Artykuł metodologiczny

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54215

⸱

14 sierpnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Université de Montréal, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Hôpital du Sacré-coeur de Montréal Research Center, Université de Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Streszczenie

Spadek pamięci jawnej zależnej od hipokampa (pamięci faktów i wydarzeń) jest jednym z najwcześniejszych objawów klinicznych choroby Alzheimera (AD). Powszechnie wiadomo, że utrata synaps i wynikająca z niej neurodegeneracja są najlepszymi predyktorami zaburzeń pamięci w chorobie Alzheimera. Najnowsze badania podkreśliły neurotoksyczną rolę rozpuszczalnych oligomerów beta amyloidu (Aβo), które zaczynają gromadzić się w ludzkim mózgu około 10 do 15 lat przed pojawieniem się objawów klinicznych. Wiele doniesień wskazuje, że rozpuszczalny Aβo koreluje z deficytami pamięci w modelach AD i u ludzi. Neurodegeneracja wywołana przez Aβo obserwowana w kulturach neuronów i wycinków mózgu była trudniejsza do rozmnażania w wielu modelach zwierzęcych. Przedstawiony tutaj model powtarzających się wlewów Aβo rozwiązuje ten problem i pozwala zająć się dwiema kluczowymi obszarami dla opracowania nowych terapii modyfikujących przebieg choroby: zidentyfikować markery biologiczne do diagnozowania wczesnej choroby Alzheimera oraz określić mechanizmy molekularne leżące u podstaw deficytów pamięci wywołanych przez Aβo na początku choroby Alzheimera. Ponieważ rozpuszczalne Aβo agreguje się stosunkowo szybko w nierozpuszczalne włókienka Aβ, które słabo korelują ze stanem klinicznym pacjentów, rozpuszczalne Aβo są przygotowywane świeżo i wstrzykiwane raz dziennie przez sześć dni w celu wywołania znacznej śmierci komórek w hipokampie. Zastosowaliśmy kaniulę specjalnie zaprojektowaną do jednoczesnych infuzji Aβo i ciągłego wlewu przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych. Ta innowacyjna metoda in vivo może być obecnie stosowana w badaniach przedklinicznych w celu potwierdzenia skuteczności nowych terapii AD, które mogą zapobiegać odkładaniu się i neurotoksyczności Aβo u pacjentów ze stanem przedotępiennym.

Wprowadzenie

Początkowo proponowano, że nagromadzenie nierozpuszczalnych gatunków Aβ w mózgu jest kluczowe dla patogenezy AD. 1,2 Jednak blaszki amyloidowe są również wykrywane u niektórych zdrowych poznawczo osób w podeszłym wieku. 3-7 Aby przezwyciężyć słabą korelację istniejącą między odkładaniem się blaszki miażdżycowej a deficytami poznawczymi w chorobie Alzheimera, najnowsze doniesienia wykazały obecność toksycznego rozpuszczalnego Aβo na początku choroby, które znacznie lepiej korelują ze stanem klinicznym pacjentów. 8-14 Ponieważ proces oligomeryzacji Aβ jest bardzo dynamiczny, zasugerowano, że neurotoksyczność jest indukowana przez różne Aβo, a nie tylko przez jeden konkretny typ oligomeru. 14-16 Ponieważ wiele badań wykazało, że Aβo może inicjować dysfunkcje synaps przed utratą synaps i neuronów,17-24 obecne teorie wskazują, że leczenie związane z Aβ może być skuteczne we wczesnej chorobie Alzheimera, a nie w późniejszych stadiach, jak testowano do tej pory w badaniach klinicznych.

Jedną z charakterystycznych cech patogenezy AD jest masowa i powszechna śmierć komórek obserwowana w późnych stadiach choroby, oraz znaczna utrata synaps i neuronów obserwowana w zlokalizowanych obszarach mózgu, gdy deficyty pamięci stają się wykrywalne na poziomie klinicznym. Szlak perforacyjny, który wystaje z kory śródwęchowej (EC) do zakrętu zębatego (DG), jest wyraźnie zaburzony na wczesnym początku AD.25,26 W stanie prodromalnym AD, gdy łagodne upośledzenie funkcji poznawczych (MCI) staje się widoczne, wykrywa się znaczną śmierć komórek w EC, a także utratę synaps w DG. Pytania z dnia 25,26

Chociaż duża ilość dowodów wskazuje na toksyczne działanie rozpuszczalnego Aβo we wczesnym okresie naszej ery,8-14 neurodegeneracja wywołana przez Aβo, obserwowana w hodowli neuronalnej lub organotypowej hodowli wycinków mózgu, była trudniejsza do odtworzenia w modelach zwierzęcych. 27 Większość transgenicznych modeli AD z nadekspresją Aβ ma blaszki amyloidowe, hiperfosforylację tau, niedobór synaps i deficyty pamięci. 27 Modele te okazały się jednak znacznie mniej skuteczne w modelowaniu śmierci komórek obserwowanej w hipokampie pacjentów z chorobą Alzheimera. Aby przezwyciężyć te problemy techniczne, opracowaliśmy model oparty na domózgowych wlewach rozpuszczalnego Aβo. Informowaliśmy wcześniej, że powtarzające się wlewy rozpuszczalnego Aβo do hipokampa indukują stopniową utratę neuronów i hiperfosforylację tau, dwie patologiczne cechy charakterystyczne związane ze spadkiem pamięci w AD.28 Tutaj pokazujemy nową metodę testowania terapii AD przy użyciu kaniuli specjalnie zaprojektowanej do jednoczesnych infuzji Aβo i ciągłego wlewu przeciwciała Aβo (6E10) za pomocą pomp osmotycznych.

Pompy osmotyczne to unikalny sposób na testowanie in vivo skuteczności dowolnego przeciwciała (lub innych związków) przeciwko neurodegeneracji wywołanej przez Aβo bezpośrednio w miejscu infuzji Aβo. W związku z tym pompy te stanowią wygodne narzędzie do ustanowienia solidnego dowodu słuszności koncepcji dotyczącej mechanizmów działania potencjalnych środków terapeutycznych w chorobie Alzheimera. Ponieważ ostatnie doniesienia wskazują na krytyczny wpływ rozpuszczalnego Aβo we wczesnych stadiach choroby Alzheimera, wiele terapii ukierunkowanych na Aβo jest w rzeczywistości testowanych przez laboratoria akademickie i farmaceutyczne. Ten nowatorski model zwierzęcy pozwala naśladować utratę synaps i neuronów obserwowaną we wczesnej chorobie Alzheimera, a pompy osmotyczne są używane do ciągłego podawania środków leczniczych, szczególnie w miejscu infuzji Aβo. Powtarzające się niepowodzenia terapii AD testowanych w ciągu ostatnich kilku lat u pacjentów z łagodnym lub umiarkowanym nasileniem skłoniły naukowców do rozpoczęcia badań u pacjentów ze stanem przeddemencyjnym, zanim Aβo zacznie się obficie gromadzić i powodować nieodwracalne uszkodzenia mózgu. W tym kontekście testowanie nowych związków, które zapobiegają odkładaniu się, a w konsekwencji neurotoksyczności Aβo, może być interesujące dla pacjentów przedklinicznych.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Protokół dla zwierząt dla tego projektu uzyskał aprobatę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie cewnika przed operacją stereotaktyczną

  1. Wytnij cewniki PE50 (o długości 6 cm), które będą używane do łączenia kaniuli z pompami osmotycznymi (patrz rysunek 1A). Napełnij cewniki PE50 sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) i uszczelnij oba końce cewników. Cewnik należy utrzymywać w temperaturze 4°C do czasu użycia.

2. Implantacja kaniuli metodą stereotaksji

  1. Operację należy wykonać w sterylnych warunkach. Wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne przez autoklawowanie. Dokładnie wyczyść aparat stereotaktyczny i obszar roboczy i zdezynfekuj 70% roztworem etanolu. Noś maskę chirurgiczną, czepek do włosów i sterylne rękawiczki.
  2. Znieczulenie szczurów należy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) roztworu ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg i 10 mg/kg). Potwierdź znieczulenie, sprawdzając ruch po delikatnym uszczypnięciu palca
    3. .
  3. Niesteroidowy lek przeciwzapalny (meloksykam; 1 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie (s.c.) znieczulonemu zwierzęciu co najmniej 30 minut przed zabiegiem.
  4. Ogolić głowę zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia i trzykrotnie zdezynfekować skórę roztworem glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  5. Umieść zwierzę na ramie stereotaktycznej z nausznikami. Zamocuj jedną kaniulę na ramieniu uchwytu ramy stereotaktycznej. Wstrzyknąć (s.c.) środek znieczulający miejscowo (bupiwakaina (1,5 mg/kg) i lidokaina (1,5 mg/kg) w czubek głowy. Znieczulenie utrzymuje się podczas całego zabiegu poprzez umieszczenie stożka nosowego dostarczającego 3% izofluranu. Całe pole operacyjne powinno być zasłonięte, ale nie zrobiono tego tutaj, aby lepiej zademonstrować technikę.
  6. Wykonaj nacięcie o długości 3 cm na czubku głowy za pomocą skalpela. Zamontuj 4 zaciski wokół nacięcia, aby czaszka była czysta. Za pomocą nożyczek z okrągłą końcówką zrób kieszeń (2 x 2 cm2) pod skórą między łopatkami zwierzęcia.
  7. Zeskrob okostną czaszki ostrzem. Nałóż gazik na czaszkę w przypadku krwawienia.
  8. Sprawdź, czy czaszka jest płaska i dobrze wyrównana na ramie stereotaktycznej. Aby upewnić się, że czaszka jest płaska, sprawdź współrzędne wysokości na bregmie i na lambdzie. Weź współrzędne bregmy, które będą używane jako punkt odniesienia.
  9. Zaczynając od bregmy, oblicz współrzędne dwóch kaniul prowadzących, które zostaną wszczepione obustronnie w hipokampie (przednio-tylna: - 0,42 cm; przyśrodkowo-boczna: ± 0,30 cm; grzbietowo-brzuszna: - 0,28 cm zgodnie z atlasem mózgu szczura Paxinosa i Watsona)29. Wskaż położenie kaniuli za pomocą markera.
  10. Wywierć otwór (0,5 mm) w czaszce w miejscu implantacji obu kaniuli. Wywierć dwa inne otwory około 5 mm powyżej i poniżej tych punktów, aby wkręcić, które zestalą kaniulę podczas nakładania cementu dentystycznego.
  11. Odetnij skalpelem jeden koniec cewnika wypełnionego wcześniej płynem mózgowo-rdzeniowym i włóż go do ramienia kątowego kaniuli. Zamocuj pierwszą kaniulę za pomocą cementu dentystycznego. Unikaj umieszczania cementu dentystycznego wokół pozycji na drugiej kaniuli.
  12. Pozostaw cement dentystyczny do wyschnięcia na 2-3 minuty, a następnie zdejmij ramię uchwytu z pierwszej kaniuli i zamocuj w niej drugą kaniulę. Powtórz kroki 2.11 i 2.12. Umieść atrapę kaniuli na obu kaniulach prowadzących. Upewnij się, że manekin i kaniula prowadząca są tej samej długości, aby zapobiec infiltracji tkanek i zablokowaniu kaniuli.
  13. Włożyć wolny koniec obu cewników do kieszeni utworzonej wcześniej między łopatkami zwierzęcia. Zdejmij zaciski i zszyj skórę nicią do szwów 4-0,
    UWAGA: Górna kaniula prowadząca musi być dostępna dla nadchodzących infuzji Aβo.
  14. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je z powrotem w klatce. Podczas rekonwalescencji pooperacyjnej umieść klatkę na podgrzewającym kocu wodnym, aż zwierzę się obudzi. Klatka powinna być częściowo na podkładce, aby szczur mógł w razie potrzeby odsunąć się od ciepła. Stale monitoruj zwierzę, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
  15. Szczury należy zwrócić do obiektu dla zwierząt w celu rekonwalescencji po operacji przez 10 dni pod ścisłym nadzorem.
    UWAGA: Nie zwracaj zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Meloksykam (1 mg/kg mc.) podaje się raz na dobę przez dwa dni po zabiegu chirurgicznym w celu leczenia bólu.

3. Instalacja pompy osmotycznej

  1. Na dzień przed montażem napełnić pompy osmotyczne przeciwciałem 6E10 (1 mg/ml; 100 μl) i przeciwciałem kontrolnym IgG1 (1 mg/ml; 100 μl) zgodnie z instrukcjami producenta w sterylnych warunkach. Pompki należy przechowywać przez noc w sterylnej wodzie destylowanej o temperaturze 37 °C, aby aktywować pompy.
  2. Znieczulij szczury izofluranem 3% w celu zainstalowania pomp osmotycznych (0,5 μl/h przez 7 dni). Ogol się między łopatkami i zdezynfekuj skórę roztworem glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%. Wykonaj nacięcie o długości 2 cm skalpelem między łopatkami, aby zlokalizować cewniki PE50 połączone z kaniulą prowadzącą.
  3. Odetnij koniec cewników PE50 zawierających cement dentystyczny za pomocą skalpela. Podłącz pompy osmotyczne do cewników PE50 i dodaj trochę cementu dentystycznego na złączu pompy i cewnika, aby zabezpieczyć połączenie.
  4. Zszyj szczelnie skórę nicią do szwów 4-0. Umieść zwierzę z powrotem w klatce na podgrzewanej poduszce wodnej. Obserwuj, jak zwierzę szybko budzi się po znieczuleniu izofluranem (około 5 min).
    UWAGA: Zabieg trwa około 5 do 10 minut.

4. Napary Aβo u obudzonych i swobodnie poruszających się szczurów

  1. Przygotować roztwór Aβo (0,2 μg/μl) zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. 28,30 Pozostawić Aβo do dynamicznej i spontanicznej agregacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed infuzją.
  2. Zainstalować dwie strzykawki o pojemności 10 μl na pompie infuzyjnej. Napełnić strzykawki 5 μl sterylnej wody destylowanej. Przyciąć skalpelem dwa cewniki PE50 do długości około 60 cm. Napełnij oba cewniki sterylną wodą destylowaną za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml i igieł 21G.
  3. Strzykawki o pojemności 1 ml należy trzymać na jednym końcu cewnika, a drugi koniec podłączyć do strzykawek Hamiltona. Wyjąć strzykawki o pojemności 1 ml i sprawdzić, czy w cewnikach nie ma pęcherzyków powietrza.
  4. Wprowadzić kaniulę wewnętrzną na końcu cewników PE50. Używając sterylnej wody destylowanej, napełnij wewnętrzną kaniulę podłączoną do cewników PE50 do 1 μl na strzykawkach Hamiltona. Utworzyć pęcherzyk powietrza, odciągając tłoki do tyłu do 2 μl.
  5. Wymieszać roztwór Aβo, pipetując w górę i w dół, używając końcówki o minimalnej przyczepności. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania. Napełnij obie kaniule wewnętrzne 1,5 μl roztworu Aβo, odciągając tłoki do 3,5 μl.
  6. Wykonaj linie markerem przed i po pęcherzyku powietrza wykonanym w obu cewnikach. Służy to jako punkt kontrolny trwającej infuzji. Do infuzji należy zbliżyć klatkę do pompy infuzyjnej i zdjąć jej pokrywę.
  7. Umieść szczura w przytulnym miejscu i mocno zeskrob ramię przytuliska wokół jego szyi, aby unieruchomić głowę szczura. Wyjmij atrapę kaniuli z dwóch kaniul prowadzących. Wprowadzić przygotowaną wcześniej kaniulę wewnętrzną do kaniuli prowadzącej. Sprawdź, czy są całkowicie włożone i dobrze przymocowane do podstawy kaniuli prowadzącej.
  8. Uwolnij szczura z przytulanki i umieść go z powrotem w klatce, aby ograniczyć stres związany z rywalizacją. Należy uważnie monitorować, aby upewnić się, że cewniki nie skręcają się ze sobą, a infuzja jest wykonywana prawidłowo.
  9. Włączyć pompę infuzyjną. Wstrzyknąć 1 μl roztworu Aβo z szybkością 0,1 μl/min (10 min). Podczas infuzji należy sprawdzić, czy tłok strzykawki porusza się z 3,5 μl do 2,5 μl i czy pęcherzyki powietrza w obu cewnikach PE50 poruszają się w sposób ciągły.
  10. Pozostaw wewnętrzną kaniulę na miejscu na kolejne 5 minut po infuzji, aby umożliwić skuteczną dyfuzję roztworu Aβo. Przyłóż szczura z powrotem do przytuliska, aby usunąć kaniulę wewnętrzną i zaślepioną kaniulę prowadzącą, aby zapobiec refluksowi wstrzykniętego roztworu. Użyj atrapy kaniuli, która zatrzymuje się tuż przed ramieniem kątowym kaniuli. Włóż zwierzę do klatki.
  11. Powtarzaj infuzję Aβo raz dziennie przez 6 kolejnych dni. Poddaj zwierzę eutanazji przez ścięcie.

Wyniki

Neurotoksyczny efekt Aβo badano u szczurów Long-Evans poprzez implantację kaniuli w zakręt zębaty (DG) hipokampa. Rozpuszczalne oligomery Aβo wstrzykiwano codziennie przez sześć kolejnych dni. Użyliśmy kaniuli zaprojektowanej specjalnie do jednoczesnych infuzji Aβo oraz ciągłej infuzji przeciwciała 6E10 lub kontrolnego przeciwciała IgG1 do hipokampa przy użyciu pomp osmotycznych (Rysunek 1A). Do badań immunohistochemicznych szczury zanieczulono, poddano perfuzji przezsercowej 0,9% NaCl, a następnie mózgowia zanurzono w 4% roztworze paraformaldehydu na 48 h i w 15% roztworze sacharozy na 24 h. Swobodne koronalne skrawki (40 µm) poddano działaniu 0,3% H2O2 przez 30 min, blokowano w 1% surowicy koziej przez 1 h, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C przy użyciu przeciwciała anty-pan-Aβ. Przed naniesieniem przeciwciała skrawki poddano działaniu 70% kwasu mrówkowego przez 3 min. Detekcję przeprowadzono z użyciem kompleksu ABC oraz 0,05% roztworu 3,3-diaminobenzydyny. Skrawki zamocowano na szkiełkach przedmiotowych powlekanych żelatyną, suszono na powietrzu przez 2 h, odwodniono (alkohole 30%, 70%, 95% i 100%), inkubowano w toluenie przez 5 min, a następnie przykryto szkiełkami podstawkowymi. W celu barwienia fioletem krezylowym skrawki inkubowano przez 10 min w 0,5% roztworze fioletu krezylowego, przez 1 min w 0,5% roztworze kwasu octowego, odbarwiono (alkohole 70%, 95% i 100%), zanurzono w toluenie na 5 min i przykryto szkiełkami podstawkowymi.

Przedstawione tutaj wyniki pokazują depozycję Aβo w zakręcie zębatym (DG) w pobliżu miejsca infuzji oraz śmierć komórek związaną z tą akumulacją. Stwierdzono, że poziom Aβo uległ znacznemu obniżeniu po zastosowaniu przeciwciała 6E10 (Ryc. 1B). W pobliżu miejsca wstrzyknięcia Aβo zaobserwowano wyraźną neurodegenerację, która została złagodzona dzięki leczeniu przeciwciałem 6E10 (Ryc. 1B). Wyniki te są zgodne z akumulacją Aβo, którą zaobserwowano w DG po wielokrotnych infuzjach Aβo u myszy.28 Wykazane tutaj usuwanie złogów amyloidu poprzez immunoterapię przeciwciałem 6E10 jest zgodne z innym raportem wykonanym w transgenicznym modelu mysim choroby Alzheimera (AD).31

Szczur z cewnikiem PE50 i kaniulami, układ do badania neuronaukowego, eksperyment z zakresu badań biomedycznych.
Rycina 1. Zdjęcie zwierzęcia z obustronnymi kaniulami podczas infuzji Aβo. Roztwór Aβo (0,2 µg/µl; 1 µl) wstrzykiwano budzącym się i swobodnie poruszającym się szczurom (raz dziennie przez 6 dni) za pomocą cewników PE50 połączonych z kaniulami wewnętrznymi wprowadzonymi do kaniuli prowadzącej. Leczenie kontrolnymi (Ctl) przeciwciałami IgG1 lub 6E10 podawano bezpośrednio w miejscu infuzji Aβo przy użyciu pomp osmotycznych umieszczonych podskórnie między łopatkami zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat pompy Alzet z podawaniem Aβ; wyniki barwienia przeciwciałem 6E10 w analizie mikroskopowej.
Rycina 2. Utrata neuronów indukowana depozycją Aβo jest łagodzona przez leczenie przeciwciałem 6E10. A, Aβo (0.2 µg/µl; 1 µl) wstrzykiwano raz dziennie przez 6 kolejnych dni, a w miejscu infuzji stosowano pompy osmotyczne z Ctl (IgG1) lub przeciwciałem 6E10. B, Reprezentatywne nagromadzenie Aβo w DG na przekroju bezpośrednio obok miejsca wprowadzenia kaniuli oraz reprezentatywne barwienie fioletem krezylowym wykazujące utratę komórek. Paski skali: 50 µm (n = 4) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym protokole istnieją krytyczne kroki, które wymagały szczególnej uwagi. Podczas wszczepiania kaniuli należy unikać wkładania cementu dentystycznego, gdy jest on zbyt płynny, aby zapobiec zablokowaniu otworu drugiej kaniuli. Ważne jest, aby umieścić cement dentystyczny na wolnym końcu cewnika P50 podłączonego do pompy, aby zapobiec podrażnieniu i możliwej reakcji zapalnej. W dniu operacji stereotaktycznej użyj atrapy kaniuli o tej samej długości co kaniula prowadząca, aby uniknąć zablokowania kaniuli. Jednak po zainstalowaniu pomp należy użyć krótszej atrapy kaniuli, która zatrzymuje się przed ramieniem kątowym kaniuli, aby umożliwić prawidłowe wlanie roztworu z pompy do hipokampa. Należy uważnie monitorować infuzje Aβo i sprawdzić, czy pęcherzyki powietrza wykonane w cewnikach poruszają się w sposób ciągły podczas infuzji. Zawsze upewnij się, że kaniula iniekcyjna jest całkowicie włożona do kaniuli prowadzącej podczas infuzji.

Jeśli podczas infuzji Aβ wystąpi problem, sprawdź, czy kaniula wewnętrzna nie jest zablokowana. W takim przypadku przepłucz sterylną wodę destylowaną przez wewnętrzną kaniulę. Jeśli kaniula prowadząca jest zatkana, zamień kaniulę wewnętrzną w kaniulę prowadzącą. W przeciwnym razie poruszaj wewnętrzną kaniulą w górę iw dół. Kłótnia w przytulaniu może być stresująca dla szczurów, zwłaszcza pierwszego dnia. Aby zmniejszyć stres zwierzęcia, zalecamy manipulowanie i przyzwyczajanie szczurów do przytulania się przed operacją stereotaktyczną.

To nowatorskie i elastyczne podejście in vivo ma wiele zalet. Rzeczywiście, charakter wstrzykniętego Aβo można dokładnie kontrolować przed infuzją, a różne rodzaje preparatów Aβ (na przykład roztwory syntetyczne i roztwory Aβ pochodzące z mózgu) mogą być wstrzykiwane w celu oceny ich neurotoksyczności in vivo. Model ten może być również wykorzystany do zbadania mechanizmów, za pomocą których różne gatunki Aβ (np. monomery, oligomery o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej, protofibryle) mogą indukować efekty neurotoksyczne in vivo oraz w jaki sposób terapie, takie jak immunoterapia, mogą przeciwdziałać ich szkodliwemu wpływowi na mózg. Ponieważ napary są wykonywane u obudzonych, swobodnie poruszających się zwierząt, nie ma zakłócającego wpływu między środkami znieczulającymi a roztworem Aβo na szlaki sygnałowe, jak wykazano w poprzednich badaniach. 32,33 Napary u swobodnie poruszających się zwierząt są również zgodne z testami behawioralnymi w dowolnym momencie przed i po infuzjach.

Napary Aβo i instalację pompy można wykonać u zwierząt w różnym wieku, aby określić efekty Aβo i zabiegów podczas starzenia. Ponieważ neurodegeneracja zachodzi w pobliżu miejsca infuzji, utrata synaps i neuronów może być indukowana w różnych i zlokalizowanych obszarach mózgu. Uboczny wlew Aβo i kontroli (nośnik lub mieszanie Aβ) pozwala na kontrolowanie wszelkich zmian w obrębie tego samego zwierzęcia. I odwrotnie, roztwory Aβo lub kontrolne mogą być wstrzykiwane obustronnie w prawy i lewy hipokamp, na przykład podczas testowania zwierząt w zadaniach behawioralnych. Wlew Aβo i leczenie można wykonać jednocześnie lub alternatywnie można zainstalować pompy po infuzji Aβo, aby ocenić, czy leczenie jest skuteczne po osadzaniu Aβ. Ten sam opisany tutaj protokół może być również stosowany podczas wykonywania wlewów Aβo do komór mózgowych. Wpływ Aβo na wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe można ocenić przed i po utracie neuronów w rozsądnie krótkim czasie. Dawkę i liczbę wlewów Aβ można również dostosować, aby uzyskać mniej lub bardziej nasiloną patogenność Aβ.

Chociaż jest bardzo wszechstronna, ta technika ma pewne ograniczenia. Implantacja kaniuli powoduje mechaniczne uszkodzenie tkanki i zapalenie nerwów w ciągu pierwszych kilku dni po operacji. W związku z tym konieczne jest odczekanie co najmniej tygodnia po zabiegu przed rozpoczęciem infuzji Aβo i dodanie odpowiednich kontroli (wstrzyknięcie nośnika lub nieaktywne mieszanie Aβ) w celu uwzględnienia tych zdarzeń. Ponadto tylko niewielka objętość Aβo może być podawana w infuzji, aby ograniczyć dyfuzję roztworu.

Pompy osmotyczne stanowią wygodną i unikalną metodę dostarczania do przedklinicznej walidacji środków zaprojektowanych w celu zapobiegania neurodegeneracji indukowanej przez Aβ. Ponieważ wykazano wcześniej, że immunoterapia przeciwciałem 6E10 zmniejsza akumulację Aβ w mózgu,31 użyliśmy przeciwciała 6E10 jako dowodu słuszności koncepcji, aby potwierdzić nasze nowe podejście in vivo . Zastosowanie pomp osmotycznych w tym modelu może być teraz wykorzystane do opracowania nowych terapii modyfikujących przebieg choroby, które mogłyby zapobiec odkładaniu się i neurotoksyczności Aβo u przedklinicznych pacjentów z AD.

Oświadczenia

Publikacja tego artykułu wideo jest sponsorowana przez ALZET Osmotic Pumps.

Podziękowania

Dziękujemy Caroline Bouchard z ośrodka dla zwierząt za pracę na szczurach. A.S. posiada stypendium mistrzowskie J.A. De Sève, a B.P. stypendium COPSE na Université de Montréal Ta praca została sfinansowana z grantów przyznanych J.B. z FRQS-Pfizer i funduszy start-up z Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)Aparat Harvard59-7316
PE 50 Cewnik cienkościennyTworzywa sztuczne jedenC232CT
Chlorowodorek ketaminy (100 mg / ml)Bioniche1989529
Chlorowodorek ksylazyny (100 mg / ml)Bimeda8XYL004C
Meloksykam (5 mg / ml)Norbrook215670I01
Roztwór glukonianu chlorheksydyny 2% i alkoholu izopropylowego 2%Carefusion260100C
Chlorowodorek lidokainyAlveda Pharma0122AG01
Chlorowodorek bupiwakainyHospira1559
maść oftalmicznaBaussh and Lomb inc.
rama stereotaktycznaStoelting51600
stereotaktyczne ramię uchwytu kaniuliAparat Harvarda72-4837
WiertłoDremel8050-N/18
Kaniula prowadzącaTworzywa sztuczne jedna326OPG/spc
Tworzywa sztuczne jednaatrapa C315I/spc
Tworzywa sztuczne oneC315DC/spc
Nici powlekane nicią vicryl rapide 4-0EthiconVR2297
Dentystyczny cement akrylowyAparat Harvard72-6906
JI Morris CompanyP0090CE125
6E10 (izotyp myszy IgG1) BioLegend803003
Mysz Przeciwciało kontrolujące izotyp IgG1AbcamAB18447
Alzet model 1007DDurect corporation290
IsofluraneBaxterCA2L9100
Amyloid-beta 1-42 rPeptideA-1163-1
Strzykawka Hamilton (10 &mikro; l)Fisher Scientique14815279
Infuzyjna pompa strzykawkowa CMA 402Harvard AparatCMA8003110
Strzykawka 1 mlBD309659
igła 21 GTerumoNN-2125R
SnuggleLomir BiomedicalRTS04
2125706 kaniula iniekcyjna kaniula przeciwciało Pompy osmotyczne

Bibliografia

  1. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
  2. Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer's disease. Hypothesis: Alzheimer's disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
  3. Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
  4. Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer's disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
  5. Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
  6. Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
  7. Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
  8. Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
  9. Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer's disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
  10. Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
  11. Hardy, J. Amyloid double trouble. Nat. Genet. 38, 11-12 (2006).
  12. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
  13. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
  14. McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
  15. Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochemistry. 45, 15157-15167 (2006).
  16. Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
  17. Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
  18. Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
  19. Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B. Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 14745-14750 (2009).
  20. Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
  21. Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
  22. Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
  23. Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
  24. Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
  25. Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer's disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
  26. DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
  27. Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer's Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
  28. Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
  29. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. New York. Fourth edition (1998).
  30. Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer's disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
  31. Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
  32. Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E. Alzheimer's disease and anesthesia. Front. Neurosci. 4, 272(2011).
  33. Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Infuzja za pomocą pompy osmotycznejimplantacja kaniulimodel choroby Alzheimeraneurodegeneracja hipokampawalidacja immunoterapiichirurgia stereotaktycznaodkładanie A-betaanaliza śmierci komórkowej
Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.