Przedstawiono metodę hodowli Drosophila melanogaster w warunkach aksonicznych i gnotobiotycznych. Zarodki much są dechorionowane w podchlorynie sodu, przenoszone aseptycznie do jałowej diety i hodowane w zamkniętych pojemnikach. Zaszczepianie diety i zarodków bakteriami prowadzi do asocjacji gnotobiotycznych, a obecność bakterii potwierdza się poprzez posiew homogenatów Drosophila na całe ciało.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hodowla muszki owocowej Drosophila melanogaster w warunkach aksenicznych i gnotobiotycznych
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Wpływ mikrobów na niezliczone cechy i zachowania zwierząt jest coraz bardziej rozpoznawany w ostatnich latach. Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest modelem do zrozumienia interakcji mikrobiologicznych z gospodarzami zwierzęcymi, ułatwionymi przez podejścia do hodowli dużych rozmiarów próbek Drosophila w warunkach wolnych od mikroorganizmów (aksenowych) lub ze zdefiniowanymi zbiorowiskami drobnoustrojów (gnotobiotyk). W pracy przedstawiono metodę pobierania zarodków Drosophila, dechorionacji i sterylizacji podchlorynu oraz przejścia na jałową dietę. Wysterylizowane zarodki są przenoszone do sterylnej diety w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml, a rozwijające się larwy i dorosłe osobniki pozostają wolne od jakichkolwiek egzogennych drobnoustrojów do momentu otwarcia fiolek. Alternatywnie, muchy o określonej mikrobiocie mogą być hodowane poprzez zaszczepienie sterylnej diety i zarodków gatunkami drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania. Opisujemy wprowadzenie 4 gatunków bakterii w celu stworzenia reprezentatywnej mikrobioty gnotobiotycznej u Drosophila. Na koniec opisujemy podejścia do potwierdzania składu społeczności bakteryjnej, w tym testowanie, czy aksowa Drosophila pozostaje wolna od bakterii w wieku dorosłym.
Wprowadzenie
Większość zwierząt jest ściśle związana z bakteriami ("mikrobiota") od urodzenia do śmierci1. Porównania zwierząt wolnych od mikroorganizmów ("aksenicznych") i związanych z mikroorganizmami ("konwencjonalnych") wykazały, że mikroorganizmy wpływają na różne aspekty zdrowia zwierząt, w tym na funkcje metaboliczne, żywieniowe, naczyniowe, wątrobowe, oddechowe, immunologiczne, endokrynologiczne i neurologiczne2. Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest kluczowym modelem dla zrozumienia wielu z tych procesów w obecności drobnoustrojów3,4 oraz dla badania wpływu mikrobioty na zdrowie zwierząt5,6. Nie u każdego osobnika ("rdzenia") nie występuje żaden gatunek bakterii, ale gatunki Acetobacter i Lactobacillus liczebnie dominują w mikrobiocie zarówno hodowanej w laboratorium, jak i dziko odławianej D. melanogaster. Inne Acetobacteraceae (w tym Komagataeibacter i Gluconobacter), Firmicutes (takie jak Enterococcus i Leuconostoc) oraz Enterobacteriaceae są albo często obecne u osobników Drosophila w niskiej liczebności, albo nieregularnie obecne w wysokiej liczebności7-12.
Mikrobiota Drosophila i ssaków jest niestała w obrębie i między pokoleniami14,19. Niestałość mikrobioty może prowadzić do szumu fenotypowego podczas pomiaru cech zależnych od mikrobioty. Na przykład Acetobacteraceae wpływają na magazynowanie lipidów (trójglicerydów) u Drosophila15-18. Jeśli Acetobacteraceae są liczniejsze u much z jednej fiolki niż w innych19, muchy izogeniczne mogą mieć różne fenotypy20. Rozwiązanie problemu niestałości mikrobioty u myszy14 jest stosowane w praktyce od lat sześćdziesiątych XX wieku, poprzez wprowadzenie zdefiniowanej społeczności 8 dominujących gatunków drobnoustrojów do młodych myszy w każdym nowym pokoleniu (zmieniona flora Schaedlera), zapewniając, że każde młode jest narażone na te same kluczowe elementy mikrobioty myszy. Praktyka ta kontroluje skład mikrobioty nawet wtedy, gdy mikrobiota nie jest głównym celem badania32 i stanowi precedens w celu zapewnienia obecności kluczowych mikroorganizmów w różnych warunkach eksperymentalnych.
Aby określić wpływ mikrobów na odżywianie Drosophila, opracowano kilka protokołów wyprowadzania linii muchowych aksenu, w tym dechorionację podchlorynu zarodków (pochodzących de novo w każdym pokoleniu lub utrzymywanych z pokolenia na pokolenie przez przejście na bezpłodne diety) oraz leczenie antybiotykami13. Istnieją korzyści płynące z różnych podejść, takie jak łatwość i szybkość zarówno leczenia antybiotykami, jak i seryjnego transferu, w porównaniu z większą kontrolą zmiennych zakłócających dechorionację de novo (np. gęstość jaj, resztkowe drobnoustroje zanieczyszczające, niezamierzone działanie antybiotyków). Niezależnie od metody przygotowania, wprowadzenie określonych gatunków drobnoustrojów do zarodków aksonicznych pozwala na hodowlę Drosophila w określonych zbiorowiskach ("gnotobiotycznych"). Alternatywnie, naśladując wykorzystanie flory Schaedlera, społeczność ta może zostać zaszczepiona do jaj składanych w sposób konwencjonalny (tylko w krokach 6-7), aby zapewnić obecność drobnoustrojów wpływających na cechy w każdej fiolce i uniknąć powikłań związanych z niestałością mikrobioty. W tym miejscu opisujemy protokół hodowli aksonicznej i gnotobiotycznej Drosophila poprzez dechorionację zarodków de novo oraz potwierdzania obecności wprowadzonych lub zanieczyszczających taksonów drobnoustrojów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla bakterii (Rozpocznij ~1 tydzień przed zbieraniem jaj)
- Przygotować zmodyfikowane płytki MRS20 (mMRS) i probówki bulionowe (Tabela 1). Wlać 20 ml agaru mMRS do każdej 100 mm płytki Petriego i pozostawić do ostygnięcia/wyschnięcia na noc lub 5 ml bulionu mMRS do probówek o średnicy 18 mm.
- Smuga Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis i L. plantarum na płytkach agarowych mMRS. Inkubować Acetobacter przez noc w temperaturze 30 °C. Inkubować Lactobacillus beztlenowo, umieszczając płytki w hermetycznym pojemniku i zalewając dwutlenkiem węgla przed zamknięciem. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc.
Uwaga: Kolonie L. brevis mogą być widoczne dopiero po 24-48 godzinach. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C, a kolonie można używać do 3 tygodni. - Dwa do trzech dni przed przeniesieniem zdechorionowanych jaj do bezpłodnej diety (sekcja 5) należy pobrać pojedynczą kolonię z płytki mMRS do probówki zawierającej bulion mMRS. Uprawiać Acetobacter z potrząsaniem i hodować Lactobacillus statycznie przez 24 godziny lub do zmętnienia, w obu przypadkach w temperaturze 30 °C.
2. Przygotuj sterylną dietę
- Przygotować jałową dietę (Tabela 2) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 l. Podgrzej dietę w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje 3 razy po sekwencji; Mieszaj między każdym gotowaniem.
- Umieścić kolbę na płytce mieszającej, aby utrzymać mieszanie podczas przenoszenia diety do stożkowych probówek wirówkowych. Przenieś 7,5 ml paszy do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Luźno zakryj probówki i umieść w zakrytym, autoklawowalnym stojaku polipropylenowym.
- Sterylizuj dietę much za pomocą autoklawu w temperaturze 121 °C i 15 psi przez 25 minut. Wyjmij stojaki z autoklawu i natychmiast potrząśnij każdym stojakiem poziomo, aby upewnić się, że dieta nie rozdzieli się podczas chłodzenia. Uważaj, aby nie potrząsać rusztami pionowo, aby zapobiec przeniesieniu diety na pokrywkę lub brzegi tubek. Pozostaw dietę do ostygnięcia na shakerze dokładnie przez 45 minut i ponownie wstrząśnij dietą poziomo ręcznie.
Uwaga: Dieta może być przechowywana w temperaturze 4-15 °C przez okres do tygodnia. - Jako alternatywę dla używania zakrytych stojaków do sterylizacji w autoklawie (kroki 2.1-2.3) lub do hodowli much na diecie zawierającej kwaśne konserwanty, należy wykonać następujące czynności:
- Przygotuj 1 l płynnej diety w kolbie o pojemności 2 l z mieszadłem w kolbie. Autoklaw diety.
- Po sterylizacji w autoklawie dodać 10 ml środka konserwującego i ciągle mieszać na rozgrzanej płytce mieszającej. Gdy agar ostygnie do 50-60 °C, przenieść kolbę na rozgrzaną płytkę mieszającą w komorze bezpieczeństwa biologicznego i utrzymać temperaturę kolby poprzez ogrzewanie do 50-60 °C.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego pipetować ~7,5 ml pojedynczo do stożkowych probówek.
3. Przygotuj klatki do składania jaj
- Przygotuj talerze agarowe z sokiem winogronowym, podgrzewając w kuchence mikrofalowej 100 ml wody, 10 g drożdży piwnych, 10 g glukozy i 1 g agaru. Doprowadź do wrzenia 3 razy w kroku 1.1 i dodaj 10 g mrożonego koncentratu soku winogronowego, aby zwiększyć widoczność jaj na talerzu agarowym.
- Gdy agar ostygnie do temperatury 55 °C, wlać 20 ml do szalek Petriego o średnicy 100 mm i pozostawić do zestalenia.
- Przykryj powierzchnię płytek agarowych pastą drożdżową, mieszając 1 g drożdży piwnych z 15 g wody. Wlej pastę drożdżową na płytkę agarową, upewniając się, że powierzchnia jest pokryta, a następnie odlej nadmiar, pozostawiając cienką pozostałość drożdży. Jeśli używanych jest wiele płytek, pastę można sekwencyjnie wlewać na wiele płyt.
- Przenieś płytki agarowe na dno klatki.
Uwaga: Pojemnik delikatesowy o pojemności 32 uncji jest dobrym substytutem akrylowych klatek na muchy.- Zrób pokrywki do pojemników delikatesowych o pojemności 32 uncji, wycinając otwór w górze i przyklejając oddychającą siatkę do otworu za pomocą nietoksycznego kleju. Jeśli klej jest rozpuszczalny w wodzie, nie dopuścić do kontaktu pokrywki z wodą.
- Przenieś 200-300 much do pojemnika i przykryj pokrywką. Przykryj otwór zabezpieczony siatką pustą pokrywką szalki Petriego, aby zapobiec parowaniu z powierzchni agaru i w razie potrzeby dodaj wilgotną bibułkę do wnętrza pokrywki. Wysiadywać muchy w temperaturze 25 °C przez noc przez 16-20 godzin.
4. Zbieraj jajka
- Przygotuj sito do zbierania jaj, umieszczając nylonową siatkę w plastikowej tulei.
- Aby odzyskać talerz z jajami, usuń muchy z klatki, przenosząc je do pustego pojemnika. Jeśli te same muchy zostaną użyte następnego dnia, natychmiast przenieś je do nowej klatki zawierającej świeżo drożdżowy talerz agarowy z sokiem winogronowym. Muchy mogą być używane przez 3-5 kolejnych dni
- Usuń martwe muchy z agaru czystym pędzlem, uważając, aby nie rozbić agaru.
- Zbieraj jajka, płucząc płytkę agarową wodą destylowaną, delikatnie strzepując jajka z powierzchni agaru i wylewając gnojowicę na siatkę. Powtórz 3-4 razy, aż wszystkie lub większość jaj zostanie usunięta z płytki agarowej.
5. Jaja dechorionate i przejście na dietę sterylną
- Przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego, spryskując jej wnętrze (w tym boki) 70% etanolem. Przetrzyj spód chusteczką laboratoryjną i sterylizuj kaptur światłem UV przez ~15 min. Wysterylizuj wszystkie materiały niebiologiczne (kubki na próbki, pędzel, kleszcze, pojemnik na odpady, 400 ml wysterylizowanej wody i 100 ml 0,6% podchlorynu sodu) poprzez spryskanie etanolem i natychmiastowe umieszczenie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Sterylizuj światłem UV przez 15 minut.
- Rozpocznij pierwsze z 2 płukań podchlorynem sodu, umieszczając tuleję z jajami w kubku na próbkę o pojemności 120 ml lub innym sterylnym pojemniku. Powoli wlej ~90 ml 0,6% roztworu podchlorynu sodu do tulei, aż znajdzie się tuż pod krawędzią.
- Opłucz jajka przez 2,5 minuty. Okresowo ponownie zawieszaj jaja, przesuwając tuleję w górę iw dół w roztworze podchlorynu za pomocą kleszczy.
- Przenieść tuleję bezpośrednio do drugiego pojemnika na próbkę, wstępnie napełnionego 90 ml wybielacza, wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
- Powtórz krok 5.3 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Pod koniec drugiego wybielacza jaja powinny zacząć przylegać do boków tulei.
- Wykonać kroki 5.7-5.8 w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Wyrzuć wybielacz i umyj tuleję sterylną wodą 3 razy. Kilkakrotnie ponownie zawieś jajka podczas każdego mycia, przesuwając tuleję kleszczami. Pod koniec trzeciego mycia większość jaj powinna być przymocowana do boku tulei.
- Za pomocą pędzla wysterylizowanego w etanolu przenieś jaja z boku tulei na sterylną dietę. Przenoś jaja pojedynczo lub w małych partiach. Staraj się o 30-50 jaj w fiolce. Pozostaw nakrętki luźne, aby tlen mógł dostać się do rurki. Jeśli fiolki mają pozostać aksoniczne, należy je przenieść do inkubatora dla owadów; W przeciwnym razie dodaj bakterie, jak poniżej.
6. Wytwarzaj muchy gnotobiotyczne przy użyciu 4 gatunków bakterii
- Przygotuj bakterie
- Przygotuj wysterylizowaną szafkę bezpieczeństwa biologicznego z niezbędnymi materiałami (pipety, pudełka na końcówki do pipet, wysterylizowane probówki wirówkowe, bulion MRS i stojaki na probówki), jak w kroku 4.1. Wytrzyj zewnętrzną część probówek chusteczką laboratoryjną nasączoną etanolem przed umieszczeniem w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Osadzaj bakterie, najpierw przenosząc 500 μl nocnego wzrostu do sterylnej probówki do mikrofuge. Jeśli gęstość bakterii jest niska, dodaj do 1,5 ml do każdej probówki lub sekwencyjnie usuń supernatant i dodaj dodatkową kulturę do tej samej probówki. Wyjąć próbki z komory bezpieczeństwa biologicznego i wirować przez 10 minut przy 10 000 x g. Używaj końcówek filtrujących, aby uniknąć zanieczyszczenia między próbkami.
- Określ gęstość każdej kultury, mierząc OD600. W przypadku korzystania z czytnika płytek wielodołkowych przenieść 200 μl każdej kultury na płytkę 96-dołkową w 1-, 2- i 4-krotnych rozcieńczeniach.
- Określić ilość mMRS, w której należy rozcieńczyć każdą osadę komórkową (5.2.2) za pomocą spektrofotometru do odczytu płytki i następujących równań. Zaplanuj dodanie wystarczającej ilości bulionu, aby zaszczepić 50 μl do każdej fiolki muchowej.
- Zbierzodczyty OD 600 dla rozcieńczenia 1:1, 1:2 i 1:4 każdej kultury bakteryjnej na spektrofotometrze z odczytem płytki. Wybrać rozcieńczenie dla każdego szczepu bakteryjnego, który wytwarza wartość OD600 między 0,1 a 0,2 i użyć tej wartości wraz z odpowiadającym jej współczynnikiem rozcieńczenia jako "O" i "D" we wzorach podanych w ppkt 6.1.4.2 lub 6.1.4.3.
- Jeśli używasz 4 opisanych tutaj gatunków, znormalizuj komórki do równoważnej gęstości jednostki tworzącej kolonię (CFU)/ml (konwersja OD600 do CFU określona wcześniej20) za pomocą tego równania:
E = ((O-B) x V x D)/C
gdzie E = objętość do ponownego zawieszenia osadu w (μl), O = OD600 bakterii, B = OD600 ślepej pożywki, D = krotne rozcieńczenie, V = μl kultury bakteryjnej przed odwirowaniem, C = OD600 o ustalonej stałej. Zobacz Plik kodu uzupełniającego, aby zapoznać się z przykładami obliczeń przy użyciu tych równań. W przypadku spektrofotometrów, które automatycznie się wyłączają, należy użyć "O" zamiast "O-B".
Uwaga: Z góry określone stałe (jednostki OD600, znormalizowane do 107 CFU ml-1, stałe wyprowadzone w20) są następujące: A. tropicalis (0,053), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,077), L. plantarum (0,056). - W przypadku stosowania innych gatunków bakterii (brak stałej CFU/OD600), znormalizuj gęstość do OD600 = 0,1, używając tego równania:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
Uwaga: Jednostki są takie same jak w kroku 6.1.4.2. Zobacz Plik kodu uzupełniającego, aby zapoznać się z przykładami obliczeń przy użyciu tych równań.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety i ponownie zawiesić osad w świeżym mMRS lub PBS, jak obliczono w kroku 6.1.4.2.
- Zaszczepić bakterie
- Przenieś 50 μl bakterii do stożkowych probówek ze sterylną dietą i zdekorionowanymi jajami w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj bakterie po przeniesieniu jaj, aby zapobiec zanieczyszczeniu między fiolkami.
- Umieścić zaszczepione probówki w inkubatorze w temperaturze 25°C.
7. Zmierz obciążenie CFU/Test na sterylność
- Aby zmierzyć obciążenie CFU w homogenatach much całego ciała, przenieś 5 much (5-7 dni po eklacji) do probówki o pojemności 1,7 ml zawierającej 125 μl kulek ceramicznych i 125 μl bulionu mMRS. Homogenizować muchy za pomocą homogenizatora tkankowego przez 30 sekund z prędkością 4,0 M/s.
- Alternatywnie pomiń kulki i ręcznie homogenizuj w probówkach do mikrowirówek z plastikowymi tłuczkami przez 1 minutę.
- W przypadku ilościowego określania mikrobioty jelitowej należy wysterylizować muszki powierzchniowo, aby usunąć egzogenne drobnoustroje22. Przenieść muchy do probówki mikrowirówkowej zawierającej 100 μl 70% etanolu na 1 minutę, odessać etanol i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki w celu homogenizacji. Jeśli będzie mierzona zawartość DNA w jelitach, przed płukaniem etanolem należy płukać przez 1 minutę 0,6% podchlorynem sodu.
- Rozcieńczyć homogenat 875 μl mMRS, wirować przez 5 sekund i odpipetować 120 μl homogenatu do pierwszego dołka płytki do mikromiareczkowania.
- Wykonać dwa sekwencyjne rozcieńczenia 1:8 przy użyciu 10 μl homogenatu i 70 μl MRS w dwóch następnych studzienkach.
- Usunąć 10 μl z pierwszego dołka i dodać go do drugiego dołka zawierającego 70 μl MRS. Dokładnie wymieszać zawartość drugiego dołka, przenieść 10 μl z drugiego dołka do trzeciego dołka zawierającego 70 μl MRS i dokładnie wymieszać. Prowadzi to do 3 całkowitych stężeń oryginalnego homogenatu o objętości 1 000 μl: nierozcieńczonego, 1:8 i 1:64.
- Przenieść 10 μl każdego rozcieńczenia na płytkę mMRS (w razie potrzeby używając pipety wielokanałowej). Lekko pochyl naczynie, aby rozprowadzić rozcieńczenie kilka milimetrów po powierzchni agaru i pozwól płynowi wyschnąć przed przesunięciem płytki. Płyn szybko wysycha na talerzu, jeśli płytki mają 2 dni, zmniejszając mieszanie się dwóch sąsiednich kropel.
- Inkubować w temperaturze 30 °C przez 1-2 dni. Wyjmij płytki z inkubatora, gdy są wyraźne, widoczne są poszczególne kolonie i policz od rozcieńczenia z 10-100 izolowanymi koloniami.
- Obliczyć jtk na muchę, korzystając z równania E = C x D/P x V/F, gdzie E = jtk na muchę, C = liczba zliczonych kolonii, D = rozcieńczenie, P = μl platerowane, V = objętość homogenatu muchy, a F = liczba homogenizowanych much.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomyślny chów much aksenicznych potwierdza się brakiem jednostek tworzących kolonie (CFU) w homogenizatach całego ciała dorosłych osobników D. melanogaster (Rysunek 1). W przeciwnym razie, jeśli homogenizat wysiany na płytkę daje kolonie, probówki są zanieczyszczone i należy je odrzucić. W przypadku much gnotobiotycznych każdy z czterech izolatów bakteryjnych wyizolowano z pul 5 dorosłych samców, wykazując różnice w całkowitej liczbie żywych CFU związanych z doro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda jest jednym z kilku podejść do dechorionacji zarodka8,11,18,25,26,27, wraz z alternatywnymi metodami hodowli much aksenicznych, w tym seryjnym transferem dorosłych aksenów18,27 lub antybiotykoterapią13,18. Inne metody dechorionacji obejmują płukanie etanolem i redukcję11,25,26 lub przedłużenie8 leczenia podchlorynem. Różne etapy mycia mogą pomóc w hodowli różnych genotypów much: w poprzednim badaniu większość z ~ 100 genotypów Drosophila
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Niektóre szczegóły tego protokołu zostały zoptymalizowane dzięki pomocy dr Adama Dobsona, który również dostarczył pomocnych komentarzy do manuskryptu. Prace te były wspierane przez Fundację na rzecz Narodowych Instytutów Zdrowia (FNIH) grant nr R01GM095372 (JMC, A(CN)W, AJD i AED). Grant FNIH o numerze 1F32GM099374-01 (PDN) oraz fundusze startowe Uniwersytetu Brighama Younga (JMC, MLK, MV). Koszty publikacji zostały pokryte przez Kolegium Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Brighama Younga oraz Wydział Nauk o Roślinach i Dzikiej Przyrodzie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Drożdże piwne | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glukoza | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | |
| 100% koncentrat | soku winogronowego firmy WelchWalmart lub inny sklep spożywczy | 9116196 | |
| http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 Cage: 32 uncje Półprzezroczysty okrągły pojemnik Deli | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Półprzezroczysty okrągły pojemnik na delikatesy z pokrywą | Webstaurant | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Butelki magazynowe | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Siatka nylonowa | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastikowa tuleja | Home Depot | 100404002 | http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002 |
| Plastikowa nasadka tulei | Home Depot | 100153897 | http://www.homedepot.com/p/1-1-4-Sztywna-Plastikowa-izolowana-tuleja-2-Pack-27529/100153897 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html | |
| 50 ml Probówki wirówkowe | TrueLine Probówki | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Pudełka na żywność | USA Naukowy | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Matryca Lizująca D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | |
| http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search końcówki do pipet z filtrem, 300 μ l | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Sprzedaż produktów laboratoryjnych | na szalkach Petriego | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | |
| http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 Pędzel | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Kleszcze | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Wybielacz domowy (6-8% podchlorynu) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Uniwersalny pepton | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Ekstrakt drożdżowy | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Fosforan dipotasowy | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0& mode=dopasowanie%20partialmax& lang= en& region=US& focus=produkt |
| Cytrynian amonu | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0& mode=dopasowanie%20partialmax& lang= en& region=US& focus=produkt |
| Octan sodu | VWR | 97061-994 | |
| https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 Siarczan magnezu | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Siarczan manganu | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20częściowymax& lang=en& region =US& focus=produkt |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96-dołkowy czytnik płytek | BioTek (epoka) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html |
| 1,7 ml Probówki wirówkowe | USA Scientific | 1615-5500 | |
| http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 Końcówki do pipet z filtrem, 1,000 μ l | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 dołków | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/ |
| Koraliki ceramiczne | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Homogenizator tkankowy | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy 1 | Thermo Scientific | Wzór 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
Bibliografia
- McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
- Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
- Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
- Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
- Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
- Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
- Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272(2011).
- Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117(2014).
- Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
- Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749(2013).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
- Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437(2014).
- Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
- Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
- Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
- Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
- Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
- Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
- Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
- Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312(2015).
- Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
- Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
- Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860(2013).
- Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
- Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
- Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765(2012).
- Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576(2014).
- Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
- Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).
