Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Różne polimery używane w medycynie, które zostały zatwierdzone od pewnego czasu, nie wykazują zwiększonej biokompatybilności, np. brak adhezji komórek, indukcja zwłóknienia i trombogeniczność, żeby wymienić tylko kilka. Interakcje między biomateriałem a systemem biologicznym zachodzą głównie na powierzchni implantu. W związku z tym badania skupiły się na modyfikacji powierzchni w celu stworzenia odpowiednich właściwości dla pożądanego zastosowania, pozostawiając nienaruszone właściwości materiałowe materiału. Politetrafluoroetylen (PTFE) jako fizjologicznie obojętny polimer jest stosowany w wielu dziedzinach medycyny, takich jak siatka chirurgiczna przepukliny ¹, porty medyczne ² i, co najważniejsze, przeszczepy naczyniowe ³.

Szczególnie w sytuacjach kontaktu z krwią, hydrofobowa natura PTFE powoduje niespecyficzną adsorpcję składników osocza, a w konsekwencji adhezję płytek krwi, co często prowadzi do zdarzeń zakrzepowych i niedrożności przeszczepu ⁴. Ponadto PTFE, podobnie jak większość polimerów, nie wspomaga adhezji i pokrycia komórkowego, co byłoby pożądaną cechą w celu wywołania tworzenia korzystnej warstwy komórek śródbłonka (EC) na wewnętrznej (świetlnej) powierzchni przeszczepu naczyniowego ⁵. Oczekuje się, że śródbłonek biomimetyczny będzie spełniał wiele funkcji swojego naturalnego odpowiednika, w szczególności właściwości przeciwzakrzepowe ⁶. Ogólna strategia modyfikacji biomimetycznej opiera się na koncepcji wyłącznego nadania materiałowi adhezji komórkowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonych właściwości materiałów masowych. Ponadto adhezja płytek krwi może być zmniejszona poprzez włączenie właściwości antyadhezyjnych (przeciwporostowych) ⁷. Opisano różne peptydy – głównie pochodzące z białek macierzy zewnątrzkomórkowej – które silnie zwiększają adhezję komórek poprzez wiązanie się z receptorami komórkowymi, należącymi do klasy integryn ⁸. Najbardziej znanym przykładem w tym zakresie jest peptyd Arg-Gly-Asp (RGD), który oddziałuje z większością typów komórek. Inne sekwencje aminokwasów są rozpoznawane przez integryny ulegające ekspresji wyłącznie na określonych komórkach. Na przykład stwierdzono, że Arg-Glu-Asp-Val (REDV) i Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) wiążą się z EC w określony sposób ⁹. Kowalencyjną immobilizację takich peptydów przeprowadzono na wielu materiałach z natury nieadhezyjnych, w tym metalach i polimerach ^10,11.

Porowaty PTFE, a dokładniej ekspandowany PTFE (ePTFE) — wraz z politereftalanem etylenu (PET) - jest najważniejszym materiałem do produkcji przeszczepów naczyniowych ¹². Ugruntowane techniki fizyczne dla odpowiednich zabiegów, takich jak modyfikacja plazmą ¹³ lub metody fotochemiczne ¹⁴, są utrudnione ze względu na fakt, że porowate i/lub rurkowe struktury nie są łatwe do uleczenia odpowiednio wewnątrz porów lub światła. Chemia mokra PTFE jest trudnym zadaniem ze względu na wysoce obojętny charakter polimeru zawierającego fluor, który jest odporny na większość ataków chemicznych ¹⁵.

W tym artykule opisujemy stosunkowo łatwą metodę dla strategii modyfikacji kowalencyjnej. Na powierzchni materiału stworzono grupy funkcyjne, które służą jako punkty zaczepienia dla dalszej koniugacji biologicznie aktywnych cząsteczek.

1. Przygotowanie roztworu aktywującego naftalenowcy sodu i aktywacja powierzchniowa

Uwaga: Przeprowadzaj reakcje w dobrze wentylowanym dygestorium. Postępuj zgodnie z ogólnymi zasadami obchodzenia się z wysoce łatwopalnymi rozpuszczalnikami i metalami, takimi jak sód metaliczny. Naftalen ma bardzo nieprzyjemny zapach (naftalina), nawet w bardzo małych ilościach! Jeśli nie wskazano inaczej, reakcje przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Azydek sodu jest wysoce toksyczny! THF (99,9%, patrz Lista materiałów) przechowywano na około 20% (objętościowo) sicie molekularnym. Destyluj THF z zauważalną zawartością wody nad sodem. Tworzenie się naftalenidu sodu nie zachodzi, jeśli obecne są śladowe ilości wody.

1. Do roztworu 1,4 g (10,9 mmol) naftalenu w 20 ml tetrahydrofuranu (THF, wysuszonego na sicie molekularnym 3 A) dodać 0,25 g (10,9 mmol) metalicznego sodu do zakręcanej szklanej butelki o pojemności 100 ml wyposażonej w mieszadło magnetyczne pokryte PTFE.
   Uwaga: Rozpuszczanie można znacznie poprawić, krojąc sód na małe kawałki i skromne podgrzewanie (35 - 40 °C). Końcowy roztwór ma ciemny, lekko zielonkawy kolor i może być przechowywany w ściśle suchych warunkach.
2. Z materiału foliowego o grubości 0,5 mm należy wykrawać krążki PTFE o średnicy 12 mm. Zaznacz jedną stronę (np. za pomocą stempla do stempla) i wyczyść izopropanolem.
3. Próbki PTFE inkubować pojedynczo w roztworze aktywującym (krok 1.1) przez 1-2 minuty za pomocą kleszczy. Uwaga: Zmiana koloru z białego na ciemnobrązowy wskazuje na udane leczenie.
4. Następnie spłukać dwukrotnie THF, a następnie izopropanolem.
   Uwaga: Roztwór naftalenidu jest wyczerpany, gdy jego kolor zmieni się na wodnisty jasnobrązowy. Niewykorzystany roztwór naftalenidu (prawdopodobnie zawierający metaliczny sód) musi zostać rozłożony przez powolne dodawanie izopropanolu przed usunięciem.
5. Próbki poddane działaniu substancji należy utlenić w nadtlenku wodoru (30%) zawierającym 20% (w/v) kwasu trichlorooctowego przez 3 godziny. Umyć wodą i wysuszyć. Powierzchnia ma teraz lekko brązowawy wygląd. Uwaga: Aktywacja i utlenianie powodują drastycznie zwiększenie zwilżalności powierzchni. Stwierdzenie to zostało szczegółowo zbadane wcześniej ¹⁴.
6. Potraktuj utlenione krążki 50% (v/v) diizocyjanianem heksametylenu (HMDI) w suchym THF przez 2 godziny, spłucz THF i pozostaw do wyschnięcia.
7. Hydrolizuj próbki zawierające izocyjanian w wodzie przez 2 - 3 godziny i wysusz. Uwaga: Końcowa powierzchnia PTFE funkcjonalizowana aminami jest znacznie bardziej stabilna niż próbki zawierające izocyjanian i jest kompatybilna z wieloma standardowymi środkami sieciującymi w celu dalszego sprzężenia.

2. Unieruchomienie peptydów

1. Przygotować roztwór 20% (v/v) eteru diglicydydylowego (diepsydylu) glikolu dietylenowego w 50 mM buforze węglanowym o pH 9.
2. Umieść zaminowane krążki oznaczoną stroną do góry pojedynczo na płytce 24-dołkowej i dodaj 1,5 ml roztworu epoksydu. Zapewnić pełne pokrycie próbek. Inkubować przez 2 godziny i przemyć dwa razy wodą i raz buforem węglanowym.
3. Dodać 50 μl peptydu 0,5 mg/ml (np. REDV) w 50 mM buforze węglanowym o pH 9 zawierającym 0,01% NaN₃ na dno poszczególnych studzienek świeżej płytki 24-dołkowej i ostrożnie umieścić krążki funkcjonalizowane żywicą epoksydową do góry nogami (tj. oznaczoną stroną do dołu) na kropli roztworu peptydu. Upewnij się, że przestrzeń między dnem studzienki a dyskiem PTFE jest całkowicie zwilżona z powodu działania kapilarnego.
4. Inkubować w mokrej komorze (np. w dowolnym zamykanym plastikowym pudełku ze szczelnie zamykającą się pokrywą) w wilgotnej atmosferze (umieszczając mokrą bibułkę na dnie) przez co najmniej 3 godziny lub przez noc.
   Uwaga: Chociaż motyw REDV może być uważany za dobrze scharakteryzowany, zakodowana lub odwrócona sekwencja aminokwasów może być włączona jako dodatkowa kontrola ujemna.
5. Umyć trzykrotnie wodą i sterylizować w 50% izopropanolu/wodzie przez co najmniej 30 minut. Przed wysiewem komórek próbki należy przepłukać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

3. Sadzenie komórek

1. Hodować HUVEC przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowych ^17,18.
2. Umieść próbki sprzężone z peptydami zmodyfikowaną stroną do góry w 24-dołkowych płytkach. Do kontroli należy używać nieobrobionych krążków PTFE.
3. Wysiać 5 x 10⁴ HUVEC w 2 ml pożywki na basenik i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w inkubatorze.
4. Wyjmij krążki, dokładnie spłucz, aby usunąć nieprzyłączone komórki i przenieś na świeżą płytkę 24-dołkową. Dodać 2 ml świeżej pożywki i inkubować przez żądany okres (np. 24 godziny, 1 W itd.). Zmieniaj podłoże co dwa dni.
5. Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml Calcein-AM w dimetylosulfotlenku (DMSO).
6. Po wyhodowaniu komórek usunąć pożywkę, przemyć PBS i dodać PBS zawierający 1 μl/ml barwnika Calcein-AM (np. 1 μl roztworu podstawowego na ml PBS). Delikatnie mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut w ciemności.
7. Przemyć PBS i natychmiast wykonać mikrofotografie pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w standardowe filtry FITC (Ex 488 nm, Em 515 nm). Użyj 100-krotnego powiększenia. Wykonać potrójne próby zarówno z próbek niezmodyfikowanych, jak i poddanych działaniu substancji.
8. Za pomocą oprogramowania ImageJ określ obszar skolonizowany przez komórki. Możesz też policzyć komórki ręcznie lub użyć ImageJ. Obie metody dostarczą podobnych informacji na temat przyczepiania i wzrostu komórek na odpowiednich powierzchniach.

Wyniki kluczowych etapów reakcji chemicznej były monitorowane za pomocą spektroskopii IR (Rysunek 1). Początkowa aktywacja naftalenem sodu generuje wiązania podwójne - i w mniejszym stopniu - funkcje OH. Sygnał wskazujący, że wiązania C=C zanikają po utlenieniu, dając powierzchnię zawierającą prawie wyłącznie grupy hydroksylowe. Analiza dalszych standardowych etapów koniugacji nie jest tutaj pokazana. Zmiany koloru spowodowane aktywacją i utlenianiem są zgodne z oczekiwaną chemią, która jest stosowana: oczekuje się, że sprzężone systemy podwójnych wiązań będą brązowawe, a ich utrata spowoduje pojaśnienie (ryc. 2). Ponadto zbadano możliwy wpływ aktywacji i utleniania na morfologię powierzchni za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Nie zaobserwowano praktycznie żadnego szkodliwego wpływu leczenia (ryc. 2).

Rysunki 3 i 4 pokazują wynik immobilizacji REDV na wzrost komórek śródbłonka. Podczas gdy na materiale niepoddanym działaniu substancji praktycznie nie dochodzi do adhezji i proliferacji komórek, modyfikacja silnie wspiera kolonizację przez okres dwóch tygodni. Na przykładzie zastosowania klinicznego (tj. przeszczepów naczyniowych), modyfikacja została identycznie przeprowadzona na oryginalnym materiale z dostępnego na rynku przeszczepu wykonanego z ekspandowanego PTFE z podobnymi wynikami w okresie jednego tygodnia (ryc. 5).

Rysunek 1. Spektroskopia w podczerwieni PTFE. Obróbka nieskazitelnego PTFE (A) powoduje powstawanie wiązań podwójnych i do pewnego stopnia funkcji hydroksylowych (B). Następnie wiązania C=C są redukowane w wyniku utleniania (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Wygląd optyczny gołego i aktywowanego powierzchniowo PTFE. (A) Podczas gdy nieobrobiony PTFE (po lewej) wydaje się biały, aktywacja za pomocą naftalenidu sodu daje ciemnobrązowawy kolor (środek), który jest lekko rozjaśniony po utlenieniu (po prawej). Niepoddane obróbce (B) i utlenione próbki PTFE (C) dodatkowo przebadano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (powiększenie: 2000X). Tarcze mają średnicę 12 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Hodowla komórek śródbłonka na nieskazitelnym i modyfikowanym peptydami PTFE. Próbki niepoddane działaniu peptydów nie są kolonizowane przez EC (A, C, E po 24 godzinach, odpowiednio 1 w i 2 w), podczas gdy adhezja i wzrost na materiale modyfikowanym peptydami jest znacznie zwiększona (B, D i F po 24 godzinach, odpowiednio 1 w i 2 w). Podziałka: 100 μm, powiększenie 100X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Kwantyfikacja pokrycia komórek za pomocą analizy ImageJ. Wzrost komórek na gołych powierzchniach polimerowych PTFE (A, C, E) i na powierzchniach polimerowych sprzężonych z REDV (B, D, F) wyrażony jako procentowe pokrycie całkowitej powierzchni. Unieruchomiony peptyd wyraźnie umożliwia początkową adhezję (B) i wspomaga kolonizację przez okres 2 tygodni (D, F). Oznaczenia w trzech egzemplarzach, średnia ± odchylenie standardowe). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Komórki śródbłonka hodowane przez 1 tydzień na ekspandowanym PTFE. Strukturę ePTFE przedstawiono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (A). Wyniki uzyskane na materiale porowatym są zgodne z wynikami uzyskanymi dla płaskiej próbki PTFE. W przeciwieństwie do kilku komórek znajdujących się na gołym materiale (B), zmodyfikowana powierzchnia (C) stanowi doskonały substrat do wzrostu komórek. Podziałka wynosi 100 μm odpowiednio dla A, B i C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Schematyczne przedstawienie modyfikacji chemicznej PTFE za pomocą chemii mokrej. Wiązania podwójne generowane przez obróbkę Na-naftalenami są utleniane, co skutkuje funkcjonalnością OH. Diizocyjanian hydroksylowo-reaktywny jest następnie unieruchamiany i hydrolizowany do aminy. Na koniec dwufunkcyjny diepoksyd jest nakładany w celu sprzężenia peptydu REDV przy użyciu N-końcowej grupy aminowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.