Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54241

⸱

17 lipca 2016

 , 
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Streszczenie

Nerki są podatne na uszkodzenia spowodowane ekspozycją na substancje chemiczne, które filtrują z krwiobiegu. Może to prowadzić do uszkodzenia narządów związanego z szybkim pogorszeniem czynności nerek i rozwojem zespołu klinicznego znanego jako ostre uszkodzenie nerek (AKI). Środki farmakologiczne stosowane w leczeniu różnych schorzeń, od infekcji bakteryjnej po raka, podawane pojedynczo lub w połączeniu z innymi lekami, mogą zainicjować AKI. Danio pręgowany jest użytecznym modelem zwierzęcym do badania wpływu chemicznego na czynność nerek in vivo, ponieważ tworzą embrionalną nerkę składającą się z jednostek funkcjonalnych nefronów, które są konserwatywne z wyższymi kręgowcami, w tym z ludźmi. Co więcej, danio pręgowany może być wykorzystywany do wykonywania genetycznych i chemicznych badań przesiewowych, które dają możliwość wyjaśnienia komórkowych i molekularnych aspektów AKI oraz opracowania strategii terapeutycznych, takich jak identyfikacja cząsteczek nefroprotekcyjnych. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób mikroiniekcja do zarodka danio pręgowanego może być wykorzystana jako paradygmat do badań nefrotoksyn.

Wprowadzenie

AKI to nagła utrata funkcji nerek, która może prowadzić do katastrofalnych konsekwencji zdrowotnych1. AKI jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie ze względu na wysoką częstość występowania wynoszącą około 20% wśród hospitalizowanych pacjentów, z jeszcze wyższymi wskaźnikami 30-50% w przypadkach intensywnej terapii i osób starszych oraz śmiertelnością 50-70%1-3. Niestety, częstość występowania AKI rośnie i przewiduje się, że będzie się dalej nasilać w ciągu następnej dekady, częściowo ze względu na różnorodność czynników, które mogą indukować AKI, w tym stres pooperacyjny, niedokrwienie i narażenie na nefrotoksyny, takie jak antybiotyki i chemioterapeutyki.

AKI wiąże się z nagłym uszkodzeniem komórek w nerkach, często występującym w nefronach, które są podstawowymi jednostkami funkcjonalnymi i składają się z filtra krwi i segmentowanego kanalika, który odprowadza mocz do centralnych kanałów zbiorczych1. Gdy znaczna liczba nefronów zostaje uszkodzona podczas AKI, natychmiastowe skutki obejmują przerwę w usuwaniu odpadów z krążenia oraz zmniejszony lub zniesiony przepływ płynu przez nefrony z powodu niedrożności ze strony martwych i umierających komórek1. Z biegiem czasu niedrożność kanalików może prowadzić do zwyrodnienia całych nefronów, co trwale zmniejsza czynność nerek1. Fizjologiczne zmiany w nerkach po AKI obejmują również złożone zdarzenia zapalne, które mogą prowadzić do przewlekłych bliznowaceń1.

Pomimo tych wyników, nefrony mają pewną zdolność do regeneracji po AKI, która odtwarza nabłonek rurkowy5,6. Chociaż istnieje coraz większa wiedza molekularna na temat regeneracji nefronów, mechanizmy te pozostają nieuchwytne pod wieloma względami i wymagajądalszych badań7. Stopień, w jakim AKI powoduje trwałe uszkodzenie nerek, również pozostaje nieznany. Obecne badania sugerują, że potencjał regeneracyjny nerek jest najwyższy po mniej ciężkich przypadkach AKI, podczas gdy bardziej wyraźne lub powtarzające się epizody prowadzą do przewlekłej choroby nerek (PChN) i prowadzą do schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), która wymaga ratującego życie przeszczepu lub dializy8,9. Ponadto osoby już cierpiące na PChN są narażone na jeszcze większe ryzyko zachorowania na ciężki epizod AKI8,9. Podsumowując, jasne jest, że kontynuowanie badań podstawowych i klinicznych jest niezbędne do zrozumienia, leczenia i zapobiegania AKI.

Badania na modelach zwierzęcych były kluczowe w docenieniu postępu lokalnych i środowiskowych zmian, które zachodzą podczas AKI10. Aby poszerzyć tę wiedzę, a także opracować nowe terapie, model zwierzęcy danio pręgowanego został wykorzystany na różne sposoby11,12. Nefrony nerki danio pręgowanego, zarówno u zarodka, jak i osobnika dorosłego, wykazują wysoki stopień ochrony u ssaków13-16. Co więcej, uszkodzenie nabłonka nefronów u danio pręgowanego przypomina proces u wyższych kręgowców, w którym po miejscowym zniszczeniu komórek kanalikowatych następuje proliferacja wewnątrzkanalikowa i przywrócenie architektury nefronów17-19. Jednak w zarodku rozległe uszkodzenie kanalików przez nefrotoksyny, takie jak cisplatyna, wiąże się ze śmiertelnością20,21. Dla porównania, dorosłe rybki danio pręgowanej przeżywają AKI i wykazują znaczne zdolności regeneracyjne w nerkach. Na przykład, po ekspozycji na antybiotyk aminoglikozydowy gentamycynę, danio pręgowany regeneruje uszkodzenia nabłonka kanalików i wytwarza nowe jednostki nefronów22-24. Chociaż te indukowane gentamycyną badania AKI dostarczyły bezcennych informacji, zrozumienie uszkodzenia nerek przez różne nefrotoksyny pozostaje kluczowe, aby docenić efekty i reakcję na różne rodzaje uszkodzeń

.

Zarodek danio pręgowanego, ze względu na swoją wielkość, przezroczystość i genetyczną wykonalność, ma wiele zalet dla badań nad nefrotoksynami25, gdzie metoda mikroiniekcji20,21 jest używana do podawania cząsteczki (cząsteczek) do badań. Nefrony powstają w ciągu 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) i zaczynają filtrować krew o około 48 hpf26,27. W ten sposób szybkie tworzenie i funkcja embrionalnej nerki ułatwia analizę eksperymentalną. Jednak proces mikroiniekcji wiąże się z wyzwaniami technicznymi, a opanowanie tej techniki może wymagać stromej krzywej uczenia się. W tym artykule wideo opisujemy, jak wykonywać mikrozastrzyki i podajemy wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, aby zwiększyć wskaźnik udanych zastrzyków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury pracy z zarodkami danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować 50-krotny roztwór podstawowy pożywki dla zarodków E3, mieszając 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 i 9,95 gMgSO4 w 5 l wody destylowanej i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. W przypadku hodowli zarodków danio pręgowanego rozcieńczyć 50x roztwór podstawowy podłoża zarodkowego E3 do 1x roztworu roboczego wodą destylowaną, a następnie dodać 200 μl 0,05% błękitu metylenowego do każdego 1 litra 1x E3, aby działał jako fungicyd i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować roztwór blokujący pigmentację pożywki zarodkowej E3 z 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznik (PTU), łącząc 40 ml 50-krotnego E3 z 0,06 mg PTU. Następnie doprowadzić objętość do całkowitej objętości 2 l wodą destylowaną.
  4. Wymieszaj E3/PTU O/N w temperaturze pokojowej, aby proszek PTU znalazł się w roztworze. Następnie przechowuj E3/PTU w RT.
    Uwaga: E3/PTU ma okres trwałości około jednego tygodnia, a starsze roztwory będą mniej skuteczne w blokowaniu rozwoju pigmentacji u larw danio pręgowanego.
  5. Przygotować roztwór znieczulający 0,2% trikainy (MS-222), dodając 1 g trikainy do 500 ml wody destylowanej i dostosować pH do 7,2 za pomocą 1 M Tris, pH 9,5.
  6. Przygotować do przygotowania 2% roztworu metylocelulozy do obrazowania, umieszczając roztwór 1x E3 (bez błękitu metylenowego), z dodatkiem 1/10 objętości 0,2% trikainy w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Roztwór metylocelulozy jest gęstym, przezroczystym roztworem, który służy do delikatnej stabilizacji żywych zarodków do mikroskopii. Po wykonaniu manipulacji zarodki można umyć w 1x E3 w celu rozpuszczenia metylocelulozy bez uszkadzania zwierzęcia i umożliwienia mikroskopii na kolejnych etapach w tej samej próbce.
  7. Po schłodzeniu do temperatury 4 °C energicznie wymieszać 1x roztwór E3/Tricaine na płytce mieszającej i stopniowo dodawać odpowiednią ilość proszku metylocelulozy, kontynuując energiczne mieszanie. Stopniowo dodawać proszek do roztworu, aby zapobiec tworzeniu się nierozpuszczalnych agregatów metylocelulozy.
  8. Po zmieszaniu całego proszku z 2% roztworem metylocelulozy/E3/trikainy, wymieszać roztwór złożony w chłodni o temperaturze 4 °C O/N.
    Uwaga: Niska temperatura jest najlepsza do całkowitego rozpuszczenia proszku. Jeśli roztwór nie jest klarowny po jednej nocy, mieszaj przez dodatkowy dzień roboczy i/lub drugi O/N.
  9. Aby usunąć pęcherzyki powietrza z 2% roztworu metylocelulozy/E3/trikainy, należy podzielić mieszaninę na probówki o pojemności 1,5 ml i wirować z dużą prędkością (12 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 30 minut lub do 2 godzin.
  10. Umieścić 2% roztwór metylocelulozy/E3/trikainy w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania.
    Uwaga: Przed użyciem porcje powinny być wstępnie podgrzane do RT do pracy z okazami danio pręgowanego.

2. Przygotowanie narzędzi

  1. Przygotuj narzędzie do manipulowania zarodkami, używane do pozycjonowania zarodków do mikrowstrzyknięcia, mocując końcówkę ładującą żel na końcu 5-calowej prostej igły preparacyjnej i zabezpiecz taśmą lub klejem superglue.
  2. Przygotuj igły do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do igieł, najpierw umieszczając w instrumencie polerowane ogniowo szkło borokrzemianowe o średnicy 10 cm z żarnikiem i zabezpiecz szkło borokrzemianowe, dokręcając uchwyty.
  3. Pociągnij szkło borokrzemianowe, aby uzyskać drobno stożkowe igły. Użyj następujących ustawień: ciepło 540, ciąg 245, prędkość 200 i czas 125.
  4. Umieść igły wewnątrz szalki Petriego, zawieszając je na pasku plasteliny, aby chronić końcówki igieł, i trzymaj naczynie przykryte, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.
  5. Aby zakończyć przygotowanie igły do mikroiniekcji, użyj żyletki lub cienkiej krawędzi kleszczy, aby przeciąć naciągnięty koniec igły, aby utworzyć ostrą, kątową końcówkę iniekcji o średnicy około 0,05-0,1 mm.
  6. Aby przygotować tackę do mikroiniekcji, należy przygotować 1,5% roztwór agarozy/E3 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml i rozpuścić agarozę, podgrzewając E3 do wrzenia w kuchence mikrofalowej, a następnie pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.
  7. Wlej schłodzony roztwór agarozy/E3 na szalkę Petriego, aby utworzyć fundament o głębokości około 0,5 cm. Gdy to zastygnie, wlej drugą warstwę o głębokości około 0,3 cm i włóż prefabrykowaną formę do studzienki zarodkowej i pozwól agarozie zestalić się w temperaturze RT.
    Uwaga: Podczas wkładania formy do górnej warstwy agaru/E3, umieść formę w agarze pod kątem, aby zmniejszyć liczbę pęcherzyków powietrza.
  8. Gdy cała tacka do mikroiniekcji jest już ustawiona, należy dobrze podnieść prefabrykowany zarodek, powoli i ostrożnie uformować za pomocą czerpaka, a następnie napełnić naczynie roztworem E3 i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie zarodków

  1. Skonfiguruj zbiorniki godowe danio pręgowanego, umieszczając przegrody w komorach godowych i napełnij wodą systemową.
  2. Umieścić po jednej rybie z każdej strony przegrody w taki sposób, aby w każdej komorze krynowej znajdowała się jedna samica i jeden samiec ryby, a następnie przykryć każdą komorę kryjową.
  3. Następnego ranka usuń przegrody, aby umożliwić tarło.
  4. Sprawdź ryby po około 30 minutach, a po powrocie dorosłych do akwarium zbierz ich zarodki, przepuszczając wodę ze zbiornika godowego przez drobne sitko z siatki drucianej.
  5. Odwróć sitko na szalce Petriego i spłucz E3, aby zebrać zarodki.
  6. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C O/N.
  7. Gdy zarodki osiągną stadium 24-26 somitów26, zdekantować większość pożywki E3, a następnie dokonać dechorionatu, dodając 100 μl 50 mg/ml pronazy do każdej szalki z zarodkami i inkubując szalkę w temperaturze 23 °C) przez około 15 minut
    Uwaga: Potrzeba około 24-25 godzin od momentu zapłodnienia, aby zarodki osiągnęły stadium somitów 24-26, jeśli zostaną zebrane w opisany sposób i inkubowane O/N w temperaturze 28,5 °C.
  8. Napełnij naczynie E3, a następnie delikatnie zamieszaj, aby usunąć kosmówkę z zarodków.
  9. Zdekantować E3/pronazę i opłukać naczynie 25 ml świeżego E3. Powtórz etap płukania, aby usunąć całą pronazę.
  10. Aby zahamować rozwój pigmentacji, należy zdekantować E3 i zastąpić 25 ml świeżego E3/PTU, gdy zarodki osiągną 24 godziny po zapłodnieniu.
    Uwaga: W przypadku eksperymentów trwających kilka dni należy raz dziennie zastąpić roztwór E3/PTU świeżymi pożywkami, aby utrzymać naczynie w czystości.

4. Mikroiniekcja roztworu nefrotoksyny

  1. W dniu wstrzyknięcia należy przygotować żądany roztwór nefrotoksyny wraz z odpowiednią kontrolą nośnika.
  2. Delikatnie wymieszaj lub wymieszaj, aby upewnić się, że lek(i) jest/są w roztworze, sprawdzając boki rurki i górną część słupa wody.
    Uwaga: Roztwory nefrotoksyn można przygotować tak, aby zawierały śladowe ilości fluorescencyjnie sprzężonego dekstranu w celu monitorowania skuteczności mikroiniekcji, a także oceny klirensu nerkowego w kolejnych punktach czasowych20,28.
  3. Załaduj przyciętą igłę do mikroiniekcji ~ 2-3 μl nefrotoksyny, nawlekając cienką końcówkę ładującą żel z tyłu igły i zawieś igłę pionowo za pomocą kawałka taśmy, aby roztwór mógł wypełnić przyciętą końcówkę igły grawitacyjnie.
  4. Gdy końcówka igły jest pełna, zabezpiecz załadowaną igłę w mikromanipulatorze.
  5. Zbadaj objętość mikroiniekcji, umieszczając kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i wstrzyknij do oleju, aby ocenić wielkość kropli. Objętość wtrysku 500 pl ma średnicę 0,1 mm.
  6. Wyjąć szalkę z zarodkami z inkubatora i znieczulić, dodając około 5 ml 0,2% trikainy do szalki z zarodkami.
  7. Aby zapewnić całkowite znieczulenie, delikatnie dotknij zarodka końcówką narzędzia do manipulowania zarodkami. Brak ruchu wskazuje na wystarczające znieczulenie.
  8. Po udanym znieczuleniu przenieś zarodki do formy iniekcyjnej za pomocą pipety transferowej.
  9. Manewruj każdym zarodkiem w innym dołku pleśni, umieszczając głowę w najgłębszym obszarze studzienki tak, aby tułów spoczywał wzdłuż zagłębienia, a ogon wystawał z zagłębienia.
  10. Wprowadzić wypełnioną igłę do mikromanipulatora i umieścić końcówkę igły obok zarodka.
  11. Delikatnie włóż igłę do naczynia ogonowego, przesuwając joystick do przodu i wciśnij pedał nożny, aby wprowadzić mikrowstrzyknięcie.
    Uwaga: Udane wstrzyknięcie można ocenić, obserwując, jak ciecz wchodzi do obiegu. Co więcej, jednoczesne wstrzyknięcie nefrotoksyny z fluorescencyjnie sprzężonym dekstranem umożliwia badaczowi zweryfikowanie udanego wstrzyknięcia po zabiegu.
  12. Delikatnie pociągnij joystick do tyłu, aby wyjąć igłę z zarodka.
  13. Po wstrzyknięciu przenieść zarodki do czystego naczynia i spłukać w celu usunięcia trikainy i zastąpić ją świeżym E3/PTU.
  14. Inkubuj zarodek do pożądanego punktu czasowego, aby ocenić morfologię, którą można udokumentować za pomocą fotografii w pożywce montażowej metylocelulozy lub procesu analizy eksperymentalnej zgodnie z życzeniem.
    Uwaga: Powrót do zdrowia zarodków powinien być oceniany w celu określenia odsetka osób z obrzękiem, który zwykle wskazuje na uszkodzenie nerek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Konfiguracja stanowiska do mikroiniekcji obejmuje stereomikroskop, mikromanipulator oraz regulator ciśnienia (Ryc. 1A). Podczas tej procedury zaleca się stosowanie oświetlenia przechodzącego płytki iniekcyjnej w celu lepszej widoczności okazów (Ryc. 1B). Przygotowanie igły do iniekcji polega na wyciągnięciu odpowiedniego szkła borokrzemianowego, a następnie przygotowaniu krawędzi poprzez odcięcie oraz końcowym napełnieniu igły od tyłu. Optymalnie końcówka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Z AKI29 powiązano różnorodną liczbę środków terapeutycznych. Poczyniono znaczne postępy w badaniach nad zrozumieniem szkód indukowanych przez wiele pojedynczych związków, takich jak aminoglikozyd gentamycyna30 i szeroko stosowana chemioterapeutyk cisplatyna31,32. Niektóre zmiany patologiczne związane z tymi stanami pozostają jednak przedmiotem trwających badań. Jednym z najpoważniejszych wyzwań pozostaje zrozumienie, w jaki sposób wiele leków niekorzystnie wpływa na pacjentów, zwłaszcza w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez DP2OD008470 grantu NIH. Dodatkowo RAM był częściowo wspierany przez fundusze dostarczone przez University of Notre Dame Graduate School. Dziękujemy pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych, Centrum Badań nad Danio Pręgowanym oraz Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu Notre Dame. Szczególnie dziękujemy członkom laboratorium za angażujące dyskusje na temat biologii nerek i ich pomocne opinie na temat tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AmerykańskiAB01915bioanalityczny
Amerykański Chlorek potasuAB01652Bioanalityczny
Chlorek wapniaAB00366bioanalityczny
N-fenylotiomocznik (PTU)Aldrich ChemistryP7629
3-aminobenzoesan etylu (trikaina)Fluka AnalyticalA5040
Szkło borokrzemianoweSutter Instruments Co.BF100-50-10
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipetSutter Instruments Co.P097
UltraPure AgarozaInvitrogen15510-027
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506
Błękit metylenowySigma-AldrichM9140
Falcon Jednorazowe szalki Petriego, sterylne, Corning:
60 mm x 15 mmVWR25373-085
100 mm x 15 mmVWR25373-100
 ( taca do mikroiniekcji) 150 mm x 15 mmVWR25373-187
Inkubator niskotemperaturowyFischer Scientific11 690 516DQ
Mikro pęseta preparcyjnaRoboz Surgical Instruments Co.Mikrometr RS-5010
Ted Pella, Inc.2280-24
Amerykański Amerykański

Bibliografia

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30(2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11(2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644(2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845(2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304(2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079(2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636(2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270(2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826(2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604(2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112(2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063(2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131(2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115(2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroiniekcja u danio pręgowanegoekspozycja na nefrotoksynymanipulacja zarodkamiigły do mikroiniekcjiroztwór agarozy E3leczenie gentamycynąekspozycja na cisplatynęocena obrzękówobrazowanie przez prześwietlanie
Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.