Artykuł metodologiczny

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

DOI:

10.3791/54252

⸱

8 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) były tradycyjnie izolowane, poprzez ich plastikowe przyleganie, od pierwotnych trawień tkankowych, podczas gdy ich anatomiczna lokalizacja tkanki pozostawała niejasna. Niedawne odkrycie przez naszą grupę i innych badaczy zdefiniowanej ekspresji markerów okołonaczyniowych i komórek MSC przez komórki okołonaczyniowe w wielu tkankach dało możliwość prospektywnego wyizolowania i oczyszczenia określonych jednorodnych subpopulacji multipotencjalnych okołonaczyniowych komórek prekursorowych. Wcześniej wykazaliśmy zastosowanie fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS) do oczyszczania mikronaczyniowych perycytów CD146 + CD34 - i naczyniowych komórek przybyszowych CD34 + CD146 z ludzkich mięśni szkieletowych. W niniejszym artykule opisujemy metodę jednoczesnego izolowania tych dwóch podzbiorów komórek okołonaczyniowych z ludzkiego mięśnia sercowego za pomocą FACS, w oparciu o ekspresję określonego zestawu markerów powierzchni komórek dla selekcji pozytywnej i negatywnej. Metoda ta udostępnia zatem dwie specyficzne subpopulacje multipotencjalnych sercowych komórek prekursorowych podobnych do MSC do wykorzystania w badaniach podstawowych i/lub badaniach terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serce od dawna uważane jest za organ postmitozyczny. Jednak ostatnie badania wykazały ograniczoną rotację kardiomiocytów w sercach dorosłych ludzi1. Natywne komórki macierzyste/progenitorowe o potencjale różnicowania kardiomiocytów zostały również zidentyfikowane w mięśniu sercowym u dorosłych gryzoni i ludzkich serc, w tym Sca-1+, c-kit+, tworzących kardiosferę, a ostatnio okołonaczyniowych komórek prekursorowych2,3. Komórki te są atrakcyjnymi kandydatami do terapii mających na celu poprawę naprawy/regeneracji serca poprzez przeszczep komórek lub stymulację proliferacji in situ.

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) zostały wyizolowane z prawie każdej ludzkiej tkanki4,5 Przeprowadzono badania kliniczne terapeutycznych zastosowań MSC dla wielu stanów patologicznych, takich jak naprawa układu krążenia6, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi7 i marskość wątroby8. Korzystne działanie przypisuje się zdolności MSCs do: lokalizacji miejsc zapalnych9; różnicować się w różne typy komórek10; wydzielają cząsteczki pronaprawcze11; i modulować odpowiedzi immunologiczne gospodarza12. Izolacja MSCs tradycyjnie opierała się na ich preferencyjnym przyleganiu do podłoży z tworzyw sztucznych. Jednak uzyskana populacja komórek jest zazwyczaj wyraźnie niejednorodna13. Stosując fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowanych (FACS) z kombinacją kluczowych markerów komórek okołonaczyniowych, byliśmy w stanie wyizolować i oczyścić multipotencjalną populację prekursorów podobnych do MSC (CD146+/CD31-/CD34-/CD45-/CD56-) z wielu tkanek ludzkich, w tym dorosłych mięśni szkieletowych i białego tłuszczu14.

Wykazano, że populacje komórek okołonaczyniowych w różnych tkankach niesercowych mają właściwości komórek macierzystych/progenitorowych i są badane pod kątem klinicznego zastosowania w warunkach sercowo-naczyniowych. Perycyty, jeden z najbardziej znanych podzbiorów komórek okołonaczyniowych, to niejednorodna populacja, która odgrywa kilka ról patofizjologicznych, w tym w rozwoju nowych naczyńkrwionośnych 15, regulacji ciśnienia krwi16 i utrzymaniu integralności naczyń17,18. Jak wykazano w wielu tkankach, określone podzbiory perycytów natywnie wyrażają antygeny MSC i utrzymują swoje fenotypy podobne do MSC w hodowli pierwotnej po oczyszczeniu FACS14. Co więcej, komórki te stabilnie utrzymują swoje długoterminowe fenotypy w hodowli i wykazują potencjał różnicowania wieloliniowego, podobny do MSCs19,20. Wyniki te sugerują, że perycyty są jednym z początków nieuchwytnego MSC14. Wykazano potencjał terapeutyczny perycytów w postaci zmniejszenia bliznowacenia mięśnia sercowego i poprawy funkcji serca po przeszczepieniu do niedokrwiennie uszkodzonych serc21. Niedawno z powodzeniem oczyściliśmy perycyty z ludzkiego mięśnia sercowego i wykazaliśmy ich fenotypy podobne do MSC oraz multipotencję (adipogeneza, chondrogeneza i osteogeneza) przy braku miogenezy szkieletowej3. Ponadto perycyty mięśnia sercowego wykazywały zróżnicowany potencjał kardiomiogenny i zdolności angiogenne w porównaniu z odpowiednikami oczyszczonymi z innych narządów.

Druga populacja multipotencjalnych okołonaczyniowych komórek macierzystych/progenitorowych, komórka przybyszowa, została wyizolowana z ludzkich żył odpiszczelowych na podstawie dodatniego ekspresji CD3422. Wykazano, że żylne komórki przybyszowe mają potencjał klonogenny, zdolność różnicowania mezodermalnego i potencjał proangiogenny in vitro. Przeszczepienie tych komórek do niedokrwiennie uszkodzonych serc myszy spowodowało zmniejszenie zwłóknienia śródmiąższowego, zwiększenie angiogenezy i przepływu krwi w mięśniu sercowym, zmniejszenie rozszerzenia komór i zwiększenie frakcji wyrzutowej serca23. Co ciekawe, wykazano, że komórki przybyszowe tkanki tłuszczowej tracą ekspresję CD34 i zwiększają ekspresję CD146 w hodowli w odpowiedzi na leczenie angiopoetyną II, co sugeruje przyjęcie fenotypu perycytów ze stymulacją24. Jednak w obrębie serca populacja komórek przybyszowych nie została jeszcze prospektywnie oczyszczona przez FACS i/lub dobrze scharakteryzowana. Wykorzystując procedury izolacji komórek opisane w poniższych sekcjach, obecnie charakteryzujemy komórki przybyszowe mięśnia sercowego i badamy ich potencjał do zastosowań regeneracyjnych.

Tutaj opisujemy metodę izolacji i oczyszczania dwóch subpopulacji okołonaczyniowych komórek macierzystych/progenitorowych z ludzkiego płodu lub dorosłego mięśnia sercowego. Ta prospektywna metoda izolacji komórek umożliwi naukowcom uzyskanie izogenicznych okołonaczyniowych komórek macierzystych/progenitorowych z biopsji ludzkiego serca do badań porównawczych i dalsze badanie ich potencjału terapeutycznego w różnych stanach patologicznych serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przetwarzanie próbki ludzkiego serca

  1. Upewnij się, że wszystkie płyny, pojemniki, instrumenty i wyznaczony obszar operacyjny są sterylne.
  2. Umieścić próbkę tkanki serca (pobraną przez bank tkanek lub zespół chirurgiczny) na podłożu magazynowym złożonym ze schłodzonej zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (P/S) na lodzie do transportu3.
  3. Wyjąć próbkę serca z pożywki magazynowej i przemyć pożywką płuczącą składającą się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 2% FBS i 1% P/S. Podczas obchodzenia się z próbką należy używać kleszczy z cienką końcówką, aby chwycić duże naczynia lub osierdzie i zminimalizować zgniatanie mięśnia sercowego.
  4. Zanurz próbkę w podłożu myjącym na szalce Petriego i usuń osierdzie, wsierdzie i duże naczynia krwionośne za pomocą wysterylizowanych nożyczek do tęczówki i kleszczyków z cienką końcówką, jak opisano3.
  5. Pokrój pozostały mięsień sercowy na małe kawałki o wielkości około 1 mm3 za pomocą jednostronnej żyletki lub ostrych nożyczek do tęczówki. Uwaga: Najwyższą wydajność komórek uzyska się, jeśli próbki zostaną przetworzone natychmiast. Jeżeli opóźnienie jest nieuniknione, możliwe jest przechowywanie przetworzonej tkanki serca w świeżym podłożu magazynującym (>5 ml na 1cm3 tkanki) w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin, jednak przypuszczalnie z towarzyszącym spadkiem wydajności komórek.

2. Trawienie tkanki i izolacja komórek

  1. Świeżo uzupełnić roztwór wytrawiający składający się po 1,5 ml kolagenazy I, kolagenazy II i kolagenazy IV (wszystkie w stężeniu 0,5 mg/ml w DMEM) i ogrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej><. Uwaga: Objętość i stężenie kolagenaz są odpowiednie dla próbek o wielkości około 1 cm3.
  2. Przefiltruj zawieszone kawałki tkanki przez sitko o średnicy 100 μm i przemyj dwukrotnie PBS. Przenieść kawałki tkanki do sterylnego pojemnika o pojemności 30 ml ze szczelnie zamkniętą pokrywką.
    Uwaga: Krótkie, szerokie doniczki, a nie wysokie, wąskie rurki, dają lepsze rezultaty. Alternatywnie, umieść kawałki tkanek w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i ułóż poziomo, jeśli pojemnik o pojemności 30 ml nie jest dostępny.
  3. Dodać wszystkie roztwory wytrawiające (łącznie 4,5 ml) i umieścić pojemnik w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ustawionej na 120 obr./min. Alternatywnie należy uszczelnić pojemnik folią parafinową i umieścić w podgrzewanej wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 120 obr./min.
  4. Po 15 minutach wyjmij i odwróć garnek trzy razy, a następnie umieść go na kolejne 15 minut. Wyjmij i ugasz kolagenazy 5 ml DMEM uzupełnionym 20% FBS i 1% P/S.
  5. Rozprowadzić trawienie, delikatnie pipetując dziesięć do dwudziestu razy pipetą serologiczną o pojemności 10 ml, aby rozbić wszelkie grudki tkanek. Przefiltrować zawiesinę sekwencyjnie przez sitka komórkowe 100 μm, 70 μm i na końcu 40 μm, aby usunąć niestrawione materiały i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
    Uwaga: Nie spłukuj między sitkami komórkowymi, aby uniknąć zanieczyszczeń komórkowych powstających w procesie trawienia enzymatycznego.
  6. Odwirować zawiesinę komórek przy 200 x g przez 4 minuty, ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych na 2 minuty w temperaturze pokojowej przed rozcieńczeniem 4 ml pożywki myjącej.
  7. Powtórzyć etap wirowania i ponownie zawiesić osad w 1 ml środka myjącego. Dobrze wymieszać i pobrać 10 μl zawiesiny komórek do liczenia komórek.
  8. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl barwienia błękitem trypanowym i umieścić 10 μl mieszaniny na standardowym hemocytometrze do zliczania komórek. Policz liczbę jasnych, okrągłych komórek obecnych w czterech kwadratach narożnych (każdy podzielony na szesnaście małych kwadratów) i podziel przez 4, aby uzyskać średnią na kwadrat narożny. Pomnóż średnią przez 2, aby uwzględnić współczynnik rozcieńczenia barwienia, a następnie przez 104, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek na 1 ml próbki.

3. Etykietowanie i sortowanie komórek

  1. Dodać 50 μl surowicy myszy do zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał.
  2. Odwirować zawiesinę komórkową z mysią surowicą o stężeniu 200 x g przez 4 minuty, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w pożywce płuczącej o stężeniu 1 x10,6 komórek na 100 μl.
  3. Podamy po 50 μl zawiesiny komórek dla izotypu i niebarwionych kontroli do dwóch probówek do cytometrii przepływowej z polistyrenu z okrągłym dnem, a następnie umieść pozostałą objętość w trzeciej probówce w celu barwienia wielokolorowego.
  4. Dodaj przeciwciała CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 i CD146-AF647 (wszystkie 1:100) do zawiesiny pojedynczej komórki w celu barwienia wielokolorowego. Do kontroli izotypu dodać równoważne objętości przeciwciał przeciwko izotypowi sprzężonym z PE, APC-Cy7, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5 i AF647. Delikatnie odpipetować w celu wymieszania przeciwciał z komórkami i inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
  5. Przygotować koraliki kontrolne kompensacji, dodając jedną kroplę kulek dodatnich do 100 μl medium myjącego w pięciu polistyrenowych probówkach do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem. Dodaj przeciwciała CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 i CD146-AF647 (wszystkie 1:100) indywidualnie do każdej z 5 probówek. Inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
  6. Podczas inkubacji należy przygotować probówki do pobierania komórek, każda zawierająca 500 μl pożywki hodowlanej Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) i umieścić w temperaturze 4 °C.
  7. Po inkubacji przeciwciał dodać 5 ml pożywki myjącej, aby przepłukać komórki i kulki w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Odwirować wszystkie probówki o sile 200 x g przez 4 min. Powtórz etap mycia i wirowania. Ostrożnie zdekantować supernatant i delikatnie odpipetować podczas ponownego zawieszania komórek.
  8. Ponownie zawiesić w podłożu myjącym o stężeniu około 1 x 106 komórek na 250 μl. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl środka myjącego.
  9. Transportuj wszystkie zawiesiny komórek i kulek do sortownika komórek na lodzie w ciemności. Dodaj 1 kroplę ujemnych kulek do probówek kontrolnych z dodatnią kompensacją koralików i użyj ich do ustawienia kompensacji fluorescencji.
  10. Uruchom niezabarwione ogniwa kontrolne zgodnie z instrukcjami producenta, aby ustalić fluorescencję tła i ustaw napięcia na następujące: FSC 150V; SSC 290V; V450/50 350V; V710/50 620V; B530/30 400V; B710/50 530V; YG780/60 460; Czynnik chłodniczy R670/30 480V; Czynnik chłodniczy R780/60 460V. Uruchom kontrole izotypów zgodnie z instrukcjami producenta, aby ustalić progi fluorescencji tła związane z niespecyficznym wiązaniem. Uruchom wielokolorową barwioną próbkę i zbierz populacje komórek perycytów i przybyszów do probówek zbiorczych (ryc. 1).
    UWAGA: Optymalna wydajność komórek żywotnych wynosi około 3% całkowitej dysocjacji żywych komórek w przypadku perycytów i 4% w przypadku komórek przybyszowych.

4. Hodowla komórkowa

  1. Wybierz odpowiedni rozmiar płytek hodowlanych zgodnie z wynikiem sortowania FACS. Dodać 100 μl sterylnego 0,2% roztworu żelatyny nacm2 obszaru wzrostu i mieszać ręcznie, aby pokryć całe studzienki. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez 10 minut i całkowicie usunąć roztwór żelatyny. Zebrane komórki należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania płytek hodowlanych.
    Uwaga: Świeżo posortowane perycyty i komórki przybyszowe dobrze rosną po wysiewie w gęstości od 30 000 do 40 000 komórek/cm2 na powierzchni hodowli pokrytej żelatyną.
  2. Świeżo zebrane komórki odwirować w stężeniu 200 x g przez 4 minuty i delikatnie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości EGM-2. Wysiewaj komórki na płytkach pokrytych żelatyną.
    Uwaga: Rzeczywista liczba komórek, które mają być wysiane na studzienkę i ilość EGM-2, która ma zostać dodana, zależą od wyboru płytki. Na przykład 0,5 ml i 1 ml EGM-2 są potrzebne na studzienkę odpowiednio dla płytek 48- i 24-dołkowych.
  3. Zamień EGM-2 na pożywkę do wzrostu komórek okołonaczyniowych (DMEM uzupełniony o 20% FBS i 1% P / S) zarówno dla perycytów, jak i komórek przybyszowych, gdy komórki osiądą i przylgną do płytki (po co najmniej 72 godzinach). Od tego momentu zmieniaj nośnik co 72 godziny. Przeprowadzić początkową i wszystkie kolejne inkubacje w 5% CO2 i w temperaturze 37 °C.
  4. Dysocjuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny EDTA, gdy perycyty i komórki przybyszowe osiągną 80 do 90% zbieżności. Schłodzić 20% FBS w PBS, odwirować przy 200 x g przez 4 min, ponownie zawiesić w pożywce do wzrostu komórek okołonaczyniowych, a następnie przejść komórki w stosunku 1:3 na niepowlekane płytki hodowlane z polistyrenu. Począwszy od Pasażu 2, komórki pasażowe w stosunku 1:5 (lub w ilości około 7 000 komórek/cm2) do niepowlekanych płytek lub kolb hodowlanych z polistyrenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedyncze komórki zostały odróżnione od szczątków i dubletów na podstawie rozkładu rozproszenia do przodu i na boki. Żywe komórki zidentyfikowano na podstawie niepobrania przez nie barwnika DAPI. Strategia bramkowania została wybrana na podstawie znakowania kontrolnego izotypu tej żywej dysocjacji komórek całego serca (ryc. 1). Z żywych komórek najpierw bramkowane zostały komórki CD45 +, a następnie komórki CD56 +. Komórki śródbłonka CD144+

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz więcej dowodów potwierdza ograniczoną zdolność regeneracyjną serca dorosłego człowieka po urazie. Identyfikacja i charakterystyka natywnych komórek prekursorowych odpowiedzialnych za takie reakcje regeneracyjne w uszkodzonych sercach ma kluczowe znaczenie zarówno dla zrozumienia powiązanych mechanizmów i szlaków sygnałowych, jak i dla opracowania podejść do wykorzystania tych komórek w terapii.

Poprzednie protokoły opisywały izolację podzbiorów okołonaczyniowych komórek prekursorowych z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Shonnie Johnston, Claire Cryer, Fionie Rossi i Willowi Ramsayowi z Uniwersytetu w Edynburgu oraz Alison Logar i Megan Blanchard z Uniwersytetu w Pittsburghu za ich fachową pomoc w cytometrii przepływowej. Pragniemy również podziękować Anne Saunderson i Lindsay Mock za ich pomoc w pozyskaniu tkanek ludzkich. Próbki tkanek serca ludzkiego, dorosłego i płodu zostały pobrane za pełną zgodą etyczną Komitetu ds. Etyki Badań Medycznych NHS Scotland Tayside oraz Komitetu Etyki Badań Naukowych NHS Lothian (REC08/S1101/1). Prace te były wspierane przez granty z Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children's Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP) oraz Henry J. Mankin Endowed Chair na Uniwersytecie w Pittsburghu (JH). Projekt otrzymał wsparcie w ramach programu kształcenia doktoranckiego British Heart Foundation Centre of Research Excellence (RE/08/001/23904). WC było częściowo wspierane przez stypendium przeddoktoranckie American Heart Association (11PRE7490001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw kulek przeciw myszom AbCSondy molekularneA-10344
Kolagenaza IGibco17100-017W razie potrzeby rozpuść proszek i wysterylizuj filtr
Kolagenaza IIGibco17101-015
Kolagenaza IVGibco17104-019
anty-ludzka CD34-PEBD Pharmingen555822Zachowaj sterylność
anty-ludzki CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833Utrzymuj sterylny
anty-ludzki CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747Utrzymuj sterylny
anty-ludzki CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Utrzymuj sterylny
anty-ludzki CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647Utrzymuj sterylność
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162Do pobierania komórek i hodowli do momentu przylegania
DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX bez pirogronianu soduThermoFischer Scientific10566-016
Surowica bydlęcapłodu ThermoFischer Scientific10500-064Zamrażać w porcjach i przechowywać w sterylnej
ŻelatynaSigma AldrichG1393Rozcieńczyć sterylną wodą
IgG1k-PEBD Pharmingen559320Zachowaj sterylność
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873Zachowaj sterylność
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen557872Zachowaj sterylność
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Zachowaj sterylność
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647Zachowaj sterylność
Serum dla myszySigma AldrichM5905Keep sterylna
folia parafinowa - Parafilm MSigma AldrichP7793
Penicylina-StreptomycynaGibco15979-063Zamrozić w porcjach i zachować sterylne
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4ThermoFischer Scientific10010-023Utrzymuj sterylny
bufor lizujący czerwone krwinki Hybri-MaxSigma AldrichR7757Utrzymuj sterylny
trypan Niebieski roztwórSigma AldrichT8154
Trypsyna-EDTA 0,5%(10x)Witamina15400-054
  FACSARIA FUSIONBD PharmingenAktywowany fluorescencją sortownik komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Perivascular Precursor CellsCardiac Tissue IsolationFluorescent Activated Cell SortingCD146 CD34 MarkersTissue Digestion ProtocolCell Strainer FiltrationFlow Cytometry AnalysisCell Viability AssessmentMyocardial Progenitor CellsCell Surface Markers

Powiązane artykuły