Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Streszczenie

Komórki macierzyste trofoblastu (TSC) powstają w wyniku pierwszej decyzji o losie komórki w rozwoju ssaków. Mogą być hodowane in vitro, zachowując zdolność do samoodnawiania się i różnicowania we wszystkie podtypy linii trofoblastu, co odpowiada populacji komórek macierzystych in vivo, które dały początek płodowej części łożyska. W związku z tym TSC stanowią unikalny model do badania rozwoju łożyska oraz decyzji o losie komórek zarodkowych i pozaembrionalnych in vitro. Począwszy od stadium blastocysty, wyraźna bariera epigenetyczna składająca się z metylacji DNA i modyfikacji histonów ściśle oddziela obie linie. Tutaj opisujemy protokół pełnego pokonania tej bariery rodowej poprzez przejściową nadmierną ekspresję kluczowych regulatorów trofoblastu Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2 w mysich fibroblastach embrionalnych. Indukowane komórki macierzyste trofoblastu są zdolne do samoodnawiania się i są prawie identyczne z komórkami macierzystymi trofoblastu pochodzącymi z blastocyst pod względem morfologii, ekspresji genów markerowych i wzorca metylacji. Funkcjonalne testy in vitro i in vivo potwierdzają, że komórki te są zdolne do różnicowania się wzdłuż linii trofoblastu, generując poliploidalne gigantyczne komórki trofoblastu i chimeryzując łożysko po wstrzyknięciu do blastocyst. Indukcja komórek macierzystych trofoblastu z tkanki somatycznej otwiera nowe możliwości badania cech genetycznych i epigenetycznych tej linii pozaembrionalnej i oferuje możliwość generowania linii komórek macierzystych trofoblastu bez niszczenia odpowiedniego zarodka.

Wprowadzenie

Niedawno, badanie porównujące kilka podejść do konwersji embrionalnych komórek macierzystych myszy na trofoblasty ujawniło, że we wszystkich analizowanych systemach konwersja linii pozostała niekompletna. Zamiast indukowanych komórek macierzystych trofoblastu (iTSC) wytworzone zostały tzw. komórki macierzyste trofoblastu, które zachowują pamięć o losie komórki pochodzenia¹. W tym przypadku zastosowaliśmy inne podejście do generowania iTSC. Podobnie jak w przypadku bezpośredniej indukcji pluripotencjalnych komórek macierzystych z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) ², iTSC zostały bezpośrednio przekształcone ze zróżnicowanej tkanki somatycznej. Po pierwsze, zidentyfikowaliśmy 12 potencjalnych czynników indukujących los TSC w przypadku nadekspresji w MEF. Później czynniki Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2 zostały zidentyfikowane jako niezbędne i wystarczające do indukcji iTSC ³. W tym samym czasie inna grupa niezależnie stwierdziła, że Tfap2c, Gata3 i Eomes są wystarczające do przekształcenia MEF w iTSC. Jednak w tym badaniu czas wymagany do ekspresji transgenu jest znacznie dłuższy w porównaniu z naszym badaniem, co wskazuje na inną kinetykę konwersji, gdy Ets2 jest nieobecny w koktajlu transdyferencyjnym ⁴.

Konwencjonalna płodowa surowica bydlęca (FBS) zawierająca hodowlę indukowanych i pochodzących z blastocyst komórek macierzystych trofoblastu opiera się na obecności czynników wydzielanych przez MEF-y inaktywowane wzrostem ^5,6. Podczas indukcji iTSC czynniki te są dostarczane przez MEF, które nie mają pełnej kombinacji transgenów i nie podlegają transdyferencjacji. Jednak po subhodowli poszczególnych kolonii iTSC wymagają one pożywki, która została wstępnie uwarunkowana przez MEF inaktywowane wzrostem. Od tego momentu iTSC mogą być hodowane i traktowane jak TSC pochodzące z blastocyst zgodnie ze standardowymi protokołami. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do Tanaka i wsp. ⁵, rutynowo hodujemy TSC i iTSC bez żelatynizacji naczyń do hodowli komórkowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim prawem ochrony zwierząt i za zgodą lokalnych komitetów ds. opieki nad zwierzętami (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nadrenia Północna-Westfalia [numer identyfikacyjny zezwolenia: AZ 84-02.04.2013.A428]).

1. Przygotowanie mediów

1. Przygotuj pożywkę 293T: Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 10% (v/v) FBS, L-glutamina (2 mM), pirogronian sodu (1 mM), penicylina/streptomycyna (1x).
2. Przygotuj pożywkę MEF: DMEM, 10% (v/v) FBS, L-glutamina (2 mM), 1x aminokwasy endogenne, penicylina/streptomycyna (1x).
3. Przygotuj pożywkę TS (bez FGF4/heparyny): Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 20% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), penicylina/streptomycyna (1x), L-glutamina (2 mM), pirogronian sodu (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM).
4. Przygotuj pożywkę TS z FGF4/heparyną (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), penicylina/streptomycyna (1x), L-glutamina (2 mM), pirogronian sodu (1 mM), 2-merkaptoetanol (0,1 mM), 25 ng/ml FGF4, 1 μg/ml heparyny.
   Uwaga: FGF4 i heparyna są dodawane bezpośrednio do pożywki bezpośrednio przed użyciem.
5. Przygotować TS-CM z FGF4/heparyną (TS-CM + F4H): 70% pożywki TS kondycjonowanej MEF + 30% świeżo przygotowanej pożywki TS + 25 ng/ml FGF4, 1 μg/ml heparyny.
   Uwaga: FGF4 i heparyna są dodawane bezpośrednio do pożywki bezpośrednio przed użyciem.
6. Przygotowanie pożywki transfekcyjnej: Zaawansowany DMEM, 2% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), L-glutamina (2 mM), penicylina/streptomycyna (1x).
7. Przygotuj pożywkę do produkcji wirusa: Zaawansowany DMEM, 5% (v/v) FBS (klasa hodowli komórek macierzystych), L-glutamina (2 mM), penicylina/streptomycyna (1x).

2. Wyprowadzenie mysich fibroblastów embrionalnych

1. Ustaw krycie w czasie przy użyciu samic wt 129S2SV i homozygotycznego samca myszy R26::rtTA (nazwa szczepu; Klasa B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(rtTA*M2)Jae/J 7}). Na E13.5 należy poświęcić myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i wyizolować pierwotne mysie fibroblasty zarodkowe (MEF) zgodnie ze standardowymi protokołami⁸. Następnie płytki komórek z jednego zarodka na szalce o średnicy 150 mm w pożywce MEF.
2. Gdy pierwotne kultury MEF osiągną zbieżność na szalkach o średnicy 150 mm, umyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS i dodaj 4 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA. Inkubować naczynia przez 3 - 4 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
3. Po inkubacji sprawdź, czy komórki oderwały się od naczynia za pomocą odwróconego mikroskopu (przy użyciu soczewki 10X). Dodać 5 ml pożywki MEF, aby zatrzymać trypsynizację i zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
4. Zbierz zawiesinę komórek z kilku naczyń i zbierz do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zawiesinę komórek wirować przez 3 minuty w temperaturze 200 x g i temperaturze 10 °C.
5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w FBS zawierającym 10% (v/v) dimetylosulfotlenku. Zamroź MEF-y w podwielokrotnościach do dalszego wykorzystania.
   Uwaga: Alternatywnie użyj podstawowych MEF-ów typu dzikiego; jednak dodatkowy wektor lentiwirusowy wyrażający rtTA musi być transdukowany razem z innymi wektorami lentiwirusowymi (na przykład przy użyciu plazmidu FUdeltaGW-rtTA opisanego przez Maherali i wsp. ⁹).
6. Przygotowanie kondycjonowanego MEF TS pożywki
   Uwaga: Przed eksperymentami konwersji należy przygotować pożywkę TS kondycjonowaną MEF (CM), która jest wymagana do subhodowli poszczególnych linii iTSC (opisanych w sekcji 6).
   1. Talerz 1 x 10⁷ mitotycznie inaktywowanych MEFów na 150 mm szalka w pożywce MEF na żądanej liczbie szalek. Dezaktywować MEF przez napromieniowanie γ dawką 9 Gy.
      Uwaga: Wydajność z naczynia 150 mm wynosi około 60 ml CM.
   2. Następnego dnia po posianiu odessać i odrzucić pożywkę MEF oraz dodać 20 ml świeżo przygotowanej pożywki TS (bez FGF4/heparyny) do każdej szalki z mitotycznie inaktywowanymi MEF i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
   3. Po inkubacji pożywki TS przez trzy dni na mitotycznych inaktywowanych MEF-ach, zebrać pożywkę w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przefiltrować medium przez filtr 0,2 μm i postępować zgodnie z ppkt 2.6.4. Zastąp CM 20 ml świeżej pożywki TS w celu przygotowania kolejnej partii CM.
      Uwaga: Mitotycznie inaktywowane MEF-y mogą być używane do przygotowania CM do trzech razy.
   4. Porcję 35 ml przefiltrowanego CM rozlać do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Po rozmrożeniu dodać 15 ml świeżo przygotowanej pożywki TS w celu uzyskania 70% TS-CM i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.

3. Produkcja wektorów lentiwirusowych w komórkach 293T

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w przestrzeni laboratoryjnej z licencją na poziom bezpieczeństwa biologicznego 2.

1. Przed eksperymentami konwersji należy przygotować wektory lentiwirusowe dla zależnej od doksycykliny (dox) nadekspresji Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 i mCherry. Dla każdego lentiwirusa należy kotransfekować komórki 293T przy użyciu odpowiedniego wektora przenoszącego lentiwirusa wraz z plazmidem pakującym i plazmidem otoczki eksprymującej VSV-G (informacje o plazmidzie znajdują się w tabeli materiałów).
   Uwaga: Aby uzyskać przydatne informacje na temat produkcji wirusów, zapoznaj się z Gavrilescu et al.¹⁰. Chociaż opisuje produkcję retrowirusa, ogólne uwagi dotyczące jakości komórek 293T i plazmidowego DNA są również prawdziwe w przypadku produkcji lentiwirusa.
   UWAGA: Podczas pracy z wektorami lentiwirusowymi należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa, a praca musi być wykonywana w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
2. Pokryj pięć szalek o średnicy 100 mm roztworem poli-L-lizyny (100 μg/ml), przykrywając szalki 5 ml roztworu i delikatnie kołysząc, aby równomiernie rozprowadzić roztwór powlekający. Umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Po 30 minutach odessać roztwór powlekający i raz spłukać naczynia PBS.
3. Płytka: 7 x 10⁶ komórek 293T na szalkę w 10 ml pożywki z komórek 293T, obracać szalki, aby równomiernie rozprowadzić komórki i umieszczać szalki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
4. Następnego ranka zastąp pożywkę wzrostową 5 ml pożywki do transfekcji. Dodać 6 μl 1000-krotnego roztworu chlorochiny (25 mM) i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
5. W międzyczasie przygotuj mieszaninę transfekcyjną:
   1. Dla każdego wektora lentiwirusowego należy przygotować dwie probówki reakcyjne o pojemności 5 ml, oznaczone jako A i B.
   2. Dodać 600 μl 2x buforowanej soli fizjologicznej HEPES (HBS) do probówki A.
   3. W probówce B wymieszać 61,5 μl roztworu CaCl₂ (2 M) z 18,5 μg DNA lentiwektora i 9,25 μg psPAX2 i 9,25 μg pMD2.G. Dostosować objętość do 600 μl za pomocą sterylnej kultury klasy_H2O.
   4. Dodaj roztwór z probówki B kroplami do probówki A podczas wirowania. Inkubować mieszaninę transfekcyjną przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Dodać mieszaninę transfekcyjną bardzo ostrożnie kroplami do przygotowanych komórek 293T na szalce 100 mm. Po 5 do 6 godzinach usuń pożywkę i zastąp ją 10 ml pożywki do produkcji wirusa. Włożyć naczynia z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania i wymiany pożywki, ponieważ ogniwa 293T łatwo odłączają się od naczynia. Zmiana podłoża 5-6 godzin po transfekcji ma kluczowe znaczenie, ponieważ długotrwała ekspozycja na chlorochinę jest toksyczna dla komórek.
7. Następnego ranka ostrożnie usunąć i wyrzucić pożywkę, a następnie zastąpić ją 7 ml pożywki do produkcji wirusa.
8. Następnego ranka należy zebrać pierwszą partię pożywki zawierającej wirusa. Odessać pożywkę i zebrać w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Ponownie dodaj 7 ml pożywki do produkcji wirusa na komórki. Pożywkę zawierającą wirusa należy przechowywać w lodówce do czasu zebrania drugiej partii następnego dnia.
9. Następnego ranka należy odessać drugą partię pożywki zawierającej wirusa, dodając ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej pierwszą partię. Komórki 293T można teraz wyrzucić. Przefiltrować pożywkę zawierającą wirusa przez filtr membranowy z octanu celulozy 0,45 μm bez środków powierzchniowo czynnych. Przefiltrowaną pożywkę zawierającą wirusy i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.
   Uwaga: Produkcja wirusa może być również prowadzona w naczyniach 6-dołkowych. Odpowiednio zmniejsz woluminy i numery komórek.

4. Transdukcja fibroblastów z 4 czynnikami i wektorem kontrolnym mCherry

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.

1. Schematyczne przedstawienie zarysu eksperymentu znajduje się na rysunku 1. Rozmrozić jedną podwielokrotność pierwotnych rtTA-MEF i płytkę 3,33 x 10⁵ komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki w całkowitej objętości 2 ml pożywki MEF. Przygotuj co najmniej 3 dołki i oznacz je 4 czynnikami (4F), mCherry i control.
   Uwaga: Alternatywnie można użyć MEF typu dzikiego, gdy wektor lentiwirusowy wykazujący ekspresję rtTA zostanie dodany do koktajlu lentiwektorowego w kroku 4.2.
2. Następnego dnia, po całkowitym odzyskaniu komórek po krioprezerwacji, zastąp pożywki MEF w trzech 6-dołkach odpowiednio 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) i 1 ml (kontrola) pożywki transdukcyjnej. Rozmrozić jedną podwielokrotność wirusa pLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -Ets i -mCherry w RT i dodać 100 μl każdego supernatantu zawierającego wirusa (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) do studzienki 4F.
   Uwaga: W przypadku MEF typu dzikiego należy zmniejszyć objętość wstępnie poszczepionych pożywek o 100 μl i dodatkowo dodać 100 μl wirusa FUdeltaGW-rtTA zawierającego supernatant do mieszaniny 4F.
3. Dodaj 100 μl pożywki zawierającej wirusa mCherry do studzienki oznaczonej mCherry. Dodać polibren do końcowego stężenia 8 μg/ml do każdej studzienki. Umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubować MEF-y O/N z supernatantem zawierającym wirusa.
   Uwaga: W przypadku MEF typu dzikiego należy zmniejszyć objętość wstępnie poszytych pożywek o 100 μl i dodatkowo dodać 100 μl supernatantu zawierającego wirusa FUdeltaGW-rtTA.
4. Następnego ranka ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą wirusa i przemyć trzykrotnie 2 ml PBS. Na koniec dodać 2 ml pożywki TS (bez FGF4/heparyny).
   Uwaga: Transdukowane MEF-y mogą być bezpośrednio wykorzystywane do eksperymentów indukcyjnych iTSC lub zamrażane do dalszego wykorzystania.

5. Konwersja fibroblastów na iTSC

Uwaga: Wszystkie kroki są wykonywane w przestrzeni laboratoryjnej z licencją na poziom bezpieczeństwa biologicznego 2.

1. Przemyć transdukowane MEF-y dwukrotnie 2 ml PBS i po dodaniu 0,5 ml roztworu trypsyny/EDTA inkubować je w inkubatorze przez 3 - 4 minuty. Sprawdź pod odwróconym mikroskopem, czy komórki są prawidłowo odłączone.
   1. Dezaktywuj trypsynę, dodając 1 ml pożywki TS. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 200 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki TS. Użyj nietransdukowanej próbki kontrolnej, aby policzyć komórki.
   2. Płytka 4F-MEF, mCherry-MEF i nietransdukowane kontrolne MEF, każda o gęstości 2 x 10 5 komórek na 100 mm naczynie do hodowli komórkowej w 10 ml pożywki TS zawierającej 2 μg/ml dox (pożywka TS + FGF4/heparyna + dox).
   3. Alternatywnie, wykonaj transdyferencjację na mniejszych naczyniach. Talerz 3,6 x 10³ komórki na cm² na żądanej wielkości naczynia, odpowiednio skaluj objętość.
2. Następnego dnia, za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (przy użyciu soczewki 10X i filtra odpowiedniego do wzbudzenia czerwonej fluorescencji) monitoruj ekspresję białka mCherry w celu oszacowania wydajności transdukcji.
   Uwaga: Wydajność transdukcji powinna być bliska 100%. Jeśli zwiększona śmierć komórki jest widoczna po indukcji transgenu, oznacza to, że miano wirusa było zbyt wysokie. Transdukcję należy powtórzyć ze zmniejszoną ilością pożywki zawierającej wirusa.
3. Od teraz zmieniaj podłoże na wszystkich naczyniach co drugi dzień aż do 10 dnia po poszyciu. Następnie nakarm komórki pożywką TS bez dox (pożywka TS + FGF4/heparyna).
4. Używanie monitora z odwróconym mikroskopem w celu wykrycia "obszarów transzróżnicowanych" (patrz rysunek 2B i C) na szalce 4F przez okres do 3 tygodni. Takie kolonie nie powinny być widoczne na dwóch szalkach kontrolnych (mCherry-MEFs i nietransdukowane MEF).

6. Izolacja poszczególnych linii iTSC

Uwaga: Dla kroku 6.3 kaptur do hodowli tkankowej nie jest wymagany. Zaleca się przetarcie odwróconego mikroskopu 70% etanolem, aby zminimalizować ryzyko skażenia bakteryjnego. Poszczególne kolonie iTSC można izolować między 21 a 28 dniem transdyferencjacji.

1. Dodaj 40 μl 0,05% roztworu trypsyny/EDTA do 12 dołków naczynia z dnem 96 U i umieść naczynie na lodzie.
2. Przed izolacją kolonii odessać pożywkę na szalce transdyferencyjnej 4F-MEF. Umyj komórki raz 10 ml PBS. Ponownie dodaj 10 ml PBS i umieść naczynie pod odwróconym mikroskopem.
3. Za pomocą pipety o pojemności 100 μl ustawionej na 40 μl podnieś pojedyncze kolonie, okrążając je końcówką pipety i zasysając pływającą kolonię. Przenieś komórki po jednej kolonii do jednego dołka przygotowanej 96-dołkowej płytki. Po wybraniu 12 rodzin należy umieścić 96-dołkowe naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
4. Dysocjuj komórki, pipetując w górę iw dół przez kilka razy i przenieś zawiesinę komórek do jednego dołka 24-dołkowego naczynia z przygotowanymi 500 μl pożywki TS-CM (30% świeżej pożywki TS + 70% CM + FGF4/heparyna).
5. Następnego dnia zastąp pożywkę świeżą pożywką TS-CM, aby usunąć martwe komórki. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
6. Monitoruj pojawienie się kolonii nabłonka z jasnymi granicami (patrz rysunek 2). Gdy pojawią się kolonie, hoduj do 70% zlewania się lub przez okres do jednego tygodnia i stopniowo rozwijaj się na większych naczyniach. Od tej pory komórki hodowlane są prawdziwymi TSC, zgodnie ze standardowymi protokołami w pożywkach zawierających surowicę lub w pożywkach niezawierających surowicy, zdefiniowanych ^{pożywkach 3,5,11}.

Wyniki

Na szalce, gdzie aktywowana jest transgeniczna ekspresja 4F, komórki szybko zmieniają morfologię (porównaj Rysunek 2A i B). Około 14 - 21 dnia pojawiają się wyraźne obszary transzróżnicowane (dwa przykłady podano na ryc. 2B i C). Te pierwotne kolonie nie mają typowej morfologii TSC; jednak po ich subhodowli pojawia się charakterystyczna morfologia nabłonka z ciasnymi krawędziami i jasnymi granicami, bardzo przypominająca prawdziwe TSC (ryc. 2D

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół transdyferencjacji oparty na 4 czynnikach (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) oferuje niezawodną metodę generowania wiernie przekształconych iTSC z mysich fibroblastów embrionalnych. Co więcej, metoda ta ma również zastosowanie w przypadku pourodzeniowych fibroblastów ogonowych, chociaż ze spadkiem skuteczności w porównaniu z fibroblastami embrionalnymi ³. Ogólnie rzecz biorąc, jakość pierwotnych fibroblastów jest krytycznym czynnikiem wpływającym na wynik transdyferencjacji i należy zach...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hyklalat doksycykliny	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Rozpuścić w sterylnym PBS, przygotować roztwór podstawowy 2 mg/ml. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
Sól difosforanu chlorochiny	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Przygotować 25 mM roztwór podstawowy w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
Polybrene (bromek heksadimetryny)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Przygotować roztwór podstawowy 8 mg/ml w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
ludzki rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów 4	ReliaTech	300-131L	Rozpuścić w sterylnym 0,1% BSA w PBS, przygotować 25 i mikro; g/ml roztworu podstawowego. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -80 ° C
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml przez rozpuszczenie w sterylnym PBS. Przechowuj porcje w temperaturze -80° C
ProFection System transfekcji ssaków	Promega	E1200
PBS, bez wapnia, bez magnezu	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, bez glutaminy	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poli-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P4707
Płodowa surowica bydlęca	Hyklon	SH30071.03IR
Filtr membranowy z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnych	Corning	431220
Aminokwasy endogenne	ThermoFisher Scientific	11140-035
Penicylina Streptomycyna	ThermoFisher Scientific	15140-122
Pirogronian sodu	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutamina	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-merkaptoetanol	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimetylosulfotlenek (DMSO), klasa hodowli komórkowych	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-GATA3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Myszy B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Myszy	6965
129S2SV	Charles River	129