Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

Podsumowanie

Ten manuskrypt zawiera procedurę techniczną, która może być użyta do scharakteryzowania hodowli komórek C1498 in vitro oraz ostrej białaczki wywołanej u myszy po ich wstrzyknięciu. Analizy fenotypowe i funkcjonalne wykonywane są za pomocą cytometrii przepływowej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, cytochemii i barwienia Maya-Grünwalda Giemsy.

Streszczenie

Dożylne wstrzykiwanie komórek C1498 myszom syngenicznym lub kongenicznym jest wykonywane od 1941 roku. Zastrzyki te powodują rozwój ostrej białaczki. Jednak charakter tej choroby nie został dobrze udokumentowany w literaturze. W tym miejscu przedstawiamy protokół techniczny do charakteryzowania komórek C1498 in vitro i określania charakteru indukowanej białaczki in vivo. Pierwsza część tej procedury koncentruje się na określeniu linii krwiotwórczej i stadium różnicowania hodowanych komórek C1498. Aby to osiągnąć, stosuje się wieloparametryczne barwienie cytometryczne przepływowe do wykrywania markerów komórek krwiotwórczych. Następnie przeprowadza się mikroskopię immunofluorescencyjną, cytochemię i barwienie Maya-Grünwalda Giemsy w celu oceny ekspresji mieloperoksydazy, aktywności esterazy i morfologii komórki. Druga część tego protokołu poświęcona jest opisowi choroby białaczkowej, która jest wywoływana in vivo. To ostatnie można osiągnąć, określając częstość występowania komórek białaczkowych i wrodzonych we krwi, narządach krwiotwórczych (np. szpiku kostnym i śledzionie) oraz tkankach nielimfatycznych (np. wątrobie i płucach) za pomocą specyficznych analiz barwienia i cytometrii przepływowej. Charakter białaczki jest następnie potwierdzany za pomocą barwienia Maya-Grünwalda Giemsy i barwienia dla określonych esterazy w szpiku kostnym. Tutaj przedstawiamy wyniki, które uzyskano przy użyciu tego protokołu u myszy z wstrzyknięciem C1498 i PBS w dopasowanym wieku.

Wprowadzenie

Ostra białaczka szpikowa (AML) charakteryzuje się niekontrolowaną proliferacją krwiotwórczych komórek szpikowych, które są blokowane na różnych etapach dojrzewania. Ta dysregulacja może wpływać na szlaki różnicowania granulocytarnego, monocytowego, erytrocytarnego lub megaryocytarnego¹. Komórki AML gromadzą się w szpiku kostnym, co prowadzi do upośledzenia hematopoezy, co skutkuje trombopenią, limfopenią i niedokrwistością. Komórki białaczkowe atakują również krew i narządy nielimfoidalne.

Model myszy C1498 był używany przez dziesięciolecia jako model ostrej białaczki, odkąd komórki rakowe zostały wyizolowane z białaczki 10-miesięcznej myszy C57BL/6 (H-2^b) w 1941 roku. Literatura opisuje inwazję do krwi, narządów krwiotwórczych (np. śledziony i węzłów chłonnych) i narządów niekrwiotwórczych (np. wątroby, płuc, jajników i nerek) przez wysoce proliferacyjne komórki C1498 po ich wstrzyknięciu drogą dożylną, podskórną lub dootrzewnową do podatnych myszy^2-4. Jednak doniesiono, że ten model mysi indukuje białaczkę granulocytarną^2,5 lub mielomonocytarną⁶. Niedawno badanie opublikowane w 2002 roku opisało ten typ raka jako mysią białaczkę z komórek NKT⁷. W związku z tym literatura różni się co do charakteru tej linii komórkowej C1498 i związanej z nią białaczki, którą wywołuje u myszy. Rozbieżności te wynikają głównie z braku szczegółowych i aktualnych opublikowanych informacji na temat komórek i ogólnie choroby białaczkowej, ponieważ wiele badań przeprowadzono w latach 1950-70.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół opisujący, jak scharakteryzować komórki C1498 i przeanalizować naturę choroby białaczkowej, która jest wywoływana przez ich dożylne wstrzyknięcie myszom. Pierwsza sekcja tego protokołu poświęcona jest opisowi komórek C1498, które zostały wyhodowane in vitro. Przeciwciała fluorescencyjne skierowane przeciwko powierzchniowym i wewnątrzkomórkowym markerom krwiotwórczym wykorzystano do określenia ich fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej. Obecność mieloperoksydazy oceniano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, ich linię krwiotwórczą i stopień różnicowania oceniano za pomocą cytochemii w celu oceny aktywności esterazy oraz przeprowadzono barwienie Maya-Grünwalda Giemsa. Komórki C1498 zostały następnie wstrzyknięte myszom, a wywołana ostra białaczka została opisana w drugiej części tego manuskryptu. Te same techniki zastosowano do określenia częstości występowania i fenotypów komórek białaczkowych i wrodzonych w szpiku kostnym, krwi obwodowej, śledzionie i narządach niekrwiotwórczych (wątroba i płuca).

Ten protokół jest wysoce powtarzalny, a przedstawione tutaj dane pomogą badaczom ocenić efekty nowych strategii terapeutycznych. Ten mysi model białaczki został już wykorzystany do testowania podejść do immunoterapii i różnych chemioterapeutyków przeciwnowotworowych^8,9. Ich skuteczność oceniano, określając ewolucję obciążenia guzem i wskaźników przeżycia. Protokół ten może być wykorzystany do dostarczenia dodatkowych informacji na temat rozmieszczenia i utrzymania populacji komórek białaczkowych i innych komórek krwiotwórczych podczas leczenia.

Protokół

Pomieszczenia dla zwierząt i wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyczną ds. Opieki nad Zwierzętami w Europie Środkowo-Wschodniej. NPDC (umowa nr 512012), a wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z francuskimi i europejskimi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Charakterystyka in vitro linii komórkowej C1498

1. Hodowla in vitro komórek C1498
   1. Przygotuj kompletną pożywkę RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny (100 U/ml)-streptomycyny (100 μg/ml), 500 μl 50 mM β-merkaptoetanolu, 5 ml kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES), 5 ml aminokwasów endogennych i 5 ml pirogronianu sodu do 500 ml pożywki RPMI.
   2. Rozwijaj linię komórkową C1498 w pełnym RPMI. Pobrać komórki w zawiesinie przez pipetowanie i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 350 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.
   3. Dodać 20 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1x), odwirować przy 350 x g przez 10 minut i usunąć sklarowany nad osadem.
   4. Zawiesić komórki w 10 ml buforu sortownika komórek aktywowanego fluorescencją (FAC) (2,5 g albuminy surowicy bydlęcej w proszku (BSA) i 2 ml 0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 500 ml roztworu PBS). Policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek Thoma po zabarwieniu komórek błękitem trypanowym.
2. Charakterystyka fenotypowa linii komórkowej C1498 z wykorzystaniem barwienia immunologicznego i analizy cytometrii przepływowej
   1. Barwienie powierzchni komórek
      1. Przygotuj bufor FAC.
      2. Dostosuj zebrane komórki w buforze FAC do 10⁷ komórek/ml i dozuj 10⁶ komórek (w 100 μl) dla każdego eksperymentu barwienia do probówek do cytometrii przepływowej.
      3. Oznaczyć komórki 100 μl następujących przeciwciał lub związanych z nimi kontroli izotypowych rozcieńczonych w buforze FAC:
         1. W przypadku markerów komórek prekursorowych i zróżnicowanych oznacz komórki przeciwciałami anty-CD11b / anty-CD18 (1), anty-Ly-6G (1), anty-CD19, anty-B220 (2), anty-NK1.1, anty-CD49b, anty-CD4 (1), anty-CD8 (2), anty-CD3 (3), anty-CD21/35, anty-CD115 i anty-TCRVβ.
         2. W przypadku markerów hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych należy zastosować kombinację samych przeciwciał anty-CD34 / anty-CD117 / anty-Sca-1, anty-CD150 / anty-CD117 / anty-Sca-1, anty-CD117 / anty-CD127 lub anty-CD16 / 32-biotyny.
         3. W przypadku markerów funkcji komórek (np. adhezji, prezentacji antygenu, cząsteczek i receptorów kostymulujących) wybarwić komórki przeciwciałami anty-CD18 (2)/anty-CD11a, anty-MHC klasy I, anty-MHC klasy II, anty-CD31, anty-CD44, anty-CD80-biotyny, anty-CD86 i anty-CD274.
      4. Inkubować wszystkie probówki do cytometrii przepływowej w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      5. Przemyć komórki dwukrotnie, dodając 2 ml buforu FAC do każdej probówki, odwirować przy 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      6. Dodać 100 μl buforu FAC do każdej probówki i przystąpić do barwienia wtórnego, dodając 100 μl fluorescencyjnego streptawidyny (1/100 w buforze FAC do końcowego rozcieńczenia 1:200) do przeciwciał sprzężonych z biotynylem. Inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      7. Przemyć komórki dwukrotnie w następujący sposób: dodać 2 ml buforu FAC do każdej probówki, odwirować probówki o stężeniu 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant przez pipetowanie.
      8. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl zimnego PBS i umieścić komórki na lodzie, utrzymując je w ciemności, używając folii aluminiowej do przykrycia probówek. Przeanalizuj wyniki za pomocą cytometru¹⁰.
   2. Barwienie wewnątrzkomórkowe
      1. Przygotować bufor utrwalający, dodając 125 ml 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) do 375 ml roztworu PBS.
         UWAGA: Aby przygotować 500 ml 4% PFA, podgrzej 400 ml roztworu PBS do około 60 °C na płytce mieszającej w wentylowanym okapie. Dodać 20 g proszku PFA i podnosić pH, aż PFA się rozpuści. Pozostawić roztwór do ostygnięcia, dostosować pH do 6,9 i uzupełnić objętość do 500 ml za pomocą PBS.
      2. Przygotować bufor przepuszczalny, dodając 0,5 g saponiny i 0,5 g BSA do 500 ml roztworu PBS.
      3. Dostosuj zebrane komórki w buforze FAC do 10-7 komórek/ml i rozprowadź 10-6 komórek (100 μl) dla każdego eksperymentu barwienia do probówek do cytometrii przepływowej. Odwirować komórki przy sile 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      4. Umieścić komórki w 200 μl 1% roztworu PFA i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Do każdej probówki dodać 2 ml buforu przepuszczalnego, odwirować probówki o stężeniu 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant przez pipetowanie. Do każdej probówki dodać 100 μl buforu przepuszczalnego.
      6. Oznaczyć komórki 100 μl następujących przeciwciał lub odpowiadających im kontrolnych izotypów po rozcieńczeniu ich w buforze permeabilizującym: anty-CD3 (2)/anty-CD8 (1), anty-CD3 (3)/anty-CD4 (2), anty-CD107b i anty-CD3 (3)/anty-TCRVβ.
      7. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      8. Przemyć komórki dwukrotnie, dodając 2 ml buforu przepuszczalnego do każdej probówki. Odwirować probówki o sile 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      9. Dodać 100 μl buforu przepuszczalnego do komórek. Przejdź do barwienia wtórnego, dodając 100 μl fluorescencyjnej streptawidyny rozcieńczonej w buforze permeabilizującym do przeciwciał sprzężonych z biotynylacją. Inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      10. Do każdej probówki dodać 2 ml buforu przepuszczalnego, odwirować probówki o stężeniu 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz ten krok jeszcze raz.
      11. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl zimnego PBS, a następnie umieścić komórki na lodzie w ciemności. Przeanalizuj wyniki za pomocą cytometru przepływowego¹⁰.
3. Przygotowanie zawiesiny komórek na szkiełkach do mikroskopii
   1. Przepłukać 10⁶ zebranych komórek C1498 (otrzymanych w kroku 1.1.4) dwukrotnie 5 ml zimnego buforu FAC i rozcieńczyć komórki w 1 ml zimnego buforu FAC. Umieść probówki na lodzie.
   2. Umieść szkiełka w jednorazowych komorach z dołączonymi kartami filtracyjnymi i umieść je w cytowirówce.
   3. Dodać 100 μl buforu FAC do każdej komory i karty filtrującej, a następnie obracać je przez 2 minuty w temperaturze 4,52 x g.
   4. Dodać 100 μl komórek do każdej komory i karty filtracyjnej, a następnie wirować komórki w temperaturze 4,52 x g przez 2 minuty.
   5. Ostrożnie wyjmij szkiełka z komór i wysusz je na powietrzu przed zabarwieniem ich mieloperoksydazą (krok 1.4), esterazy (krok 1.5) lub May-Grünwald Giemsa (krok 1.6).
4. Barwienie mieloperoksydazą w celu immunofluorescencji
   1. Zamocuj komórki na szkiełkach, zanurzając je w zimnym roztworze metanolu:acetonu (1:1) na 2 minuty, a następnie wysusz szkiełka na powietrzu.
   2. Aby ograniczyć ciecz do obszaru szkiełka zawierającego komórki, narysuj okrąg wokół komórek za pomocą wodoodpornego pisaka.
   3. Przepłukać komórki w 200 μl zimnego roztworu PBS przez 10 minut.
   4. Zablokuj komórki w 200 μl 3% buforu BSA/PBS zawierającego 10 μl normalnej surowicy osła i 10 μg/ml oczyszczonych przeciwciał anty-CD16/32.
   5. Zastosować 200 μl mysiej mieloperoksydazy (rozcieńczonej do 20 μg/ml w 3% buforze BSA/PBS). Inkubować komórki O/N w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej.
   6. Umyj ogniwa 200 μl zimnego 0,1% BSA/PBS.
   7. Zastosować 200 μl przeciwciał anty-kozich IgG rozcieńczonych w stosunku 1/250 w 3% buforze BSA/PBS. Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.
   8. Przemyć komórki 3 razy 200 μl 0,1% buforu BSA/PBS i dwukrotnie w zimnym PBS.
   9. Wybarwić jądra komórkowe 200 μl Hoechst rozcieńczonego w stosunku 1/1000 w PBS (do końcowego stężenia 1 μg/ml) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   10. Umyj szkiełka wodą i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przed montażem. Nanieś jedną kroplę podłoża montażowego 1 na komórki, umieść jedną krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i ostrożnie opuść ją na komórki za pomocą kleszczy. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
5. Cytochemia esterazy
   Uwaga: Podgrzej wszystkie odczynniki do temperatury rzeczywistej.
   1. Przygotowanie utrwalacza
      1. Aby przygotować roztwór cytrynianu-acetonu-formaldehydu (CAF), dodaj 2,5 ml roztworu cytrynianu, 6,5 ml acetonu i 0,8 ml 37% formaldehydu do szklanej butelki. Delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Test aktywności esterazy chlorooctanu naftolu AS-D (CAE)
      1. Podgrzej wodę dejonizowaną do 37 °C.
      2. W probówce o pojemności 50 ml dodać 1 ml roztworu azotynu sodu do 1 ml roztworu barwnika. Delikatnie wymieszaj i odstaw na 2 minuty. Dodać 40 ml wstępnie podgrzanej wody dejonizowanej, 5 ml koncentratu buforowego o pH 6,3 i 1 ml roztworu chlorooctanu naftolu AS-D. Wymieszaj i przełóż do słoika Coplin.
      3. Umieścić komórki na szkiełkach podstawowych (patrz sekcja 1.3) przez 30 sekund roztworem CAF (patrz krok 1.5.1.1) i myć szkiełka przez 45 sekund wodą dejonizowaną.
      4. Przenieść szkiełka do roztworu, który został przygotowany w kroku 1.5.2.2 i inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C przez 30 minut w komorze wilgotnościowej chronionej przed światłem.
      5. Wysuszyć szkiełka, a następnie opłukać je przez zanurzenie w wodzie dejonizowanej na 2 minuty.
      6. Przeciwbarwić komórki, dodając kilka kropli roztworu Hematoksyliny i inkubując je przez 1 minutę.
      7. Umyj szkiełka neutralną wodą (pH 7) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Nanieś jedną kroplę podłoża montażowego 2 na komórki, umieść jedną krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i ostrożnie opuść ją na komórki za pomocą kleszczy. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
   3. Oznaczanie aktywności esterazy alfa-naftylomaślanu (NBE)
      1. Przed użyciem rozgrzać roztwór maślanu α-naftylu do temperatury 37 °C.
      2. Rozcieńczyć jedną tabletkę azotynu sodu w 6,25 ml wody dejonizowanej.
      3. Do probówki o pojemności 50 ml dodać 1,5 ml roztworu azotynu sodu w tabletkach i 1,5 ml roztworu pararozaniliny. Delikatnie wymieszaj i odstaw roztwór na 5 minut. Uzupełnić roztwór 40 ml roztworu buforowanego fosforanem. Doprowadzić do pH 6, ostrożnie dodając kroplami 10 N NaOH. Dodać 5 ml roztworu maślanu α-naftylu, wymieszać cały roztwór i przenieść do słoika Coplin.
      4. Umieść komórki na szkiełkach na 10 sekund za pomocą roztworu CAF w temperaturze pokojowej i płucz przez 45 sekund wodą dejonizowaną.
      5. Przenieść szkiełka do słoika Coplin zawierającego roztwór, który został przygotowany w kroku 1.5.3.2 i inkubować razem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej, chroniąc je przed światłem.
      6. Płucz szkiełka przez 2 minuty w neutralnej wodzie (pH 7) i wysusz na powietrzu.
      7. Wybarwić komórki roztworem błękitu metylenowego, dodając kilka kropli na szkiełko i inkubować przez 4 minuty.
      8. Zanurz szkiełka w wodzie dejonizowanej na 2 minuty i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Aby zamontować szkiełka, nałóż jedną kroplę podłoża montażowego 2 na komórki, umieść jedną krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i ostrożnie opuść ją na komórki za pomocą kleszczy. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
6. Barwienie May-Grünwald Giemsa (MGG)
   1. Wybarwić komórki (przygotowane w sekcji 1.3) zanurzając szkiełka w słoiku z kopliny zawierającym roztwór Maya-Grünwalda na 3 minuty.
   2. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego roztwór buforowy o pH 6,8 na 1 minutę.
   3. Wybarwić szkiełka, umieszczając je w słoiku z kopliny zawierającym roztwór Giemsa R (rozcieńczony do 1/20 w roztworze buforowym o pH 6,8) na 10 minut. Myć szkiełka obojętną wodą (pH 7) przez 10 sekund.
   4. Odcedź i wysusz szkiełka na powietrzu. Zamontuj szkiełka, nakładając jedną kroplę medium montażowego 2 na ogniwa. Umieść jedną krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i ostrożnie opuść je na komórki za pomocą kleszczy. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

2. Rozwój i charakterystyka ostrej białaczki in vivo

UWAGA: Czterotygodniowe samice kongenicznych myszy C57BL / 6J-Ly5.1 utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów (tj. w sterylnym środowisku). Myszom wstrzyknięto, gdy miały od 5 do 6 tygodni

.

1. Wstrzyknięcie dożylne z komórkami C1498
   1. Zebrać wyhodowane komórki C1498 w zawiesinach przez pipetowanie. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 350 x g przez 10 minut. Przemyć komórki dwukrotnie w 10 ml zimnego PBS i przygotować zawiesinę komórek 10-7 komórek/ml w PBS. Przed wykonaniem wstrzyknięcia umieścić zawiesinę komórkową na lodzie.
   2. Umieścić mysz w ograniczniku i wykonać wstrzyknięcie w sterylnych warunkach w kapturze z przepływem laminarnym.
   3. Użyj igły 29G ze strzykawką, aby wstrzyknąć komórki do żyły ogonowej. Chwyć ogon na dystalnym końcu i zdezynfekuj go gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem. Sprawdź, czy w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie powoli wstrzyknij 100 μl zawiesiny komórek C1498 (10⁶ komórek) do żyły ogonowej.
   4. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy wyjąć igłę z ogonka i zatamować krwawienie, uciskając miejsce wstrzyknięcia jałową gąbką z gazy. Wróć zwierzę do klatki i dokładnie sprawdzaj jego stan zdrowia przez następne godziny i dni.
2. Retro orbitalne pobieranie krwi
   1. Monitoruj zachowanie myszy, którym wstrzyknięto PBS i C1498 pod kątem objawów choroby białaczkowej (np. piloerekcja, izolacja od grupy i zmniejszone ruchy w klatce lub ich brak).
      UWAGA: Zwykle dzieje się to od 17 do 19 dni po wstrzyknięciu komórek.
   2. Przeprowadzić retroorbitalne pobranie krwi tuż przed eutanazją (patrz krok 2.2.7) w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym i pod lampą grzewczą, aby zapobiec hipotermii.
   3. Do znieczulenia należy stosować ketaminę w dawce 150 mg/kg i ksylazynę w dawce 10 mg/kg. Przygotować roztwór znieczulający, rozcieńczając 1,5 ml ketaminy i 0,5 ml ksylazyny w 18 ml roztworu PBS.
   4. Znieczulij myszy kontrolne i białaczkowe. Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie 200 μl roztworu znieczulającego na 10 g myszy za pomocą igły 26 g i strzykawki o pojemności 1 ml. Sprawdź, czy nie ma utraty odruchu pedałowania, aby potwierdzić znieczulenie.
   5. Włóż rurkę kapilarną do przyśrodkowej kantu oka. Krew uniesie się z zatoki oczodołowej do rurki kapilarnej. Tamować krwawienie, delikatnie uciskając oko sterylną gąbką z gazy.
      UWAGA: Za pomocą tej techniki można pobrać objętość od 100 do 200 μl krwi.
   6. Zbierz krew do probówki EDTA i przechowuj próbkę na lodzie przed wyizolowaniem komórek jednojądrzastych.
   7. Poddać mysz eutanazji za pomocą zwichnięcia szyjki macicy i przystąp do izolacji narządów (punkt 2.3).
3. Izolacja narządów i komórek
   1. Izolacja narządów
      1. Umieść uśpioną mysz na plecach na plastikowej desce i użyj igieł, aby przypiąć stopy zwierzęcia, aby ułatwić izolację narządów. Zdezynfekuj mysz przy użyciu 70% etanolu przed wykonaniem nacięcia.
      2. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj brzuszne nacięcie od skóry brzucha do szyi. Przeciąć ścianę brzucha, aby uzyskać dostęp do wątroby. Przeciąć klatkę piersiową i przeponę, aby uzyskać dostęp do płuc. Przesuń jelito na bok i usuń śledzionę za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy.
      3. Aby wyizolować szpik kostny, odetnij nogi w górnej części kości udowej nad stawem za pomocą sterylnych nożyczek. Odłącz kość piszczelową od kości udowej, delikatnie pociągając, a następnie usuń skórę i mięśnie z kości za pomocą kleszczy i nożyczek.
      4. Umieścić każdy narząd i kość w probówce o pojemności 50 ml zawierającej zimny PBS i umieścić je na lodzie.
   2. Izolacja komórek z narządów
      1. Zważ śledzionę przed rozerwaniem komórek. Mechanicznie rozbić śledzionę, płuca i wątrobę, przeciskając je przez sitko o średnicy 70 μm za pomocą tłoka strzykawki w probówce o pojemności 50 ml, a następnie zebrać komórki do 30 ml zimnego PBS.
      2. Aby pobrać komórki szpiku kostnego, umieść kości udowe i piszczelowe na szalce Petriego na lodzie, przetnij kończyny za pomocą sterylnych nożyczek i wypłucz szpik kostny, wprowadzając igłę 26G dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml zawierającej 5 ml zimnego PBS.
         1. Rozbić komórki szpiku kostnego, przepuszczając zawiesinę komórkową przez igłę/strzykawkę, a następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 70 μm w probówce o pojemności 50 ml.
      3. Odwirować wszystkie probówki zawierające każdy z narządów i komórki szpiku kostnego w stężeniu 350 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki pobrane z płuc i szpiku kostnego w 2 ml buforu do lizy (1x), a komórki wyizolowane z wątroby i śledziony w 5 ml buforu do lizy (1x), delikatnie pipetując mieszaninę w górę i w dół. Napełnij probówki do 50 ml zimnym PBS.
      4. Odwirować komórki przy ciśnieniu 350 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w buforze FAC w celu analizy metodą cytometrii przepływowej lub przygotowania komórek do mikroskopii. Policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek Thoma po zabarwieniu ich błękitem trypanowym.
4. Barwienie powierzchni komórek wyizolowanych z narządów do analizy metodą cytometrii przepływowej
   1. W probówce do cytometrii przepływowej oznacz 10⁶ komórek, które wyizolowano z narządów, za pomocą 10 μg/ml oczyszczonych przeciwciał anty-CD16/32 w 100 μl buforu FAC.
   2. Do 10⁶ komórek szpiku kostnego dodać 100 μl następujących przeciwciał lub kombinacji przeciwciał i odpowiadających im kontroli izotypowych rozcieńczonych w buforze FAC: anty-CD11b/anty-CD3 (1)/anty-Ly6C/anty-Ly6G (2), anty-B220 (1)/anty-CD45.2/anty-CD19, anty-CD115/anty-CD3 (1)/anty-Ly6C/anty-Ly6G (2), anty-CD45.2, anty-Ly6G (2), anty-CD11b, anty-CD115 lub anty-CD19 dla ustawień kompensacji.
   3. Do splenocytów dodać 100 μl następujących przeciwciał i odpowiadających im kontrolek izotypowych rozcieńczonych w buforze FAC: kombinację anty-CD11b / anty-CD3 (1) / anty-Ly6C / anty-Ly6G (2), anty-B220 (1) / anty-CD45.2 / anty-CD19, anty-CD45.2, anty-Ly6G (2), anty-CD11b lub anty-CD19 dla ustawień kompensacji.
   4. Do komórek płuc i wątroby dodać 100 μl przeciwciał anty-CD45.2 i odpowiadającej im kontroli izotypowej rozcieńczonej w stosunku 1/100 w buforze FAC.
   5. Inkubować wszystkie roztwory komórkowe przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu FAC do każdej probówki. Odwirować probówki przez 5 minut przy sile 350 x g i wyrzucić supernatant przez pipetowanie. Powtórz ten krok jeszcze raz.
   7. Ponownie zawiesić znakowane komórki w 500 μl zimnego PBS. Utrzymuj komórki na lodzie i chroń przed światłem przed wykonaniem cytometrii przepływowej w celu akwizycji i analizy¹⁰.
5. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi i barwienie immunofluorescencyjne do analizy cytometrii przepływowej
   1. Przed rozpoczęciem protokołu należy wstępnie podgrzać roztwór separujący do temperatury regulowanej.
   2. Przenieść próbkę krwi (100-200 μl; otrzymaną z kroku 2.2) do probówki mikrowirówkowej i dodawać PBS/1 mM roztwór EDTA, aż objętość roztworu wyniesie 500 μl. Ostrożnie umieścić 500 μl roztworu oddzielającego pod roztworem zawierającym krew za pomocą igły 30G i strzykawki o pojemności 1 ml. Nie mieszać krwi z roztworem rozdzielającym.
   3. Odwirować probówki o sile 800 x g (bez hamulca) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu zebrać pierścień komórkowy (nieprzezroczystą białą warstwę) za pomocą pipety. Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Nieprzezroczysta biała warstwa zawiera limfocyty, a także monocyty i pojawia się między dolną warstwą - roztworem rozdzielającym - a górną warstwą.
   4. Dodać 1 ml roztworu PBS i odwirować probówkę o stężeniu 350 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w 600 μl buforu FAC.
   5. Dodać 10 μg/ml oczyszczonych przeciwciał anty-CD16/32 i rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej do sześciu oddzielnych probówek (po 100 μl każda).
   6. Oznacz komórki 100 μl następujących przeciwciał lub związanych z nimi kontroli izotypowych rozcieńczonych w buforze FAC: kombinacja anty-CD3 (1)/anty-B220(1)/anty-CD45.2 i anty-Ly6C/anty-CD115/anty-CD45.2 lub anty-CD45.2 i anty-CD115 w celu uzyskania ustawień kompensacji.
   7. Inkubować wszystkie probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
   8. Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu FAC do każdej probówki, a następnie odwirować probówki przez 10 minut przy sile 350 x g i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
   9. Ponownie zawiesić znakowane komórki w 500 μl zimnego PBS. Utrzymuj komórki na lodzie i chroń przed światłem przed wykonaniem akwizycji i analizy cytometrii przepływowej¹⁰.
6. Przygotowanie zawiesin komórek szpiku kostnego na szkiełkach podstawowych do mikroskopii
   1. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1.3, ale w kroku 1.3.1 użyj 10⁵ komórek szpiku kostnego, a w kroku 1.3.4 wiruj komórki w każdej komorze w temperaturze 72,26 x g przez 10 minut.
7. Oznaczanie aktywności esterazy z wykorzystaniem komórek szpiku kostnego
   1. Aby wykonać testy cytochemiczne esterazy szpiku kostnego, należy przejść od kroków 1.5 do 1.5.3.7.
8. Barwienie komórek szpiku kostnego metodą Maya-Grünwalda Giemsa
   1. W celu barwienia komórek szpiku kostnego należy postępować zgodnie z protokołem opisanym w punkcie 1.6, ale w kroku 1.6.1 inkubować szkiełka w roztworze Maya-Grünwalda przez 5 minut.

Wyniki

Aby scharakteryzować mysi model C1498, przeprowadzono dwa główne etapy. Po pierwsze, scharakteryzowano komórki C1498 w celu określenia ich linii hematopoetycznej oraz stopnia dojrzewania in vitro (Rycina 1). Następnie komórki te wstrzyknięto myszom kongenicznym, a charakter indukowanej choroby białaczkowej oceniono pod kątem różnych cech: infiltracji komórek białaczkowych, ich fenotypu, ilości komórek hematopoetycznych (dojrzałych oraz progenitorów/prekursorów) w szpiku kostnym, częstości występowania komórek C1498 i dojrzałych komórek hematopoetycznych we krwi oraz oceny obrzęku narządów (śledziony, wątroby i płuc) i ich składu komórkowego.

W celu charakterystyki fenotypów komórek C1498 in vitro, komórki znakowano przeciwciałami skierowanymi przeciwko cząsteczkom wyrazanym przez prekursory hematopoetyczne i dojrzałe komórki (Tabela 1), a wyniki analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej. Komórki C1498 wykazano jako dodatnie pod względem ekspresji powierzchniowej Mac-1 (CD11b/CD18) (∼ 7%), B220 (> 25%), a także stwierdzono ich wewnątrzkomórkową ekspresję CD3ε, łańcuchów Vβ receptora komórek T (TCR) oraz Mac-3 (Ryc. 2A i B). Komórki były ujemne pod kątem markerów powierzchniowych Ly6G, Ly6C, CD115, CD21/CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 i cząsteczek pan-NK, a także pod kątem wewnątrzkomórkowej ekspresji CD4 i CD8 (dane nie pokazano). Następnie sprawdzono obecność markerów komórek macierzystych i progenitorów hematopoetycznych (Tabela 1). Wykazano również brak ekspresji powierzchniowej CD117, CD34, Sca-1, CD150 i CD16/32 (dane nie pokazano). Następnie badano te komórki białaczkowe w celu określenia ekspresji cząsteczek adhezyjnych, prezentacji antygenu i cząsteczek kostymulujących. Komórki wykazano jako dodatnie dla markerów powierzchniowych LFA-1 (CD11a/CD18), CD44, CD31 (PECAM-1) oraz H-2D^b , natomiast były ujemne dla MHC klasy II, CD80, CD86 i CD274 (dane nie pokazano). Komórki C1498 wyrazowały zatem zarówno markery mieloidalne (Mac-1, Mac-3), jak i limfoidalne (B220, CD3, TCR).

Aby lepiej scharakteryzować linię krwiotwórczą komórek, oceniono ekspresję mieloperoksydazy za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wszystkie komórki były dodatnie pod kątem mieloperoksydazy, co potwierdziło ich pochodzenie mieloidalne (Rycina 3A). Większość komórek wybarwiła się również dodatnio na esterazy α-naftylobutyranu (Rycina 3B, panel lewy), a niektóre z nich na esterazy chloroacetanu naftolu AS-D (czarne strzałki) (Rycina 3B, panel prawy). Wyniki wskazują, że populacja składała się z mieszaniny komórek monocytycznych i granulocytycznych. Po wykonaniu barwienia metodą May-Grünwalda Giemsy zaobserwowano, że komórki C1498 wykazują morfologię blastocytarną z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy, obecnością 3 do 5 jąderzek w jądrze, otoczką okołojądrową, licznymi wakuolami oraz bazofilną cytoplazmą (Rycina 3C). Zatem linia komórkowa C1498 składa się z monoblastów i mieloblastów.

Komórki C1498 (CD45.2⁺) wstrzyknięto następnie dożylnie myszom CD45.1⁺ . Myszy padły od 17 do 19 dni po wstrzyknięciu komórek. Myszy te uśmiercono, aby przed śmiercią z powodu choroby można było przeanalizować typ białaczki. Myszy kontrolne, którym wstrzyknięto PBS, przeanalizowano w tych samych punktach czasowych w celu porównania. U myszy, którym wstrzyknięto komórki C1498, zaobserwowano masywną infiltrację komórek C1498 do szpiku kostnego, co potwierdził blastowy wygląd komórek po przeprowadzeniu barwienia May-Grünwalda i Giemsy (Rycina 4A). Zachowały one również swój fenotyp monocytowy i granulocytowy (Rycyna 4B i C), co wykazało akumulację komórek monoblastycznych i mieloblastycznych charakterystyczną dla ostrej białaczki mielomonocytowej.

Aby ustalić, czy liczba szpiku kostnego komórek krwiotwórczych była niższa po inwazji komórek białaczkowych, CD45.2⁺ Populacje komórek C1498, limfocytów B, monocytów oraz granulocytów (w tym progenitorów, prekursorów i komórek dojrzałych) poddano ilościowemu oznaczeniu z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego i wieloparametrycznej analizy cytometrii przepływowej. Komórki białaczkowe stanowiły od 16 do 36% komórek krwiotwórczych (dane nie zostały przedstawione). Pozostałe typy komórek występowały w znacznie mniejszej liczbie u myszy wstrzykniętych komórkami C1498 niż u myszy wstrzykniętych PBS (średnio 5-krotnie mniej w przypadku subpopulacji limfocytów B, 4-krotnie mniej dla komórek granulocytowych i 3-krotnie mniej dla subpopulacji monocytowych) (Rycina 5A–C).

Badanie częstości występowania komórek jednojądrowych w próbkach krwi myszy leukemicznych i kontrolnych wykazało, że zawierały one porównywalny procent limfocytów (Ryc. 6A), ale wyższą częstość występowania komórek monocytowych i leukemicznych. Cechy te są reprezentatywne dla ostrej białaczki mielomonocytowej¹¹ (Ryc. 6B).

Wśród innych cech ostrej białaczki mielomonocytowej¹², u myszy wstrzykniętych linią C1498 wystąpił obrzęk wątroby (hepatomegalia), płuc i śledziony (splenomegalia) (Rysunek 7A). Za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej w organach tych wykryto różną częstotliwość występowania komórek C1498 CD45.2⁺ (Rysunek 7B). Ponieważ splenomegalia może być wynikiem wysokiej liczby naciekających monocytów, oszacowano również proporcje populacji śledzionowych. Liczba komórek w frakcjach limfocytów B, monocytów i granulocytów była w śledzionach białaczkowych znacząco większa niż w śledzionach kontrolnych, średnio odpowiednio 2-krotnie, 2,5-krotnie i 3-krotnie (Rysunek 7C).

Rycina 1. Schematyczny przebieg protokołu służącego do charakterystyki linii komórkowych C1498 hodowanych in vitro oraz opisów ostrej białaczki in vivo. W pierwszej kolejności określono linię krwiotwórczą i stopień różnicowania komórek C1498 hodowanych tkankowo. Następnie komórki C1498 wstrzyknięto myszom kongenicznym w celu indukowania rozwoju ostrej białaczki. Przeprowadzono izolację szpiku kostnego, krwi obwodowej, śledziony, wątroby i tkanek płuc, aby określić częstość występowania, fenotypy i zmiany morfologiczne po infiltracji komórek C1498. IV: dożylnie, MGG: May-Grünwald Giemsa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2. Analiza fenotypowa komórek C1498 po hodowli in vitro. Przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe i histogramy cytometrii przepływowej dla cząsteczek ekspresyjne przez C1498 na powierzchni komórki (A) oraz wewnątrzkomórkowo (B), które są związane z różnicowaniem dojrzałych komórek krwiotwórczych. Komórki C1498 pobrano z hodowli, przemyto i znakowano za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych specyficznych dla markerów powierzchniowych CD11b, CD18 i B220 lub ich kontroli izotypowych. Do barwienia wewnątrzkomórkowego komórki utrwalono, permeabilizowano i znakowano przeciwciałami skierowanymi przeciwko Mac-3, CD3ε oraz wspólnemu epitopowi łańcucha Vβ TCR (T-Cell Receptor) lub ich kontrolom izotypowym. Analizy przeprowadzono z zastosowaniem bramkowania dla żywych komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3. Charakterystyka funkcjonalna i morfologiczna hodowlanych komórek C1498. Komórki C1498 zostały zebrane z kultur i odwirowane na szkiełkach do analizy mikroskopowej. (A) Barwienie na ekspresję mieloperoksydazy wykonano z wykorzystaniem immunofluorescencji. (B) Do analizy aktywności α-naftylobutyranowej esterazy (NBE) oraz naftol AS-D chloroacetylowej esterazy (CAE) w komórkach C1498 zastosowano reakcje cytochemiczne. Komórki uznano za pozytywne dla każdego znacznika w przypadku zaobserwowania odpowiednio dużych, brązowych i czerwono-fioletowych granulek cytoplazmatycznych. (C) Barwienie komórek C1498 metodą May-Grünwalda Giemsy (MGG). Dla każdego eksperymentu barwienia podano powiększenie obiektywu mikroskopu. Każdy obraz jest reprezentatywny dla trzech oddzielnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Morfologia szpiku kostnego u myszy wstrzykniętych PBS oraz komórkami C1498. Komórki szpiku kostnego wyizolowano od myszy po wstrzyknięciu PBS oraz komórek C1498, a następnie odwirowano na szkiełkach do analizy mikroskopowej. (A) Barwienie metodą May-Grünwalda-Giemsy (MGG). (B) Aktywność α-naftylobutyrany esterazy (NBE) oraz (C) naftol AS-D chloroacetaty esterazy (CAE) oceniono za pomocą cytochemii. Na panelu A neutrofile prążkowane (niedojrzałe) lub segmentowane (dojrzałe) są mniej widoczne w szpiku kostnym myszy po wstrzyknięciu C1498 niż u myszy po wstrzyknięciu PBS. Panele B i C wskazują na akumulację komórek monocytycznych i granulocytarnych w leukemicznym szpiku kostnym w porównaniu do liczby obserwowanej w kontrolnym szpiku kostnym. Wszystkie analizy mikroskopowe wykonano z użyciem obiektywu o powiększeniu 100X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Analiza ilościowa populacji szpiku w myszach wstrzykniętych PBS i C1498. Komórki szpiku kostnego wyizolowano z myszy wstrzykniętych PBS oraz komórkami C1498, a następnie oszacowano ich liczbę po wykonaniu zliczenia komórek. Częstość występowania różnych populacji komórek określono po barwieniu immunologicznym i analizie cytometrycznej z bramkowaniem żywych komórek. (A) Subpopulacje limfocytów B obejmowały komórki CD19⁺B220⁺ na etapach od pro-B do dojrzałych limfocytów B; (B) komórki granulocytarne w liniach CD3^- i CD11b⁺Ly6G⁺, obejmujące prekursory oraz granulocyty niedojrzałe i dojrzałe; (C) subpopulacje monocytarne zdefiniowano jako CD3^-CD115⁺, obejmujące komórki od etapu progenitora do dojrzałego monocytu. n = 7 myszy/grupa; dane przedstawiono w formie histogramów wykazujących średnie ± SEM. ***, p< 0.0001 i **, p< 0.01, nieparowany test t Studenta porównujący myszy wstrzyknięte PBS i C1498. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Analiza krwi pod kątem podzbiorów komórek mononuklearnych u myszy wstrzykniętych PBS oraz C1498. Reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej przedstawiające (A) procentowy udział limfocytów T i B, zdefiniowanych odpowiednio jako komórki CD3⁺ i B220⁺ u myszy wstrzykniętych PBS oraz komórkami C1498. (B) Częstość występowania komórek monocytarnych u myszy białaczkowych C1498 i kontrolnych (PBS) określono poprzez analizę komórek CD115⁺Ly6C^- oraz CD115⁺Ly6C^high. Analizę przeprowadzono poprzez bramkowanie żywych komórek. W celu porównania myszy białaczkowych i kontrolnych wykluczono komórki CD45.2⁺ C1498. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Oszacowanie populacji śledziony u myszy z białaczką oraz w grupie kontrolnej. (A) Reprezentatywne fotografie powiększenia wątroby, płuc i śledziony u myszy z białaczką w porównaniu z myszami kontrolnymi. Śledziony zostały pobrane i zważone, a następnie, po rozbiciu tkanek, dokonano zliczenia splenocytów. (B) Histogram przedstawiający częstość występowania komórek białaczkowych w różnych organach po przeprowadzeniu immunostainingu na CD45.2⁺ komórki, a wyniki przeanalizowano przy użyciu cytometrii przepływowej. (C) Szacowanie liczby komórek B, granulocytów i monocytów śledziony po barwieniu immunocytochemicznym i bramkowaniu w analizie cytometrii przepływowej przeprowadzono w celu identyfikacji żywych komórek CD19⁺B220⁺, CD3^-CD11b⁺Ly6G⁺, CD3^-CD11b⁺Ly6C^- oraz CD3^-CD11b⁺Ly6C^wysoki komórki. Paski skali przedstawione dla płuc, śledzion i wątrób oznaczają 1 cm. n = 5–8 myszy/grupa, a dane przedstawiono na histogramach jako średnie ± SEM. *, p< 0.05; **, p= 0,0033, nieparowany test t Studenta t-test porównujący myszy po wstrzyknięciu PBS oraz C1498. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Typ komórki	Cząsteczki błonowe lub wewnątrzkomórkowe
Prekursory i komórki dojrzałe
komórki NK	NK1.1+, pan-NK+
komórki NKT	NK1.1+, pan-NK+, TCR Vbeta+(8.2), CD3+
limfocyty T	TCR Vbeta+, CD3+, CD4+, CD8+
prekursory komórek B i limfocyty B	B220+, CD19+, CD21/35+
prekursory granulocytowe i granulocyty	Ly6G+, Mac-1+, CD11b+
prekursory monocytowe i monocyty/makrofagi	CD11b+, Mac-1+, Mac-3+, CD21/35+, CD115+, Ly6Chi
Progenitory
multipotentne progenitory	CD117+ Sca-1+ CD34+ (Lin- CD150-)
limfoidalnie ukierunkowane multipotentne progenitory	CD117hi Sca-1hi CD127+ (Lin- )
wspólne progenitory limfoidalne	CD117lo Sca-1lo CD127+ (Lin- )
wspólne progenitory mieloidalne	CD16/32lo CD117+ CD34int (Lin- Sca-1-)
progenitory granulocytowo-makrofagowe	CD16/32hi CD117+ CD34hi (Lin- Sca-1-)
progenitory megakariocytowo-erytroidalne	CD16/32lo CD117+ CD34lo (Lin- Sca-1-)
Hematopoetyczne komórki macierzyste	CD117+ Sca-1+ CD150+ (Lin- CD34-)

Tabela 1. Markery linii komórek hematopoetycznych i różnicowania.
CD: klaster różnicowania; Lin: markery dojrzałych komórek; lo: niska ekspresja; hi: wysoka ekspresja; int: ekspresja pośrednia; NK: komórki natural killer; TCR: receptor komórek T.

Dyskusja

W poprzednich badaniach linia komórkowa C1498 była opisywana jako induktor ostrej białaczki granulocytarnej⁵, mielomonocytarnej⁶ lub NKT⁷ . Jednak dane demonstracyjne w literaturze były albo nieobecne, albo niekompletne. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje różne techniki, takie jak cytometria przepływowa, immunofluorescencja, barwienie MGG i testy cytochemiczne, w celu scharakteryzowania hodowanych komórek C1498 i określenia charakteru białaczki, która jest indukowana u myszy po ich wstrzyknięciu.

Kiedy fenotypowaliśmy komórki C1498 hodowane in vitro po przeprowadzeniu analiz barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej, zaobserwowaliśmy pewne ograniczenia, ponieważ komórki te wyrażały niewiele markerów krwiotwórczych na powierzchni komórki, które zostały wcześniej opisane w literaturze^6,7. Zgodnie z naszymi wynikami, Labelle i in. nie zaobserwowali ekspresji powierzchni komórek dojrzałego TCR na komórkach C1498 za pomocą barwienia cytometrią przepływową. Jednak uznali je za linię komórkową NKT po wykryciu mRNA CD3ε i TCRVβ8,2⁷. Zaobserwowaliśmy również wewnątrzkomórkową ekspresję łańcuchów TCRVβ i cząsteczek CD3ε w większości komórek (> 70%), ale nie można było określić ich linii krwiotwórczych, ponieważ jednocześnie występowała wewnątrzkomórkowa ekspresja cząsteczki Mac-3.

Barwienie mieloperoksydazą, MGG i oceny w celu analizy esterazy funkcjonalnych za pomocą cytochemii wykazały, że linia komórkowa C1498 miała pochodzenie szpikowe i składała się z monoblastów i mieloblastów. Wyniki te były zgodne z procentem komórek Mac-3 ⁺ , które uzyskano w analizie barwienia cytometrią przepływową. Chociaż nie są to kroki ilościowe, stanowią kluczowe eksperymenty, które należy przeprowadzić. Rzeczywiście, pozostają one, jak dotąd, najlepszymi istniejącymi metodami charakteryzowania linii i etapu różnicowania komórek krwiotwórczych, które nie wyrażają żadnych lub niewiele specyficznych markerów fenotypowych.

Barwienie cytometrią przepływową było pomocne w wykazaniu rozwoju ostrej białaczki u myszy kongenicznych po dożylnym wstrzyknięciu komórek C1498. Komórki CD45.2 ⁺ C1498, które przeniknęły do krwi obwodowej i różnych narządów, zostały wyizolowane, a ich częstotliwości określono . Przeprowadzono również kwantyfikację w celu analizy nieodłącznych komórek rdzenia i śledziony po immunofenotypowaniu. Napotkano ograniczenia, gdy fenotyp komórek C1498 był badany w narządach, ponieważ wyrażały one niewiele markerów krwiotwórczych (tylko kilka z nich było B220⁺). W celu określenia charakteru obserwowanej ostrej białaczki przeprowadzono barwienie metodą Maya-Grünwalda Giemsa oraz analizę aktywności esterazy monocytowych i granulocytarnych przy użyciu szpiku kostnego. Wyniki wykazały, że komórki C1498 zachowały swoją morfologię i funkcję mieloblastyczną i monoblastyczną, ujawniając początek białaczki mielomonocytowej.

Biorąc pod uwagę krytyczne etapy opisane w niniejszym protokole, należy zwrócić szczególną uwagę na pH podczas przeprowadzania reakcji cytochemicznych i barwienia MGG, ponieważ błędy w pH mogą prowadzić do nieprawidłowej interpretacji wyników. Na przykład aktywność esterazy maślanu α-naftylu jest specyficzna dla komórek monocytowych tylko przy pH 6,0, ponieważ granulocyty i limfocyty mogą również barwić się dodatnio w tym teście przy wyższych wartościach pH. Utrwalanie komórek nie jest zalecane przed wykonaniem barwienia MGG, a wykazaliśmy, że tylko utrwalenie CAF dało zadowalające wyniki podczas wykonywania reakcji cytochemicznych esterazy z użyciem komórek C1498. Aby zachować ekspresję cząsteczki CD115 i jej wykrycie za pomocą cytometrii przepływowej, wszystkie próbki (np. krew, komórki szpiku kostnego i śledziony) powinny być przechowywane w lodzie podczas zabiegu. Jeżeli w doświadczeniach cytometrii przepływowej i/lub immunofluorescencji nie obserwuje się barwienia, należy sprawdzić odniesienie przeciwciał, zalecenia dotyczące ich przechowywania i ich rozcieńczenia. Odniesienia określone w tabeli materiałów/sprzętu zostały wybrane do zastosowań cytometrii przepływowej lub immunofluorescencji. Przeciwciała pierwszorzędowe/drugorzędowe lub ich sprzężone fluorofory mogły utracić swoją aktywność z powodu niewłaściwego przechowywania (np. ekspozycji na światło lub ciepło), niewłaściwego rozcieńczenia, intensywnego zamrażania/rozmrażania lub stosowania zanieczyszczonych. Uruchom kontrole pozytywne, aby upewnić się, że działają prawidłowo. Użyj mysich komórek pochodzących ze szpiku kostnego lub śledziony, o których wiadomo, że wyrażają interesujące nas białka. Aby uniknąć barwienia o wysokim tle i niespecyficznym, upewnij się, że komórki są odpowiednio umyte i przechowywane w wysokiej wilgotności (w celu immunofluorescencji) oraz że przeciwciała są rozcieńczone zgodnie z instrukcją. Użyć tego samego stężenia i rozcieńczenia dla przeciwciała kontrolnego izotypu i przeciwciała pierwszorzędowego, aby dokładnie określić poziom tła w próbce. W przypadku eksperymentów cytochemicznych esterazy odczynniki można testować przy użyciu dodatnich i ujemnych szkiełek kontrolnych zawierających oczyszczone komórki granulocytowe (Ly6G⁺) i monocytowe (CD115⁺) śledziony myszy.

Procedura opisana w tym badaniu wykazała, że wiele cech białaczki obserwowanych u myszy po wstrzyknięciu komórek C1498 ma wspólne cechy z ostrą ludzką białaczką mielomonocytową^11,12. Zaatakowane komórki białaczkowe spowodowały redukcję dojrzałych i niedojrzałych (progenitorów i prekursorów) komórek rdzeniastych krwiotwórczych. Komórki C1498 są obecne z dużą częstotliwością (> 20%) we krwi obwodowej, podobnie jak komórki monocytowe. Zaobserwowano, że hepatomegalia i splenomegalia wynikają z naciekania komórek białaczkowych, a znaczny wzrost limfocytów B i komórek szpikowych towarzyszy splenomegalii. Trombopenię obserwowano również po oszacowaniu liczby płytek krwi za pomocą analizatora hematologicznego.

Wykazano, za pomocą eksperymentów in vitro , że komórki C1498 hamują normalną mysią hematopoezę poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników¹³. W kilku mysich modelach nowotworowych wykazano również, że niedojrzałe komórki szpikowe (w tym komórki monocytowe i granulocytarne) migrują ze szpiku kostnego do śledziony, gdzie hamują aktywację i proliferację limfocytów T specyficznych dla nowotworu¹⁴. Tak więc zmniejszenie liczby komórek krwiotwórczych, które zaobserwowano w szpiku kostnym, mogło wynikać albo z niedoboru hematopoezy, albo z ich emigracji. Ten ostatni mechanizm może wyjaśniać obecność monocytozy we krwi obwodowej lub obserwację powiększonych frakcji szpikowych w śledzionie. Możliwe jest również, że komórki te mogły pochodzić z ulepszonej hematopoezy śledziony. Rzeczywiście, w warunkach stanu stacjonarnego niektóre podzbiory limfocytów B śledziony zostały zidentyfikowane jako prekursory dojrzałych limfocytów B¹⁵. Ponadto wykazano, że w stanach zapalnych rdzeniaste komórki macierzyste i progenitorowe przemieszczają się do śledziony w celu indukowania produkcji dojrzałych monocytów¹⁶. Protokół ten nie pozwala nam na wyciąganie wniosków dotyczących mechanizmów, które są zaangażowane w rozwój białaczki i należy w tym celu zastosować dodatkowe testy funkcjonalne i molekularne. Dane te zawierają jednak szczegółowe informacje na temat cech klinicznych ostrej białaczki mielomonocytowej i pomogą naukowcom ocenić i zrozumieć działanie nowych środków terapeutycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa C1498	ATCC	TIB 49
C57BL/6J-Ly5.1	Charles River	B6.SJL-Ptprc a Pep3 b / BoyCrl
Cells odczynniki do hodowli
2-merkaptoetanol, Gibco	ThermoFisher Scientific	21985
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Scientific	10270
HEPES, Gibco (1 m)	ThermoFisher Scientific	15630
Roztwór aminokwasów endogennych, Gibco	ThermoFisher Scientific	11140
Penicylina-Streptomycyna, Gibco	ThermoFisher Scientific	15140
RPMI 1640 Medium (Gibco, Suplement GlutaMAX)	ThermoFisher Scientific	61870
Pirogronian sodu, Gibco (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360
Cytometria przepływowa odczynniki barwiące
anty-mysie B220 APC (1)	ebiosciences	17-0452	klon RA3-6B2, końcowe rozcieńczenie 1/100
anty-mysia B220 biotyna (2)	ebiosciences	13-0452	klon RA3-6B2, 1/400
anty-mysi CD3 eFluor450 (1)	ebiosciences	48-0032	klon 17A2, 1/100
anty-mysi CD3 PE (2)	BD biosciences	555275	klon 17A2, 1/100
anty-mysz CD3 PE-Cy5 (3)	ebiosciences	15-0031	klon 145-2C11, 1/100
anty-mysie CD4 APC (1)	ebiosciences	17-0041	klon GK1.5, 1/500
anty-mysie CD4 PE (2)	ebiosciences	12-0041	klon GK1.5, 1/200
anty-mysia biotyna CD8 (1)	ebiosciences	13-0081	klon 53-6,7, 1/100
anty-mysi CD8 eFluor450 (2)	ebiosciences	48-0081	klon 53-6,7, 1/500
anty-mysia biotyna	CD11aebiosciences	13-0111	klon M17/4, 1/100
anty-mysz CD11b PE	ebiosciences	12-0112	klon M1/70, 1/200
anty-mysia CD16/32 biotyna	ebiosciences	13-0161	klon 93, 1/400
oczyszczony anty-mysz CD16/32 (blokowanie FcR)	BD biosciences	553141	klon 2.4G2
anty-mysia biotyna CD18 (1)	ebiosciences	13-0181	klon M18/2, 1/100
anty-mysi CD18 FITC (2)	ebiosciences	11-0181	klon M18/2, 1/50
anty-mysi CD19 PE	ebiosciences	12-0193	klon 1D3, 1/200
anty-mysz CD21/35 PE	ebiosciences	12-0211	klon 8D9, 1/50
anty-mysie CD31 PE	ebiosciences	12-0311	klon 390, 1/100
anty-mysie CD34 eFluor660	ebiosciences	50-0341	klon RAM34, 1/20
anty-mysie CD44 PE	BD biosciences		553134 klon IM7, 1/50
anty-mysie CD45.2 FITC	ebiosciences	11-0454	klon 104, 1/100
anty-mysz CD49b/Pan NK PE	BD biosciences	553858	klon DX5, 1/50
anty-mysia CD80 biotyna	ebiosciences	13-0801	klon 16-10A1, 1/200
anty-mysia CD86 biotyna	ebiosciences	13-0862	klon GL1, 1/200
anty-mysz CD107b (Mac-3) PE	ebiosciences	12-5989	klon M3/84, 1/40
anty-mysz CD115 PE	ebiosciences	12-1152	klon AFS98, 1/100
anty-mysie CD117 eFluor450	ebiosciences	48-1171	klon 2B8, 1/100
anty-mysie CD127 PE	ebiosciences	12-1271	klon A7R34, 1/100
anty-mysie CD150 APC	ebiosciences	17-1501	klon 9D1, 1/20
anty-mysi CD274 (PD-L1) biotyna	ebiosciences	13-5982	klon MIH5, 1/200
anty-mysi Ly-6A/E (Sca-1) PE	ebiosciences	12-5981	klon D7, 1/100
anty-mysz Ly-6C APC	ebiosciences	17-5932	klon HK1.4, 1/200
anty-mysz Ly-6G  (Gr-1) biotyna (1)	ebiosciences	13-5931	klon RB6-8C5, 1/400
anty-mysie Ly-6G FITC (2)	ebiosciences	11-9668	klon 1A8, 1/50
anty-mysie MHC klasa I (H-2Db) biotyna	ebiosciences	13-5999	klon 28-14-8, 1/50
anty-mysie MHC klasa II (I-A/I-E) PE-Cy5	ebiosciences	15-5321	klon M5/114.15.2, 1/1000
anty-mysz NK1.1 PE	BD biosciences	557391	klon PK136, 1/50
anty-mysie TCRVb FITC	BD biosciences	553170	klon H57-597, 1/50
streptawidyna PE-Cy5	ebiosciences	15-4317	1/200
			do barwienia immunofluorescencyjnego
Anty-mysia mieloperoksydaza (przeciwciało o łańcuchu ciężkim)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16129	1/10 (20 &mikro; g/ml)
przeciwciało przeciw kozom IgG (Texas Red sprzężone przeciwciało)	Jackson Immunoresearch	705-076-147	1/250
Normalna surowica osła	Jackson Immunoresearch	017-000-001
Roztwór Hoechst	BD Biosciences	561908	1/1000
Podłoże montażowe 1 (Fluoromount)	Sigma-Aldrich	F4680
Aceton	VWR	20066
Metanol	Merck Millipore	106009
Esterazy cytochemiczne odczynniki barwiące
Naphtol AS-D roztwór chlorooctanu	Sigma-Aldrich	911
Roztwór barwnika (roztwór Fast Red Violet LB Base)	Sigma-Aldrich	912
pH6,3 (TRIZMAL)	Sigma-Aldrich	913
Roztwór azotynu sodu	Sigma-Aldrich	914
Roztwór cytrynianu	Sigma-Aldrich	915
Roztwór hematoksyliny	Sigma-Aldrich	GHS3
Aceton	VWR	20066
Roztwór formaldehydu, 37%	Sigma-Aldrich	F1635
&alfa;-roztwór maślanu naftylu	Sigma-Aldrich	1801
Bufor fosforanowy	Sigma-Aldrich	1805
Tabletka azotynu sodu	Sigma-Aldrich	1809
Roztwór pararozaniliny	Sigma-Aldrich	1804
Roztwór błękitu metylenowego	Sigma-Aldrich	1808	1/10
podłoże montażowe 2 (Clearmount)	Invitrogen	00-8010
May-Grü odczynniki barwiące do Walda Giemsa
May-Grü nwald solution	RAL Diagnostics	320070
Giemsa R solution	Diagnostyka RAL	320310	Roztwór buforowy 1/20
pH 6,8	RAL Diagnostyka 330368
Inne materiały, odczynniki i sprzęt
Ketamina 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3597132111010
Ksylazyna SEDAXYLAN (20 mg/ml)	CEVA
Surowica albuminy Bovin (BSA) w proszku	ThermoFisher Scientific	BP671
Roztwór PBS (1x koncentrat)	ThermoFisher Scientific	14190
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Ultra Pure 0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0	ThermoFisher Scientific	15575
Roztwór separujący (Mysz Pancoll)	PANBIOTECH	P04-64100
Bufor do lizy (bufor lizujący czerwone krwinki) (10x)	BD Biosciences	555899	1/10
NaOH 10 N	ThermoFisher Scientific	SS267
Roztwór błękitu trypanowego (0,4 %)	ThermoFisher Scientific	15250-061	1/2
probówka 50 ml (Falcon)	Fisher Scientific	14-432-22
70 µ m Sitko do komórek (Falcon)	Corning Nauki Przyrodnicze	352350
Izba & karta filtracyjna (EZ Cytofunnel Shandon)	Okulary
, 24 x 24 mm	Knittel Glass	VD1 2424 Y100
Szkiełka (Starfrost - szlifowane krawędzie 90)	Knittel Glass	VS1137# 077FKB
EDTA Rurka	Greiner Bio-One	454034
Pasteur Pipeta 150 mm (rurka kapilarna)	Fisherbrand	1154-6963
Igła 26 G	Terumo	NN-2613R
strzykawka insulinowa z igłą 29 G	Terumo	BS05M2913
30 G	Becton & Dickinson	304000
Rurki do cytometrii przepływowej (niebieskie)	Długopis hydrofobowy Beckman Coulter	2523749
Dakopen)	Dako	S200230
Ostre sterylne nożyczki	Nessi-care	SCI-01
Sterylne kleszcze	Dominique Dutscher	956506
Komora zliczania komórek Thoma	VWR	631-0397
Szalki Petriego (Fisherbrand Plastic)	ThermoFisher Scientific	S33580A
Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)	ThermoFisher Scientific	05-408-129
Cylindryczny ogranicznik 15 - 30 g	Stoelting	51338
Shandon Cytospin 3 Cytospin 3 Cytowirówka	ThermoFisher Scientific
10 ml strzykawka	Terumo	SS-10L
Strzykawka 1 ml	Terumo	SS-01T
Etanol	Merck	1.08543
Sterylne gąbki z gazy	URGO	501580

Odczynniki Koncentrat buforowy nakrywkowe do mikroskopu Thermo Scientific A78710003 (