Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54242

⸱

7 czerwca 2017

 , 
1Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Immunología de Trasplantes, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III

W tym artykule

Podsumowanie

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Streszczenie

Nagromadzenie makrofagów w przeszczepionych narządach od dawna jest uznawane za cechę odrzucania przeszczepu allogenicznego1. Immunogenne monocyty infiltrują przeszczep allogeniczny wcześnie po przeszczepie, wywołują reakcję reaktywną przeszczepu przeciwko przeszczepionemu narządowi i inicjują odrzucenie narządu2. Najnowsze dane sugerują, że supresyjne makrofagi ułatwiają udaną długoterminową transplantację3 i są wymagane do indukcji tolerancji przeszczepu4. Sugeruje to wielowymiarową koncepcję ontogenezy, aktywacji i funkcji makrofagów, która wymaga nowej mapy drogowej dla izolacji i analizy funkcji makrofagów5. Ze względu na plastyczność makrofagów konieczne jest zapewnienie metodologii izolacji i charakterystyki makrofagów, w zależności od środowiska tkankowego, oraz zdefiniowanie ich funkcji według różnych scenariuszy. W tym miejscu opisujemy protokół charakterystyki immunologicznej makrofagów naciekających przeszczepy oraz metody, które zastosowaliśmy do funkcjonalnej oceny ich zdolności do hamowania proliferacji T CD8 + i promowania ekspansji CD4 + Foxp3 + Treg in vitro.

Wprowadzenie

Ten protokół opisuje techniki in vitro do badania funkcji makrofagów infiltrujących tkanki wyizolowanych z alloprzeszczepów serca, zgodnie z ich zdolnością do modulowania odpowiedzi limfocytów T. Szeroko opisywane w literaturze fluorescencyjne barwniki śledzące komórki w połączeniu z cytometrią przepływową są potężnymi narzędziami do badania funkcji supresyjnej określonych typów komórek in vitro i in vivo. Nasz protokół jest zgodny z metodą estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów in vitro.

Gdy komórka znakowana CFSE dzieli się, jej potomstwo nabywa o połowę mniej cząsteczek oznaczonych karboksyfluoresceiną6. Odpowiedni spadek fluorescencji komórek za pomocą cytometrii przepływowej można wykorzystać do oceny podziału komórek, monitorowania zdolności supresyjnych makrofagów do modulowania odpowiedzi immunologicznej komórek T. Ponieważ CFSE jest barwnikiem na bazie fluoresceiny, jest kompatybilny z szeroką gamą innych fluorochromów, dzięki czemu ma zastosowanie w wielokolorowej cytometrii przepływowej. Odpowiedni dobór fluorochromów do fenotypowania jest również ważny, aby uniknąć nadmiernego nakładania się widm i niezdolności do rozpoznania komórek dodatnich pod kątem przeciwciał, szczególnie w przypadku widocznych barwników białkowych, takich jak CFSE7.

Istnieje wiele zalet stosowania barwników fluorescencyjnych w porównaniu z alternatywnymi technikami mierzącymi proliferację komórek, takimi jak test inkorporacji tymidyny, który wykorzystuje radioznakowaną tymidynę (TdR)8. Test ten wykorzystuje tritiowaną tymidynę (3H-TdR), która jest włączana do nowych nici chromosomalnego DNA podczas podziału komórek mitotycznych. Problemem związanym z bezpieczeństwem tego testu jest stosowanie izotopów promieniotwórczych, ponieważ licznik scyntylacyjny beta służy do pomiaru radioaktywności w DNA odzyskanym z komórek w celu określenia zakresu podziału komórki. Metodologicznie próba trytiacji tymidyny nie jest wystarczająco elastyczna, aby dopasować się do ważnych ograniczeń laboratoryjnych klinicznych, takich jak mała liczba komórek i opóźniona analiza po barwieniu. Wręcz przeciwnie, wykazano, że barwienie CFSE zapobiega proliferacji komórek i zakłóca krytyczne markery aktywacji, takie jak CD69, HLA-DR i CD259. Dlatego zrozumienie zalet i ograniczeń każdej metodologii, szczególnie w badaniach wielokolorowych, w których do śledzenia różnych typów komórek stosuje się wiele barwników, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W tym badaniu, myszy są trzymane zgodnie z wytycznymi Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych oraz zaleceniami Przewodnika Publicznej Służby Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych. Wszystkie techniki eksperymentalne z wykorzystaniem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Utylizacji (IACUC) protokołami Szkoły Medycznej Mount Sinai.

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotuj kompletną pożywkę RPMI 1640 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml), używając 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 5 mM HEPES i 0,05 mM 2-merkaptoetanolu.

2. Izolacja alloprzeszczepu i zawiesina jednokomórkowa

UWAGA: Technika przeszczepu i zespolenia tętnicy płucnej i żyły głównej dolnej została początkowo opisana przez Corry'ego i współpracowników i może być zwizualizowana w Liu & Kang10,11 (Figura 1A).

  1. Znieczulić przeszczepioną mysz 4-5% izofluranem w komorze indukcyjnej. Poświęć go przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej standardowymi nożyczkami i usuń zawartość brzucha, aby zlokalizować aortę.
    UWAGA: Przeszczepione serce będzie znajdować się po prawej stronie aorty brzusznej biorcy (ryc. 1B).
  3. Delikatnie wyciągnij przeszczep za pomocą cienkich kleszczyków z ostrymi zębami i natychmiast umieść go w lodowatym podłożu RPMI.
    UWAGA: Użycie nożyczek chirurgicznych do oddzielenia przeszczepu od aorty może uszkodzić przeszczep i spowodować, że część tkanki pozostanie przylegająca do biorcy.
  4. Po pobraniu wszystkich przeszczepów przenieś je do sterylnego kaptura hodowlanego w celu przetworzenia tkanek. Umieść przeszczep na szalce Petriego i pokrój tkankę w kostkę na małe kawałki (1 mm) za pomocą sterylnych, nożyczek mikrochirurgicznych.
  5. Za pomocą kleszczy z ostrymi zębami przenieś kawałki do probówki o pojemności 50 ml z 5 ml kolagenazy A (0,1 mg / ml kolagenazy w sterylnym 1x PBS). Inkubować przez 1 godzinę w łaźni o temperaturze 37 °C.
  6. Dodać 5 ml pożywki RPMI, aby zneutralizować kolagenazę i przenieść próbkę przez sitko o wielkości 100 μm za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.
  7. Wirować próbkę w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy ACK. Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Dodać 1 ml pożywki RPMI, aby zneutralizować bufor do lizy i odwirować próbkę w temperaturze 400 x g przez 5 m w temperaturze 4 °C.
  10. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl pożywki RPMI i przenieść go do 5 ml polipropylenowej probówki okrągłodennej.
    UWAGA: Rurki polipropylenowe zapewniają mniejsze przyleganie. Ponadto utrzymywanie komórek w niskiej temperaturze, takiej jak 4 °C, zmniejsza przyczepność.

3. Izolacja makrofagów infiltrujących przeszczepy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

  1. Blokuj niepożądane specyficzne wiązanie na komórkach szpikowych za pomocą receptora Fc blokującego mAb (szczurzy anty-mysz CD16 / 32). Dodać 1-2 μl na próbkę 15 minut przed barwieniem powierzchni.
  2. Barwienie anty-mysie CD11b Percp/Cy5,5 (końcowe stężenie 0,6 μg/μL w pożywce RPMI), anty-mysie CD45 APC/eFluor780 (0,6 μg/μL), anty-mysie Ly6C APC (2 μg/μL) i anty-mysie Ly6G Pe/Cy7 (2 μg/μL). Przykryj probówki folią aluminiową w celu ochrony przeciwciał fluorescencyjnych przed światłem i inkubuj probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez 45 min.
    UWAGA: Do kompensacji pojedynczego zabarwienia należy przygotować probówkę kontroli ujemnej (bez plamy) i probówki z komórkami oznaczonymi pojedynczo każdym z fluorochromów. Aby pomóc w ustawieniu bramki, kontrole izotypów mogą być używane szczególnie dla Ly6C (IgG2a) i Ly6G (IgG2b).
  3. Umyć komórki dwukrotnie pożywką RPMI i wirować je w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru i rozcieńcz je w 1 ml pożywki RPMI na 1 x 106 komórek. Przed sortowaniem należy przenieść próbki przez nasadkę z sitkiem o pojemności 5 ml i 70 μm. Dodaj DAPI (1 μg/ml) jako marker żywotności komórek i przystąp do sortowania.
  4. Ponieważ makrofagi są wrażliwymi i delikatnymi komórkami, ustaw warunki sortowania na 20 psi i użyj dyszy o rozmiarze 100 μm, aby wyizolować makrofagi w 4-kierunkowym trybie czystości.
  5. Przygotuj probówki zbiorcze z 1 ml pożywki RPMI w probówce polipropylenowej o pojemności 5 ml.
  6. Korzystając z oprogramowania sortującego, otwórz nowy eksperyment i wybierz pusty eksperyment z pustym panelem, aby zdefiniować ustawienia.
  7. Skonfiguruj wykres punktowy, który wyświetla rozproszenie do przodu (FSC) i (w porównaniu) z boku (SSC) oraz bramkę na wszystkich leukocytach, z wyłączeniem szczątków i grudek o najniższym rozproszeniu do przodu i na bok. Z tej bramki nadrzędnej utwórz nowy wykres punktowy, który wyświetla SSC i DAPI oraz bramkę w komórkach DAPI.
    1. Na tej nowo bramkowanej populacji utwórz wykres punktowy, który wyświetla CD11b vs. CD45 i bramkuje podwójnie dodatnie (CD11b+, CD45+) makrofagi i neutrofile.
    2. W tym miejscu utwórz końcowy wykres punktowy przedstawiający Ly6C w porównaniu z Ly6G i wybierz pożądane populacje: Ly6Chi Ly6G-, Ly6CloLy6G- i Ly6CintLy6G+ (Rysunek 2).
  8. Po sortowaniu sprawdzić czystość i żywotność komórek (>90%) i wirować probówki zbiorcze o stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru i ponownie zawieś je w żądanym stężeniu (np. 1 x 106 makrofagów/ml) w pełnym podłożu RPMI.
  9. Płytka: 50 x 10:3 makrofagi na studzienkę w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem z końcową objętością 100 μl kompletnej pożywki RPMI. Pozostawić komórki w spokoju przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

4. Izolacja limfocytów T za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

UWAGA: C57BL/6-Foxp3tm1Flv/Jn to ukierunkowany szczep myszy typu knock-in sprzężony z chromosomem X, który łączy komórki wyrażające gen Foxp3 (forkhead box P3) z monomerycznym białkiem czerwonej fluorescencji (mRFP).

  1. Znieczulić i poświęcić myszy C57BL/6 i C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J (H-2b), jak opisano wcześniej w kroku 2.1. Odizoluj śledzionę i węzły chłonne (LN: pachwinowe, lędźwiowe, pachowe, ramienne i szyjne) i szybko umieść je w lodowatym podłożu RPMI.
  2. W celu odizolowania RN należy ułożyć mysz w pozycji leżącej, wykonać nacięcie skóry w linii środkowej od dołu do góry, ostrożnie przecinając otrzewną i delikatnie rozsuwając skórę. Po zebraniu wszystkich LN pachwinowych, lędźwiowych, pachowych, ramiennych i szyjnych (ryc. 1C, zabarwiony na czerwono), przetnij otrzewną i odizoluj śledzionę w lewym górnym rogu jelita.
  3. Zdezagreguj śledzionę i LN za pomocą filtra 100 μm umieszczonego na górze probówki o pojemności 50 ml. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml delikatnie dociśnij chusteczkę. Przepłucz filtr medium RPMI tyle razy, ile to konieczne, aż będzie czysty.
    UWAGA: LN i śledziona od każdej myszy mogą być zebrane razem w tej samej probówce.
  4. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić osad w 2 ml buforu do lizy ACK. Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Dodaj 2 ml pożywki RPMI, aby zneutralizować bufor do lizy. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl pożywki RPMI i przenieść go do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml.
  8. Barwnik do anty-mysiego CD4 APC (0,6 μg/μL) i/lub anty-mysiego CD8 PeCy7 (2 μg/μL). Przykryj probówki folią aluminiową, aby chronić przeciwciała fluorescencyjne przed światłem, i inkubuj probówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez 45 min.
    UWAGA: Do kompensacji pojedynczego zabarwienia należy przygotować probówkę kontroli ujemnej (bez plamy) i probówki z komórkami oznaczonymi pojedynczo każdym z fluorochromów.
  9. Umyć komórki dwukrotnie pożywką RPMI i wirować je w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
    UWAGA: Barwnik CFSE jest dostarczany w postaci proszku estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny, zwykle w ilości 50 μg. Dodać 18 μl DMSO do fiolki CFSE w celu uzyskania końcowego roztworu podstawowego 5 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
  10. W przypadku znakowania CFSE należy ponownie zawiesić komórki barwione CD8 w stężeniu do 106 komórek na ml w PBS przy końcowym stężeniu roboczym 5 μM CFSE z roztworu podstawowego. Inkubować je w kąpieli w temperaturze 20 °C przez 5 minut, jak opisano wcześniej6.
    UWAGA: (ETAP KRYTYCZNY) W przypadku komórek o niskim stężeniu (≤106 na ml) konieczne jest, aby komórki były znakowane w obecności dodanego białka w celu buforowania toksycznego działania CFSE. W związku z tym PBS może zawierać 5% FBS. Należy pamiętać, że jeśli używana jest pożywka, wolne aminokwasy mogą obniżyć skuteczność znakowania, konkurując o CFSE.
  11. Zneutralizuj CFSE za pomocą 2 ml pożywki RPMI. Wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 1 ml pożywki RPMI na 1 x 106 limfocytów T CD8.
  12. Przed sortowaniem należy przenieść próbkę przez sitko o pojemności 70 μm na nasadce probówki o pojemności 5 ml. Dodać 50 μl 1x DAPI (1 μg/ml) jako marker żywotności komórek i przystąpić do sortowania.
    UWAGA: 1x oznacza stosunek 1:1 odczynnika w stosunku do innego składnika.
  13. Ustaw warunki sortowania na 20 psi i rozmiar dyszy 100 μm, aby wyizolować podwójnie dodatnie limfocyty T CD8 + CFSE + (rysunek 3A).
  14. Przygotuj probówki zbiorcze z 1 ml pożywki RPMI w probówce polipropylenowej o pojemności 5 ml i przystąp do sortowania.
  15. Korzystając z oprogramowania sortującego, otwórz nowy eksperyment i wybierz pusty eksperyment z pustym panelem, aby zdefiniować ustawienia.
  16. W przypadku izolacji limfocytów T CD4 + należy ustawić wykres punktowy, który wyświetla FSC w porównaniu z SSC i bramką na limfocytach, z wyłączeniem zanieczyszczeń, a także dużych komórek ziarnistych, takich jak komórki dendrytyczne.
    1. Z tej bramki nadrzędnej utwórz nowy wykres punktowy, który wyświetla SSC i DAPI oraz bramkę w komórkach DAPI.
    2. Na tej nowo bramkowanej populacji utwórz wykres punktowy, który wyświetla SSC w porównaniu z CD4, aby wyizolować wszystkie komórki CD4 + (Rysunek 3B). Alternatywnie, przeciwciało anty-CD3 może być użyte w celu zapewnienia izolacji populacji czystych limfocytów T.
      UWAGA: Niewielka część wszystkich limfocytów T CD4 + (5-10%) powinna być Foxp3 + mRFP +.
  17. Po sortowaniu sprawdzić czystość i żywotność komórek (>90%) i obracać probówki zbiorcze o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Zawiesić przy użyciu 1 ml kompletnej pożywki RPMI na 2x106 limfocytów T.
  18. Skonfiguruj test supresji, hodując limfocyty T z wcześniej posortowanymi makrofagami. Płytka 10 x 104 CD4 + T i 10 x 104 limfocyty T CD8 + CFSE + w tym samym dołku w końcowej objętości 100 μl kompletnej pożywki RPMI. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 96 h.
    UWAGA: Makrofagi i limfocyty T zastosowano w stosunku 1:4.
  19. Stymuluj podział limfocytów T poprzez przemycie kulek magnetycznych aktywatora limfocytów T CD3 / CD28 w 2 ml PBS przed ich użyciem w celu usunięcia buforu zawierającego azydek. Dodaj 5 μl kulek CD3/CD28 aktywatora mysich limfocytów T na dołek.
    UWAGA: Koraliki magnetyczne mają podobną wielkość do komórek prezentujących antygen i są sprzężone z mAb anty-CD3 i anty-CD28, oferując prostą metodę aktywacji i ekspansji limfocytów T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki przedstawiają strategię bramkowania opisaną w powyższym protokole. Wyniki obrazują również analizę aktywności proliferacyjnej limfocytów T po ko-kulturze z makrofagami infiltrującymi przeszczep. Zdolność supresyjną podzbiorów makrofagów in vitro przeanalizowano na Rysunku 4. Wyniki wskazują, że makrofagi Ly6CloLy6G- uzyskane od biorców tolerystycznych wykazują właściwości supresyjne. Wyniki wskazują również, że komórki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metody, które zastosowaliśmy do immunocharakterystyki podzbiorów komórek szpikowych naciekających przeszczep w eksperymentalnym mysim modelu przeszczepu serca, który ma również zastosowanie do innych tkanek w różnych mysich modelach eksperymentalnych. Sortowanie komórek pod niskim ciśnieniem przy ciśnieniu 20 psi było preferowaną metodą izolowania dobrej wydajności czystych podzbiorów komórek. Utrzymanie czystości każdej podgrupy szpiku ma kluczowe znaczenie dla ustalenia rozstrzygających wyników zdo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Doceniamy techniczny wkład Centrów Doskonałości Badawczej Cytometrii Przepływowej, Mikrochirurgii i Biorepozytorium/Patologii na Górze Synaj. Prace te były wspierane przez COST Action BM1305: Action to Focus and Accelerate Cell Tolerogenic Therapies (A FACTT), fundusze rozwojowe Mount Sinai Recanati/Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R i SAF2016-80031-R J.O.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
10% FBSLife Technologies26140-079
1,000x 2-merkaptoetanolLife Technologies21985023
100x Pen/StrepLife Technologies15140122
100x L-glutaminaLife Technologies25030081
100x Non Aminokwasy niezbędneCorning25025039
1 M bufor HEPES Corning25060CL
100 mM Pirogronian soduThermoScientificSH30239.01
Penicylina/StreptavidynThermoScientific15140122
Kolagen ARoche70381322
DPBS (bez wapnia& magnez)Corning21031CV
70 & mikro; m Sitko komórkoweFisher22363548
bufor do lizy ACKLife TechnologiesA10492-01
DAPISigma32670-5mg-F
CFSE-FITCInvitrogenC34554
Dynabeads Mysi aktywator limfocytów T CD3/CD28Life Technologies11452D
96 dobrze  U-dolna płytaCorning353077
Przeciwciała:
anty-Ly6C-APCeBioscience175932-80
anty-Ly6G-Pe/Cy7Biolegend127617
anty-CD11b-Percp/Cy5.5eBioscience45011282
anty-CD45-APC/Cy7eBioscience47045182
anty-CD4-APCeBioscience17004181
anty-CD8-P/ Cy7eBioscience25008181
Cytometr przepływowy LSRIIBD Bioscience
FACSDiva OprogramowanieBD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J Laboratorium Jacksona008374
C57BL/6Laboratorium Jacksona000664
Balb/cLaboratorium Jacksona000651

Bibliografia

  1. Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
  2. Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
  3. Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
  4. Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
  5. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
  6. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627(2014).
  7. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287(2012).
  8. Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
  9. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
  10. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  11. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238(2007).
  12. Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
  13. Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
  14. Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
  15. Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
  16. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przep ywowasortowanie kom rekizolacja makrofag wproliferacja limfocyt w Tekspansja TregCD11b CD45Ly6C Ly6Gtest kokultury
Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.