Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Coxiella burnetii to unikalny wewnątrzkomórkowy patogen, który powoduje odzwierzęcą infekcję człowieka gorączką Q. Choroba ta wiąże się z szerokim spektrum objawów klinicznych, począwszy od bezobjawowej serokonwersji do zagrażającej życiu przewlekłej infekcji, która często objawia się zapaleniem wsierdzia wiele lat po ekspozycji¹. Do zakażenia człowieka dochodzi głównie poprzez wdychanie skażonych aerozoli z przeżuwaczami, które są głównym rezerwuarem infekcji, w szczególności krów mlecznych, owiec i kóz. Chociaż zakażenie Coxiella u tych zwierząt jest zazwyczaj subkliniczne, zakażenie może wywołać poronienie, a znaczne obciążenie bakteryjne w płynie porodowym i łożysku może zanieczyścić lokalne środowisko¹. Przykładem ogromnego obciążenia, jakie takie zanieczyszczenie może stanowić zarówno dla zdrowia publicznego, jak i dla przemysłu rolnego, była niedawna epidemia gorączki Q, która miała miejsce w Holandii². W latach 2007-2010 zdiagnozowano ponad 4000 przypadków gorączki Q u ludzi, a wybuch epidemii był związany ze znacznym zanieczyszczeniem ferm kóz³. Ponadto Coxiella jest potencjalną bronią biologiczną, zgodnie z klasyfikacją amerykańskich Centrów Kontroli i Prewencji Chorób, ze względu na stabilność środowiskową bakterii i niską dawkę zakaźną niezbędną do spowodowania ciężkiej zachorowalności i śmiertelności⁴.

Coxiella istnieje w dwóch fazach: organizmy fazy I, wyizolowane z naturalnych źródeł, są niezwykle zjadliwe, a organizmy fazy II są bardzo osłabione in vivo. Na przykład, po kilku pasażach in vitro organizmów Coxiella burnetii Nine Mile Phase I, wyprodukowano bakterie fazy II, które zawierają nieodwracalną delecję chromosomalną skutkującą skróceniem lipopolisacharydu (LPS)⁵. Szczep ten, C. burnetii NMII, jest fenotypowo podobny do fazy I w modelach hodowli tkankowych i stanowi bezpieczniejszy model dla naukowców do badania patogenezy Coxiella w laboratoriach⁵. W ostatnich latach kilka przełomowych odkryć przyczyniło się do szybkiego postępu w dziedzinie genetyki Coxiella. Przede wszystkim rozwój pożywki aksenowej (zakwaszonej pożywki cysteinowej cytrynianowej - ACCM-2) umożliwił bezkomórkowy wzrost Coxiella zarówno w cieczy, jak i na pożywkach stałych^6,7. Zaowocowało to bezpośrednim ulepszeniem narzędzi genetycznych dostępnych dla Coxiella, w tym indukowalnego systemu ekspresji genów, wektorów wahadłowych i losowych systemów transpozonów^8-11. Ostatnio opracowano również dwie metody celowanej inaktywacji genów, torując drogę do badania określonych kandydatów na geny wirulencji¹².

Po internalizacji przez makrofagi pęcherzykowe, Coxiella replikuje się do dużej liczby w obrębie błony komórkowej komory zwanej wakuolą zawierającą Coxiellę (CCV). CCV wymaga transportu endocytarnego gospodarza przez wczesne i późne endosomy, aż dojrzeje do organelli pochodzącej z lizosomów¹³. W trakcie tego procesu CCV nabywa czynniki gospodarza, które albo pojawiają się przejściowo, albo pozostają związane z wakuolą, w tym między innymi Rab5, Rab7, CD63 i LAMP-1^13-15. Replikacja Coxiella w komórkach gospodarza jest całkowicie zależna od w pełni funkcjonalnego systemu wydzielania IVB typu Dot / Icm (T4SS)^8,16,17. Ten system wydzielania jest strukturą wielobiałkową, spokrewnioną przodkowo z systemami koniugacyjnymi i obejmuje zarówno błony bakteryjne, jak i wakuolarne, aby dostarczyć białka bakteryjne, zwane efektorami, do cytoplazmy gospodarza¹⁸. Coxiella T4SS jest funkcjonalnie bardzo podobna do dobrze scharakteryzowanego systemu wydzielania typu IVB Dot/Icm Legionella pneumophila^19,20. Co ciekawe, aktywacja T4SS i późniejsza translokacja efektorowa nie zachodzi, dopóki Coxiella nie dotrze do organelli pochodzących z kwaśnych lizosomów, około 8 godzin po zakażeniu^17,21. Do tej pory zidentyfikowano ponad 130 efektorów Dot/Icm^9,17,22-24. Wiele z tych efektorów prawdopodobnie odgrywa ważną rolę podczas replikacji Coxiella w komórkach gospodarza; Jednak tylko kilka efektorów zostało funkcjonalnie scharakteryzowanych^25-29.

W tym badaniu wykorzystujemy test translokacji oparty na fluorescencji, który opiera się na rozszczepieniu substratu CCF2-AM FRET (zwanego dalej substratem BlaM) poprzez aktywność β-laktamazy w cytoplazmie komórki gospodarza (Rysunek 1). Interesujący gen jest połączony z TEM-1 β-laktamazą (BlaM) na plazmidzie reporterowym, który zapewnia konstytutywną ekspresję. Substrat BlaM składa się z dwóch fluoroforów (kumaryny i fluoresceiny), które tworzą parę FRET. Wzbudzenie kumaryny powoduje FRET emisji fluoresceiny i zielonej fluorescencji przy braku translokacji efektorowej; jednakże, jeśli białko fuzyjne efektora BlaM jest translokowane do cytoplazmy gospodarza, wynikowa aktywność β-laktamazy rozszczepia pierścień β-laktamowy substratu BlaM, oddzielając parę FRET, wytwarzając emisję niebieskiej fluorescencji po wzbudzeniu. Ten test translokacji został dobrze sprawdzony jako podejście do identyfikacji białek efektorowych z szeregu różnych bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, w tym C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogennej E. coli, Salmonelli i Brucella^17,30-35.

Aby określić rolę określonych czynników gospodarza w translokacji efektorowej Coxiella, używamy dobrze znanej metody wyciszania genów znanej jako interferencja RNA, w szczególności małego interferującego RNA (siRNA). Pierwotnie zidentyfikowana u Caenorhabditis elegans, interferencja RNA jest konserwatywnym endogennym procesem komórkowym wykorzystywanym do wrodzonej obrony przed wirusami, a także do regulacji genów^36,37. Po związaniu specyficznego dla sekwencji siRNA, degradacja mRNA zachodzi przez RISC (kompleks wyciszający indukowany RNA), co skutkuje specyficznym wyciszeniem genu lub knockdownem³⁸. W tym badaniu siRNA wykorzystano do celowania w dwa białka gospodarza, Rab5A i Rab7A, które są ważnymi regulatorami szlaku endocytarnego. Wpływ wyciszenia Rab5A i Rab7A na translokację efektorową ustalono za pomocą C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 został wybrany, ponieważ wcześniej wykazano, że jest translokowany przez system wydzielania Dot/Icm Coxiella¹⁷.

Wykorzystując zarówno wyciszanie genów siRNA, jak i opisany tutaj test translokacji oparty na fluorescencji, zaczynamy ustalać rolę czynników gospodarza w translokacji białek efektorowych przez Coxiella. Podejście to można zastosować do szerokiej gamy bakterii zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych, które posiadają podobne systemy wydzielania odpowiedzialne za translokację białek efektorowych.

Uwaga: Wszystkie procedury związane z hodowlą lub manipulacją Coxiella burnetii RSA439 NMII powinny być wykonywane w Laboratorium Fizycznego Poziomu Zabezpieczenia 2 oraz w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zgodnie z lokalnymi wytycznymi. Schemat ideowy przepływu pracy testu odwrotnej transfekcji i translokacji opisany poniżej przedstawiono na rysunku 2.

1. Przygotowanie kultury C. burnetii wyrażającej CBU0077 skondensowanej z β-laktamazą (pBlaM-CBU0077) (DZIEŃ 1)

1. Przygotuj 1X ACCM-2⁶:
   1. Połącz składniki wymienione w tabeli 1. Doprowadzić pH do 4,75 za pomocą 6 M NaOH i sterylizować filtrem (nie sterylizować w autoklawie). ACCM-2 jest stabilny przez około trzy tygodnie przechowywany w temperaturze 4 °C.
2. Generowanie zapasów C. burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Zainfekuj komórki HeLa 229 szczepem C. burnetii przenoszącym pBlaM-CBU0077 i pasażem, aż w większości komórek zaobserwuje się duże wakuole.
      1. Hodować szczep C. burnetii przenoszący pBlaM-CBU0077 w 20 ml ACCM-2 zawierającym 3 μg/ml chloramfenikolu w kolbie do hodowli tkankowej o długości 75^cm2 z wentylowaną nasadką przez 7 dni w temperaturze 37 °C w 5 % CO₂, 2,5 % O_{2 .}
      2. Odwirować kulturę C. burnetii pBlaM-CBU0077 w stężeniu 15 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Ponownie zawiesić osad w 20 ml DMEM + 10 % płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 3 μg/ml chloramfenikolu (pożywka podtrzymująca). Usunąć pożywkę z 50 % zlewającej się kolby o długości 75^cm2 z komórkami HeLa 229. Dodać ponownie zawieszoną C. burnetii do komórek HeLa 229. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 5 % CO_{2 w} celu umożliwienia zakażenia komórek HeLa 229.
      4. Podzielić komórki do kolby do hodowli tkankowej o długości 175^cm2.
         1. Wyjąć pożywkę z kolby o długości 75^cm2 i dwukrotnie przemyć monowarstwę 10 ml wstępnie podgrzanego PBS.
         2. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA i umieścić komórki w temperaturze 37 °C + 5 % CO₂ na 3-5 minut w celu odłączenia komórek.
         3. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki konserwacyjnej. Dodać 2 ml ponownie zawieszonych komórek do kolby o długości 175^cm2 zawierającej 38 ml pożywki do konserwacji.
         4. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5 % CO₂ przez kolejne 3–5 dni, aż do osiągnięcia 100 % zbiegu i zaobserwowania dużych wakuoli.
   2. Zebrać supernatant z kolby o długości^{175 cm2}, dodać 10 ml_dH2O, aby pokryć zakażone komórki HeLa 229 i inkubować przez 15 minut w celu lizy zakażonych komórek.
   3. Połączyć supernatant i lizowane komórki i osad w ilości 15 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Ponownie zawiesić osad w 10 ml_dH2O. Dalej lizować komórki, wielokrotnie przepuszczając reparację przez igłę 23G dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml co najmniej 20 razy. Granulat w ilości 500 × g przez 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
   5. Usunąć i zagnieździć supernatant w ilości 15 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu zebrania C. burnetii.
   6. Ponownie zawiesić C. burnetii w DMEM + 10 % FCS i określić ilościowo liczbę bakterii jak na 4. Rozcieńczyć do 1 × 10⁹ genomów/ml przy użyciu DMEM + 10 % FCS + 10 % dimetylosulfotlenku (DMSO), podanie 50 μl zapasów do probówek do mikrofuge i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Zaszczepić 10 ml wstępnie podgrzanego ACCM-2 zawierającego 3 μg/ml chloramfenikolu 20 μl szczepu C. burnetii pBlaM-CBU0077 szczep¹⁷ (z zapasów wytworzonych w 1.2 przechowywanych w temperaturze -80 °C) w kolbie do hodowli tkankowej o długości 25^cm2 z wentylowaną nasadką. Hodować kulturę bakteryjną przez 7 dni w temperaturze 37 °C w 5 % CO₂, 2,5 % O_{2 .}

2. Odwrotna transfekcja siRNA i wysiewanie komórek HeLa 229 (DZIEŃ 4)

1. Używając eksperymentalnego siRNA po raz pierwszy, przygotuj siRNA w następujący sposób:
   1. Krótko odwirować liofilizowane siRNA, aby upewnić się, że osadek siRNA został zebrany na dnie probówki.
   2. Ponownie zawiesić granulowane siRNA do końcowego stężenia wyjściowego 20 μM, pipetując odpowiednią objętość 1x buforu siRNA (Tabela 2).
   3. Pipetować roztwór w górę i w dół 3 - 5 razy, aby wymieszać i umieścić na mieszalniku orbitalnym na 30 minut w temperaturze pokojowej, odwracając probówkę co 5 - 10 minut.
   4. Krótko odwiruj probówkę, aby upewnić się, że siRNA zostało zebrane na dnie probówki.
   5. Podwielokrotność siRNA podzielić na 50 μl podwielokrotności w probówkach do mikrofuge i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie to wymagane.
   6. Aby wytworzyć 1 μM stężenie robocze siRNA, w razie potrzeby należy pobrać pipetę z 950 μl buforu 1X siRNA do 50 μl podwielokrotności (20 μM). Uwaga: To stężenie robocze 1 μM może być wielokrotnie zamrażane i rozmrażane w celu wielokrotnych transfekcji.
2. Umieścić DMEM + 10 % FCS, 0,05 % trypsyny-EDTA i PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (lub równoważnej) na 30 minut do ogrzania przed użyciem.
3. Przygotowanie komponentów transfekcji:
   Uwaga: Poniższy protokół został zoptymalizowany dla komórek HeLa 229 w 96-dołkowej mikropłytce z czarnymi ściankami i płaskim, przezroczystym dnem. Optymalizacja ilości odczynnika do transfekcji, stężenia siRNA i gęstości wysiewu komórek może być konieczna dla różnych linii komórkowych.
   1. Do każdej studzienki należy użyć 0,1 μl odczynnika do transfekcji, 15,9 μl pożywki o zredukowanej surowicy (minimalna ilość niezbędnych pożywek używanych do transfekcji, patrz Tabela materiałów) i 4 μl 1 μM siRNA (co daje końcowe stężenie siRNA 40 nM). Użyj oddzielnych probówek do mikrofuge dla OTP, PLK1, Rab5A i Rab7A. Zmierzyć każdy warunek testu w trzech egzemplarzach. Przykład układu płytki 96-dołkowej pokazano na rysunku 3.
      Uwaga: Ten protokół obejmuje użycie dwóch elementów sterujących: OTP i PLK1. OTP składa się z czterech połączonych siRNA, które zostały zoptymalizowane w celu zmniejszenia efektów off-target, a zatem OTP jest używany jako negatywna, nieukierunkowana kontrola. Zaszyfrowane siRNA może być również używane jako kontrola ujemna. Utrata ekspresji PLK1 powoduje rozległą śmierć komórki w wielu liniach komórkowych poprzez indukcję szlaków proapoptotycznych, a zatem siRNA PLK1 jest stosowany jako kontrola pozytywna do transfekcji, gdzie śmierć komórki koreluje ze skutecznością transfekcji.
      1. Dla każdej eksperymentalnej transfekcji siRNA połącz 0,4 μl odczynnika do transfekcji i 63,6 μl pożywki o zredukowanej surowicy w osobnej probówce do mikrofuge. Zwiruj wszystkie rurki do mikrofuge i pozwól komponentom się sformować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Dodaj 16 μl każdego eksperymentalnego siRNA do odpowiednich probówek do mikrofuge zawierających kompleks transfekcyjny. Wirować i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Ważne jest, aby nie przekraczać 30 minut, ponieważ wydajność transfekcji zmniejszy się.
4. Podczas 20-minutowej inkubacji (2.3.1.2) dodać 20 μl odczynnika do transfekcji + pożywki o zredukowanej surowicy + siRNA do odpowiednich dołków sterylnej czarnej, 96-dołkowej tacki z płaskim przezroczystym dnem.
5. Jak tylko zakończy się 20-minutowy okres inkubacji, wysiewaj HeLa 229 komórek o gęstości 3,92 × 10³ komórek/dołek.
   1. Zebrać komórki HeLa 229 z kolby do hodowli tkankowej o średnicy 75 cm² we wstępnie ogrzanym DMEM + 10% FCS i ponownie zawiesić komórki do końcowej gęstości 4,9 × 10⁴ komórek/ml zgodnie ze standardowymi metodami. Aby zapewnić, że skuteczność transfekcji nie jest zagrożona, należy przygotować komórki podczas 20-minutowego okresu inkubacji (2.3.1.2).
      1. Umyj monowarstwę komórek HeLa 229 dwukrotnie 10 ml wstępnie podgrzanego PBS.
      2. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA i umieścić komórki HeLa 229 w temperaturze 37 °C + 5% CO₂ na 3 - 5 minut w celu odłączenia komórek.
      3. Zebrać komórki w 9 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10 % FCS. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj komórki do końcowej gęstości 4,9 × 10⁴ komórek/ml przy użyciu DMEM + 10 % FCS.
   2. Odpipetować 80 μl komórek HeLa 229 o gęstości 4,9 × 10⁴ komórek/ml do każdej studzienki, która zawiera odczynnik do transfekcji + pożywkę o obniżonej surowicy + mieszaninę siRNA. Odpowiada to gęstości komórek wynoszącej 3,92 × 10³ komórki/studzienkę.
      Uwaga: Odejmowanie tła jest wymagane dla podłoża BlaM.
      1. Nie dodawaj komórek ani siRNA do "pustych" studzienek (ryc. 3). Zamiast tego dodać 80 μl DMEM + 10 % FCS do tych studzienek ustawionych w trzech egzemplarzach.
   3. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C + 5 % CO₂ .

3. Zmień media (DZIEŃ 5)

1. Po 24 godzinach wyjmij pożywkę za pomocą adaptera wielokanałowego podłączonego do źródła podciśnienia lub ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej i zastąp ją 100 μl świeżego, wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS.
2. Inkubować przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C + 5 % CO₂ .
3. W tym momencie sprawdź wizualnie żywotność komórek za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego. Jeśli odwrotna transfekcja zakończyła się sukcesem, w studzienkach zawierających siRNA PLK1 zaobserwuje się znaczną śmierć komórek w porównaniu z siRNA OTP.

4. Kwantyfikacja szczepu Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 za pomocą qPCR (DZIEŃ 7)

1. Po 7 dniach wzrostu w ACCM-2 w temperaturze 37 °C w 5 % CO₂, 2,5 % O₂ (1,3), odwirować 10 ml kultury C. burnetii pBlaM-CBU0077 w temperaturze 15 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
2. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10 % FCS. Przygotować rozcieńczenia kultury (próbki) w stosunku 1:10 i 1:100 przy użyciu_dH2O.
3. Skonfiguruj składniki wymagane dla qPCR.
   Uwaga: ekstrakcję gDNA można przeprowadzić z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
   1. Przygotowanie norm:
      1. Ekstrahuj gDNA ze szczepu Coxiella burnetii RSA439 NMII typu dzikiego hodowanego w ACCM-2 w temperaturze 37 °C w 5 % CO₂, 2,5 % O₂ przez 7 dni przy użyciu zestawu do ekstrakcji gDNA, zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Zmierz stężenie gDNA (g/μl) za pomocą Nanodrop (lub równoważnika) przy absorbancji 260 nm.
      3. Oblicz liczbę kopii genomu na μl, korzystając z poniższego wzoru, i przelicz na liczbę genomów/ml.
         
      4. Dostosuj liczbę genomów/ml do 10⁹/ml (w końcowej objętości 100 μl) w nowej probówce do mikrofuge, używając_dH2O. Można go gotować przez 10 minut i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebny.
      5. W dniu zakażenia należy wygenerować 10-krotne seryjne rozcieńczenia 10⁸ genomów/ml do 10⁵ genomów/ml z zapasu 10⁹ genomów/ml.
         1. Odpipetować 10 μl z 10⁹ genomów/ml do 90 μl dH₂O, aby wygenerować 10⁸ genomów/ml. Wirować do wymieszania. Odpipetować 10 μl z 10⁸ genomów/ml do 90 μl dH₂O, aby wygenerować 10⁷ genomów/ml. Wirować i powtarzać do 10⁵ genomów/ml.
   2. Ustaw reakcję qPCR. Utwórz mieszankę wzorcową dla 25 dołków, aby uwzględnić wszelkie błędy pipetowania. Do każdej studzienki użyj 10 μl qPCR Master Mix; 2 μl mieszaniny starterów ompA (4.3.2.2) i 3 μl dH₂O.
      Uwaga: OmpA jest białkiem błony zewnętrznej C. burnetii'³⁹, a sekcja 82 par zasad w wysoce konserwatywnym regionie została wybrana do użycia jako sonda, jak opisano wcześniej⁴⁰.
      1. Ustaw każdy wzorzec (dH₂O, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ genomów/ml) i próbkę (rozcieńczenie 1:10 i 1:100) na 96-dołkowej płytce do odrywania PCR (bez spódnicy) odpowiednio w dwóch lub trzech egzemplarzach. Dodać 5 μl próbki lub wzorca do odpowiednich studzienek.
      2. Używając dH₂O, rozcieńczyć zarówno starter przednie ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3'), jak i starter odwrotny ompA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') do końcowego stężenia 4 μM i połączyć w tej samej probówce do mikrofuge.
         Uwaga: Mieszankę podkładową ompA można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.
      3. Połącz 250 μl qPCR Master Mix, 50 μl mieszanki starterów ompA, 75 μl dH₂O i wir do wymieszania. Dodać 15 μl tej mieszanki wzorcowej do studzienek zawierających wzorce lub próbki.
      4. Umieść 8-pokrywkowe nakrętki pasków PCR na odpowiednich dołkach i odwiruj pulsacyjnie probówki PCR, aby upewnić się, że wszystko zebrało się na dnie probówek.
      5. Ustaw następujący program na ilościowej maszynie do PCR: 50 °C przez 2 minuty, 95 °C przez 10 minut, a następnie 45 cykli po 95 °C przez 1 sekundę i 60 °C przez 20 sekund (Rysunek 4A).
   3. Przeanalizuj wartości Ct (próg cyklu) z qPCR:
      1. Przenieś wartości Ct do arkusza kalkulacyjnego za pomocą funkcji eksportu programu.
      2. Utwórz wykres rozrzutu standardów od 10⁵ genomów/ml do 10⁹ genomów/ml (wyrażonych jako wartości logarytmiczne). Odrzucić wszelkie oczywiste wartości odstające z trzech próbek. Wygeneruj logarytmiczną linię trendu i określ równanie wykresu.
      3. Obliczyć całkowitą liczbę genomów/ml w próbce, korzystając z równania wygenerowanego w ppkt 4.3.3.2. Nie należy zapominać o uwzględnieniu początkowego rozcieńczenia (1:10 i 1:100) próbek.

5. Zakażenie komórek transfekowanych metodą odwrotnej transfekcji (DZIEŃ 7)

1. Po obliczeniu całkowitej liczby genomów/ml w kulturze C. burnetii pBlaM-CBU0077, która ma być użyta do zakażenia, należy dostosować ponownie zawieszoną hodowlę bakteryjną, aby zainfekować komórki przy MOI 300 w końcowej objętości 50 μl/basenik, używając wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS.
   Uwaga: Oczekiwana gęstość zasianych komórek HeLa 229 przy normalnym czasie podwojenia po 72 godzinach wynosi 3,136 × 10⁴ komórki / dołek. Ilość bakterii wymagana do zakażenia przy MOI 300 wynosi 9,408 × 10⁶ na 50 μl, co odpowiada 1,88 × 10⁸ bakterii/ml.
   1. Stosując wartość obliczoną na podstawie qPCR (genomy/ml) (4.3.3.3), ponownie zawieszone bakterie rozcieńczyć za pomocą wstępnie podgrzanego DMEM + 10 % FCS w końcowej objętości 2 ml w celu zakażenia odwrotnych transfekowanych komórek.
2. Usunąć istniejące pożywki z ślepej próby i odwrócić transfekowane komórki.
3. Dodać 50 μl rozcieńczonych bakterii (1,88 × 10⁸ bakterii/ml) do odpowiednich studzienek. Dodać 50 μl DMEM + 10% FCS zarówno do ślepej, jak i niezainfekowanej studzienki.
4. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C + 5 % CO₂ .

6. Dodanie substratu BlaM w celu określenia poziomu translokacji (DZIEŃ 8)

1. Przygotuj roztwory dla podłoża BlaM 6x roztwór ładujący.
   Uwaga: Roztwory A, B i C są dostarczane w zestawie podłoży BlaM (patrz Tabela materiałów). Roztwór B może tworzyć osad w temperaturze pokojowej. Przed użyciem podgrzać ten roztwór do temperatury 37 °C, a osad powinien się rozpuścić.
   1. Przy pierwszym użyciu zestawu należy dodać 185 μl DMSO (dostarczanego z zestawem substratów BlaM) do wysuszonego roztworu A. Następnie ponownie zawieszony roztwór A należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotować wcześniej 0,1 M roztwór probenicydu i przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20°C do czasu, gdy będzie to potrzebne.
      1. Przygotować 0,4 M NaOH (1,6 g w 100 ml dH₂O).
      2. Przygotować 100 mM buforu fosforanowego Na pH 8 (1,56 g NaH₂PO_{4,2H 2}O i 1,41 g Na₂HPO₄ w 100 ml dH₂O).
      3. Rozpuścić 1,25 g probenicydu w 22 ml 0,4 M NaOH przez energiczne mieszanie.
      4. Dodać 22 ml 100 mM buforu fosforanowego Na o pH 8 (roztwór stanie się mętny) i mieszać, aby rozpuścić tworzący się osad.
      5. Doprowadzić pH do 8 (jeśli to konieczne) za pomocą 1 M NaOH/HCl.
      6. Mieszać energicznie i delikatnie podgrzewać (< 50 °C), aż roztwór będzie w większości klarowny.
      7. Przefiltrować (wielkość porów 0,2 μm) i podwielokrotność w objętości 1 ml. Przechowywać porcje w temperaturze -20°C.
2. Do każdej studzienki należy użyć 0,06 μl roztworu A, 0,54 μl roztworu B, 7,9 μl roztworu C i 1,5 μl 0,1 M Probenicidu. Stwórz mieszankę wzorcową dla 30 studzienek, najpierw łącząc 1,8 μl roztworu A i 16,2 μl roztworu B w probówce do mikrofuge. Dobrze wymieszaj za pomocą wiru. Dodać 237 μl roztworu C i 45 μl 0,1 M probenicydu. Wir, aby połączyć wszystkie komponenty.
   Uwaga: Roztwór 6x Loading jest stabilny do 4 godzin (w ciemności), ale przed użyciem należy go przygotować jak najbliżej.
3. Dodaj 10 μl 6-krotnego roztworu ładującego bezpośrednio do wszystkich ślepych i odwróconych studzienek transfekowanych bez usuwania istniejących pożywek.
4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemności.
5. Aby określić poziom translokacji, należy określić ilościowo ilość fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek.
   Uwaga: poniższa procedura jest specyficzna dla czytnika mikropłytek ClarioSTAR. Można również zastosować równoważne czytniki mikropłytek.
   1. Utwórz nowy protokół intensywności fluorescencji, używając punktu końcowego jako trybu odczytu.
   2. Dostosuj podstawowe parametry w następujący sposób:
      1. Wybierz mikropłytkę 96-dołkową.
      2. W ustawieniach optycznych wybierz 2 multichromatyki z następującymi ustawieniami zdefiniowanymi przez użytkownika: (1) Wejście wzbudzenia 410-10 nm i emisji 520-10 nm. (2) Wejście wzbudzenia 410-10 nm i emisji 450-10 nm. Upewnij się, że dobrze wybrano wielobarwność.
      3. Wybierz uśrednianie orbitalne o średnicy 3 mm.
      4. W obszarze optyka wybierz dolną optykę.
      5. W obszarze Szybkość i precyzja wybierz pozycję precyzyjny. Odpowiada to ośmiu regionom na jeden odwiert.
   3. Dostosuj układ płyt, wybierając odpowiednie studzienki jako próbki.
   4. Wybierz rozpocznij pomiar.
   5. Zdejmij pokrywę i umieść tackę w czytniku płytek. Aby uniknąć osiągnięcia maksymalnych wartości fluorescencji, upewnij się, że wartość wzmocnienia jest wyregulowana. Aby to zrobić, wykonaj regulację wzmocnienia na jednym z zainfekowanych studzienek, który został odwrócony transfekowany siRNA OTP. Odpowiada to najwyższej oczekiwanej translokacji.
   6. Wybierz początek pomiaru, aby zmierzyć wszystkie odpowiednie studzienki przy użyciu dolnej fluorescencji przy wzbudzeniu 410 nm i emisji zarówno 450 nm, jak i 520 nm odpowiednio dla niebieskiej i zielonej fluorescencji.

7. Analiza wyników:

1. Obliczyć stosunek 450 nm do 520 nm (niebieski do zielonego) dla wszystkich próbek po redukcji ślepej próby i wyrazić w odniesieniu do niezakażonej próbki OTP.
   Uwaga: dla prostego programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych dostępne są następujące etapy analizy.
   1. Korzystając z funkcji eksportu w czytniku mikropłytek, przenieś surowe wartości fluorescencji uzyskane dla długości fal emisji 520 nm i 450 nm (6.5) do arkusza kalkulacyjnego.
   2. Obliczyć średnią odczytów "ślepej" próby (tylko pożywka, bez komórek) dla długości fali 520 nm, dodając surowe wartości fluorescencji 520 nm i dzieląc przez liczbę studzienek (3). Powtórzyć tę czynność, używając ślepych wartości długości fali 450 nm. Wartości te reprezentują fluorescencję tła spowodowaną 96-dołkową płytką i pożywką.
   3. Odejmij fluorescencję tła. Korzystając z wartości otrzymanych w ppkt 7.1.2, odjąć średnią długości fali ślepej 520 nm od wszystkich wartości fluorescencji próbki o długości fali 520 nm. Powtórz te czynności dla wartości długości fali 450 nm.
   4. Aby uzyskać stosunek długości fali 450:520 nm, należy użyć skorygowanych wartości ślepej próby (7.1.3). Podzielić każdą próbkę o wartości fluorescencji 450 nm przez odpowiadającą jej wartość 520 nm.
   5. Obliczyć średnią wartości współczynnika OTP niezainfekowanych, dodając wartości stosunku 450:520 nm (z 7.1.4) i dzieląc przez liczbę studzienek (3).
   6. Obliczyć stosunek próbek do niezakażonego OTP, dzieląc stosunek 450:520 nm obliczony w ppkt 7.1.4 przez średnią wartości współczynnika OTP niezakażonego obliczoną w ppkt 7.1.5.

8. Dodanie barwienia jąder w celu określenia liczby komórek po teście translokacji (DZIEŃ 8)

1. Po ilościowym określeniu fluorescencji należy usunąć pożywkę zawierającą 6-krotny roztwór ładujący ze wszystkich studzienek za pomocą adaptera wielokanałowego podłączonego do źródła próżni lub ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej.
2. Dodać 50 μl 4 % roztworu PFA (paraformaldehydu) w PBS do wszystkich odpowiednich studzienek w celu utrwalenia komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
3. Usunąć 4 % roztwór PBS PFA (jak w ppkt 8.1) i dwukrotnie przemyć komórki 75 μl PBS.
4. Dodać 50 μl przepuszczalnego dla komórek barwnika jądrowego, na przykład DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindolu), do każdego dołka. Uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określ ilościowo liczbę jąder obecnych w każdym dołku po traktowaniu siRNA za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ⁴¹.

Do tego badania wybrano szczep C. burnetii pBlaM-CBU0077, ponieważ wcześniej wykazano, CBU0077 że jest to translokowany efektor systemu wydzielania Coxiella Dot/Icm17. Przed zakażeniem całkowitą liczbę genomów/ml w siedmiodniowej hodowli C. burnetii pBlaM-CBU0077 policzono za pomocą qPCR. Na rysunku 4 przedstawiono przykład wartości progu cyklu (Ct) oczekiwanych zarówno dla wzorców, jak i próbek po qPCR. Wartości Ct (przedstawione graficznie na wykresie amplifikacji (Rysunek 4B) i numerycznie (Rysunek 4C)) zostały wyeksportowane i przeanalizowane zgodnie z opisem w 4.3.3. Na podstawie reprezentatywnych danych stwierdzono, że w 10 ml ponownie zawieszonej hodowli bakteryjnej (ryc. 4D) znajdowało się 2,31 × 108 genomów/ml (ryc. 4D). Aby wygenerować odpowiednie rozcieńczenie bakteryjne (1,88 × 108 genomów/ml w 2 ml), 1,63 ml zawieszonych bakterii dodano do 370 μl świeżego, wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS. Komórki odwrócono transfekowane siRNA, które następnie zostały zakażone C. burnetii pBlaM-CBU0077 przy MOI 300 przez 24 godziny.

Po inkubacji odwrotnie transfekowanych zakażonych komórek substratem BlaM, kwantyfikacja translokacji efektorowej może być określona za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Po analizie opisanej w punkcie 7 wszystkie wartości współczynników, które zostały znormalizowane do niezainfekowanego OTP, można również znormalizować do zainfekowanego OTP. Poziom translokacji efektorowej po wyciszeniu genów gospodarza można podzielić na trzy wyniki po porównaniu z zakażoną kontrolą OTP: (1) Brak zmian; (2) Zwiększona translokacja efektorowa; (3) Zmniejszona translokacja efektorowa. Późniejsza analiza statystyczna, na przykład test Studenta t, może być wykorzystana do określenia znaczenia każdej zaobserwowanej różnicy w stosunku do zakażonej kontroli OTP. Wynik wyciszenia Rab5A lub Rab7A na translokacji efektorowej z trzech niezależnych eksperymentów pokazano na rysunku 5A. Istotny spadek poziomu translokacji BlaM-CBU0077 nastąpił podczas wyciszania zarówno Rab5A, jak i Rab7A w porównaniu z kontrolą OTP (wartość p = 0,0088 (Rab5A) i wartość p = 0,0059 (Rab7A), sparowany, test Studenta t). Ustalono również wpływ leczenia siRNA na żywotność komórek. Po teście translokacji komórki utrwalono, wybarwiono je barwnikiem jądrowym, a następnie oznaczono ilościowo. Jak pokazano na rycinie 5C, chociaż leczenie Rab5A lub Rab7A powoduje zmniejszenie żywotności komórek w porównaniu z kontrolą OTP (odpowiednio 12% i 31%), zmniejszenie to nie jest tak poważne jak PLK1 (97%), gen, o którym wiadomo, że powoduje śmierć komórki (wartość p = 0,0102 (Rab5A); wartość p = 0,0081 (Rab7A); wartość p < 0,0001 (PLK1), sparowany, test t-Studenta). Wyniki te pokazują, w jaki sposób wyciszenie genów gospodarza za pomocą siRNA może negatywnie zmienić poziomy translokacji efektorowej bakterii.

Rysunek 1.Mechanizm działania substratu BlaM podczas infekcji. C. burnetii jest internalizowany przez komórki gospodarza i tworzy wakuolę pochodzącą z lizosomów, zwaną wakuolą zawierającą Coxiella. 24 godziny po zakażeniu komórki są ładowane przepuszczalnym dla błony substratem BlaM, który zawiera dwa fluorofory tworzące parę FRET (A). W przypadku braku β-laktamazy, tj. braku translokacji efektora BlaM-CBU0077, wzbudzenie kumaryny przy 410 nm powoduje FRET do fluoresceiny, obserwowanej jako sygnał zielonej fluorescencji (520 nm) (B). W przypadku funkcjonalnego systemu wydzielania Dot/Icm, białko fuzyjne BlaM-CBU0077 zostanie przemieszczone do komórki gospodarza i rozszczepi substrat BlaM poprzez aktywność β-laktamazy, powodując oddzielenie dwóch barwników i powodując zakłócenie FRET i niebieski sygnał fluorescencyjny (450 nm) po wzbudzeniu przy 410 nm (C). Zarówno zielone, jak i niebieskie sygnały fluorescencji można wykryć za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2.Schematyczny przegląd przebiegu testu odwróconej transfekcji i translokacji. Dzień 1: Przygotowanie kultury C. burnetii pBlaM-CBU0077. Dzień 4: Odwrotna transfekcja przy użyciu 40 nM siRNA i komórek zasiewnych HeLa 229 o końcowej gęstości 3,92 × 103 komórek / studzienkę do 96-dołkowej tacy. Dzień 5: Zmień nośnik. Dzień 7: Określ ilościowo całkowite genomy/ml kultury C. burnetii pBlaM-CBU0077 za pomocą qPCR, a następnie zainfekuj odwrotne transfekowane komórki MOI wynoszącym 300. Dzień 8: Dodaj 6-krotny barwnik ładujący, zmierz fluorescencję i określ ilościowo liczbę komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3.96-dołkowy układ płytek używany do ustawienia odwrotnej transfekcji i wysiewu komórek HeLa 229. "Puste" studzienki (pokazane na czerwono) zawierają tylko pożywki i nie wymagają dodawania ani komórek siRNA, ani HeLa 229. SiRNA OTP (pokazane na jasnoniebiesko dla niezainfekowanych studni i ciemnoniebieskie dla zainfekowanych studni) jest używane jako kontrola nieukierunkowana, ponieważ została zoptymalizowana tak, aby miała mniej efektów poza celem. Bordowe i zielone studzienki reprezentują odpowiednio siRNA Rab5A i Rab7A. SiRNA PLK1 (pokazane na żółto) jest używane jako miara wydajności transfekcji, ponieważ utrata ekspresji PLK1 może indukować szlaki proapoptotyczne i rozległą śmierć komórki w zdecydowanej większości linii komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Reprezentatywne wartości qPCR Ct stosowane do ilościowego określenia całkowitej liczby genomów/ml w hodowli C. burnetii pBlaM-CBU0077. (A) Warunki cyklu zastosowane w qPCR w celu określenia liczby genomów/ml w kulturach Coxiella. Wartości Ct zarówno dla wzorców, jak i próbek są przedstawiane w formatach graficznych (B) i numerycznych (C). (D) Standardowe wartości Ct zostały uśrednione, sporządzone na wykresie i obliczono logarytmiczną linię trendu. Korzystając z równania i średnich wartości Ct próbki, określono całkowitą liczbę genomów/ml w kulturze C. burnetii pBlaM-CBU0077 na 2,31 × 108. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Translokacja efektora Dot/Icm BlaM-CBU0077 podczas wyciszania siRNA Rab5A i Rab7A. Komórki HeLa 229 były odwrotnie transfekowane siRNA specyficznym dla Rab5A (bordowe paski), Rab7A (zielone paski), OTP (niebieskie paski) lub PLK1 (żółte paski) i inkubowane przez 72 godziny przed zakażeniem szczepem C. burnetii pBlaM-CBU0077 przy MOI 300 przez 24 godziny. Po dodaniu substratu BlaM zmierzono fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek. (A) Tabela przedstawia surowe wartości fluorescencji uzyskane z pojedynczego eksperymentu wraz ze stosunkiem 450:520 nm w stosunku do niezakażonej kontroli OTP po odjęciu wartości ślepej próby (tylko pożywka, bez komórek). Poziom translokacji (B) i żywotność komórek (C) przedstawiono jako średnią procentową odchylenia standardowego ± stosunku do zakażonych komórek transfekowanych odwrotnie OTP z trzech niezależnych eksperymentów. * wartość p < 0,05; **Wartość p < 0,01; Wartość p < 0,0001 (sparowany, test t-Studenta). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1.Komponenty wymagane do wykonania 1x ACCM-2.

Tabela 2.Objętość 1x buforu siRNA potrzebna do uwodnienia liofilizowanego siRNA do odpowiedniego stężenia.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.