replikacja Coxiella w komórkach gospodarza jest całkowicie zależna od w pełni funkcjonalnego systemu wydzielania IVB typu Dot / Icm (T4SS)8,16,17. Ten system wydzielania jest strukturą wielobiałkową, spokrewnioną przodkowo z systemami koniugacyjnymi i obejmuje zarówno błony bakteryjne, jak i wakuolarne, aby dostarczyć białka bakteryjne, zwane efektorami, do cytoplazmy gospodarza18. Coxiella T4SS jest funkcjonalnie bardzo podobna do dobrze scharakteryzowanego systemu wydzielania typu IVB Dot/Icm Legionella pneumophila19,20. Co ciekawe, aktywacja T4SS i późniejsza translokacja efektorowa nie zachodzi, dopóki Coxiella nie dotrze do organelli pochodzących z kwaśnych lizosomów, około 8 godzin po zakażeniu17,21. Do tej pory zidentyfikowano ponad 130 efektorów Dot/Icm9,17,22-24. Wiele z tych efektorów prawdopodobnie odgrywa ważną rolę podczas replikacji Coxiella w komórkach gospodarza; Jednak tylko kilka efektorów zostało funkcjonalnie scharakteryzowanych25-29.

W tym badaniu wykorzystujemy test translokacji oparty na fluorescencji, który opiera się na rozszczepieniu substratu CCF2-AM FRET (zwanego dalej substratem BlaM) poprzez aktywność β-laktamazy w cytoplazmie komórki gospodarza (Rysunek 1). Interesujący gen jest połączony z TEM-1 β-laktamazą (BlaM) na plazmidzie reporterowym, który zapewnia konstytutywną ekspresję. Substrat BlaM składa się z dwóch fluoroforów (kumaryny i fluoresceiny), które tworzą parę FRET. Wzbudzenie kumaryny powoduje FRET emisji fluoresceiny i zielonej fluorescencji przy braku translokacji efektorowej; jednakże, jeśli białko fuzyjne efektora BlaM jest translokowane do cytoplazmy gospodarza, wynikowa aktywność β-laktamazy rozszczepia pierścień β-laktamowy substratu BlaM, oddzielając parę FRET, wytwarzając emisję niebieskiej fluorescencji po wzbudzeniu. Ten test translokacji został dobrze sprawdzony jako podejście do identyfikacji białek efektorowych z szeregu różnych bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, w tym C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogennej E. coli, Salmonelli i Brucella17,30-35.

Aby określić rolę określonych czynników gospodarza w translokacji efektorowej Coxiella, używamy dobrze znanej metody wyciszania genów znanej jako interferencja RNA, w szczególności małego interferującego RNA (siRNA). Pierwotnie zidentyfikowana u Caenorhabditis elegans, interferencja RNA jest konserwatywnym endogennym procesem komórkowym wykorzystywanym do wrodzonej obrony przed wirusami, a także do regulacji genów36,37. Po związaniu specyficznego dla sekwencji siRNA, degradacja mRNA zachodzi przez RISC (kompleks wyciszający indukowany RNA), co skutkuje specyficznym wyciszeniem genu lub knockdownem38. W tym badaniu siRNA wykorzystano do celowania w dwa białka gospodarza, Rab5A i Rab7A, które są ważnymi regulatorami szlaku endocytarnego. Wpływ wyciszenia Rab5A i Rab7A na translokację efektorową ustalono za pomocą C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 został wybrany, ponieważ wcześniej wykazano, że jest translokowany przez system wydzielania Dot/Icm Coxiella17.

Wykorzystując zarówno wyciszanie genów siRNA, jak i opisany tutaj test translokacji oparty na fluorescencji, zaczynamy ustalać rolę czynników gospodarza w translokacji białek efektorowych przez Coxiella. Podejście to można zastosować do szerokiej gamy bakterii zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych, które posiadają podobne systemy wydzielania odpowiedzialne za translokację białek efektorowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wszystkie procedury obejmujące hodowlę lub manipulację Coxiella burnetii RSA439 NMII powinny być przeprowadzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (Physical Containment Level 2) wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego, zgodnie z lokalnymi wytycznymi. Schematyczny przebieg badania odwrotnej transfekcji i translokacji opisany poniżej przedstawiono na Rysunku 2.

1. Przygotowanie kultury C. burnetii wykazującej ekspresję białka CBU0077 połączonego z β-laktamazą (pBlaM-CBU0077) (DZIEŃ 1)

  1. Przygotuj 1X ACCM-26:
    1. Połącz składniki wymienione w Tabeli 1. Dostosuj pH do 4,75 za pomocą 6 M NaOH i wysterylizuj przez filtrowanie (nie autoklawować). ACCM-2 jest stabilny przez około trzy tygodnie przy przechowywaniu w 4 °C.
  2. Przygotuj zapasy C. burnetii pBlaM-CBU0077.
    1. Zainfekuj komórki HeLa 229 szczepem C. burnetii niosącym pBlaM-CBU0077 i pasażuj aż do momentu zaobserwowania dużych wakuol w większości komórek.
      1. Hoduj szczep C. burnetii niosący pBlaM-CBU0077 w 20 ml ACCM-2 zawierającego 3 µg/ml chloramfenikolu w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm2 z wentylowanym zakrętką przez 7 dni w temperaturze 37 °C w 5 % CO2, 2,5 % O2.
      2. Odwiruj kulturę C. burnetii pBlaM-CBU0077 przy 15 000 × g przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
      3. Resuspenduj osad w 20 ml DMEM + 10 % płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 3 µg/ml chloramfenikolu (pożywka do utrzymania). Usuń pożywkę z kolby 75 cm2 z komórkami HeLa 229 o 50 % konfluencji. Dodaj resuspendowane C. burnetii do komórek HeLa 229. Inkubuj przez 2 dni w 37 °C w 5 % CO2, aby umożliwić ustanowienie infekcji komórek HeLa 229.
      4. Przesiej komórki do kolby do hodowli tkankowej o powierzchni 175 cm2.
        1. Usuń pożywkę z kolby 75 cm2 i dwukrotnie przemyj monowarstwę 10 ml uprzednio ogrzanego PBS.
        2. Dodaj 1 ml 0,05 % roztworu trypsyny-EDTA i inkubuj komórki w 37 °C + 5 % CO2 przez 3–5 min w celu odklejenia komórek.
        3. Resuspenduj komórki w 10 ml pożywki do utrzymania. Dodaj 2 ml resuspendowanych komórek do kolby 175 cm2 zawierającej 38 ml pożywki do utrzymania.
        4. Inkubuj w 37 °C w 5 % CO2 przez kolejne 3–5 dni, aż do osiągnięcia 100 % konfluencji i zaobserwowania dużych wakuol.
    2. Zbierz nadsącz z kolby 175 cm2, dodaj 10 ml dH2O, aby pokryć zainfekowane komórki HeLa 229, i inkubuj przez 15 min w celu lizy zainfekowanych komórek.
    3. Połącz nadsącz z lizowanymi komórkami i odwiruj przy 15 000 × g przez 15 min w RT.
    4. Resuspenduj osad w 10 ml dH2O. Dalszą lizę komórek przeprowadź, wielokrotnie przepuszczając resuspensję przez igłę 23G przymocowaną do strzykawki 10 ml, co najmniej 20 razy. Odwiruj przy 500 × g przez 5 min, aby usunąć szczątki komórkowe.
    5. Zbierz nadsącz i odwiruj przy 15 000 × g przez 15 min w RT, aby zebrać C. burnetii.
    6. Resuspenduj C. burnetii w DMEM + 10 % FCS i określ liczbę bakterii zgodnie z punktem 4. Rozcieńcz do 1 × 109 genomów/ml przy użyciu DMEM + 10 % FCS + 10 % dimetylosulfoksydu (DMSO), rozdziel zapasy po 50 µl do probówek do mikrocentryfugi i przechowuj w -80 °C.
  3. Zaszczep 10 ml uprzednio ogrzanego ACCM-2 zawierającego 3 µg/ml chloramfenikolu 20 µl szczepu C. burnetii pBlaM-CBU007717 (z zapasów przygotowanych w punkcie 1.2, przechowywanych w -80 °C) w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 25 cm2 z wentylowaną zakrętką. Hoduj kulturę bakteryjną przez 7 dni w 37 °C w 5 % CO2, 2,5 % O2.

2. Odwrócona transfekcja siRNA i wysiew komórek HeLa 229 (DZIEŃ 4)

  1. Przy pierwszym użyciu eksperymentalnego siRNA przygotuj siRNA w następujący sposób:
    1. Krótko odwiruj liofilizowane siRNA, aby upewnić się, że pellet siRNA zebrał się na dnie probówki.
    2. Resuspenduj pellet siRNA do końcowego stężenia zapasu 20 µM, pipetując odpowiednią objętość buforu do siRNA 1x (Tabela 2).
    3. Pipetuj roztwór w górę i w dół 3–5 razy w celu wymieszania, a następnie umieść na mieszalniku orbitalnym przez 30 min w RT, odwracając probówkę co 5–10 min.
    4. Krótko odwiruj probówkę, aby upewnić się, że siRNA zebrało się na dnie probówki.
    5. Rozdziel siRNA na aliquoty po 50 µl w probówkach do mikrocentryfugi i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    6. Aby przygotować roztwór roboczy siRNA o stężeniu 1 µM, pipetuj w razie potrzeby 950 µl buforu do siRNA 1X do jednej aliquoty zapasu 50 µl (20 µM). Uwaga: Ten roztwór roboczy o stężeniu 1 µM może być wielokrotnie zamrażany i rozmrażany do ponownych transfekcji.
  2. Umieść DMEM + 10 % FCS, 0,05 % trypsyny-EDTA oraz PBS w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C (lub odpowiedniku) na 30 min w celu ogrzania przed użyciem.
  3. Przygotowanie komponentów do transfekcji:
    Uwaga: Poniższy protokół został zoptymalizowany dla komórek HeLa 229 w mikro płytce 96-dołkowej z czarnymi ściankami i płaskim, przezroczystym dnem. W przypadku innych linii komórkowych konieczna może być optymalizacja ilości odczynnika do transfekcji, stężenia siRNA oraz gęstości siewu komórek.
    1. Dla każdego dołka użyj 0,1 µl odczynnika do transfekcji, 15,9 µl medium z obniżoną zawartością surowicy (minimalne medium niezbędne do transfekcji, patrz Tabela Materiałów) oraz 4 µl siRNA o stężeniu 1 µM (co daje końcowe stężenie siRNA wynoszące 40 nM). Użyj oddzielnych probówek do mikrocentryfugi dla OTP, PLK1, Rab5A i Rab7A. Każdy warunek badawczy zmierz w trzech powtórzeniach. Przykład układu płytki 96-dołkowej przedstawiono na Rysunku 3.
      Uwaga: Protokół ten obejmuje zastosowanie dwóch kontroli: OTP i PLK1. OTP składa się z czterech połączonych siRNA, które zostały zoptymalizowane w celu zmniejszenia efektów off-target, dlatego OTP jest stosowane jako negatywna kontrola niecelująca. Jako kontrola negatywna może być również użyte siRNA typu scrambled. Utrata ekspresji PLK1 prowadzi do rozległej śmierci komórek w wielu liniach komórkowych poprzez indukcję ścieżek proapoptotycznych, dlatego siRNA PLK1 jest stosowane jako kontrola pozytywna transfekcji, gdzie śmierć komórek koreluje z wydajnością transfekcji.
      1. Dla każdej eksperymentalnej transfekcji siRNA połącz 0,4 µl odczynnika do transfekcji i 63,6 µl medium z obniżoną zawartością surowicy w oddzielnej probówce do mikrocentryfugi. Wymieszaj wszystkie probówki w wortexie i pozostaw komponenty do utworzenia kompleksów przez 5 min w RT.
      2. Dodaj 16 µl każdego eksperymentalnego siRNA do odpowiednich probówek zawierających kompleks transfekcyjny. Wymieszaj w wortexie i inkubuj przez 20 min w RT. Uwaga: Ważne jest, aby nie przekroczyć 30 min, ponieważ wydajność transfekcji spadnie.
  4. W czasie 20-minutowej inkubacji (2.3.1.2) dodaj 20 µl mieszaniny odczynnika do transfekcji + medium z obniżoną zawartością surowicy + siRNA do odpowiednich dołków sterylnej czarnej płytki 96-dołkowej z płaskim, przezroczystym dnem.
  5. Natychmiast po zakończeniu 20-minutowego okresu inkubacji wysiej komórki HeLa 229 z gęstością 3,92 × 103 komórek/dołek.
    1. Zabierz komórki HeLa 229 z konfluencyjnej lub subkonfluencyjnej kolby do hodowli tkankowej 75 cm2 w uprzednio ogrzanym DMEM + 10 % FCS i resuspenduj komórki do końcowej gęstości 4,9 × 104 komórek/ml zgodnie ze standardowymi metodami. Aby nie pogorszyć wydajności transfekcji, przygotuj komórki podczas 20-minutowego okresu inkubacji (2.3.1.2).
      1. Przemyj monowarstwę komórek HeLa 229 dwukrotnie 10 ml uprzednio ogrzanego PBS.
      2. Dodaj 1 ml 0,05 % roztworu trypsyny-EDTA i inkubuj komórki HeLa 229 w temperaturze 37 °C + 5 % CO2 przez 3–5 min w celu odczepienia komórek.
      3. Zbierz komórki w 9 ml uprzednio ogrzanego DMEM + 10 % FCS. Policz komórki za pomocą hemosytometru i przygotuj zawiesinę o końcowej gęstości 4,9 × 104 komórek/ml w DMEM + 10 % FCS.
    2. Pipetuj 80 µl komórek HeLa 229 o gęstości 4,9 × 104 komórek/ml do każdego dołka zawierającego mieszaninę odczynnika do transfekcji + medium z obniżoną zawartością surowicy + siRNA. Odpowiada to gęstości komórek wynoszącej 3,92 × 103 komórek/dołek.
      Uwaga: Wymagane jest odjęcie tła dla substratu BlaM.
      1. Nie dodawaj komórek ani siRNA do dołków „blank” (Rysunek 3). Zamiast tego dodaj 80 µl DMEM + 10 % FCS do tych dołków przygotowanych w trzech powtórzeniach.
    3. Inkubuj przez 24 h w temperaturze 37 °C + 5 % CO2.

3. Wymiana pożywki (DZIEŃ 5)

  1. Po 24 h usunąć pożywkę za pomocą adaptera wielokanałowego podłączonego do źródła próżni lub ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie zastąpić ją 100 µl świeżego, uprzednio ogrzanego DMEM + 10% FCS.
  2. Inkubować przez kolejne 48 h w temperaturze 37 °C + 5 % CO2.
  3. Na tym etapie sprawdzić wizualnie żywotność komórek przy użyciu standardowego mikroskopu świetlnego. Jeśli transfekcja odwrotna przebiegła pomyślnie, w studzienkach zawierających PLK1 siRNA zaobserwuje się znaczną śmierć komórek w porównaniu do OTP siRNA.

4. Ilościowe oznaczenie szczepu Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 za pomocą qPCR (DZIEŃ 7)

  1. Po 7 dniach wzrostu w pożywce ACCM-2 w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2, 2.5% O2 (1.3), odwirować 10 ml hodowli C. burnetii pBlaM-CBU0077 przy 15 000 × g przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Resuspender osad bakteryjny w 10 ml podgrzanego DMEM + 10 % FCS. Przygotować rozcieńczenia hodowli (próbki) w stosunku 1:10 i 1:100, używając dH2O.
  3. Przygotować komponenty wymagane do qPCR.
    Uwaga: ekstrakcję gDNA można przeprowadzić wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    1. Przygotowanie standardów:
      1. Wyizolować gDNA z dzikiego szczepu Coxiella burnetii RSA439 NMII hodowanego w ACCM-2 w temperaturze 37 °C w atmosferze 5 % CO2, 2.5 % O2 przez 7 dni, używając zestawu do ekstrakcji gDNA zgodnie z instrukcją producenta.
      2. Zmierzyć stężenie gDNA (g/µl) za pomocą Nanodrop (lub odpowiednika) przy absorbancji 260 nm.
      3. Obliczyć liczbę kopii genomu na µl, korzystając z poniższego wzoru, a następnie przeliczyć na liczbę genomów/ml.
        figure-protocol-1
      4. Dostosować liczbę genomów/ml do poziomu 109/ml (w końcowej objętości 100 µl) w nowej probówce do mikrocentryfugi, używając dH2O. Próbkę tę można gotować przez 10 min i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      5. W dniu infekcji przygotować 10-krotne rozcieńczenia szeregowe od 108 genomów/ml do 105 genomów/ml z roztworu zapasowego 109 genomów/ml.
        1. Pipetować 10 µl roztworu 109 genomów/ml do 90 µl dH2O, aby uzyskać 108 genomów/ml. Wymieszać w wortexie. Pipetować 10 µl roztworu 108 genomów/ml do 90 µl dH2O, aby uzyskać 107 genomów/ml. Wymieszać w wortexie i powtarzać czynność aż do uzyskania 105 genomów/ml.
    2. Przygotowanie reakcji qPCR. Stworzyć master mix dla 25 dołków, aby uwzględnić ewentualne błędy pipetowania. Do każdego dołka użyć 10 µl qPCR Master Mix, 2 µl mieszaniny starterów ompA (4.3.2.2) oraz 3 µl dH2O.
      Uwaga: OmpA jest białkiem błony zewnętrznej C. burnetii'39, a fragment o długości 82 par zasad w obrębie wysoce konserwatywnego regionu został wybrany do zastosowania jako sonda, jak opisano wcześniej40.
      1. Przygotować każdy standard (dH2O, 105, 106, 107, 108, 109 genomów/ml) oraz próbkę (rozcieńczenie 1:10 i 1:100) w 96-dołkowej płytce PCR typu tear-away (bez ramki), odpowiednio w duplikacie lub triplikacie. Dodać 5 µl próbki lub standardu do odpowiednich dołków.
      2. Używając dH2O, rozcieńczyć zarówno startery przedni (forward) ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3'), jak i odwrotny (reverse) ompA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') do stężenia końcowego 4 µM i połączyć w jednej probówce do mikrocentryfugi.
        Uwaga: Mieszaninę starterów ompA można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      3. Połączyć 250 µl qPCR Master Mix, 50 µl mieszaniny starterów ompA oraz 75 µl dH2O i wymieszać w wortexie. Dodać 15 µl tego master mixu do dołków zawierających standardy lub próbki.
      4. Nałożyć 8-dołkowe nakrętki do pasków PCR na odpowiednie dołki i krótko odwirować probówki PCR, aby upewnić się, że cała zawartość znajduje się na dnie probówek.
      5. Ustawić następujący program w urządzeniu do ilościowej PCR: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 10 min, a następnie 45 cykli: 95 °C przez 1 s i 60 °C przez 20 s (Rysunek 4A).
    3. Przeanalizować wartości Ct (cycle threshold) z qPCR:
      1. Przenieść wartości Ct do arkusza kalkulacyjnego za pomocą funkcji eksportu programu.
      2. Stworzyć wykres rozrzutu dla standardów od 105 genomów/ml do 109 genomów/ml (wyrażonych jako wartości logarytmiczne). Odrzucić oczywiste wartości odstające spośród próbek w triplikatach. Wyznaczyć logarytmiczną linię trendu i ustalić równanie wykresu.
      3. Obliczyć całkowitą liczbę genomów/ml w próbce, korzystając z równania wyznaczonego w punkcie 4.3.3.2. Należy pamiętać o uwzględnieniu początkowego rozcieńczenia próbek (1:10 i 1:100).

5. Zakażanie komórek poddanych odwrotnej transfekcji (DZIEŃ 7)

  1. Po obliczeniu całkowitej liczby genomów/ml w kulturze C. burnetii pBlaM-CBU0077 przeznaczonej do infekcji, dostosuj stężenie resuspendowanej kultury bakteryjnej w celu zainfekowania komórek przy MOI równym 300 w końcowej objętości 50 µl/studzienkę, używając uprzednio ogrzanego medium DMEM + 10% FCS.
    Uwaga: Przewidywana gęstość wysianych komórek HeLa 229 o normalnym czasie podwojenia po 72 h wynosi 3,136 × 104 komórek/studzienkę. Ilość bakterii wymagana do infekcji przy MOI 300 wynosi 9,408 × 106 w 50 µl, co odpowiada 1,88 × 108 bakterii/ml.
    1. Wykorzystując wartość obliczoną za pomocą qPCR (genomy/ml) (4.3.3.3), rozcieńcz resuspendowane bakterie, używając uprzednio ogrzanego medium DMEM + 10 % FCS w końcowej objętości 2 ml, aby zainfekować komórki poddane odwrotnej transfekcji.
  2. Usuń obecne medium z komórek kontrolnych (blank) oraz komórek poddanych odwrotnej transfekcji.
  3. Dodaj 50 µl rozcieńczonych bakterii (1,88 × 108 bakterii/ml) do odpowiednich studzienek. Dodaj 50 µl DMEM + 10% FCS do studzienek kontrolnych oraz niezinfekowanych.
  4. Inkubuj przez 24 h w temperaturze 37 °C + 5 % CO2.

6. Dodanie substratu BlaM w celu określenia poziomu translokacji (DZIEŃ 8)

  1. Przygotować roztwory do 6-krotnego roztworu ładującego dla substratu BlaM.
    Uwaga: Roztwory A, B i C znajdują się w zestawie do substratu BlaM (patrz: Tabela materiałów). W roztworze B w temperaturze pokojowej (RT) może wytrącić się osad. Przed użyciem należy podgrzać ten roztwór do 37 °C, aby osad się rozpuścił.
    1. Przy pierwszym użyciu zestawu dodać 185 µl DMSO (załączonego do zestawu do substratu BlaM) do wysuszonego roztworu A. Następnie ponownie zawieszony roztwór A przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować wcześniej roztwór probenicydy 0,1 M i przechowywać w alikwotach po 1 ml w temperaturze -20°C do momentu użycia.
      1. Przygotować 0,4 M NaOH (1,6 g w 100 ml dH2O).
      2. Przygotować 100 mM bufor fosforanowy sodu pH 8 (1,56 g NaH2PO4.2H2O i 1,41 g Na2HPO4 w 100 ml dH2O).
      3. Rozpuścić 1,25 g probenicydy w 22 ml 0,4 M NaOH poprzez intensywne mieszanie.
      4. Dodać 22 ml 100 mM buforu fosforanowego sodu pH 8 (roztwór stanie się mętny) i mieszać, aby rozpuścić powstający osad.
      5. Dostosować pH do wartości 8 (jeśli to konieczne) za pomocą 1 M NaOH/HCl.
      6. Mieszać intensywnie i łagodnie podgrzewać (< 50 °C), aż roztwór stanie się niemal przejrzysty.
      7. Przefiltrować (pory 0,2 µm) i rozdzielić na alikwoty po 1 ml. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20°C.
  2. Na każdą studzienkę przypada 0,06 µl roztworu A, 0,54 µl roztworu B, 7,9 µl roztworu C i 1,5 µl probenicydy 0,1 M. Przygotować master mix dla 30 studzienek, łącząc najpierw w probówce do wirówki 1,8 µl roztworu A i 16,2 µl roztworu B. Wymieszać dokładnie za pomocą vortexa. Dodać 237 µl roztworu C i 45 µl probenicydy 0,1 M. Wymieszać wszystkie składniki za pomocą vortexa.
    Uwaga: 6-krotny roztwór ładujący jest stabilny przez maksymalnie 4 h (w ciemności), ale należy go przygotować jak najpóźniej przed użyciem.
  3. Dodać 10 µl 6-krotnego roztworu ładującego bezpośrednio do wszystkich pustych studzienek oraz studzienek z transfekcją odwrotną, nie usuwając istniejącego medium.
  4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 h w ciemności.
  5. Aby określić poziom translokacji, zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek.
    Uwaga: poniższa procedura dotyczy czytnika mikropłytek ClarioSTAR. Można również użyć równoważnych czytników mikropłytek.
    1. Utworzyć nowy protokół intensywności fluorescencji, wybierając tryb odczytu punkt końcowy (endpoint).
    2. Dostosować parametry podstawowe w następujący sposób:
      1. Wybrać mikropłytkę 96-dołkową.
      2. W ustawieniach optycznych wybrać dwa multichromatyki z następującymi ustawieniami zdefiniowanymi przez użytkownika: (1) wzbudzenie 410-10 nm i emisja 520-10 nm. (2) wzbudzenie 410-10 nm i emisja 450-10 nm. Upewnić się, że wybrano multichromatyki dla studzienek.
      3. Wybrać uśrednianie orbitalne o średnicy 3 mm.
      4. W sekcji optyki wybrać optykę dolną (bottom optic).
      5. W sekcji prędkości i precyzji wybrać tryb precyzyjny (precise). Odpowiada to ośmiu regionom na studzienkę.
    3. Dostosować układ płytki, wybierając odpowiednie studzienki jako próbki.
    4. Wybrać start pomiaru.
    5. Zdjąć pokrywkę i włożyć tacę do czytnika płytek. Aby uniknąć osiągnięcia maksymalnych wartości fluorescencji, należy dostosować wartość wzmocnienia (gain). W tym celu przeprowadzić regulację wzmocnienia w jednej z zainfekowanych studzienek, w której przeprowadzono transfekcję odwrotną siRNA OTP. Odpowiada to najwyższej oczekiwanej translokacji.
    6. Wybrać start pomiaru, aby zmierzyć wszystkie odpowiednie studzienki przy użyciu fluorescencji dolnej przy wzbudzeniu 410 nm i emisji odpowiednio 450 nm oraz 520 nm dla fluorescencji niebieskiej i zielonej.

7. Analiza wyników:

  1. Oblicz stosunek 450 nm do 520 nm (niebieskiego do zielonego) dla wszystkich próbek po odjęciu tła i wyraź go względem nieinfected OTP.
    Uwaga: poniższe kroki analizy są przeznaczone dla prostego programu arkusza kalkulacyjnego.
    1. Używając funkcji eksportu w czytniku mikropłytek, przenieś surowe wartości fluorescencji uzyskane dla obu długości fal emisji 520 nm i 450 nm (6.5) do arkusza kalkulacyjnego.
    2. Oblicz średnią odczytów „tła” (sama pożywka, bez komórek) dla długości fali 520 nm, sumując surowe wartości fluorescencji 520 nm i dzieląc przez liczbę studzienek (3). Powtórz czynność dla wartości tła dla długości fali 450 nm. Wartości te reprezentują fluorescencję tła wynikającą z płytki 96-dołkowej i pożywki.
    3. Odejmij fluorescencję tła. Używając wartości uzyskanych w punkcie 7.1.2, odejmij średnią tła dla długości fali 520 nm od wszystkich wartości fluorescencji próbek przy 520 nm. Powtórz dla wartości długości fali 450 nm.
    4. Aby uzyskać stosunek 450:520 nm, użyj wartości skorygowanych o tło (7.1.3). Podziel każdą wartość fluorescencji próbki przy 450 nm przez odpowiadającą jej wartość przy 520 nm.
    5. Oblicz średnią wartości stosunku dla nieinfected OTP, sumując wartości stosunków 450:520 nm (z punktu 7.1.4) i dzieląc przez liczbę studzienek (3).
    6. Oblicz stosunek próbek względem nieinfected OTP, dzieląc stosunek 450:520 nm obliczony w punkcie 7.1.4 przez średnią wartość stosunku dla nieinfected OTP obliczoną w punkcie 7.1.5.

8. Dodanie barwnika jąder komórkowych w celu określenia liczby komórek po teście translokacji (DZIEŃ 8)

  1. Po ilościowym oznaczeniu fluorescencji usunąć z wszystkich studzienek pożywkę zawierającą 6x bufor do ładowania, używając adaptera wielokanałowego podłączonego do źródła próżni lub ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej.
  2. Do wszystkich odpowiednich studzienek dodać 50 µl 4 % roztworu PFA (paraformaldehydu) w PBS w celu utrwalenia komórek. Inkubować w RT przez 20 min.
  3. Usunąć roztwór 4 % PFA w PBS (zgodnie z punktem 8.1) i dwukrotnie przemyć komórki 75 µl PBS.
  4. Do każdej studzienki dodać 50 µl barwnika jądrowego przenikającego przez błony komórkowe, np. DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindolu). Wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i oznaczyć ilościowo liczbę jąder obecnych w każdej studzience po traktowaniu siRNA, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ41.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu wybrano szczep C. burnetii pBlaM-CBU0077, ponieważ wcześniej wykazano, że CBU0077 jest translokowanym efektorem systemu sekrecji Dot/Icm bakterii Coxiella17. Przed infekcją określono całkowitą liczbę genomów/ml w siedmiodniowej hodowli C. burnetii pBlaM-CBU0077 za pomocą qPCR. Rysunek 4 przedstawia przykład wartości progu cyklu (Ct) oczekiwanych dla standardów oraz próbek po przeprowadzeniu qPCR. Wartości Ct (prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Systemy wydzielania i bakteryjne białka efektorowe, które te systemy transportują do cytoplazmy komórek gospodarza, są ważnym składnikiem wirulencji, który wiele bakterii chorobotwórczych wykorzystuje do ustanowienia infekcji w unikalnych niszach replikacyjnych. Wiele grup badawczych skupiło się na zbadaniu wzajemnych oddziaływań między efektorami bakteryjnymi a białkami gospodarza oraz wpływu tych efektorów na szlaki komórkowe gospodarza. Bardzo ograniczone badania, jeśli w ogóle, dotyczyły potencjału białek gospodarza ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Health and Medical Research Council (NHMRC) (Grant ID 1062383 i 1063646) przyznane HJN. EAL jest wspierany przez Australian Postgraduate Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Kwas cytrynowySigmaC0759ACCM-2 średni składnik
Cytrynian soduSigmaS4641ACCM-2 średni składnik
Fosforan potasuSigma60218ACCM-2 średni składnik
Chlorek magnezuCalbiochem442611ACCM-2 medium składnik
Chlorek wapniaSigmaC5080ACCM-2 średni składnik
Siarczan żelazaFisherS93248ACCM-2 średni składnik
Chlorek soduSigmaS9625ACCM-2 średni składnik
L-cysteinaSigmaC6852ACCM-2 średni składnik
Bacto-neopeptonBD211681ACCM-2 medium składnik
Casamino acidyFisherBP1424ACCM-2 średni składnik
Beta-cyklodekstryna metylowaSigmaC4555ACCM-2 średni składnik
RPMI + GlutamaxThermoFisher Scientific61870-036ACCM-2 średni składnik
ChloramfenikolSigmaC0378Do hodowli bakteryjnych
ON-TARGETplus Kontrola nieukierunkowana Pula (OTP)DharmaconD-001810-10-05Kontrola nieukierunkowana
siGENOME Ludzki PLK1 (5347) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-003290-01-005Powoduje śmierć komórki; miara skuteczności transfekcji
siGENOME Ludzki RAB5A (5968) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-004009-00-0005
siGENOME Ludzki RAB7A (7879) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-010388-00-0005
5x bufor siRNADharmaconB-002000-UB-100Użyj sterylnej wody wolnej od RNaz do rozcieńczenia 5x bufor siRNA do 1x buforu siRNA
Odczynnik do transfekcji DharmaFECT-1DharmaconT-2001-01Do transfekcji
Opti-MEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific51985-034Pożywka o zredukowanej surowicy używana do transfekcji
DMEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific10567-014Do hodowli komórkowych i infekcji
Inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca (FCS)Thermo ScientificSH30071.03Można użyć alternatywnego równoważnego produktu
DMSOSigmaD8418Do przechowywania szczepu Coxiella
PBSDo hodowli komórkowej
0,05% Trypsyna + EDTAThermoFisher Scientific25300-054Do hodowli komórkowej
dH2ODo rozcieńczania próbek i wzorców do qPCR
Quick-gDNA Mini PrepZYMO ResearchD3007Może używać alternatywnego równoważnego produktu do ekstrakcji gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX KitBiolineBIO-98020Może używać alternatywnego odpowiednika produktu qPCR master mix do reakcji qPCR
LiveBLAzer FRET-B/G Zestaw ładujący z CCF2-AMInvitrogenK1032Do pomiaru translokacji za pomocą fluorescencji i wytwarzania roztworu ładującego 6X (zawiera roztwór A, B, C i DMSO)
Wodorotlenek soduMerck106469Składnik roztworu probenicydu
Fosforan sodu jednozasadowySigma71505Składnik roztworu probenicydu
di-Wodorortofosforan soduMerck106586Roztwór probenicydu składnik
ProbenicidSigmaP8761Składnik roztworu probenicydu
DRAQ5 Roztwór sondy fluorescencyjnej (5 mM)ThermoFisher Scientific62251Barwienie jąder w celu określenia żywotności komórek. Stosować 1:4000 rozcieńczony w PBS. 
4% roztwór PFA (paraformaldehydu) w PBSSigmaP6148Roztwór utrwalający do komórek HeLa 229
Kolba do hodowli tkankowych 25 cm2 z wentylowaną nasadkąCorning430639Do wzrostu szczepu bakteryjnego
96 Well Flat Clear Czarne mikropłytki z polistyrenu poddanego działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylneCorning3603
75 cm2 kolba do hodowli tkankowych z wentylowaną nasadkąCorning430641Do wzrostu komórek HeLa 229
Kolba do hodowli tkankowych 175 cm2 z wentylowaną nasadkąCorning431080Do wzrostu komórek HeLa 229
HemocytometrDo oznaczania ilościowego komórek HeLa 229
Płytki Tear-A-Way 96 Well PCR4titude4ti-0750/TADo qPCR Łańcuch reakcyjny
8-wieczkowy, płaskiSarstedt65.989.002Do reakcji qPCR
NazwaFirma<silny>Numer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Mikrofuge
Wir
Mieszalnik
WirówkaEppendorf5810 RDo granulowania kultur bakteryjnych
NanodropDo kwantyfikacji gDNA
Maszyna Mx3005P QPCRAligent Technologies401456Do oznaczania ilościowego genomów Coxiella w 7-dniowej hodowli
Mikropłytka ClarioSTAR czytnikBMG LabTechDo pomiaru fluorescencji
stołowystołowyorbitalny

Bibliografia

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97(2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056(2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566(2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117(2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252(2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013(2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza FRETwyciszanie Rab5Awyciszanie Rab7Areporter BlaMinterakcje gospodarz-patogenmikrobiologia komórkowapomiar fluorescencji
Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.