Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nadawanie powierzchni materiałów właściwości adhezyjnych jest powszechną strategią w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Jest to szczególnie interesujące w przypadku już zatwierdzonych polimerów, które mają wieloletnie zastosowanie w medycynie, ponieważ materiały te są dobrze scharakteryzowane i można uniknąć problemów prawnych związanych z wprowadzaniem nowo zsyntetyzowanych polimerów. Politetrafluoroetylen (PTFE) jest jednym z najczęściej stosowanych materiałów do produkcji przeszczepów naczyniowych, ale polimer ten nie ma właściwości sprzyjających adhezji komórek. Endotelializacja, czyli całkowite pokrycie wewnętrznej powierzchni przeszczepów zlewającą się warstwą komórek śródbłonka, jest uważana za klucz do optymalnej wydajności, głównie poprzez zmniejszenie trombogenności sztucznego interfejsu.
To badanie bada wzrost komórek śródbłonka na PTFE modyfikowanym peptydami i porównuje te wyniki z wynikami uzyskanymi na niezmodyfikowanym substracie. Sprzężenie z peptydem adhezyjnym komórek śródbłonka Arg-Glu-Asp-Val (REDV) odbywa się poprzez aktywację polimeru zawierającego fluor za pomocą odczynnika naftalenidu sodu, po którym następują kolejne etapy koniugacji. Hodowla komórkowa odbywa się przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), a doskonały wzrost komórek na materiale immobilizowanym peptydem jest wykazywany przez okres dwóch tygodni.
Wprowadzenie
Różne polimery używane w medycynie, które zostały zatwierdzone od pewnego czasu, nie wykazują zwiększonej biokompatybilności, np. brak adhezji komórek, indukcja zwłóknienia i trombogeniczność, żeby wymienić tylko kilka. Interakcje między biomateriałem a systemem biologicznym zachodzą głównie na powierzchni implantu. W związku z tym badania skupiły się na modyfikacji powierzchni w celu stworzenia odpowiednich właściwości dla pożądanego zastosowania, pozostawiając nienaruszone właściwości materiałowe materiału. Politetrafluoroetylen (PTFE) jako fizjologicznie obojętny polimer jest stosowany w wielu dziedzinach medycyny, takich jak siatka chirurgiczna przepukliny 1, porty medyczne 2 i, co najważniejsze, przeszczepy naczyniowe 3.
Szczególnie w sytuacjach kontaktu z krwią, hydrofobowa natura PTFE powoduje niespecyficzną adsorpcję składników osocza, a w konsekwencji adhezję płytek krwi, co często prowadzi do zdarzeń zakrzepowych i niedrożności przeszczepu 4. Ponadto PTFE, podobnie jak większość polimerów, nie wspomaga adhezji i pokrycia komórkowego, co byłoby pożądaną cechą w celu wywołania tworzenia korzystnej warstwy komórek śródbłonka (EC) na wewnętrznej (świetlnej) powierzchni przeszczepu naczyniowego 5. Oczekuje się, że śródbłonek biomimetyczny będzie spełniał wiele funkcji swojego naturalnego odpowiednika, w szczególności właściwości przeciwzakrzepowe 6. Ogólna strategia modyfikacji biomimetycznej opiera się na koncepcji wyłącznego nadania materiałowi adhezji komórkowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonych właściwości materiałów masowych. Ponadto adhezja płytek krwi może być zmniejszona poprzez włączenie właściwości antyadhezyjnych (przeciwporostowych) 7. Opisano różne peptydy – głównie pochodzące z białek macierzy zewnątrzkomórkowej – które silnie zwiększają adhezję komórek poprzez wiązanie się z receptorami komórkowymi, należącymi do klasy integryn 8. Najbardziej znanym przykładem w tym zakresie jest peptyd Arg-Gly-Asp (RGD), który oddziałuje z większością typów komórek. Inne sekwencje aminokwasów są rozpoznawane przez integryny ulegające ekspresji wyłącznie na określonych komórkach. Na przykład stwierdzono, że Arg-Glu-Asp-Val (REDV) i Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) wiążą się z EC w określony sposób 9. Kowalencyjną immobilizację takich peptydów przeprowadzono na wielu materiałach z natury nieadhezyjnych, w tym metalach i polimerach 10,11.
Porowaty PTFE, a dokładniej ekspandowany PTFE (ePTFE) — wraz z politereftalanem etylenu (PET) - jest najważniejszym materiałem do produkcji przeszczepów naczyniowych 12. Ugruntowane techniki fizyczne dla odpowiednich zabiegów, takich jak modyfikacja plazmą 13 lub metody fotochemiczne 14, są utrudnione ze względu na fakt, że porowate i/lub rurkowe struktury nie są łatwe do uleczenia odpowiednio wewnątrz porów lub światła. Chemia mokra PTFE jest trudnym zadaniem ze względu na wysoce obojętny charakter polimeru zawierającego fluor, który jest odporny na większość ataków chemicznych 15.
W tym artykule opisujemy stosunkowo łatwą metodę dla strategii modyfikacji kowalencyjnej. Na powierzchni materiału stworzono grupy funkcyjne, które służą jako punkty zaczepienia dla dalszej koniugacji biologicznie aktywnych cząsteczek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworu aktywującego naftalenowcy sodu i aktywacja powierzchniowa
Uwaga: Przeprowadzaj reakcje w dobrze wentylowanym dygestorium. Postępuj zgodnie z ogólnymi zasadami obchodzenia się z wysoce łatwopalnymi rozpuszczalnikami i metalami, takimi jak sód metaliczny. Naftalen ma bardzo nieprzyjemny zapach (naftalina), nawet w bardzo małych ilościach! Jeśli nie wskazano inaczej, reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Azydek sodu jest wysoce toksyczny! THF (99,9%, patrz Lista materiałów) przechowywano na około 20% (objętościowo) sicie molekularnym. Destyluj THF z zauważalną zawartością wody nad sodem. Tworzenie się naftalenidu sodu nie zachodzi, jeśli obecne są śladowe ilości wody.
- Do roztworu 1,4 g (10,9 mmol) naftalenu w 20 ml tetrahydrofuranu (THF, wysuszonego na sicie molekularnym 3 A) dodać 0,25 g (10,9 mmol) metalicznego sodu do zakręcanej szklanej butelki o pojemności 100 ml wyposażonej w mieszadło magnetyczne pokryte PTFE.
Uwaga: Rozpuszczanie można znacznie poprawić, krojąc sód na małe kawałki i skromne podgrzewanie (35 - 40 °C). Końcowy roztwór ma ciemny, lekko zielonkawy kolor i może być przechowywany w ściśle suchych warunkach. - Z materiału foliowego o grubości 0,5 mm należy wykrawać krążki PTFE o średnicy 12 mm. Zaznacz jedną stronę (np. za pomocą stempla do stempla) i wyczyść izopropanolem.
- Próbki PTFE inkubować pojedynczo w roztworze aktywującym (krok 1.1) przez 1-2 minuty za pomocą kleszczy. Uwaga: Zmiana koloru z białego na ciemnobrązowy wskazuje na udane leczenie.
- Następnie spłukać dwukrotnie THF, a następnie izopropanolem.
Uwaga: Roztwór naftalenidu jest wyczerpany, gdy jego kolor zmieni się na wodnisty jasnobrązowy. Niewykorzystany roztwór naftalenidu (prawdopodobnie zawierający metaliczny sód) musi zostać rozłożony przez powolne dodawanie izopropanolu przed usunięciem. - Próbki poddane działaniu substancji należy utlenić w nadtlenku wodoru (30%) zawierającym 20% (w/v) kwasu trichlorooctowego przez 3 godziny. Umyć wodą i wysuszyć. Powierzchnia ma teraz lekko brązowawy wygląd. Uwaga: Aktywacja i utlenianie powodują drastycznie zwiększenie zwilżalności powierzchni. Stwierdzenie to zostało szczegółowo zbadane wcześniej 14.
- Potraktuj utlenione krążki 50% (v/v) diizocyjanianem heksametylenu (HMDI) w suchym THF przez 2 godziny, spłucz THF i pozostaw do wyschnięcia.
- Hydrolizuj próbki zawierające izocyjanian w wodzie przez 2 - 3 godziny i wysusz. Uwaga: Końcowa powierzchnia PTFE funkcjonalizowana aminami jest znacznie bardziej stabilna niż próbki zawierające izocyjanian i jest kompatybilna z wieloma standardowymi środkami sieciującymi w celu dalszego sprzężenia.
2. Unieruchomienie peptydów
- Przygotować roztwór 20% (v/v) eteru diglicydydylowego (diepsydylu) glikolu dietylenowego w 50 mM buforze węglanowym o pH 9.
- Umieść zaminowane krążki oznaczoną stroną do góry pojedynczo na płytce 24-dołkowej i dodaj 1,5 ml roztworu epoksydu. Zapewnić pełne pokrycie próbek. Inkubować przez 2 godziny i przemyć dwa razy wodą i raz buforem węglanowym.
- Dodać 50 μl peptydu 0,5 mg/ml (np. REDV) w 50 mM buforze węglanowym o pH 9 zawierającym 0,01% NaN3 na dno poszczególnych studzienek świeżej płytki 24-dołkowej i ostrożnie umieścić krążki funkcjonalizowane żywicą epoksydową do góry nogami (tj. oznaczoną stroną do dołu) na kropli roztworu peptydu. Upewnij się, że przestrzeń między dnem studzienki a dyskiem PTFE jest całkowicie zwilżona z powodu działania kapilarnego.
- Inkubować w mokrej komorze (np. w dowolnym zamykanym plastikowym pudełku ze szczelnie zamykającą się pokrywą) w wilgotnej atmosferze (umieszczając mokrą bibułkę na dnie) przez co najmniej 3 godziny lub przez noc.
Uwaga: Chociaż motyw REDV może być uważany za dobrze scharakteryzowany, zakodowana lub odwrócona sekwencja aminokwasów może być włączona jako dodatkowa kontrola ujemna. - Umyć trzykrotnie wodą i sterylizować w 50% izopropanolu/wodzie przez co najmniej 30 minut. Przed wysiewem komórek próbki należy przepłukać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
3. Sadzenie komórek
- Hodować HUVEC przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowych 17,18.
- Umieść próbki sprzężone z peptydami zmodyfikowaną stroną do góry w 24-dołkowych płytkach. Do kontroli należy używać nieobrobionych krążków PTFE.
- Wysiać 5 x 104 HUVEC w 2 ml pożywki na basenik i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
- Wyjmij krążki, dokładnie spłucz, aby usunąć nieprzyłączone komórki i przenieś na świeżą płytkę 24-dołkową. Dodać 2 ml świeżej pożywki i inkubować przez żądany okres (np. 24 godziny, 1 W itd.). Zmieniaj podłoże co dwa dni.
- Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml Calcein-AM w dimetylosulfotlenku (DMSO).
- Po wyhodowaniu komórek usunąć pożywkę, przemyć PBS i dodać PBS zawierający 1 μl/ml barwnika Calcein-AM (np. 1 μl roztworu podstawowego na ml PBS). Delikatnie mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut w ciemności.
- Przemyć PBS i natychmiast wykonać mikrofotografie pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w standardowe filtry FITC (Ex 488 nm, Em 515 nm). Użyj 100-krotnego powiększenia. Wykonać potrójne próby zarówno z próbek niezmodyfikowanych, jak i poddanych działaniu substancji.
- Za pomocą oprogramowania ImageJ określ obszar skolonizowany przez komórki. Możesz też policzyć komórki ręcznie lub użyć ImageJ. Obie metody dostarczą podobnych informacji na temat przyczepiania i wzrostu komórek na odpowiednich powierzchniach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przebieg kluczowych etapów reakcji chemicznych monitorowano za pomocą spektroskopii IR (Rysunek 1). Wstępna aktywacja naftalenidem sodu generuje wiązania podwójne oraz — w niewielkim stopniu — grupy funkcyjne OH. Sygnał wskazujący na wiązania C=C znika po utlenianiu, w wyniku czego powstaje powierzchnia zawierająca niemal wyłącznie grupy hydroksylowe. Analiza kolejnych standardowych etapów konjugacji nie została tutaj przedstawiona. Zmiany barwy wynikające z aktywacji i u...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Szczegółowy opis protokołu modyfikacji powierzchni PTFE składa się z następujących po sobie etapów, począwszy od eliminacji fluoru ze szkieletu polimeru, jak pokazano na rysunku 6. W rezultacie powstaje warstwa, która zawiera obfitą ilość sprzężonych podwójnych wiązań węgiel-węgiel zgodnie z ciemnobrązowawym kolorem, który rozwinął się po obróbce naftalenami. Standardowe utlenianie kwaśnym nadtlenkiem wodoru daje hydroksylowaną powierzchnię, której towarzyszy pojaśnienie do bladobrązowego koloru, co odzw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za pomoc Walterowi Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Moguncja, Niemcy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Folia PTFE 0,5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| peptyd REDV | Genecust | n/a | niestandardowa synteza >95% czystości |
| izopropanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofuran (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimetylosulftlenek | Sigma Aldrich | D8418 | |
| sito molekularne 3 i Aring; | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodu metaliczny | Sigma Aldrich | 483745 | |
| sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naftalen | Sigma Aldrich | 147141 | |
| nadtlenek wodoru 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| kwas trichlorooctowy | Sigma Aldrich | T6399 | |
| eter diglicydylowy glikolu dietylenowego | Sigma Aldrich | 17741 | |
| diizocyjanian heksametylenu (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| wodorowęglan sodu | Sigma Aldrich | S6014 | |
| azydek sodu | Sigma Aldrich | 71290 | |
| płytki 24-dołkowe | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| spektrofotometr ATR-FTIR Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| mikroskop fluorescencyjny Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| komórki śródbłonka żyły poskromionej (HUVEC) | Lonza | n/a | |
| ePTFE przeszczep naczyniowy | Gore | n/a |
Bibliografia
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. Bioengineered blood vessels. Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. Plasma-based biofunctionalization of vascular implants. Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007(2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
