Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych

Podsumowanie

Tutaj wyjaśniamy protokół modelowania mikrośrodowiska biofizycznego, w którym sieciowanie i zwiększona sztywność błony podstawnej (BM) indukowana przez zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE) ma patologiczne znaczenie.

Streszczenie

Tutaj opisujemy protokół, który może być wykorzystany do badania mikrośrodowiska biofizycznego związanego ze zwiększoną grubością i sztywnością błony podstawnej (BM) podczas patologii związanych z wiekiem i zaburzeń metabolicznych (np. rak, cukrzyca, choroby mikronaczyniowe, retinopatia, nefropatia i neuropatia). Założeniem modelu jest nieenzymatyczne sieciowanie odtworzonej matrycy BM (rBM) poprzez traktowanie aldehydem glikolowym (GLA) w celu promowania wytwarzania zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE) w reakcji Maillarda. Przedstawiono przykłady technik laboratoryjnych, które można wykorzystać do potwierdzenia generowania AGE, nieenzymatycznego sieciowania i zwiększonej sztywności w rBM poddanych działaniu GLA. Obejmują one przygotowanie natywnego rBM (traktowanego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, PBS) i sztywnego rBM (traktowanego GLA) w celu oznaczenia: zawartości jego AGE za pomocą analizy fotometrycznej i mikroskopii immunofluorescencyjnej, jego nieenzymatycznego sieciowania za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS PAGE) oraz mikroskopii konfokalnej oraz jego zwiększonej sztywności za pomocą reometrii. Opisana tutaj procedura może być stosowana do zwiększenia sztywności (modułów sprężystości, E) rBM do 3,2 razy, zgodnie z pomiarami wykonanymi w zdrowej i chorej tkance gruczołu krokowego człowieka. Aby odtworzyć biofizyczne mikrośrodowisko związane ze starzeniem się i chorą gruczołem krokowym, wprowadzono trzy typy komórek gruczołu krokowego do natywnego rBM i sztywnego rBM: RWPE-1, komórki nabłonka prostaty (PEC) pochodzące z normalnego gruczołu krokowego; BPH-1, PEC pochodzące z gruczołu krokowego dotkniętego łagodnym przerostem gruczołu krokowego (BPH); i PC3, komórki przerzutowe pochodzące z wtórnego guza kości wywodzącego się z raka prostaty. Można mierzyć wiele parametrów, w tym wielkość, kształt i charakterystykę inwazyjną gruczołów 3D utworzonych przez RWPE-1 i BPH-1 na natywnym i sztywnym rBM oraz średnią długość komórki, prędkość migracji i trwałość ruchu komórek sferoid 3D utworzonych przez komórki PC3 w tych samych warunkach. Można również ocenić komórkowe szlaki sygnałowe i subkomórkową lokalizację białek.

Wprowadzenie

Błona podstawna (BM) to arkusz wyspecjalizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która utrzymuje stabilne granice tkanek poprzez oddzielanie warstw komórek nabłonkowych od zrębu¹. Sieciowanie kowalencyjne między sąsiednimi potrójnymi helisami kolagenu IV w BM stabilizuje ich boczne powiązanie poprzez ustanowienie nieregularnej sieci super skręconych helis². Te kolagenowe sieci dożylne działają jak rusztowanie dla jego interakcji z lamininą i innymi składnikami BM¹. Układ strukturalny BM zapewnia mu wytrzymałość mechaniczną i sztywność niezbędną do prawidłowego rozwoju nabłonka gruczołowego³.

Podczas starzenia się i choroby BM stopniowo gęstnieje i sztywnieje^3,4. Na przykład 3-krotny wzrost modułu sprężystości (E) BM oka występuje między 50 a 80 rokiem życia w normalnej populacji, a usztywnienie to nasila się w zaburzeniach metabolicznych, takich jak cukrzyca⁵. Zmiany strukturalne i biomechaniczne w BM, które powodują jego zwiększoną sztywność, zachodzą, gdy jego składniki ECM, kolagen IV i laminina, stają się nieenzymatycznie usieciowane po ekspozycji na zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE).

Celem opisanej tutaj metody było stworzenie modelu do badania, w jaki sposób sztywność BM, spowodowana ekspozycją na AGE, sprzyja inwazyjności komórek nabłonka prostaty (PEC) i komórek nowotworu prostaty (PTC) w kontekście przejścia na raka prostaty z przerzutami (PCa). Aby to zrobić, poprzednia metoda stosowana do generowania 3D gruczołowych acini z komórek nabłonka sutka (MEC) w odtworzonych żelach rBM⁶ została dostosowana do dodatkowego etapu, w którym żele rBM są wstępnie traktowane aldehydem glikolowym (GLA). Opisano kilka technik oceny sieciowania i usztywnienia indukowanego GLA wstępnie poddanych obróbce żeli rBM, w tym analizę fotometryczną, elektroforezę w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS PAGE), mikroskopię konfokalną i analizę reometryczną. Typy komórek gruczołu krokowego wybrane do hodowli na wstępnie usztywnionym rBM obejmują: RWPE-1, PEC pochodzące z normalnego gruczołu krokowego⁷; BPH-1, PEC pochodzące z gruczołu krokowego dotkniętego BPH⁸; i PC3, przerzutowe PTC pochodzące z guza wtórnego zlokalizowanego w kości kręgowej pacjenta z rakiem prostaty (PCa)⁹.

Oprócz postępu w badaniach nad patologią gruczołów krokowych, protokół usztywniania żeli rBM poprzez ich leczenie GLA może być dostosowany do zbadania, w jaki sposób sztywność BM przyczynia się do innych patologii związanych z wiekiem i zaburzeń metabolicznych. Na przykład, model może być bezpośrednio zastosowany do zbadania, w jaki sposób rak z przerzutami jest wywoływany przez sztywność BM w narządach takich jak piersi, okrężnica, jajnik i trzustka poprzez włączenie odpowiednich typów komórek. Co więcej, protokół może zostać dostosowany do zbadania, w jaki sposób sztywny BM sprzyja biomechanicznym mechanizmom progresji choroby w chorobach mikronaczyniowych związanych z cukrzycą, retinopatii, nefropatii i neuropatii.

Protokół

1. Indukcja sztywności BM wywołana przez leczenie GLA (sieciowanie nieenzymatyczne)

1. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z matrycą BM (10 ml) przez inkubację w temperaturze 4 °C (na lodzie w chłodni lub lodówce) aż zawartość fiolki stanie się płynna (8-16 godzin).
   Ostrzeżenie: Jeśli chłodnia/lodówka nie jest używana, przykryj całą butelkę lodem. Zapobiegnie to krzepnięciu roztworu podstawowego BM.
2. Do przyszłych doświadczeń i w celu uniknięcia powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania należy przygotować 25 porcji po 0,4 ml z każdej nowej 10 ml fiolki z matrycą BM. Fiolki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do upływu terminu ważności wskazanego przez producenta. W razie potrzeby rozmrażać fiolki w temperaturze 4 °C, odstawiając je na lodzie przez 2 godziny.
3. Przygotuj równą powierzchnię lodu. Umieścić szkiełko z 8 dołkami na wierzchu lodu, aby utrzymać temperaturę 4 °C podczas procedury powlekania. Rozmrozić fiolkę z matrycą BM w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Jedna fiolka o pojemności 0,4 ml z matrycą BM wystarcza do pokrycia całego szkiełka z 1 x 8-dołkową komorą. Podczas obchodzenia się z fiolką należy przechowywać przykrytą lodem, aby zapobiec zestaleniu się matrycy BM.
4. Odetnij nożyczkami końcówkę dozującą końcówki pipety o pojemności 200 μl. Schłodzić tępo zakończoną końcówkę pipety o pojemności 200 μl do temperatury 4 °C i umieścić ją w przyrządzie pipetującym o pojemności 200 μl. Pobrać 40 μl zimnego roztworu matrycy BM do końcówki pipety i przenieść go do studzienki na schłodzonym szkiełku podstawowym z 8-dołkową komorą.
   Uwaga: 40 μl roztworu BM wystarcza na pokrycie powierzchni 0,8^cm2. Podczas powlekania końcówki pipet należy przechowywać w chłodnym miejscu, aby uniknąć zestalenia roztworu BM. Nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza do roztworu matrycy BM i upewnij się, że studzienka jest równomiernie pokryta bez tworzenia się widocznego menisku na krawędziach.
5. Powtórz krok 1.4 w zależności od wymaganej liczby studzienek i komór.
6. Po powlekaniu umieścić szkiełko 8-dołkowe w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby przyspieszyć polimeryzację BM. Bardzo ostrożnie zamknąć drzwi inkubatora, aby uniknąć niepożądanych zakłóceń płynnego rBM. Nie należy przekraczać 30-minutowego czasu inkubacji, aby uniknąć odwodnienia żelu rBM.
   Uwaga: Otrzymany żel jest natywnym rozpuszczonym BM (rBM). Etap inkubacji w temperaturze 37 °C nie wymaga 5 % emisji CO₂ . Jednak dla wygody należy wykonać ten krok w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na temperaturę 37 °C i 5 % CO₂ (z nawilżaniem).
7. Przygotować 50 mM aldehydu glikolowego (GLA) rozcieńczonego w 0,2 M buforze fosforanowym (pH 7,8). Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
   1. W przypadku reakcji sieciowania w końcowej objętości 250 μl 50 mM GLA należy dodać 25 μl 0,5 M cyjanoborowodorku sodu lub 2,5 M aminoguanidyny do 125 μl 100 mM GLA (2x podstawa) i 100 μl 0,2 M buforu fosforanowego (pH 7,8). Wysterylizować roztwory podstawowe, przepuszczając je przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
      Ostrzeżenie: Podczas pracy pod wyciągiem należy obchodzić się z cyjanoborowodorkiem sodu w fartuchu laboratoryjnym, rękawicach, osłonie twarzy i respiratorze.
8. Dodać 250 μl roztworu GLA w celu przykrycia spolimeryzowanego żelu rBM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin w celu uzyskania półsztywnego żelu rBM lub 14 godzin w celu uzyskania sztywnego żelu rBM.
   Uwaga: Objętość dodanego GLA musi pokrywać spolimeryzowany żel rBM i powinna być odpowiednio dostosowana. Jeżeli stosuje się różne czasy inkubacji GLA, żele rBM powinny być analizowane w celu określenia zwiększenia sztywności rBM (patrz krok 2.4).
   1. Przygotować kontrolę ujemną, inkubując natywny żel rBM w 250 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 14 godzin w temperaturze 37 °C.
   2. Przygotować dwie dodatkowe kontrole, w których tworzenie zasady Schiffa lub przegrupowanie adduktu Amadoriego podczas reakcji sieciowania jest zahamowane przez dodanie 50 mM cyjanoborowodorku sodu lub 250 mM aminoguanidyny.
9. Przygotować 1 M ester etylowy glicyny (GEE) rozcieńczony w PBS. Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
10. Po wskazanym czasie inkubacji ostrożnie usunąć roztwór GLA z usieciowanych żeli rBM, roztwór GLA zawierający inhibitory z kontrolnych żeli rBM oraz PBS z kontrolnych natywnych żeli rBM. Dodać 250 μl roztworu GEE do wszystkich żeli rBM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godz.
    Uwaga: Ten krok wygasza reakcję sieciowania.
11. Umyj wszystkie żele rBM 10 razy w 500 μl PBS, aby usunąć wszelkie ślady GLA i GEE. Żele rBM należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 400 μl PBS, aby zapobiec ich odwodnieniu.
    1. Przeanalizuj żele rBM pod kątem akumulacji AGE, nieenzymatycznego sieciowania i właściwości lepkosprężystych (kroki 2.1-2.4). Do analizy reometrycznej ich właściwości lepkosprężystych należy przygotować żele rBM w pierścieniach klonujących (krok 2.4).
    2. W przypadku hodowli komórkowej przed wysiewem komórek należy przepłukać żele rBM 2 razy pożywką hodowlaną o objętości 500 μl (kroki 5 i 6). Mycie należy wykonywać delikatnie, tak aby końcówka pipety nie dotykała powierzchni żelu.

2. Kwantyfikacja sieciowania nieenzymatycznego i sztywności rBM poddanego działaniu GLA

1. Analiza fotometryczna
   1. Zmierz akumulację AGE w żelach poddanych działaniu GLA i kontroluj rBM za pomocą analizy fotometrycznej w celu określenia zakresu reakcji Maillarda.
      1. Po kroku 1.11 usunąć PBS z żeli rBM w 8-dołkowych szkiełkach komorowych i dodać 250 μl lodowatej wody podwójnie destylowanej. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 16-24 godziny, aby upewnić się, że matryca jest całkowicie upłynniona.
         Uwaga: peptydy rBM w tym roztworze zawierają AGE o właściwościach autofluorescencyjnych.
      2. Przenieść skroplony roztwór BM do probówki o pojemności 1,5 ml i zmierzyć emisję fluorescencyjną roztworu za pomocą spektrofotometru (długość fali wzbudzenia = 370 nm; długość fali emisji = 440 nm).
2. SDS-PAGE Analiza peptydów bromku cyjanu
   1. Rozpuścić żele rBM poddane działaniu GLA i kontrolne na żelu poliakrylamidowym, aby potwierdzić, że GLA indukował sieciowanie i tworzenie makrowłókien.
      1. Odwirować skroplony roztwór BM zebrany w kroku 2.1.1.2 przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Przygotować roztwór podstawowy zawierający 2 g/ml bromku cyjanu rozcieńczonego w acetonitrylu.
         Ostrzeżenie: Z bromkiem cyjanogenu należy zawsze obchodzić się pod wyciągiem, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice, osłonę twarzy i respirator.
      3. Usunąć supernatant, zawiesić ponownie osad żelu BM w 500 μl 20 mg/ml bromku cyjanu + 70 % v/v kwasu mrówkowego i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
      4. Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml przenieść zawieszone granulki żelu BM do kasety dializacyjnej o masie cząsteczkowej odciętej 3,5 kDa.
      5. Zanurz kasetę w szklanej zlewce o pojemności 500 ml zawierającej 500 ml podwójnie destylowanej wody i mieszadło magnetyczne. Umieścić go na mieszadle magnetycznym i dializować przez noc (16 godzin) w temperaturze 4 °C (w chłodnym pomieszczeniu), aby usunąć wszelkie ślady bromku cyjanu i kwasu mrówkowego.
      6. Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml przenieś dializowany roztwór BM z kasety do probówki o pojemności 1,5 ml.
      7. Poddać analizie 25 μl każdej próbki BM w żelu poliakrylamidowym^{12% v/v 10,11}. Podążając za SDS-PAGE, przeprowadzić barwienie srebrem żelu poliakrylowoamidowego¹², aby uwidocznić wzór elektroforetyczny peptydów bromku cyjanu¹³.
3. Analiza mikroskopii immunofluorescencyjnej
   1. Przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne żeli traktowanych GLA i kontrolnych rBM za pomocą przeciwciał anty-AGE/pentozydyny, anty-kolagenu IV i anty-lamininy, a następnie mikroskopii konfokalnej w celu wizualizacji nagromadzonych AGE i rearanżacji strukturalnych włókien kolagenu IV/lamininy w usieciowanych żelach rBM¹³,
      Uwaga: Podczas inkubacji i płukania należy zawsze używać wystarczającej objętości, aby pokryć cały żel rBM bez dotykania powierzchni rBM końcówką pipety. Szczegółowe informacje na temat analizy 3D kultur acini za pomocą immunofluorescencji znajdują się w odnośniku⁶, a w przypadku mikroskopii konfokalnej 3D acini patrz odniesienie¹⁴.
      1. Przemyć żele rBM poddane działaniu GLA i kontrolujące w 8-dołkowych szkiełkach komorowych 2 razy za pomocą 300 μl PBS+ (PBS zawierający 0,1 mM CaCl₂ i 0,5 mM MgCl₂) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Usunąć PBS+, a następnie dodać 300 μl 4% w/v paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS+, aby pokryć każdy żel rBM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia składników rBM.
      3. Usunąć 4 % roztwór PFA z w/v. Dodać dodać 300 μl 75 mM roztworu NH₄Cl + 0,5 mM MgCl₂ i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (powtórzyć 5 razy), aby schłodzić utrwalenie.
      4. Przygotować bufor immunofluorescencyjny (bufor IF), sporządzając następujący roztwór w sterylnej wodzie: 130 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3,5 mM NaH₂PO₄, 7,7 mM NaN₃, 0,1% w/v albuminy surowicy bydlęcej, 0,5% v/v eteru tert-oktylofenylowego glikolu polietylenowego i 0,05% v/v monolaurynianu sorbitolu glikolu polietylenowego.
      5. Przygotować bufor blokujący IF, uzupełniając bufor IF 20 % v/v koziej surowicy.
      6. Usunąć roztwór hartowniczy i dodać 300 μl buforu blokującego IF do żeli rBM, aby zapobiec reakcjom niespecyficznym. Inkubuj 2 godziny w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej.
      7. Usunąć bufor blokujący IF i inkubować żele rBM przez 16 godzin w temperaturze 4 °C z 300 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w buforze blokującym IF (1: 500 mysich przeciwciał anty-pentozydynowych; 1/250 króliczych anty-kolagenowych IV pAb; 1/250 króliczych anty-lamininy A/C pAb).
         Uwaga: Inkubacja trwająca dłużej niż 20 godzin w temperaturze 4 °C może spowodować upłynnienie rBM.
      8. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć 3 razy (po 10 minut) 300 μl buforu IF w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej.
      9. Usunąć bufor IF i dodać 300 μl przeciwciała drugorzędowego (koziego przeciwciała anty-króliczego lub anty-mysiego IgG [H+L]) sprzężonego z fluorochromem rozcieńczonym w stosunku 1:500 w buforze blokującym IF. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej.
      10. Usunąć przeciwciało drugorzędowe i inkubować w 300 μl buforu IF przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor IF i przemyć 3 x 10 min w 300 μl PBS+ w temperaturze pokojowej.
      11. Napraw i schładzaj po raz drugi, jak opisano powyżej (kroki 2.3.1.2 i 2.3.1.3).
      12. Zamontuj barwione żele rBM w podłożu montażowym i przeanalizuj tworzenie się gęstych wiązek głównych składników za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.
          Uwaga: Szczegółowe informacje na temat analizy 3D kultur acini za pomocą immunofluorescencji znajdują się w odnośniku⁶, a w przypadku mikroskopii epifluorescencyjnej i konfokalnej 3D acini patrz odniesienie¹⁴.
4. Analiza reologiczna
   1. Wykonaj analizę reometryczną żeli traktowanych GLA i kontroluj żele rBM w celu zmierzenia ich lepkosprężystości (sztywności).
      1. Żele rBM o grubości 1 mm ułożyć w okrągłej formie o średnicy 8 mm. W tym celu należy umieścić pierścień klonujący (o średnicy 8 mm) w studzience 24-dołkowej płytki hodowlanej i dodać roztwór matrycy BM przygotowany zgodnie z opisem w krokach 1.3-1.6.
         Uwaga: W celu dokładnego podsumowania żeli rBM używanych do eksperymentów, żele rBM przygotowane do analizy reometrycznej muszą mieć taką samą powierzchnię i grubość, jak żele rBM ustawione w komorach 8-dołkowych. Żele rBM analizowane na rysunku 3 miały grubość 1 mm i średnicę 8 mm.
      2. Żele rBM ustawione w pierścieniach klonowania należy traktować PBS, GLA przez 6 godzin i GLA przez 14 godzin, jak opisano powyżej (kroki od 1.8 do 1.11).
      3. Zmierzyć moduł sprężystości (E) żeli rBM o średnicy 8 mm na reometrze o geometrii ząbkowanej płytki równoległej 8 mm, w zakresie odkształcenia 1-3%, przy oscylacji o stałej częstotliwości 1 Hz i temperaturze 21 °C. Dodatkowe informacje na temat analizy reometrycznej żeli ECM można znaleźć w piśmiennictwie, patrz odniesienie^13,15,16.
         Uwaga: E wyznacza się na podstawie wynikowego modułu magazynowania przy ścinaniu (G') za pomocą następującego równania E = 2 * G' * (1 + v), gdzie v jest współczynnikiem Poissona wynoszącym 0,5, jak opisano w odniesieniu^13,15,16.

3. Hodowla i obchodzenie się z normalną linią PEC, RWPE-1

1. Hoduj komórki RWPE-1 w pożywce wolnej od surowicy keratynocytów (KSFM) uzupełnionej 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 50 μg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE) i 50 μg/ml penicyliny z 50 μg/ml streptomycyny (kompletny KSFM).
   Uwaga: Aby uniknąć indukcji przejścia z nabłonka do mezenchymalnego (EMT), nie należy wystawiać komórek RWPE-1 na działanie surowicy. Pozwól, aby cały KSFM osiągnął RT przez 30 minut po wyjęciu z magazynu w temperaturze 4 °C i nie podgrzewaj w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ponieważ spowoduje to dezaktywację EGF i BPE.
2. Odessać cały KSFM ze zlewającej się 10 cm² płytki komórek RWPE-1, przepłukać 5 ml wstępnie podgrzanego PBS i dodać 5 ml 0,05% v/v trypsyny, upewniając się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem.
   1. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym w standardowych warunkach 37 °C i 5% CO₂ (z nawilżaniem) na 5 do 10 minut. Sprawdź stopień trypsynizacji po 5 minutach i delikatnie postukaj w płytkę hodowlaną, aby oderwać komórki.
      Uwaga: Komórki RWPE-1 nie tolerują długich okresów trypsynizacji, dlatego zaleca się, aby nie dotykać więcej niż dwóch płytek jednocześnie. Ważne jest również, aby oddzielić wszystkie komórki od płytki, aby uniknąć selekcji klonalnej.
3. Gdy wszystkie komórki RWPE-1 odłączą się, dodać 5 ml ciepłego PBS zawierającego 2 % v/v płodowej surowicy cielęcej (FCS) w celu ugaszenia trypsyny. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić agregaty komórek przed przeniesieniem komórek do probówki wirówkowej.
4. Odwirować oddzielone komórki w temperaturze 125-150 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml pełnego KSFM aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
5. Przenieść 1 ml ponownie zawieszonych komórek do nowej probówki i dodać 9 ml kompletnego KSFM w celu rozmnożenia komórek w rozcieńczeniu pasażowym 1:5 do późniejszego użycia doświadczalnego. Policz pozostałe komórki za pomocą hemocytometru w celu ustawienia acini (patrz sekcja 5.1).
   Uwaga: Nie hoduj komórek RWPE-1 przez więcej niż 10 pasaży, ponieważ po dłuższych okresach hodowli nie tworzą one acini o prawidłowej architekturze.
6. Zmieniaj pożywki hodowlane co 48 godzin, aby upewnić się, że EGF i BPE pozostają aktywne.
   Uwaga: Uwzględnij tę zmianę podłoża w przypadku wszelkich zabiegów, które trwają dłużej niż 48 godzin.

4. Hodowla i obchodzenie się z linią komórkową BPH, BPH-1

1. Hodowla komórek BPH-1 w pożywce RPMI 1640 uzupełniona 5 % v/v FCS, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzać pożywkę hodowlaną, PBS i 0,25% w/v roztwór trypsyny-0,53 M EDTA do temperatury 37 °C.
   Uwaga: Komórki można również hodować w pożywkach o stężeniu 2,5 % v/v FCS⁸.
2. Odessać pożywkę hodowlaną z konfluentnej 10^cm2 płytki komórek BPH-1 i przemyć komórki 2 x 3 ml PBS w celu usunięcia wszystkich śladów pożywki hodowlanej surowicą, która może wygasić reakcję trypsyny.
3. Odessać PBS i dodać 3 ml roztworu trypsyny-EDTA, aby pokryć komórki. Umieścić płytkę w inkubatorze nastawionym na 37 °C i 5% CO₂ (z nawilżaniem) na 5 minut. Usuń roztwór trypsyny-EDTA, gdy komórki są okrągłe, ale pozostają przymocowane do naczynia. Umyj komórki 5 ml PBS.
4. Po usunięciu PBS dodać 5 ml pożywki hodowlanej i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml.
5. Pobrać 2 ml zawiesiny komórek do nowej probówki wirówkowej z 8 ml kompletnej pożywki i umieścić komórki BPH-1 na 10 cm² płytce hodowlanej w rozcieńczeniu 1:5 w celu późniejszego użycia doświadczalnego. Policz pozostałe komórki za pomocą hemocytometru w celu ustawienia acini (patrz sekcja 5.2).
   Uwaga: Zachowaj numer przejścia, ponieważ starsze komórki BPH-1 nie tworzą acini o odpowiedniej architekturze. Fragment o numerze większym niż 10 nie jest pożądany.
6. Zmieniaj pożywkę co 72 godziny.

5. 3D Kultura gruczołu krokowego Acini na rodzimym i sztywnym rBM

1. Jeśli do tworzenia aciny używane są komórki RWPE-1, należy rozcieńczyć 5 000 komórek przygotowanych w kroku 3.5 w 300 μl kompletnego KSFM uzupełnionego 2 % v/v roztworu BM.
2. Jeśli komórki BPH-1 są używane do tworzenia acini, rozcieńczyć 2 500 komórek przygotowanych w kroku 4.5 w 300 μl pożywki hodowlanej RPMI 1640 uzupełnionej 2 % v/v roztworu BM.
   Uwaga: Komórki BPH-1 są większe niż komórki RWPE-1, dlatego stosuje się mniejszą liczbę komórek BPH-1, aby uzyskać podobny rozkład acini po 6 dniach hodowli.
3. Delikatnie wysiewaj komórki na natywnym i usztywnionym przez AGE rBM i ostrożnie umieść kultury w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO₂ (z nawilżaniem), aby zapewnić równomierne rozprowadzenie rosnących acini w studzience i że każda komórka dzieli się, aby wytworzyć jedną acina.
4. Co 2 dni należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką zawierającą 2 % roztwór BM v/v, aby upewnić się, że komórki mają czynniki wzrostu wymagane do prawidłowej homeostazy acina.
5. Monitorowanie morfologii ziarniastej w rosnących kulturach za pomocą mikroskopii jasnego pola¹³.
   Uwaga: Po 3 dniach w hodowli pojedyncze komórki utworzą skupisko >3 komórek, a po 1 tygodniu zaobserwuje się acini gruczołu krokowego o średnicy ~50 μm.
6. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w 2.3, aby przeprowadzić immunofluorescencję przy użyciu przeciwciał specyficznych dla markerów adhezji macierzy komórkowej, adhezji komórka-komórka, polarności apiko-podstawowej i inwazyjności¹³.
   1. Użyć podłoża montażowego z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) lub dołączyć dodatkowy etap (po 2.3.12) do barwienia jąder komórkowych przez inkubację z DAPI przez 5 minut i przemywać 2 x 5 minut PBS+.

6. 3D Hodowla agregatów komórek nowotworowych prostaty na natywnym i sztywnym rBM

1. Hodowla komórek PC3 w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10 % v/v FCS i 50 U/ml penicyliny z 50 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzać pożywkę hodowlaną, PBS i 0,25% w/v roztwór trypsyny-0,53 M EDTA do temperatury 37 °C.
2. Odessać pożywkę hodowlaną z naczyń hodowlanych o długości 10^cm2 komórek PC3 i umyć komórki 2x 3 ml PBS, aby usunąć wszelkie ślady FCS, które mogą wygasić reakcję trypsyny.
3. Odessać PBS i dodać 3 ml roztworu trypsyny-EDTA, aby przykryć komórki i inkubować przez 1 minutę.
4. Gdy komórki staną się zaokrąglone, ale pozostaną przyczepione do naczynia, ostrożnie odessać roztwór trypsyny-EDTA i przemyć 3 ml PBS, aby usunąć wszelkie ślady trypsyny.
5. Po usunięciu PBS dodać 5 ml pożywki hodowlanej i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml.
6. Pobrać 1 ml zawiesiny komórek PC3 do nowej probówki wirówkowej i dodać 9 ml pożywki hodowlanej. Umieścić komórki na naczyniu hodowlanym o średnicy 10^cm2 (rozcieńczenie 1:10) w celu późniejszego użycia doświadczalnego. Policz pozostałe komórki za pomocą hemocytometru.
7. Rozcieńczyć 2 500 komórek PC3 przygotowanych w kroku 6.6 w 300 μl pożywki hodowlanej RPMI 1640 uzupełnionej 2 % v/v roztworu BM, aby umożliwić utworzenie gradientowego żelu w hodowli.
8. Delikatnie wysiewaj komórki na natywnym i usztywnionym przez AGE rBM i ostrożnie umieść kulturę w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO₂ (z nawilżaniem), aby zapewnić równomierne rozprowadzenie rosnących sferoid w studzience.
9. Zmieniaj pożywkę co 72 godziny.
10. Aby zbadać wpływ sztywnego (bogatego w AGE) rBM na migrację komórek nowotworu prostaty, zobrazuj komórki PC3 za pomocą mikroskopii poklatkowej wideo w jasnym polu przy użyciu kontroli temperatury/CO₂ i wilgotnej komory¹⁷,
    Uwaga: Komórki PC3 rosną w pasmach na natywnym rBM i nie tworzą acini ze światłem, ale jeśli pozostawi się je do wzrostu dłużej niż 72 godziny na natywnym rBM, utworzą sferoidy 3D.
11. Po pobraniu danych ręcznie śledź komórki PC3 i oblicz ich prędkość migracji, kształt (współczynnik wydłużenia) i trwałość migracji^17-19,
    Uwaga: Trwałość = stosunek D/T, D = odległość od początku do końca trajektorii komórki, T = całkowita długość trajektorii komórki.

Wyniki

3D Prostata Acini hodowana na sztywnym rBM

Po 6 dniach hodowli, PEC pochodzące z normalnej tkanki prostaty (RWPE-1) (Rysunek 1A) i tkanki BPH (BPH-1) (Rysunek 1B) tworzą acini na natywnym (traktowanym PBS) rBM, które są zorganizowane w jednolite sferoidy komórek nabłonkowych. Te acini mają również cechy wysoce zorganizowanych PEC z polaryzacją wierzchołkowo-podstawową i widzialną przestrzenią świetlną^13,20.

Acini utworzone przez PEC pochodzące z normalnej tkanki prostaty (RWPE-1) (Rysunek 1A) i tkanki BPH (BPH-1) (Rysunek 1B) na usztywnionym (bogatym w AGE) rBM (traktowanym GLA) mają zaburzoną architekturę (zmieniającą kształt z sferoidalnego na wielokątny i komórki wystające/migrujące z acini do bogatego w WIEK rBM) (Rysunek 1A). Te acini charakteryzują się również wysoce zdezorganizowanymi PEC, które utraciły swoją polaryzację wierzchołkowo-podstawną z małą lub żadną przestrzenią świetlną¹³.

Rycina 1: Komórki nabłonka gruczołu krokowego wyhodowane jako gruczołowe acini 3D na natywnej i sztywnej odtworzonej błonie podstawnej (rBM). (A) Obrazy w jasnym polu komórek RWPE-1 hodowanych przez 12 godzin do 6 dni na żelach rBM traktowanych PBS (natywnym) lub 50 mM aldehydem glikolowym przez 14 godzin (AGE-rich; sztywna); Podziałka = 50 μm. (B) komórki BPH-1, wyhodowane zgodnie z opisem w panelu A; Podziałka = 50 μm; Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Charakterystyka nabłonka gruczołu krokowego RWPE-1 acini uprawianych na natywnej, półsztywnej i sztywnej odtworzonej błonie podstawnej (rBM). RWPE-1 acini hodowano na rBM wstępnie potraktowanym PBS przez 14 godzin (natywny), aldehyd glikolowy (GLA) przez 6 godzin (półsztywny) lub GLA przez 14 godzin (sztywny). W przypadku kształtu ziarniaków procent (%) ± odchylenie standardowe (SD) okrągłych, półwielokątnych i wielokątnych acini obliczono na podstawie 5 niezależnych eksperymentów (50 acini określonych ilościowo dla każdego warunku). Względną wielkość ziarniaka obliczono (natywne rBM = 100 %) na podstawie 3 niezależnych doświadczeń. Jeśli chodzi o inwazyjność, % ± SD acini z jedną lub więcej wystającymi komórkami obliczono na podstawie 3 niezależnych eksperymentów. Zmianę zagięcia oblicza się, dzieląc średnią wartość uzyskaną w warunkach półsztywnych lub sztywnych przez odpowiednią wartość dla warunków natywnych. Wartości P obliczone za pomocą testu t-Studenta (α = 0,05).

Zwiększona sztywność rBM zależna od WIEKU sprzyja migracji komórek nowotworowych gruczołu krokowego PC3

Komórki PC3 wyhodowane na natywnym rBM migrują poprzez utrzymanie ciągłego kontaktu komórka-komórka, podczas gdy komórki PC3 wyhodowane na bogatym w AGE (sztywnym) rBM poruszają się niezależnie od siebie (Rysunek 2A). Po 72 godzinach w hodowli komórki PC3 tworzą ogniska (sferoidy) na natywnym (traktowanym PBS) rBM, podczas gdy komórki PC3 na sztywnym (bogatym w AGE) rBM nie wychodzą ze sferoid i migrują niezależnie (Figura 2B). Komórki PC3 na sztywnym (bogatym w wiek) rBM są bardziej wydłużone niż komórki PC3 hodowane na natywnym rBM (Figura 2C). Komórki PC3 na sztywnym rBM migrują szybciej niż komórki PC3 hodowane na natywnym rBM (ryc. 2D). Komórki PC3 na sztywnym rBM wykazują spadek trwałości w porównaniu z komórkami PC3 hodowanymi na natywnym rBM (Figura 2E).

Rycina 2: Migracja komórek guza gruczołu krokowego na natywnej i sztywnej odtworzonej błonie podstawnej (rBM). (A) Obrazy w jasnym polu komórek PC3 hodowanych na żelach rBM traktowanych PBS (natywny) lub 50 mM aldehydu glikolowego przez 14 godzin (bogaty w AGE, sztywny). Komórki obrazowano za pomocą mikroskopu jasnego pola (obiektyw 10X) i szybkości akwizycji 1 obrazu na godzinę przez 12 godzin, a następnie śledzono komórki w celu wygenerowania trajektorii. Pokazane obrazy odpowiadają punktom czasowym po 0, 3, 6, 9 i 12 godzinach. Trajektorie pojedynczych komórek są pokazane dla 12-godzinnego punktu czasowego. Podziałka = 100 μm. (B) Komórki PC3 hodowane na natywnym lub sztywnym rBM przez 72 godziny i obrazowane zgodnie z opisem w panelu (A). Podziałka = 100 μm. Szczegół pokazuje wybrany obszar przy 2-krotnym powiększeniu. C) średnia długość komórki ± S.D. (μm); istotna różnica między natywnym rBM a sztywnym rBM (p = 1,2 x ^10-23). (D) średnia prędkość ± S.D. (μm/h) obliczona na podstawie trajektorii komórek; istotna różnica między natywnym rBM a sztywnym rBM (p = 0,004). (E) Średnia trwałość ruchu komórki ± S.D. (stosunek D/T, gdzie D = odległość od początku do końca trajektorii komórki, T = całkowita długość trajektorii komórki); istotna różnica między natywnym rBM a sztywnym rBM (p = 0,0007). Dla paneli C-E przeanalizowano >10 komórek, dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół generowania gruczołowych acini 3D z MEC w czystych żelach rBM⁶ został zmodyfikowany w poprzednim badaniu przez dodanie 4 mg / ml kolagenu typu I do matrycy rBM. Dodatek kolagenu spowodował wzrost modułu sprężystości żelu rBM ze 175 ± 37 do 1589 ± 380 Paskalach. Ten 9,1-krotny wzrost sztywności modulował wzrost, przeżywalność, migrację i różnicowanie MEC²¹. Protokół został ponownie zmodyfikowany poprzez włączenie etapu leczenia D-(-)-rybozą w celu promowania nieenzymatycznego sieciowania kolagenu typu I, który został dodany do żelu rBM. Stwierdzono, że wynikający z tego 15-krotny wzrost sztywności współpracuje z onkogenną transformacją MEC w celu promowania ich inwazyjnego zachowania²². Eksperymentalne podejście polegające na dodawaniu kolagenu typu I do żeli rBM ułatwia bezpośrednią interakcję MEC z włóknami kolagenowymi, która zachodzi tylko w tkance ludzkiej po tym, jak fizyczna bariera między zrąbem a nabłonkiem dostarczana przez BM ulega degradacji proteolitycznej. Poprzez generowanie 3D acini gruczołowych z PEC w czystych żelach rBM wstępnie potraktowanych GLA, obecny protokół otwiera drogę do zbadania, w jaki sposób sztywność BM sama w sobie może wyzwalać ich inwazyjne zachowanie (ryc. 3). Poziomy sztywności BM indukowane w tym protokole mają znaczenie fizjologiczne. Inkubacja z 50 mM GLA przez odpowiednio 6 godzin i 14 godzin zwiększyła moduły sprężystości czystego żelu rBM do 175 ± 90 i 322 ± 160 w porównaniu do 122 ± 55 paskali w żelach rBM traktowanych PBS (Tabela 1). Ten 1,7 do 3,2-krotny wzrost sztywności rBM podsumowuje 2,5-3,4-krotny wzrost sztywności obserwowany w złośliwej w porównaniu z normalną tkanką prostaty lub BPH^23-26. Jak opisano w niedawnej publikacji¹³ , zmiany morfologiczne wywołane akumulacją sztywności AGE i rBM w PEC acini można określić ilościowo dla statystycznie istotnego przesunięcia od kształtu zaokrąglonego do wielokątnego, zmniejszonej powierzchni zrazikowej światła / całkowitej i wystających komórek migrujących z aciny do rBM bogatego w AGE (Figura 3). Immunoblotting może być również stosowany do oceny markerów EMT (np. Utrata E-kadheryny¹³) i zachowania kurczliwości (np. Fosforylowany łańcuch lekki miozyny-2, pMLC2¹³) w PEC hodowanych w normalnym i sztywnym rBM (Figura 3). Dalsza ocena za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej może być zastosowana do wizualizacji BM (np. laminina, kolagen IV i akumulacja AGE¹³), polaryzacji komórkowej wierzchołkowo-podstawnej (np. Lokalizacja wierzchołkowa EEA1: wczesny antygen endosomalny 1; i GM130: marker cis-Golgiego¹³ kDa) i komórkowych wzorców cząsteczek adhezyjnych (np. Lokalizacja E-kadheryny do połączeń komórka-komórka¹³) (Figura 3).

Rysunek 3: Przegląd różnych przedstawionych tutaj protokołów. Schemat przedstawia sposób przygotowania i usztywnienia odtworzonej błony podstawnej (rBM) aldehydem glikolowym (reakcja Maillarda), jak wysiewać komórki do sztywnego rBM, jak analizować sztywny rBM (zakres reakcji Maillarda) oraz procedury, które można zastosować do analizy zmian komórkowych i molekularnych wywołanych przez rBM bogaty w AGE. AGE, zaawansowane produkty końcowe glikacji; BM, błona podstawna; DAPI, 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; EEA1, wczesny antygen endosomalny 1; GAPDH, dehydrogenaza gliceryno-3-fosforanowa; GLA, aldehyd glikolowy; GEE, ester etylowy glicyny; GM130, 130 kDa marker cis-Golgiego; p-MLC2 (Thr18/Ser19), łańcuch lekki miozyny-2 fosforylowany w miejscach treoniny 18 i seryny 19; rBM, odtworzona błona podstawna; SDS-PAGE, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu. Dla RWPE1 acini Podziałka = 10 μm; dla sferoid komórek nowotworowych PC3 Pasek skali = 100 μm. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru^{referencyjnego 13}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kroki rozwiązywania problemów będą konieczne, jeśli D-(-)-ryboza zostanie wybrana jako środek sieciujący dla rBM. Podczas opracowywania protokołu stwierdzono, że leczenie 1 M D-(-)-rybozą przez 72 godziny, jak opisano wcześniej dla żeli rBM / kolagen²², spowodowało odwodnienie i kurczenie się żeli rBM. Ocena niższych stężeń D-(-)-rybozy i krótszych czasów leczenia może pomóc w przezwyciężeniu tego ograniczenia.

Potencjalne ograniczenie w przyszłych zastosowaniach protokołu można napotkać tam, gdzie pożądane są wyższe poziomy sztywności rBM. Jeśli dłuższe czasy inkubacji i wyższe stężenia GLA są stosowane w celu wywołania wyższych poziomów sztywności żelu rBM, konieczna będzie ocena, czy te warunki leczenia mają wpływ na przeżycie i proliferację komórek, jak opisano wcześniej¹³. Należy również zauważyć, że inkubacja komórek RWPE-1 z surowicą indukuje fenotypowe przejście podobne do EMT i należy unikać ekspozycji na surowicę lub materiały zawierające surowicę. Na przykład, jeśli eksperymenty obejmują transfekcję krótkich interferujących oligonukleotydów RNA (siRNA), procedura powinna być zoptymalizowana przy użyciu komórek RWPE-1 hodowanych w KSFM, bez przełączania komórek na pożywki o niskiej transfekcji surowicy. Ta wada może zagrozić poziomowi wyciszania genów osiągniętemu przy użyciu przejściowych podejść siRNA w modelu. W przypadku niektórych celów białkowych zaleca się stosowanie indukowalnych wektorów shRNA w celu dostrajalnego wyciszenia genów i pożądanego spadku poziomu białka. Adaptacje, które obejmują sieciowanie enzymatyczne za pomocą oksydazy lizylowej (LOX) związanej z komórkami zrębu lub komórkami ^{nowotworowymi17} , mogą również zostać włączone do przyszłych modeli.

Protokół ten ułatwi w przyszłości badania mechanizmów proinwazyjnych wyzwalanych przez zależną od AGE sztywność BM w PEC (RWPE-1, BPH-1) oraz ocenę celów przeciwprzerzutowych w inwazyjnych PTC (PC3). Biorąc pod uwagę, że BPH jest uważany za zaburzenie metaboliczne²⁷, protokół ten toruje również drogę do lepszego zrozumienia związku między zaburzeniami metabolicznymi a zwiększonym ryzykiem raka prostaty. Biorąc pod uwagę, że sztywność BM wywołana ekspozycją na AGE może być wyzwalaczem inwazyjności w innych typach raka, interesujące będzie wykorzystanie protokołu do stworzenia podobnych modeli, które obejmują normalne komórki nabłonkowe i komórki nowotworowe z innych narządów (np. piersi, okrężnicy, jajników, trzustki).

Krytyczne etapy w ramach protokołu, wraz z ich harmonogramem, podsumowano na rysunku 4. Na początkowym etapie konieczne jest utrzymanie roztworu podstawowego rBM w temperaturze 4 °C podczas rozmrażania, aby zapobiec jego polimeryzacji. Końcówek pipet nie należy umieszczać w roztworze podstawowym rM, dopóki nie zostaną schłodzone do temperatury 4 °C. W następnym kroku ważne jest również, aby upewnić się, że szkiełka komory osiągnęły temperaturę 4 °C, zanim zostaną pokryte roztworem rBM. Gdy tylko temperatura roztworu rBM wzrośnie powyżej 4 °C, zostanie on poddany nieodwracalnej polimeryzacji w celu utworzenia żelu. Istotne jest, aby rBM nie został zakłócony na etapie polimeryzacji, aby zapewnić, że tworzy równą powierzchnię odpowiednią do hodowli komórkowej i analizy mikroskopowej. Czas inkubacji z GLA z lub bez inhibitorów reakcji Maillarda (cyjanoborowodorek sodu i amingoguanidyna) określi, jak sztywny stanie się żel rBM. Zaleca się 6-godzinną inkubację z GLA, jeśli wymagane są warunki półsztywne, i 14-godzinną inkubację, jeśli wymagane są warunki sztywne (Tabela 1). Można stosować alternatywne czasy inkubacji lub stężenia GLA, jeśli pożądane są różne poziomy sztywności. W takim przypadku analiza reologiczna żeli rBM musi być włączona jako niezbędny krok. Po etapie wygaszania reakcji Maillarda przez inkubację z GEE i następujących po nim etapach płukania PBS, żele rBM mogą być użyte natychmiast lub przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 48 godzin przed użyciem do hodowli komórkowej. Po skonfigurowaniu kultur komórkowych ważne jest, aby zmieniać pożywkę hodowlaną (w tym wszelkie zabiegi) co dwa dni. Zaleca się utrzymywanie kultur komórkowych 3D przez 3-12 dni zgodnie z badanymi parametrami. W przypadku 3D PEC acini zaleca się analizę kultur po 6 dniach, a w przypadku sferoid 3D PTC po 3 dniach hodowli w pierwszej kolejności.

Rysunek 4: Prosty przegląd protokołu ze wskazaniem krytycznych kroków i czasów. Schemat przepływu przedstawia sposób przygotowania i usztywnienia odtworzonej błony podstawnej (rBM) aldehydem glikolowym (reakcja Maillarda) ze wskazaniem krytycznych etapów i terminów. Wskazane są również punkty, w których protokół może zostać zatrzymany, a żele rBM przechowywane. rBM, odtworzona błona podstawna; GLA, aldehyd glikolowy; GEE, ester etylowy glicyny; O.N., noc; PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami; R.T., temperatura pokojowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
I - Materiał do hodowli jednowarstwowej
BPH-1	Baza danych linii komórkowych CaP	PCaCL-132	Kontakt: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Kompletne podłoża bez keratynocytów w surowicy	ThermoFisher Scientific	17005-075	Nie ogrzewać się w temperaturze 37 & ordm; C przed użyciem
Surowica cielęca płodu	First Link UK Ltd	02-00-850	Sklep pod adresem -20 º C w podwielokrotnościach
PC3	American Type Culture Collection	CRL-1435
Penicylina/streptomycyna	ThermoFisher Scientific	15070-063
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna w tabletkach (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G
RPMI 1640 średni	Sigma-Aldrich	R5886	ciepły w 37 & ordm; C kąpiel wodna przed użyciem
RWPE-1	American Type Culture Collection	CRL-11609
Roztwór trypsyny-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
II - Materiał do hodowli 3D
Acetonitryl	Sigma-Aldrich	271004
Chlorowodorek aminoguanidyny	Sigma-Aldrich 396494		Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę
Szkiełka komorowe, 8-dołkowe	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
Culture Matrix odtworzona membrana podstawna (rBM) ekstrakt zredukowanego czynnika wzrostu	AMS Biotechnology	3445-005-01	Przechowuj membranę podstawną (BM) przy -80 º C w podwielokrotnościach
Bromek cyjanu	Sigma-Aldrich	C91492	Działa toksycznie przez skórę kontaktową i wdychanie
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich	695076
Chlorowodorek estru etylowego glicyny (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	Działa drażniąco na oczy
Dimer aldehydu glikolowego (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
Cyjanoborowodorek sodu	Sigma-Aldrich	71435	Wysoce łatwopalny; Działa toksycznie przez kontakt ze skórą i wdychanie
Filtr strzykawkowy 0,22 mikrona	Appleton Woods	BC680
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
III - Materiał do ilościowego określenia reakcji Maillarda
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	wrażliwy na światło i przechowywany w temperaturze -20 º C w podwielokrotnościach Cylindry
klonujące	Sigma-Aldrich	C1059
Kozia anty-mysia IgG (H+L) Alexa Fluor 488 koniugat	ThemoFisher Scientific	A-11001	światłoczuły
Kozioł anty-królik IgG (H+L) Alexa Fluor 488 koniugat	ThemoFisher Scientific	A-11034	światłoczuła
surowica kozia	Abcam	ab7481	Przechowywać pod adresem -20 º C w podwielokrotnościach Nośniki montażowe
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Mysz klon anty-pentozydyny PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Przechowywać w temperaturze -20 º C w podwielokrotnościach
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-kolagen ludzki IV	Przeciwciała Acris	R1041	Przechowywać w temperaturze -20 º C w podwielokrotnościach
Królik anty-laminina A/C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	Przechowywać pod adresem -20 º C w podwielokrotnościach
Eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego (Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
Monolaurynian glikolu polietylenowego sorbitanu (Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
Kaseta do dializy Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333
Nazwa	Company	< strong>Numer katalogowy	Uwagi
IV - Sprzęt
ARG2 reometr rotacyjny z kontrolowanym odkształceniem	T.A. Instruments
Mikroskop Axiovert S100 (20-krotne powiększenie)	Zeiss Komora
do mikroskopu Zeiss Axio S100	Mikroskop Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (powiększenie 40X, 63X)	Mikroskop Zeiss
Olympus LH50A wyposażony w kamerę cyfrową wykorzystującą kontrast fazowy	Olimpia
Spektrofotometr czytnika płytek PHERAstar Plus	BMG Labtech
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
V - Oprogramowanie
Image J 1.47v	Narodowy Instytut Zdrowia, USA
Urządzenia molekularne			MetaXpress