Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.
Artykuł metodologiczny
Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Łożysko wykazuje dużą stopień międzygatunkowej zmienności anatomicznej. Aby jak najlepiej zrozumieć biologię i patofizjologię ludzkiego łożyska, konieczne jest zaprojektowanie eksperymentów z wykorzystaniem ludzkich komórek i tkanek. Zaletą hodowli narządowej jest utrzymanie trójwymiarowej (3D) organizacji strukturalnej i macierzy zewnątrzkomórkowej. Celem opisanej metody jest pomyślne założenie ex vivo ludzkich hodowli narządowych tkanek ciążowych i utrzymanie ich zdrowej hodowli przez 72-96 godzin. Protokół szczegółowo opisuje natychmiastowe przetwarzanie próbek z zezwoleniami na badania, łożyskowych i dziesiętnych świeżo po wyjęciu z sali operacyjnej. Są to liczne okazy, które w przeciwnym razie zostałyby wyrzucone. Zamieszczono szczegółowe instrukcje dotyczące sterylnego pobierania tych próbek, w tym szczegóły morfologiczne dotyczące wyboru odpowiednich tkanek w celu założenia hodowli narządów 3D. Tkanki łożyskowe, kosmkowe i liściaste są mikropreparowane na 2-3 mm3 kawałki i umieszczane oddzielnie na filtrach transwell wyłożonych matrycą i hodowane przez kilka dni. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych dobrze nadają się do badania interakcji człowiek-gospodarz-patogen. W porównaniu z innymi organizmami modelowymi, te ludzkie kultury są szczególnie korzystne do badania mechanizmu infekcji patogenów, które wykazują zmienne wzorce swoistości gospodarza. Jako przykład przedstawiono zakażenie posiewów łożyska i narządów dziesiętnych klinicznie istotnym, fakultatywnym wewnątrzkomórkowym patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes.
Wprowadzenie
Infekcje i stany zapalne na styku matki i płodu stanowią główne źródło zachorowalności i śmiertelności u kobiet i dzieci. Zrozumienie, w jaki sposób patogeny infekują te tkanki, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii zapobiegania i leczenia chorób, takich jak przedwczesny poród i śmierć płodu. Jednak duża zmienność międzygatunkowa granicy matczyno-płodowej komplikuje badania eksperymentalne. Co więcej, większość patogenów mikrobiologicznych wykazuje swoistość gospodarza, dlatego wiele modeli zwierzęcych nie jest w stanie w pełni odtworzyć chorób zakaźnych u ludzi. Niektóre organizmy (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio i wiele innych) są ściśle chorobotwórcze u ludzi, podczas gdy inne, takie jak Listeria monocytogenes, wykazują bardziej pośredni poziom swoistości gospodarza1. Specyficzność gospodarza została udokumentowana w wielu aspektach patogenezy, w tym w kolonizacji2,rozprzestrzenianiu się3, unikaniu odporności4 i pozyskiwaniu składników odżywczych5. Dlatego niezwykle ważne jest, aby wybrać optymalne systemy modelu hosta.
Łożysko składa się z komórek płodowych i krwi matki, jest organem, który szybko rozwija się w trakcie ciąży6. Mówiąc najprościej, ludzkie łożysko jest zbudowane z płodowych "kosmkowych" struktur przypominających drzewa skąpanych we krwi matki. Wymiana gazów i składników odżywczych zachodzi w wyspecjalizowanych warstwach komórek płodu zwanych trofoblastami, które wyściełają powierzchnię kosmków. Wyściółka błony śluzowej macicy matki, zwana endometrium u samicy niebędącej w ciąży, przekształca się strukturalnie i funkcjonalnie w decidua, aby pomieścić jednostkę płodowo-łożyskową. Drzewa kosmkowe są zakotwiczone w macicy przez trofoblasty kosmkowe (EVT), które migrują z zakotwiczonych kolumn komórkowych do decidua. Interfejs matczyno-płodowy składa się zatem z decidua i łożyska.
Opisana tutaj technika hodowli narządów została wykorzystana do zbadania, gdzie i jak klinicznie istotne ludzkie patogeny, w tym L. monocytogenes i Toxoplasma gondii, przekraczają barierę łożyskową2,7. Te hodowle narządowe ex vivo odtwarzają architekturę tkanek in vivo i są prawdopodobnie fizjologicznie bardzo istotnymi systemami modelowymi dla ludzkiego łożyska. Dodatkowe techniki hodowli obejmują eksplantaty całych narządów, wycinki narządów oraz organoidy tkanek lub komórek macierzystych osadzone w matrycy 3D. Szczegółowe informacje na temat tych opcji można znaleźć w obszernym niedawnym przeglądzie8. Należy pamiętać, że ten protokół dotyczy oddzielnych hodowli kosmków decydowych i łożyskowych. Do badania interakcji między komórkami łożyska a komórkami dziesiętnymi preferowana może być technika kohodowli. Odsyłamy zainteresowanego czytelnika do wcześniej opisanej techniki kohodowli kosmków i dziesiętnych, stosowanej przez badaczy zajmujących się remodelingiem naczyń za pośrednictwem trofoblastów9-11.
Protokół
Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (CHR# 11-05530). Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na pobranie próbek i późniejszą analizę. Tkanki pobrano jako próbki pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.
UWAGA: Badacz musi uzyskać zgodę swojej instytucjonalnej komisji rewizyjnej ds. badań klinicznych. Wykluczenie próbek na podstawie historii ciąży lub anomalii łożyska będzie się różnić w zależności od potrzeb konkretnego badania.
UWAGA: Odpowiednie warunki bezpieczeństwa (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2) powinny być stosowane dla wszystkich etapów niniejszego protokołu12.
1. Przygotowanie, przed dniem zbiórki
- Sitka autoklawowe / kleszcze do pobierania oraz nożyczki/kleszcze do mikropreparacji.
- Przygotuj odpowiednią objętość (500 ml na próbkę) buforu do płukania (przepis znajduje się w Tabeli 1).
- Przygotować odpowiednią objętość (100 ml na próbkę) sterylnie przefiltrowanej pożywki zbiorczej o wielkości 0,22 μM (przepis znajduje się w Tabeli 1).
- Podwielokrotność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli odczynników) do długotrwałego przechowywania.
- Przechowywać ECM w postaci stałej w temperaturze -20 °C. Aby uzyskać najlepszą wydajność, unikaj wielokrotnego rozmrażania przez zamrażanie. Rozmrozić butelkę do lepkiego roztworu o temperaturze 4 °C i przygotować 300 μl porcji w chłodni ze schłodzonymi końcówkami pipet. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
2. Pobieranie świeżych tkanek
UWAGA: Podczas pracy ze świeżą tkanką ludzką, badacze muszą przestrzegać Uniwersalnych Środków Ostrożności (OSHA) zapobiegających przenoszeniu patogenów przenoszonych przez krew i muszą przejść odpowiednie szkolenie instytucjonalne. Niezbędne są odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne.
- Transportuj autoklawowane sitka (po jednym na próbkę), autoklawowane kleszcze, bufor do płukania (gąsiek), pożywkę (25 ml na próbkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml), butelkę z rozpylaczem, 10% wybielacz, 70% etanolu, tackę do pobierania chusteczek, sharpie i wiadro/chłodziarkę do lodu.
UWAGA: Próbki przyjmowane są w wyznaczonym do badań pomieszczeniu znajdującym się w pomieszczeniu znajdującym się w pobliżu bloku operacyjnego. Sterylny kaptur do hodowli tkanek nie jest wymagany, ale pobieranie powinno nastąpić szybko, a badacz powinien odpowiednio zdezynfekować powierzchnie, jak opisano poniżej. - Umieść gródź buforu do mycia obok zlewu i spryskaj króciec 10% wybielaczem i 70% etanolem. Umieść szklaną tacę na chusteczki higieniczne na źródle światła (podkładce świetlnej lub kasetoniku) i zdezynfekuj 10% wybielaczem i 70% etanolem. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
- Poproś lekarza o przeniesienie próbek z sali operacyjnej do pomieszczenia do przygotowania próbek. W zlewie wlej próbkę na sterylne ręczne sitko, kilkakrotnie spłucz chusteczkę w buforze do płukania i przenieś całą próbkę w buforze na odkażoną szklaną tacę na górze źródła światła.
UWAGA: Ocena tkanki przez lekarza ma najwyższy priorytet, dlatego następujące kroki są wykonywane dopiero po ustnym wskazaniu przez lekarza, że zakończył ocenę. - Za pomocą sterylnych kleszczy wybierz kosmki łożyskowe i decyduy (ryc. 2A i 3A) do pobrania i przenieś do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Oznacz probówki wiekiem ciążowym.
UWAGA: Preferowany wiek ciążowy to mniej niż 9 tygodni i mniej niż 16 tygodni odpowiednio dla łożyska i decidua. W placówce pobierana jest tylko część każdej próbki do celów badawczych, ponieważ musi pozostać odpowiednia tkanka do klinicznej diagnostyki patologicznej. - Przechowuj i transportuj próbkę na lodzie do laboratorium badawczego.
- Aby zebrać więcej niż jedną próbkę, zdezynfekuj szklaną tacę zgodnie z powyższym opisem 10% wybielacza i 70% etanolu między pobraniem każdej próbki.
3. Przygotowanie płytek do hodowli organów
UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane przy użyciu sterylnej techniki w kapturze do hodowli tkankowej. Idealnie nadaje się, aby mikroskop sekcyjny znajdował się w sterylnym polu. Nie jest to jednak absolutnie konieczne, o ile mikrosekcja jest wykonywana szybko, a narzędzia są często zanurzane w 70% etanolu.
- Rozmrozić fiolkę (fiolki) ECM na lodzie. Rozcieńczyć ECM w stosunku 1:1 lodowatym roztworem do zbierania, wymieszać pipetując. Pipetować powoli, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków. Każda studzienka z 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej wymaga 100 μl tej zawiesiny i pomieści 3-4 kultury narządów.
- Umieścić wkładki transwell (wielkość porów 0,4 μM) w każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
- Pokryj każdą wkładkę transwell cienką warstwą (100 μl) zawiesiny ECM/media.
- Umieść płytkę na lodzie i natychmiast przystąp do tworzenia kultur narządowych. Alternatywnie, należy przygotować płytkę przed pobraniem tkanki, w którym to przypadku zawinąć ją w parafolię i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania. Nie zaleca się przechowywania dłuższego niż 6 godzin, ponieważ ECM wyschnie.
4. Zakładanie kultur organowych
UWAGA: Ten krok opisuje, jak umieścić hodowle organów dziesiętnych i kosmków w oddzielnych transwellach. Tkanki nie stykają się ze sobą. Badacze zainteresowani techniką kohodowli, w której decidua i kosmki są ze sobą w bezpośrednim kontakcie, mogą odwołać się do wcześniejszej literatury9,10.
- Wypłukać próbki dwukrotnie w pożywce zbiorczej i odwirować przy 1 000 x g między każdym płukaniem. Przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i umieść na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Trzymaj 6-dołkową płytkę na lodzie w pobliżu mikroskopu.
- Mikropreparować tkanki za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych i kleszczy sprężynowych, w celu ustalenia hodowli narządów kosmkowych o średnicy 2-3 mm (ryc. 2A).
UWAGA: Hodowle organów kosmków to małe, dobrze unaczynione "drzewa" z 2 lub 3 gałęziami i wydatnymi kolumnami komórek trofoblastu pozakosmkowego (EVT)11. Ważne jest, aby wykorzystywać tylko tkankę kosmkową z próbek z pierwszego trymestru w <9 tygodniu, ponieważ inwazja trofoblastów poza kosmkami do ECM jest najbardziej wyraźna w wieku13 lat. - Wybierz dobrze unaczynione kosmki z wydatnymi kolumnami komórek EVT. Kolumny komórek EVT są wizualizowane jako bulwiaste, "rozmyte", "puszyste" końce (patrz groty strzałek na rysunku 2A).
- Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść 3 lub 4 kosmyki do każdego transwella. Dostosuj gałęzie tak, aby drzewo było umieszczone płasko na szczycie ECM i oddziel zgrupowane gałęzie.
- Mikropreparować tkankę dziesiętną za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych sprężynowych i kleszczy, w celu ustalenia kultur narządów o średnicy 3 mmi 3 ułamków dziesiętnych (ryc. 3A).
UWAGA: Próbki zawierają dwa różne typy tkanek liściastych, decidua parietalis i decidua capsularis (odpowiednio fragmenty lewej i prawej tkanki, ryc. 3A). - Przytnij nożyczkami, aby utworzyć 3 mm3 kawałki decidua parietalis. Decidua capsularis nie jest stosowany w tych kulturach. Użyj kleszczy, aby usunąć zakrzepłą krew matki.
- Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść 3-4 kawałki decidua do każdego transwell.
- Dodaj 1 ml pożywki do zbierania na dno studzienki. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2
- W przypadku eksperymentów, w których ważne jest naśladowanie normalnego ciśnienia tlenu łożyskowego w pierwszym trymestrze ciąży, należy utrzymywać hodowle narządów kosmków we względnym niedotlenieniu (3%O2).
UWAGA: Opcje laboratoryjne obejmują małe komory inkubatora do hipoksji, które mieszczą się w istniejących inkubatorach, lub inkubator trójgazowy, który wprowadza zewnętrzny gazN2 w celu obniżenia stężenia tlenu. - Dodać 1 ml pożywki kosmkowej lub dziesiętnej (Tabela 1) na wierzch transwella po 12-16 godzinach hodowli.
UWAGA: Brak pożywki podczas pierwszej nocy w hodowli pozwala na inwazję kolumn komórek trofoblastu poza kosmkami (hodowla kosmków) i na bezpieczne osadzenie tkanki (zarówno kosmków, jak i liściastych) w ECM. Z naszego doświadczenia wynika, że hodowle narządów dziesiętnych zachowują żywotność przez 72 godziny, a hodowle narządów kosmków przez 96 godzin. Zalecamy eksperymentalne punkty końcowe, które mieszczą się w tym przedziale czasu. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem pożywki kosmkowej i dziesiętnej. Pożywka kosmkowa ma wysoki procent FBS, podczas gdy pożywka dziesiętna jest uzupełniana hormonami ciążowymi (progesteron, 17β-estradiol), które utrzymują stan dziesiętny (Tabela 1).
5. Przygotowanie kultur L. monocytogenes
UWAGA: Szczegółowy protokół dotyczący długoterminowego przechowywania L. monocytogenes, hodowli i wzrostu tego organizmu w bulionie i agarze z naparu do mózgu serca (BHI), proszę zapoznać się z Wang et al.14
- Wybierz pojedynczą kolonię L. monocytogenes z płytki agarowej BHI i zaszczepij 3 ml bulionu BHI.
- Inkubować kulturę L. monocytogenes przez noc (16 godzin), w pozycji skośnej, w temperaturze 30 °C.
UWAGA: Te warunki hodowli pozwalają na osiągnięcie fazy stacjonarnej wzrostu bakterii. L. monocytogenes jest wiciowy w temperaturze 30 °C, co zwiększa inwazję komórek gospodarza15.
6. Zakażenie kultur narządowych L. monocytogenes
- ciepły PBS i pożywka kosmkowa lub dziesiętna (tabela 1) do 37 °C.
- Użyj sterylnej pęsety, aby usunąć wszelkie fragmenty hodowli narządów, które nie dostały się do ECM i dlatego unoszą się w studzience.
- Ostrożnie odessać pożywkę od spodu transwella. Przepłukać dwukrotnie górne i dolne transwelle, delikatnie pipetując 1 ml ciepłego PBS do studzienki i ostrożnie zasysając pomiędzy nimi. Delikatnie odpipetować 1 ml pożywki kosmkowej lub dziesiętnej bez antybiotyków do górnego i dolnego transwell. Uważaj, aby nie zakłócić hodowli narządów.
- Pozostaw tkankę do inkubacji w pożywce wolnej od antybiotyków przez co najmniej godzinę, aby upewnić się, że antybiotyki zostały usunięte.
UWAGA: W fazie stacjonarnej gęstość kultury L. monocytogenes wynosi około 1 x 10,9 jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml. Liczba bakterii wykorzystywanych do infekowania kultur narządowych powinna być określona empirycznie, aby sprostać potrzebom doświadczalnym. - W przypadku dzikiego typu L. monocytogenes rutynowe eksperymenty z infekcją wykazują silną inwazję przy rozcieńczeniu 1:50 przez noc (4 x 10,7 L. monocytogenes w 1 ml pożywki na studzienkę). Ponownie zawiesić odpowiednią liczbę bakterii w pożywce kosmkowej lub dziesiętnej wolnej od antybiotyków.
- Zassać pożywkę z górnej części transwelli. Delikatnie dodaj 1 ml inokulum. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , aby umożliwić inwazję bakterii.
- Usuń bakterie zewnątrzkomórkowe poprzez zasysanie pożywki z górnych i dolnych transwelli. Przepłucz studzienki dwukrotnie ciepłym PBS. Dodać 1 ml pożywki kosmkowej lub dziesiętnej uzupełnionej 50 μg ml-1 gentamycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
UWAGA: L. monocytogenes jest fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową, która może rosnąć w podłożu zewnątrzkomórkowym, rosnąć wewnątrz komórek i rozprzestrzeniać się z komórki na komórkę bez dostępu do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Gentamycyna działa bakteriobójczo na zewnątrzkomórkowe L. monocytogenes, a tym samym umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowego wzrostu L. monocytogenes i rozprzestrzeniania się w hodowli narządowej16,
UWAGA: Powtarzalne zakażenie L. monocytogenes w hodowlach narządów kosmków i decidua następuje po 5-godzinnym czasie inkubacji. Czas inkubacji przed dodaniem gentamycyny może być modyfikowany w zależności od potrzeb doświadczalnych i zdolności organizmu do inwazji na tkankę. Aby lepiej zrozumieć miejsca anatomiczne najbardziej podatne na infekcje, można zastosować krótsze czasy inkubacji2. - Utrzymywać płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez czas trwania eksperymentu. Codziennie zmieniaj całe media w każdym dołku.
UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że posiewy narządów dziesiętnych zakażone L. monocytogenes zachowują żywotność przez 48 godzin, a hodowle narządów kosmków przez 72 godziny.
7. Pobieranie kultur narządowych do histopatologii
- Przygotuj świeży roztwór 4% paraformaldehydu, rozcieńczając 10 ml 16% ampułki w 30 ml PBS. Przechowywać 4% paraformaldehydu w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem i zużyć w ciągu tygodnia. Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej.
- Zassać pożywkę z górnego i dolnego transwella. Delikatnie przepłukać studzienki dwukrotnie PBS w temperaturze pokojowej. Delikatnie dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu do wierzchu transwell, aby całkowicie pokryć kulturę narządów.
- Inkubować w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Unikaj dłuższych czasów inkubacji, ponieważ może to prowadzić do nadmiernego utrwalenia tkanki.
- Odessać paraformaldehyd i dwukrotnie przepłukać studzienki PBS w temperaturze pokojowej. Osadź utrwalone kultury narządowe w pożywce OCT, zamroź i skręp na kriostacie ("utrwalone zamrożone"). Ogólnie rzecz biorąc, utrwalona zamrożona tkanka jest łatwiejsza do przekrojenia niż zamrożona tkanka bez wcześniejszego utrwalenia.
UWAGA: Aby zapoznać się z pełnym protokołem dotyczącym osadzania OCT i zamrożonych sekcji, należy uzyskać dostęp do odpowiednich sekcji z opublikowanych protokołów17,18. W zależności od potrzeb doświadczalnych oraz dostępnego sprzętu laboratoryjnego i przechowywania, tkanka może być zamiast tego zatopiona w parafinie i podzielona na mikrotom19. - Następnie przygotuj preparaty tkankowe do rutynowego barwienia hematoksyliną i eozyną, immunofluorescencji lub immunohistochemii18,20,21.
Wyniki
Rycina 1 (zmodyfikowana na podstawie Zeldovich & Bakardjiev22) przedstawia istotne elementy anatomii łożyska i macicy. Rycina 2 pokazuje reprezentatywne obrazy makroskopowe i histologiczne kosmków łożyskowych, natomiast Rycina 3 przedstawia tkankę bliźniakową.
Niniejszy protokół opisuje w pierwszej kolejności pobieranie świeżej tkanki łożyska i błony błoniowej w warunkach szpitalnych lub klinicznych. Pobrana próbka stanowi mieszaninę płodowych komponentów łożyska (chorionów) oraz maciernych komponentów macicy (decidua). Po wypłukaniu buforem zawierającym antybiotyki i środki przeciwgrzybicze o szerokim spektrum działania, cała próbka jest oglądana wizualnie przy użyciu pulpitu świetlnego. Choriony i decidua są umieszczane w oddzielnych probówkach i transportowane w lodzie do laboratorium. W laboratorium wykorzystuje się mikroskop stereoskopowy, aby ocenić drobne cechy morfologiczne zdrowej tkanki. Reprezentatywne zdjęcia chorionów (Rysunek 2A) oraz tkanki decydualne (Rysunek 3A) wykonane przy użyciu stereomikroskopu z dwoma zewnętrznymi gąsiorowymi źródłami światła przedstawiono w celach referencyjnych.
Hodowle organoidów kosmkowych przygotowuje się z materiału pobranego w pierwszym trymestrze. Hodowle składają się z niewielkich terminalnych drzew kosmkowych z 2–6 gałęziami. Ważne jest, aby wypreparować gałęzie kosmkowe kończące się kolumnami trofoblastów pozakosmkowych i będące dobrze ukrwione. Cechy te objawiają się jako „puszyste” lub „rozmyte” końce gałęzi (groty strzałek) oraz blady różowo-czerwony linearny odcień przebiegający przez gałęzie drzewa po lewej stronie na Rysunku 2A. W przeciwieństwie do tego, w przypadku drzewa po prawej stronie obrazu unaczynienie i trofoblasty pozakosmkowe nie są łatwo widoczne, co czyni taki materiał nieoptymalnym do hodowli. W ciągu pierwszej doby hodowli trofoblasty pozakosmkowe migrują do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), kotwicząc tym samym drzewa kosmkowe w matrycy na wkładce transwell.
Hodowle organowe błony jajczulowej przygotowuje się z próbek pobranych w pierwszym i wczesnym drugim trymestrze. Cała błona śluzowa macicy przekształca się w błonę jajczulową krótko po implantacji. W szczególności decidua basalis określa śluzówkę macicy znajdującą się bezpośrednio pod łożyskiem/miejscem implantacji, decidua capsularis określa śluzówkę pokrywającą płód, a decidua parietalis odnosi się do pozostałej części błony śluzowej macicy. Obrazowanie pod mikroskopem stereoskopowym pokazuje, że próbka z wczesnego okresu ciąży składa się głównie z decidua parietalis i decidua capsularis (odpowiednio lewy i prawy fragment tkanki na Rysunku 3A). Decidua capsularis jest łatwo rozpoznawalna ze względu na swoją cienką, błoniastą strukturę. W celu przygotowania hodowli organowych decidua parietalis jest wycinana za pomocą nożyczek do mikrodissekcji na fragmenty o wielkości 3 mm3 , a przylegająca skrzepła krew jest usuwana pęsetą.
Po inkubacji przez noc tkanki są zakażane L. monocytogenes. Opisany powyżej protokół zakażania opiera się na teście ochrony z użyciem gentamycyny, stosowanym do badania wzrostu i rozprzestrzeniania się wewnątrzkomórkowego fakultatywnych bakterii wewnątrzkomórkowych16. Hodowle organów w medium bez antybiotyków inkubuje się z L. monocytogenes przez 5 hr. Hodowle płucze się sterylnym PBS, aby usunąć bakterie z medium. Następnie dodaje się gentamycynę w celu wyeliminowania organizmów pozakomórkowych. W poprzedniej literaturze z naszego laboratorium wykorzystano immunofluorescencję i mikroskopię konfokalną do określenia lokalizacji bakterii w tkankach w różnych punktach czasowych po zakażeniu2. Hodowle organów płucze się w PBS, utrwala w 4% paraformaldehydzie, a następnie albo mrozi w medium OCT i przechowuje w -80 °C, albo zatapia w parafinie i przechowuje w temperaturze pokojowej. Przekroje tkanek można barwić do analizy immunofluorescencyjnej (IF) lub immunohistochemicznej (IHC) w celu oceny lokalizacji bakterii i komórek eukariotycznych. Rysunek 2B przedstawia reprezentatywny obraz IF przekroju mrożonego przygotowanego z 8,3-tygodniowej hodowli organu kosmczego 72 hr po zakażeniu. Należy zwrócić uwagę na duże obciążenie bakteryjne (zielona fluorescencja) w EVT na końcach gałęzi kosmczych oraz względny brak bakterii w warstwie syncytiotrofoblastu wyściełającej drzewo (czerwona fluorescencja). W poprzednich badaniach wykorzystaliśmy podobne barwienie IF do lokalizacji L. monocytogenes w hodowlach organów kosmczych w różnych punktach czasowych po zakażeniu. W ciągu 72 hr zakażenie rozprzestrzeniło się z EVT do podsyncytialnych cytotrofoblastów i leżącego poniżej zrębu kosmczego. Co istotne, warstwa syncytiotrofoblastu była oporna na zakażenie2.
Reprezentatywne obrazy mikroskopu optycznego z barwieniem H&E przekrojów tkanki błony podstawnej wtopionej w parafinę, przygotowanych z próbek w 14,3 tygodniu, przedstawiono na Rysunkach 3B i 3C. Ta powlekana ECM membrana transwell została zatopiona w celu pokazania hodowli narządu in situ (Rysunek 3B). Obraz przedstawia gruczoły wyścielone nabłonkiem (gwiazdka) oraz naczynia krwionośne wyścielone śródbłonkiem (romb), rozmieszczone niejednorodnie w obrębie komórkowej macierzy podścieliska błony podstawnej. Dodatkowo, w całej macierzy podścieliska błony podstawnej występują rozproszone z różną gęstością macierzyńskie komórki odpornościowe. Barwienie IHC i IF można wykorzystać do określenia mikroanatomicznej lokalizacji bakterii w stosunku do konkretnych rezydentnych komórek odpornościowych. Przykładowo, makrofagi CD14+ (zielona fluorescencja) lokalizują się w wyściółce naczyń krwionośnych i są rozproszone w macierzy podścieliska (Rysunek 3D), podczas gdy duże agregaty L. monocytogenes (czerwona fluorescencja) obserwuje się głównie w macierzy podścieliska błony podstawnej 48 hr po zakażeniu (Rysunek 3D).
| Bufor do płukania | Medium do zbierania | Medium dla kosmków | Medium dla błony decidualnej |
| PBS | DMEM/F-12 z GlutaMAX | DMEM/F-12 z GlutaMAX | DMEM/F-12 z GlutaMAX |
| Penicylina 10 IU/ml | Fetal Bovine Serum 2,5% | Fetal Bovine Serum 20% | Fetal Bovine Serum 2,5% |
| Streptomycyna 100 μg/ml | Penicylina 100 IU/ml | Penicylina 10 IU/ml | 17β-estradiol 300 pg/ml |
| Gentamycyna 50 μg/ml | Streptomycyna 10 μg/ml | Streptomycyna 10 μg/ml | Progesteron 20 ng/ml |
| Amfoterycyna B 1,25 μg/ml | Gentamycyna 50 μg/ml | ||
| Amfoterycyna B 1,25 μg/ml |
Tabela 1: Składy pożywek. Składniki i stężenia niezbędne do przygotowania buforu do płukania, pożywki do zbierania, pożywki dla kosmków oraz pożywki dla błony decydualnej.
Rysunek 1. Budowa łożyska. (A) Struktura jednostki płodo-łożyskowej w macicy matki, (B) Powiększenie pola w (A) podkreśla, że kosmki łożyskowe wyścielone trofoblastem płodowym (T) są obmywane przez krew matczyną i zakotwiczone w decydue przez trofoblasty pozakosmkowe (EVT). Wewnątrz kosmków znajdują się naczynia płodowe (FV), fibroblasty oraz makrofagi płodowe. Zmodyfikowano na podstawie Zeldovicha & Bakardjiev22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Hodowle organoidów kosmkowych – Reprezentatywne obrazy makroskopowe i mikroskopowe. (A) Dwa drzewa kosmków końcowych w 6. tygodniu wieku ciążowego, widziane pod mikroskopem stereoskopowym. Zwróć uwagę na „puszyste” końce (groty strzałek) oraz wyraźne naczynia krwionośne płodu przebiegające przez gałęzie drzewa po lewej stronie, co czyni ten fragment odpowiednim do hodowli organowej. (B) Mikroskopia immunofluorescencyjna hodowli organowej (wiek ciążowy 8,3 tygodnia) 72 h po zakażeniu Listeria monocytogenes, wykazująca duże obciążenie bakteryjne [kolor zielony] w trofoblastach pozawillowych. DAPI przedstawiono w kolorze niebieskim, a syncytiotrofoblasty βHCG+ w kolorze czerwonym. Paski skali = 1 mm (A), 250 µm (B). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Hodowla organowa błony podstawnej łożyska – Reprezentatywne obrazy makroskopowe i mikroskopowe. (A) Decidua parietalis [lewa] i decidua capsularis [prawa] w 6. tygodniu ciąży, widziane pod mikroskopem stereoskopowym. (B) H&Przebarwiony hematoksyliną i eozyną (H&E) przekrój hodowli organowej decidua parietalis z 14,3 tygodnia wieku gestacyjnego ukazuje gruczoły i naczynia krwionośne rozmieszczone niejednorodnie w obrębie zrębu decydualnego. Znaki (diament, ◆) oraz (gwiazdka, *) wskazują odpowiednio reprezentatywne naczynie i gruczoł. Brązowa linia przy dolnej krawędzi to brzeg membrany transwell. (C) H&Przekrój poddany barwieniu hematoksyliną i eozyną kultury tkankowej decidua parietalis z 14,3 tygodnia wieku ciążowej, w większym powiększeniu, ukazuje spiralne tętniczki o mięśniowej ścianie zatopione w zrębie decidualnej. Macierzyńskie komórki odpornościowe są małe, z ciemnymi, okrągłymi jądrami i są rozmieszczone nieregularnie w całej zrębie.D) Mikroskopia immunofluorescencyjna hodowli organów 48 h po zakażeniu L. monocytogenes, z zaznaczeniem dużych obszarów bakterii [czerwony] w podścielisku błony podstawnej oraz maciernego CD14+ makrofagi [zielone] wyścielające kręte naczynie oraz rozproszone w podścielisku. Paski skali = 1 mm (A), 250 µm (B), 50 µm (C i D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Wsobne, transgeniczne i nokautujące szczepy myszy mogą służyć w systemach eksperymentalnych do solidnego testowania mechanizmów. Jednak pomimo ogólnej konserwacji podstawowego materiału genetycznego, funkcjonalne genomy myszy i ludzi wykazują znaczące różnice w elementach regulatorowych23. Nic więc dziwnego, że obiecujące badania przedkliniczne na modelach zwierzęcych czasami nie znajdują podsumowania u pacjentów. Łożysko wykazuje bardzo dużą różnorodność międzygatunkową, co sprawia, że modele zwierzęce są dalekie od ideału do badania chorób człowieka24. Biorąc pod uwagę zarówno znaczące różnice w immunologii człowieka i myszy25, jak i wyraźną rozbieżną ewolucję w anatomii łożyska, rozsądne jest rozważenie wykorzystania hodowli narządowych ex vivo ludzkich tkanek ciążowych do badań eksperymentalnych.
Opisy, zdjęcia i filmy instruktażowe w tym protokole instruują badaczy, jak zakładać hodowle kosmków i narządów dziesiętnych na wkładkach do hodowli tkankowych transwell pokrytych ECM. Do zalet tej techniki należy względna prostota systemu transwell do mikropreparacji i mechanicznego wspomagania, szczególnie w porównaniu z alternatywnymi metodami, takimi jak matryce osadzone w 3D lub hodowle narządów. Zawieszenie hodowli narządowej na podłożu błonowym pozwala na wymianę składników odżywczych na wszystkich powierzchniach tkanek i utrzymanie żywotności w przypadku hodowli krótkotrwałej (96 godzin w przypadku kultur kosmkowych, 72 godziny w przypadku kultur liściastych). Technika ta pozwala na badanie biologii łożyska człowieka na poziomie tkankowym, co jest niezaprzeczalnie bardziej istotne z biologicznego punktu widzenia niż jednowarstwowe modele hodowli komórkowych.
Najważniejszym krokiem w tym protokole jest mikropreparacja odpowiednich kosmków i dziesiętnych kawałków do hodowli narządów. Optymalne fragmenty tkanki są demonstrowane fotograficznie (ryc. 2A i ryc. 3A), aby pomóc badaczom, dla których wizualizacja próbek ciążowych jest nowością. Szczególnie ważne jest, aby wybrać drzewa kosmkowe, których gałęzie kończą się w kolumnach EVT, ponieważ komórki te będą migrować do ECM i pomogą zakotwiczyć kosmki w błonie. W przypadku obu typów narządów posiewy pomocne jest zminimalizowanie zakłóceń w tkance podczas zmian pożywki poprzez pipetowanie w sposób ostrożny i niespieszny.
Ta technika przedstawia tylko minimalne trudności. Czasami próbki wykazują zanieczyszczenie. Zanieczyszczenie jest zwykle bakteryjne (czasami wielodrobnoustrojowe) i staje się widoczne dopiero po 1-2 dniach w hodowli. Po zaobserwowaniu zanieczyszczenia należy zastosować wybielacz, wyrzucić kulturę, a inkubator do hodowli tkankowych wysterylizować, aby zapobiec długotrwałemu problemowi. Istnieje kilka możliwych sposobów zakażenia: zakażenie w macicy, podczas operacji, podczas pobierania/przetwarzania próbek lub podczas konserwacji hodowli narządów. Etapy zbioru i przetwarzania są najbardziej prawdopodobnym czasem i miejscem wprowadzenia zanieczyszczenia. Dlatego ważne jest, aby skrócić czas, w którym próbka jest manipulowana podczas pobierania i mikropreparacji. Zmniejszy to narażenie próbki na otaczające, niesterylne środowisko. W zależności od konfiguracji laboratoryjnej, mikroskop preparacyjny może być umieszczony wewnątrz sterylnego kaptura do hodowli tkankowych.
Analiza histopatologiczna kultur narządowych po zakażeniu istotnym z medycznego punktu widzenia patogenem L. monocytogenes jest tutaj przedstawiona jako jedno z możliwych zastosowań protokołu. Lokalizacja immunofluorescencyjna zarówno bakterii, jak i komórek odpornościowych gospodarza po infekcji dostarcza nowych informacji na temat reakcji ludzkiego gospodarza na patogeny. Hodowle narządów dziesiętnych mogą służyć jako komplementarna technika eksperymentalna ex vivo do badania danych generowanych z infekcji myszy in vivo, w tym intrygujących doniesień pokazujących defekty w funkcjach obronnych makrofagów dziesiętnychu myszy 26,27. Ponadto hodowle narządów ludzkich mogą być wykorzystywane w strategiach zakażeń mieszanych, takich jak inokulum konkurencyjne złożone z kilku izogenicznych szczepów L. monocytogenes. Konkurencyjne zakażenie kultur narządowych jest czułym sposobem testowania znaczenia czynników wirulencji w organizmie gospodarza. Jednym z ograniczeń tej metody jest żywotność tkanek, która jest ograniczona do hodowli krótkoterminowej (96 godzin dla kultur kosmkowych, 72 godziny dla kultur dziesiętnych). Jest to idealne rozwiązanie w przypadku infekcji szybko rosnącymi drobnoustrojami, takimi jak L. monocytogenes, ale dłuższe hodowle mogą być konieczne w przypadku patogenów, które potrzebują więcej czasu, aby się zadomowić i rozprzestrzenić w tkance.
Aby zmniejszyć globalne obciążenie powikłaniami ciąży, badania muszą koncentrować się na zrozumieniu patofizjologii interfejsu człowiek-matka-płód. Patogeny bakteryjne, grzybicze i wirusowe, które przechodzą z matki na płód, powodują niszczycielskie powikłania ciąży i infekcji płodu. Kontrolowane zakażenie in vivo zwierząt laboratoryjnych jest zwykle uważane za złoty standard w określaniu, w jaki sposób patogeny kolonizują i przemieszczają się między narządami28. Ponieważ anatomia łożyska różni się znacznie u różnych gatunków ssaków, niezwykle ważne jest włączenie tkanki ludzkiej do strategii badawczych. Hodowle ludzkich kosmków i narządów dziesiętnych są bardzo istotnymi systemami modelowymi do badania interakcji gospodarz-patogen. Aby zbadać ten ważny, ale słabo poznany narząd, naukowcy mogą wykorzystać obfitość skądinąd wyrzuconych próbek ludzkiego łożyska i liści, stosując strategie hodowli narządów, takie jak opisane tutaj.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Cristinie Faralli i Davidowi Lowe'owi za pomocne dyskusje. Dziękujemy Markowi Weinsteinowi i Oddziałowi Patologii Szpitala Ogólnego w San Francisco za fachowe porady. Praca ta była wspierana przez granty Narodowego Instytutu Zdrowia R01AI084928 i Burroughs Wellcome Fund 41259 dla A.I.B; Projekt G.A.R. był wspierany przez F32AI108195, grant Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research oraz stypendium podoktoranckie rektora Uniwersytetu Kalifornijskiego na rzecz różnorodności wydziałów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Woreczki do sterylizacji | Fisher Scientific | 01-812-54 | Do autoklawowania poszczególnych narzędzi sekcyjnych |
| Sitko o drobnych oczkach | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Zawiń całkowicie w folię aluminiową i autoklaw przed pobraniem tkanki. |
| Gąsior z króćcem | Fisher Scientific | 03-007-647 | Do przygotowania dużej objętości buforu do mycia. |
| Okłady z lodu | Nortech labs | GB8818 | Nie trzeba ich kupować, można je poddać recyklingowi/ponownie wykorzystać z dowolnej rutynowej przesyłki laboratoryjnej, która zawiera je w opakowaniu. |
| 70% etanol | VWR | V1001 | 70% roztwór wykonany przez dodanie dH20 do 190 lub 200 proof alkoholu klasy badawczej. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% roztwór wykonany przez dodanie dH20. |
| Kaseton | oświetleniowy Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Zwróć uwagę, że zamienne żarówki zostały również zakupione w Blick (55305.0100) |
| Mikro kleszczyki preparacyjne | Stoelting | 52102-43 | 4 cale, 1 x 2 x 0,5 mm3, Lekka krzywa |
| Mikro kleszcze preparacyjne | Stoelting | 52102-06 | 4 cale, proste drobne, ostre |
| Nożyczki sprężynowe do preparowania Micro | Stoelting | 52130-01P | Nożyczki sprężynowe McPherson-Vannas, 8.5 cm, końcówka 0.33, mikroskop preparacyjny z lekką krzywą |
| Leica Microsystems | MZ16 lub M60 | Odnieśliśmy sukces z wymienionymi modelami. Zewnętrzne elastyczne źródła światła na gęsiej szyi są pomocne, ale nie są konieczne. | |
| Probówki stożkowe 50 ml | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | Kupujemy w naszym uniwersyteckim ośrodku Tissue Culture Core, dostępne są alternatywne opcje, takie jak ta. |
| 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Teknova | P0195 | Do przygotowania buforu płuczącego używamy 10x |
| mieszanki odżywczej PBS DMEM/F-12 (szynka) z GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | Kupujemy ten specyficzny preparat zawierający 2,438 g/l wodorowęglanu sodu, 55 mg/l pirogronianu sodu i 4,5 g/l glukozy |
| Gentamycyna | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1,000x zapas. Zaleca się przygotowanie i przechowywanie porcji w temperaturze -20 ° C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia. |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x zapas. Zaleca się przygotowanie i przechowywanie porcji w temperaturze -20 ° C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia. |
| Amfoterycyna B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x kolba. Zaleca się przygotowanie i przechowywanie porcji w temperaturze -20 ° C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia. |
| progesteron | Sigma-Aldrich | P8783 | Roztwór podstawowy 1 mM wytwarza się przez rozpuszczenie 15,7 mg proszku progesteronu w 15,7 ml etanolu i dodanie 34,3 ml PBS. Roztwór jest sterylnie filtrowany, podawany i przechowywany w temperaturze -20 stopni Celsjusza. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μ Roztwór podstawowy M sporządza się przez rozpuszczenie 13,5 mg proszku estradiolu w 10 ml etanolu i dodanie 40 ml PBS. Roztwór jest sterylnie filtrowany, podawany i przechowywany w temperaturze -20 stopni Celsjusza. |
| Filtr próżniowy butelkowy (0,22 μ m) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | Do sterylnej filtracji Pożywki zbiorczej po przygotowaniu |
| 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej | BD Falcon | 353224 | Polistyren, 6-dołkowe transwelle poddane obróbce kultur |
| tkankowych | Wkładka Millipore | PICM03050 | - średnica 30 mm, 0,4 μ m wielkość porów hydrofilowa membrana PTFE |
| Macierz zewnątrzkomórkowa (na przykład Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | W naszych badaniach wykorzystaliśmy Matrigel Matrix. W temperaturze pokojowej i w temperaturze -20 stopni Celsjusza jest ciałem stałym. Unikaj wielokrotnego zamrażania/rozmrażania. Rozmrozić butelkę do lepkiego roztworu w temperaturze 4 & stopni; C, i przygotuj ~ 300 μ L porcji w chłodni ze schłodzonymi końcówkami pipet. Przechowuj porcje w temperaturze -20 &C. |
| Paraformaldehyd, 16% w/v roztwór wodny | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Do utrwalania tkanek przygotowuje się świeży preparat 4% paraformaldehydu poprzez rozcieńczenie tego wywaru w PBS. |
| Inkubator do hodowli tkankowych, utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza; C, 5% CO2, 3% tlenu (opcjonalnie dla hodowli narządów kosmkowych) | W przypadku niektórych eksperymentów preferowane może być niedotlenienie. Można to ustalić na wiele sposobów, w tym dodanie egzogennego azotu za pomocą butli z gazem, rurki Tygon i regulatora. | ||
| Wirówka stołowa |
Bibliografia
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23(2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732(2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308(2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804(2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66(2006).
Przedruki i uprawnienia
