Zebraliśmy, wybarwiliśmy i zobrazowaliśmy komórki z spojówki wewnętrznej krawędzi powieki u ludzi. Charakteryzując morfologię komórek i aktywność metaboliczną, metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat suchego oka i roli, jaką tarcie między powierzchniami oka może odgrywać w odczuwaniu dyskomfortu ocznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Cytologia wyciskowa obszaru wycieraczki pokrywy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje niewiele doniesień na temat anatomii komórkowej obszaru wycieraczki powiek (LW) wewnętrznej powieki i tylko jeden raport wykorzystuje metody cytologiczne. W pracy opisano optymalizację metody pobierania, barwienia i obrazowania komórek z regionu LW za pomocą cytologii wyciskowej (IC). Komórki są pobierane z wewnętrznej powierzchni górnej powieki ludzi za pomocą hydrofilowych membran z politetrafluoroetylenu (PTFE) i barwione barwnikami cytologicznymi w celu ujawnienia obecności komórek kubkowych, mucyn, jąder komórkowych oraz różnych stopni pre- i parakeratynizacji. Barwniki immunocytochemiczne wykazują aktywność esterazy komórkowej i uszkodzone błony komórkowe przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Dla każdej próbki rejestrowanych jest do 100 mikroskopijnych obrazów cyfrowych i łączonych w wielkoskalowy obraz o wysokiej rozdzielczości całego zakresu układu scalonego. Wykazujemy wyższą czułość IC niż zgłaszano wcześniej, odpowiednią do identyfikacji morfologii komórkowych i aktywności metabolicznej w obszarze LW. O ile nam wiadomo, jest to pierwszy raz, kiedy ten wybór barwników fluorescencyjnych został użyty do obrazowania membran LW IC. Protokół ten będzie skuteczny w przyszłych badaniach mających na celu ujawnienie nieudokumentowanych szczegółów obszaru LW, takich jak ocena specyfiki komórkowej osób noszących soczewki kontaktowe lub pacjentów z zespołem suchego oka lub nabłonkiem wycieraczek powiek.
Wprowadzenie
Ludzka górna powieka wykonuje około 10 000 mrugnięć dziennie1, z zaledwie 1 - 2 mm wąskim obszarem spojówki naprzeciwko gałki ocznej. Ze względu na ruch wycierania podczas mrugania, ta część marginesu pokrywy została nazwana obszarem2 "wycieraczki pokrywy". Zakłada się, że tarcie w tym obszarze zwiększa się podczas nawykowego mrugania, z powodu wycierania się pokrywy o kulę ziemską. Może to odgrywać znaczącą rolę w komforcie oczu. W szczególności osoby noszące soczewki kontaktowe odczuwają dyskomfort w oku i jest to jeden z głównych powodów zaprzestania noszenia soczewek3. Wykazano, że po umieszczeniu soczewki kontaktowej na oku zmienia się współczynnik tarcia między materiałem soczewki a powierzchnią oka4. Istnieją dowody sugerujące, że objawy suchości mogą być związane z tym zmienionym tarciem2,5,6.
To powiązanie może być również odzwierciedlone w klinicznie obserwowalnych zjawiskach, zwłaszcza w nabłonku wycieraczek powiek (LWE), zwanym również barwieniem górnego brzegu powieki (ULMS)6. LWE jest wczesnym objawem podrażnienia oczu i potencjalnym predyktorem zespołu suchego oka. Jest obserwowany i mierzony przez istotne zabarwienie górnych i dolnych obszarów brzegu powieki. Podczas gdy ten system klasyfikacji2 i jego trafność kliniczna (tj. korelacja z subiektywnymi objawami) są nadal przedmiotem dyskusji, dyskomfort oczny pozostaje zagadką zarówno dla klinicystów, jak i naukowców, a co najważniejsze, niedogodnością dla pacjentów.
Do tej pory niewiele wiadomo na temat klinicznie istotnych zmian w (sub)komórkowej anatomii i fizjologii obszaru wycieraczek pokrywy7 i tylko jeden raport wykorzystuje metody cytologiczne8. Cytologia wyciskowa (IC) jest stosowana od ponad 40 lat do pobierania komórek z powierzchni nabłonka spojówki opuszkowej lub stępu poprzez zastosowanie błony9,10. Po usunięciu przylegające komórki poddawane są barwieniu cytologicznemu i obrazowaniu mikroskopowemu. Ze względu na różnice anatomiczne i komórkowe w obszarze wycieraczek pokrywy, technika ta wymaga optymalizacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Przed pobraniem komórek od ludzi, musi być uzyskana świadoma zgoda i zgoda etyczna.
1. Przygotuj plamę
UWAGA: Przygotuj plamę w dniu eksperymentu.
- Dodać 5 μl etydyny (lub 4 μM) i 5 μl kalceiny AM (lub 4 μM) do 2,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w 15 ml probówce wirówkowej; wymieszać. Zawiń w folię aluminiową, aby chronić przed światłem i przechowuj w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
2. Zbieraj komórki
- Wyjąć wkładki z hodowli komórkowych z opakowania i oznaczyć etykietą każdą powiekę, z której ma być pobierana próbka. Zaznacz orientację pobierania komórek z boku plastikowego uchwytu membrany za pomocą trwałego markera. Przeprowadź inspekcję lampy szczelinowej przy umiarkowanym powiększeniu (około 20X), aby potwierdzić odpowiedni stan zdrowia obszaru do poddania IC.
- Dozuj jedną kroplę środka znieczulającego miejscowo (0,5% chlorowodorku proparakainy) do dolnego worka spojówkowego każdego oka i poinstruuj uczestnika, aby trzymał oczy zamknięte przez jedną minutę.
- Każdą górną powiekę powieki i przytrzymaj na miejscu przez rzęsy; unikaj kontaktu z obszarem wycieraczki powieki.
Fakultatywnie: do wykonania tego kroku może być wymagana pomoc dodatkowego badacza. - Nałóż membranę prostopadle na środkową część obszaru wycieraczki pokrywy z minimalnym naciskiem.
- Przytrzymaj membranę na miejscu przez 3 - 5 sekund. Obserwuj, jak membrana staje się przezroczysta w obszarze kontaktu. W tym momencie delikatnie zdejmij membranę i pozwól, aby pokrywa uczestnika "odwróciła się" z powrotem na miejsce.
- Niezwłocznie nanieść jedną kroplę PBS na próbkę, aby zapobiec jej wyschnięciu. Membrana stanie się półprzezroczysta i w żadnym momencie nie powinna stać się nieprzezroczysta, ponieważ oznacza to wyschnięcie. Drugi badacz powinien niezwłocznie przystąpić do przetwarzania próbek (sekcja 3).
- Przeprowadź końcowe badanie wzroku, aby zapewnić integralność spojówki. Dozuj lubrykanty do oczu i poinstruuj uczestnika, aby unikał pocierania oczu, dopóki efekt znieczulenia nie zniknie (ok. 15 min).
3. Przetwarzanie próbek
- Za pomocą mikronożyczek przeciąć membranę na pół (po jednej połowie dla każdej z dalszych analiz), prostopadle do środka kolekcji komórek. Przeciąć wzdłuż zewnętrznego brzegu jednej połowy membrany, aby oddzielić ją od plastikowego uchwytu; Unikaj interakcji z zebranymi komórkami na błonie, w tym upewniając się, że błona nie składa się na siebie.
- Zabezpiecz membranę za pomocą pęsety przed całkowitym odłączeniem od uchwytu. Umieścić membranę w oznakowanej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 500 μl etanolu o stężeniu 95% (v/v) i pozostawić do utwardzenia na minimum 20 minut do maksimum 2 godzin przed przetworzeniem (sekcja 4.2).
- Natychmiast oddzielić drugą połowę membrany (zgodnie z opisem w sekcji 3.2) i niezwłocznie przejść do sekcji 4.1.
4. Barwienie próbki
- Barwienie immunocytochemiczne
- Ostrożnie umieść membranę w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem o średnicy 35 mm stroną zbiorczą skierowaną w dół; upewnij się, że membrana jest płaska.
- Odpipetować 20 μl immunocytochemicznej kompozycji barwiącej zebranej w sekcji 1 na membranie. Jeśli próbka zwija się do góry, użyj jednorazowych końcówek pipet, aby ostrożnie spłaszczyć membranę, dociskając jej krawędzie w dół. Unikaj kontaktu z miejscami pobierania komórek.
- Delikatnie przykryj membranę szkiełkiem nakrywkowym. Należy unikać niepotrzebnego przemieszczania próbki. Przykryj naczynie pokrywką i uszczelnij folią laboratoryjną wokół krawędzi. Nie zasłaniaj przezroczystości naczynia (na górze i na dole) i widoczności próbki. Etykieta za pomocą markera laboratoryjnego.
- Natychmiast należy przystąpić do obrazowania (punkt 5.1), a następnie powrócić do punktu 4.2, aby kontynuować barwienie cytologiczne drugiej połowy błony.
- Barwienie cytologiczne
- Stopniowo nawilżać membranę, powoli dodając 500 μl wody destylowanej do probówki używanej do utrwalania w sekcji 3.4. Odessać zawartość kilka razy do końcówki pipety, aby wymieszać, a następnie usunąć zawartość.
- Dodać 500 μl wody destylowanej. Odstawić na kilka sekund, a następnie wyjąć. Dodaj 500 μl barwnika Alcian Blue i pozostaw na 3 minuty. Usuń plamę i wykonaj 3 kolejne płukania wodą destylowaną o objętości 500 μl lub do momentu, aż płyn będzie czysty.
- Dodaj 500 μl barwnika Hematoxylin #1 i pozostaw na 3 min. Usuń plamę i wykonaj trzy kolejne płukania wodą destylowaną po 500 μl lub do momentu, aż płyn się wypłucze. Odwodnić (odwrócenie ppkt 4.2.1) poprzez zassanie klarownej cieczy.
- Dodaj 500 μl barwnika Papanicolaou OG-6 i pozostaw na 3 minuty. Usuń plamę i wykonaj jedno płukanie etanolem o stężeniu 500 μl 95% (v/v).
- Dodaj 500 μl bejcy Papanicolaou EA-65 i pozostaw na 3 min. Usuń plamę i wykonaj 3 kolejne płukania etanolem po 500 μl 95% (v/v).
- Całkowicie odwodnij się za pomocą trzech kolejnych płukań 500 μl 100% etanolu. Za pomocą pęsety usuń próbkę z roztworu; Unikaj dotykania obszarów pobierania komórek.
- Umieść membranę na szkiełku podstawowym; upewnij się, że linia pobierania komórek jest równoległa lub prostopadła do marginesu szkiełka, aby ułatwić wyrównanie podczas obrazowania.
- Nałóż kroplę 100% etanolu i przykryj szkiełkiem. Natychmiast należy przystąpić do obrazowania (punkt 5.2).
5. Obrazowanie próbki
- Obrazowanie fluorescencyjnych barwników immunocytochemicznych
- Należy użyć konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM)11 lub mikroskopu fluorescencyjnego12, wyposażonego w kolorową kamerę cyfrową, podłączonego do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do akwizycji obrazu. Ze względu na to, że próbki znajdują się w szalkach hodowlanych, może być konieczny mikroskop odwrócony.
- Ustawić mikroskop11,12 zgodnie z widmami absorpcyjnymi i emisyjnymi homodimeru etydyny-1 (maksima 528/617 nm Ex/Em w obecności DNA) i kalceiny AM (maksima 494/517 nm Ex/Em).
- Wybierz najmniejsze powiększenie mikroskopu (np. obiektyw 2,5x) i aktywuj cyfrowy system obrazowania; obserwuj próbkę wyświetlaną na monitorze komputera.
- Sprawdź próbkę pod kątem interesujących Cię funkcji komórkowych.
- Wybierz żądane powiększenie mikroskopu i uzyskaj obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania.
- Pliki można zapisywać w natywnym formacie pliku mikroskopu lub w formacie pliku nieskompresowanego (np. *.raw, *.tiff).
- Obrazowanie barwień cytologicznych
- Użyj standardowego laboratoryjnego mikroskopu jasnego pola bez filtrów, wyposażonego w kolorową kamerę cyfrową, podłączonego do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do akwizycji obrazu.
- Umieść i zablokuj szkiełko podstawowe (od kroku 4.2.8) na stoliku mikroskopowym. W razie potrzeby należy ponownie uwodnić próbkę 100% etanolem przez cały czas trwania procedury obrazowania.
- Wybierz najmniejsze powiększenie mikroskopu (np. obiektyw 2,5x) i aktywuj cyfrowy system obrazowania; obserwuj próbkę wyświetlaną na monitorze komputera.
- Upewnij się, że pobieranie komórek jest wyrównane z osią X lub Y sterowania stolikiem mikroskopu. W razie potrzeby wyregulować, zdejmując szkiełko nakrywkowe i obracając próbkę za pomocą końcówki pipety lub pęsety.
- Korzystając z oprogramowania do obrazowania, uchwyć obraz (obrazy) całej próbki przy najmniejszym powiększeniu mikroskopu.
- Przełącz się na umiarkowane powiększenie mikroskopu (np. obiektyw 10-20x) i dostosuj parametry obrazowania źródła światła mikroskopu oraz oprogramowania (ekspozycja, kontrast, balans bieli itp.), a także wyłącz ich automatyczny pomiar programowy. Zapisz te ustawienia do wykorzystania w przyszłości.
- Określ punkt początkowy i końcowy skanowania (np. lewy górny i prawy dolny róg kolekcji komórek).
- Korzystając z oprogramowania do obrazowania, uchwyć obraz (obrazy) całego obszaru pobierania komórek w punktach początkowych i końcowych. Upewnij się, że wszystkie sąsiednie obrazy nakładają się na siebie w 20% z boku na bok i od góry do dołu.
- Zapisywanie plików w natywnym formacie pliku mikroskopu lub w nieskompresowanym formacie pliku (np. *.raw, *.tiff).
- Wygeneruj ostateczny obraz panoramiczny za pomocą wybranego oprogramowania do automatycznego łączenia (np. Adobe Photoshop Elements). Użyj obrazów referencyjnych wykonanych w kroku 5.2.5), aby potwierdzić dokładność automatycznego łączenia w końcowym obrazie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Membrana do hodowli komórkowych rozpięta na plastikowym uchwycie jest wygodnym narzędziem do ręcznego pobierania komórek nabłonkowych z spojówki w obszarze kontaktu powieki z gałką oczną. Metoda ta eliminuje potrzebę stosowania dodatkowych sterylizowanych instrumentów, zazwyczaj używanych do przygotowania i manipulowania membranami IC. Rysunek 1 przedstawia IC w obszarze kontaktu powieki z gałką oczną z wykorzystaniem insertu do hodowli komórkowej. Zoptymalizowano dwa róż...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Cytologia wyciskowa jest zwykle wykonywana na spojówce opuszkowej, przy użyciu mieszanych błon estrów celulozy. Próbki są cięte na wymiar z arkuszy materiałów sypkich, sterylizowane, nakładane i usuwane z powierzchni spojówki za pomocą kleszczy. Wykorzystując ten sam materiał membrany, niedawno zaprojektowano sterowane tłokiem urządzenie IC, aby dopasować się do geometrii powierzchni spojówki opuszkowej i utrzymać stałe ciśnienie między aplikacjami13. Podejścia te są nieefektywne w przypadku wąskiego, wyraźnie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych istotnych funduszy ani konfliktów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować naszemu koledze dr Jalaiah Varikooty, który dostarczył wglądu i ekspertyzy na temat wycieraczek do pokryw, co bardzo pomogło w tych badaniach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue, 1% w 3% kwasie octowym | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoksylina, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Barwnik Papanicolaou, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Barwnik Papanicolaou, Zmodyfikowany EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Żywa/martwa żywość/Cytotoksyczność Zestaw | Life Technologies | L-3224 | zawiera etydynę homodimer-1 i barwniki Calcein AM |
| Alkaina (0,5% chlorowodorek proparakainy) | Wkładka | ||
| Millicell, 12 mm, hydrofilowy PTFE, 0.4 &mikro; m | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Naczynia ze szklanym dnem 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Bibliografia
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
