Method Article

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

DOI:

10.3791/54277

⸱

July 25th, 2016

 , 
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste trofoblastu (TSC) powstają w wyniku pierwszej decyzji o losie komórki w rozwoju ssaków. Mogą być hodowane in vitro, zachowując zdolność do samoodnawiania się i różnicowania we wszystkie podtypy linii trofoblastu, co odpowiada populacji komórek macierzystych in vivo, które dały początek płodowej części łożyska. W związku z tym TSC stanowią unikalny model do badania rozwoju łożyska oraz decyzji o losie komórek zarodkowych i pozaembrionalnych in vitro. Począwszy od stadium blastocysty, wyraźna bariera epigenetyczna składająca się z metylacji DNA i modyfikacji histonów ściśle oddziela obie linie. Tutaj opisujemy protokół pełnego pokonania tej bariery rodowej poprzez przejściową nadmierną ekspresję kluczowych regulatorów trofoblastu Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2 w mysich fibroblastach embrionalnych. Indukowane komórki macierzyste trofoblastu są zdolne do samoodnawiania się i są prawie identyczne z komórkami macierzystymi trofoblastu pochodzącymi z blastocyst pod względem morfologii, ekspresji genów markerowych i wzorca metylacji. Funkcjonalne testy in vitro i in vivo potwierdzają, że komórki te są zdolne do różnicowania się wzdłuż linii trofoblastu, generując poliploidalne gigantyczne komórki trofoblastu i chimeryzując łożysko po wstrzyknięciu do blastocyst. Indukcja komórek macierzystych trofoblastu z tkanki somatycznej otwiera nowe możliwości badania cech genetycznych i epigenetycznych tej linii pozaembrionalnej i oferuje możliwość generowania linii komórek macierzystych trofoblastu bez niszczenia odpowiedniego zarodka.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno, badanie porównujące kilka podejść do konwersji embrionalnych komórek macierzystych myszy na trofoblasty ujawniło, że we wszystkich analizowanych systemach konwersja linii pozostała niekompletna. Zamiast indukowanych komórek macierzystych trofoblastu (iTSC) wytworzone zostały tzw. komórki macierzyste trofoblastu, które zachowują pamięć o losie komórki pochodzenia1. W tym przypadku zastosowaliśmy inne podejście do generowania iTSC. Podobnie jak w przypadku bezpośredniej indukcji pluripotencjalnych komórek macierzystych z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) 2, iTSC zostały bezpośrednio przekształcone ze zróżnicowanej tkanki somatycznej....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim prawem ochrony zwierząt i za zgodą lokalnych komitetów ds. opieki nad zwierzętami (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nadrenia Północna-Westfalia [numer identyfikacyjny zezwolenia: AZ 84-02.04.2013.A428]).

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotuj pożywkę 293T: Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 10% (v/v) FBS, L-glutamina (2 mM), pirogronian sodu (1 mM), penicylina/streptomycyna (1x).
  2. Przygotuj pożywkę MEF: DMEM, 10% (v/v) FBS, L-glutamina (2 mM), 1x aminokwasy endogenne, penicylina/streptomycyna (1x).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na szalce, gdzie aktywowana jest transgeniczna ekspresja 4F, komórki szybko zmieniają morfologię (porównaj Rysunek 2A i B). Około 14 - 21 dnia pojawiają się wyraźne obszary transzróżnicowane (dwa przykłady podano na ryc. 2B i C). Te pierwotne kolonie nie mają typowej morfologii TSC; jednak po ich subhodowli pojawia się charakterystyczna morfologia nabłonka z ciasnymi krawędziami i jasnymi granicami, bardzo przypominająca prawdziwe TSC (ryc. 2D

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół transdyferencjacji oparty na 4 czynnikach (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) oferuje niezawodną metodę generowania wiernie przekształconych iTSC z mysich fibroblastów embrionalnych. Co więcej, metoda ta ma również zastosowanie w przypadku pourodzeniowych fibroblastów ogonowych, chociaż ze spadkiem skuteczności w porównaniu z fibroblastami embrionalnymi 3. Ogólnie rzecz biorąc, jakość pierwotnych fibroblastów jest krytycznym czynnikiem wpływającym na wynik transdyferencjacji i należy zach.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hyklalat doksycyklinySigma-AldrichD9891-10GRozpuścić w sterylnym PBS, przygotować roztwór podstawowy 2 mg/ml. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
Sól difosforanu chlorochiny Sigma-AldrichC6628-25GPrzygotować 25 mM roztwór podstawowy w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
Polybrene (bromek heksadimetryny)Sigma-Aldrich107689-10GPrzygotować roztwór podstawowy 8 mg/ml w sterylnej wodzie do hodowli komórkowych. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C
ludzki rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów 4ReliaTech300-131LRozpuścić w sterylnym 0,1% BSA w PBS, przygotować 25 i mikro; g/ml roztworu podstawowego. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -80 ° C
Sól sodowa heparynySigma-AldrichH3149-10KUPrzygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml przez rozpuszczenie w sterylnym PBS. Przechowuj porcje w temperaturze -80° C
ProFection System transfekcji ssakówPromegaE1200
PBS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher Scientific1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAXThermoFisher Scientific31966-021
RPMI 1640, bez glutaminyThermoFisher Scientific31870-025
Advanced DMEM (1x)ThermoFisher Scientific12491-015
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific25300-054
Poli-L-lizynaSigma-AldrichP4707
Płodowa surowica bydlęcaHyklonSH30071.03IR
Filtr membranowy z octanu celulozy bez środków powierzchniowo czynnychCorning431220
Aminokwasy endogenneThermoFisher Scientific11140-035
Penicylina StreptomycynaThermoFisher Scientific15140-122
Pirogronian sodu ThermoFisher Scientific11360-039
L-glutamina ThermoFisher Scientific25030-24
2-merkaptoetanolThermoFisher Scientific31350-010
Dimetylosulfotlenek (DMSO), klasa hodowli komórkowychPanreac AppliChem GmbHA3672,0100
pLV-tetO-Tfap2cAddgene70269
pLV-tetO-GATA3Addgene70270
pLV-tetO-EomesAddgene70271
pLV-tetO-Ets2Addgene70272
pLV-tetO-mCherryAddgene70273
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
FUdeltaGW-rtTA Addgene19780
Myszy B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7JAX Myszy6965
129S2SVCharles River129

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trophoblast Stem CellsMurine Embryonic FibroblastsDirect Cell ConversionLentiviral Vector TransfectionTfap2c Gata3 Eomes Ets2Induced Trophoblast Stem CellsPoly L lysine Coating293 T Cell TransfectionVirus Harvesting ProtocolColony Picking Technique

Related Articles