Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Summary

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146⁺CD34^- i komórek przybyszowych CD34⁺CD146^-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Abstract

Multipotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) były tradycyjnie izolowane, poprzez ich plastikowe przyleganie, od pierwotnych trawień tkankowych, podczas gdy ich anatomiczna lokalizacja tkanki pozostawała niejasna. Niedawne odkrycie przez naszą grupę i innych badaczy zdefiniowanej ekspresji markerów okołonaczyniowych i komórek MSC przez komórki okołonaczyniowe w wielu tkankach dało możliwość prospektywnego wyizolowania i oczyszczenia określonych jednorodnych subpopulacji multipotencjalnych okołonaczyniowych komórek prekursorowych. Wcześniej wykazaliśmy zastosowanie fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS) do oczyszczania mikronaczyniowych perycytów CD146 ⁺ CD34 - i naczyniowych komórek przybyszowych CD34 ⁺ CD146 ^z ludzkich mięśni szkieletowych. W niniejszym artykule opisujemy metodę jednoczesnego izolowania tych dwóch podzbiorów komórek okołonaczyniowych z ludzkiego mięśnia sercowego za pomocą FACS, w oparciu o ekspresję określonego zestawu markerów powierzchni komórek dla selekcji pozytywnej i negatywnej. Metoda ta udostępnia zatem dwie specyficzne subpopulacje multipotencjalnych sercowych komórek prekursorowych podobnych do MSC do wykorzystania w badaniach podstawowych i/lub badaniach terapeutycznych.

Introduction

Serce od dawna uważane jest za organ postmitozyczny. Jednak ostatnie badania wykazały ograniczoną rotację kardiomiocytów w sercach dorosłych ludzi¹. Natywne komórki macierzyste/progenitorowe o potencjale różnicowania kardiomiocytów zostały również zidentyfikowane w mięśniu sercowym u dorosłych gryzoni i ludzkich serc, w tym Sca-1⁺, c-kit⁺, tworzących kardiosferę, a ostatnio okołonaczyniowych komórek prekursorowych^2,3. Komórki te są atrakcyjnymi kandydatami do terapii mających na celu poprawę naprawy/regeneracji serca poprzez przeszczep komórek lub stymulację proliferacji in situ.

Mezenchy....

Protocol

1. Przetwarzanie próbki ludzkiego serca

1. Upewnij się, że wszystkie płyny, pojemniki, instrumenty i wyznaczony obszar operacyjny są sterylne.
2. Umieścić próbkę tkanki serca (pobraną przez bank tkanek lub zespół chirurgiczny) na podłożu magazynowym złożonym ze schłodzonej zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S) na lodzie do transportu³.
3. Wyjąć próbkę serca z pożywki magazynowej i przemyć pożywką płuczącą składającą się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 2% FBS i 1% P/S. Podczas obchodzenia się z próbką nale....

Results

Pojedyncze komórki zostały odróżnione od szczątków i dubletów na podstawie rozkładu rozproszenia do przodu i na boki. Żywe komórki zidentyfikowano na podstawie niepobrania przez nie barwnika DAPI. Strategia bramkowania została wybrana na podstawie znakowania kontrolnego izotypu tej żywej dysocjacji komórek całego serca (ryc. 1). Z żywych komórek najpierw bramkowane zostały komórki CD45 ⁺, a następnie komórki CD56 ⁺. Komórki śródbłonka CD144⁺

Discussion

Coraz więcej dowodów potwierdza ograniczoną zdolność regeneracyjną serca dorosłego człowieka po urazie. Identyfikacja i charakterystyka natywnych komórek prekursorowych odpowiedzialnych za takie reakcje regeneracyjne w uszkodzonych sercach ma kluczowe znaczenie zarówno dla zrozumienia powiązanych mechanizmów i szlaków sygnałowych, jak i dla opracowania podejść do wykorzystania tych komórek w terapii.

Poprzednie protokoły opisywały izolację podzbiorów okołonaczyniowych komórek prekursorowych z .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw kulek przeciw myszom AbC	Sondy molekularne	A-10344
Kolagenaza I	Gibco	17100-017	W razie potrzeby rozpuść proszek i wysterylizuj filtr
Kolagenaza II	Gibco	17101-015
Kolagenaza IV	Gibco	17104-019
anty-ludzka CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Zachowaj sterylność
anty-ludzki CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Utrzymuj sterylny
anty-ludzki CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Utrzymuj sterylny
anty-ludzki CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Utrzymuj sterylny
anty-ludzki CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Utrzymuj sterylność
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	Do pobierania komórek i hodowli do momentu przylegania
DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX bez pirogronianu sodu	ThermoFischer Scientific	10566-016
Surowica bydlęca	płodu ThermoFischer Scientific	10500-064	Zamrażać w porcjach i przechowywać w sterylnej
Żelatyna	Sigma Aldrich	G1393	Rozcieńczyć sterylną wodą
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Zachowaj sterylność
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Zachowaj sterylność
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Zachowaj sterylność
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Zachowaj sterylność
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Zachowaj sterylność
Serum dla myszy	Sigma Aldrich	M5905	Keep sterylna
folia parafinowa - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15979-063	Zamrozić w porcjach i zachować sterylne
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Utrzymuj sterylny
bufor lizujący czerwone krwinki Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Utrzymuj sterylny
trypan Niebieski roztwór	Sigma Aldrich	T8154
Trypsyna-EDTA 0,5%(10x)	Witamina	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Aktywowany fluorescencją sortownik komórek