Artykuł metodologiczny

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

DOI:

10.3791/54283

⸱

10 lipca 2016

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Architektura rozgałęzionych organów, takich jak płuca, nerki i gruczoły sutkowe, powstaje w wyniku procesu rozwojowego rozgałęzionej morfogenezy, która jest regulowana przez różne rozpuszczalne i fizyczne sygnały w mikrośrodowisku. Opisana tutaj jest metoda stworzona do badania procesu rozgałęziania się morfogenezy poprzez tworzenie zaprojektowanych trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonym kształcie i rozmiarze, które są całkowicie osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Metoda ta umożliwia tworzenie układów identycznych tkanek i umożliwia kontrolę różnych czynników środowiskowych, w tym geometrii tkanek, odstępów i składu ECM. Metodę tę można również połączyć z szeroko stosowanymi technikami, takimi jak mikroskopia sił trakcyjnych (TFM), aby uzyskać więcej informacji na temat interakcji między komórkami i otaczającym je ECM. Protokół może być wykorzystany do badania różnych procesów komórkowych i tkankowych poza rozgałęzioną morfogenezą, w tym inwazji raka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój rozgałęzionych tkanek nabłonkowych, znany jako rozgałęziona morfogeneza, jest regulowany przez czynniki komórkowe, fizyczne i środowiskowe. W gruczole sutkowym rozgałęziona morfogeneza jest procesem iteracyjnym, w którym kierowana zbiorowa migracja komórek tworzy architekturę przypominającą drzewo. Pierwszym krokiem jest pierwotne utworzenie pąków z przewodów mlecznych, a następnie inicjacja gałęzi i wydłużenie1,2. Inwazja gałęzi do otaczającego zrębu jest indukowana przez ogólnoustrojowe uwalnianie hormonów steroidowych w okresie dojrzewania. Nowe pierwotne pąki następnie inicjują się z końców istniejących gałęzi, a proces ten kontynuuje tworzenie drzewa nabłonkowego3. Chociaż zidentyfikowano wiele ważnych sygnałów biochemicznych, obecnie brakuje kompleksowego zrozumienia mechanizmów biologicznych komórek, które kierują tym złożonym procesem rozwojowym. Co więcej, badania mechanistyczne nad wpływem konkretnych sygnałów są trudne do dekonstrukcji na podstawie eksperymentów in vivo, ponieważ precyzyjne perturbacje i pomiary czasoprzestrzenne często nie są możliwe.

Techniki hodowli trójwymiarowej (3D), takie jak hodowla całych organów, pierwotne organoidy i modele hodowli komórkowych, są użytecznymi narzędziami do systematycznego badania mechanizmów leżących u podstaw morfogenezy tkanek4-6. Mogą one być szczególnie przydatne do określania wpływu określonych czynników indywidualnie, takich jak siły mechaniczne i sygnały biochemiczne, na różne zachowania komórek, w tym migrację, proliferację i różnicowanie. 6 W szczególności zmodyfikowane modele hodowli komórkowych umożliwiają łatwe zaburzanie pojedynczych komórek i ich mikrośrodowiska.

Jeden z takich modeli kulturowych wykorzystuje podejście oparte na mikrofabrykacji do inżynierii modelowania tkanek nabłonka sutka z kontrolowaną strukturą 3D, które konsekwentnie i powtarzalnie tworzą gałęzie, które migrują zbiorowo, gdy są indukowane odpowiednimi czynnikami wzrostu. Główną zaletą modelu jest możliwość precyzyjnego manipulowania i mierzenia wpływu czynników fizycznych i biochemicznych, takich jak wzorce naprężeń mechanicznych, z dużą pewnością statystyczną. Technika ta, wraz z modelowaniem obliczeniowym, została już wykorzystana do określenia względnego udziału sygnałów fizycznych i biochemicznych w kierowaniu normalnym rozwojem tkanek nabłonka sutka i innych nabłonków rozgałęzionych7-11. Przedstawiono szczegółowy protokół budowy tych tkanek modelowych, który można łatwo rozszerzyć na inne typy komórek i żele macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i który służy jako potencjalne narzędzie do testowania środków terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów

  1. Aby przygotować roztwór insuliny o stężeniu 5 mg/ml, należy rozcieńczyć sproszkowany zapas insuliny 5 mM kwasem solnym (HCl) w dH2O (500 mg insuliny w 100 ml rozpuszczalnika). Przygotować 100 ml rozpuszczalnika, dodając 50 μl stężonego HCl do 100 ml wody destylowanej (dH2O).
  2. Aby przygotować 1x roztwór PBS, rozcieńczyć 10x roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do 1x z dH2O w sterylnych warunkach.
  3. Przygotować roztwór elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) w następujący sposób: wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 (w:w).
  4. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych w następujący sposób: do 500 ml wywaru Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium firmy Dulbecco: mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12), dodać 10 ml sterylnej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 500 μl odczynnika gentamycyny i 500 μl 5 mg/ml insuliny.
  5. Aby przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w 1x roztworze PBS, dodaj 1% (w:v) roztwór proszku BSA do 1x PBS i dokładnie wymieszaj.
  6. Aby przygotować 4 mg/ml roztworu zobojętnionego kolagenu bydlęcego typu I, dodaj 50 μl 10x bufor zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), 30 μl 0,1 N wodorotlenku sodu (NaOH), 30 μl pożywki do hodowli komórkowych i 400 μl kolagenu wyjściowego do schłodzonej 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Mieszać powoli, pipetując w górę i w dół; Unikaj wprowadzania bąbelków. Aby usunąć pęcherzyki, należy na krótko odwirować mieszaninę w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować roztwór utrwalający, rozcieńczając 16% paraformaldehydu w stosunku 1:4 (v:v) w 1x PBS.
  8. Przygotować roztwór do znakowania jąder, rozcieńczając podstawowy roztwór do znakowania jąder w stosunku 1:1,000 (v:v) w 1x PBS.
  9. Przygotować 0,3% buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej i detergentu (PBST), mieszając 1x PBS z 0,3% (v:v) detergentem.
  10. Przygotować bufor blokujący, rozcieńczając surowicę kozią w stosunku 1:10 (v:v) w 0,3% PBST.
  11. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego dla określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania, rozcieńczając przeciwciało pierwszorzędowe (na przykład królicza antyogniskowa kinaza adhezyjna (FAK)) w stosunku 1:200 (v:v) w buforze blokującym.
  12. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając przeciwciało sprzężone z sondą fluorescencyjną (na przykład przeciwciało anty-królika kozy) w stosunku 1:1,000 (v:v) w buforze blokującym.

2. Przygotowanie stempli elastomerowych do mikrowzorów 3D

Uwaga: Stemple elastomerowe są wykonane z PDMS.

  1. Przygotuj roztwór PDMS w tym samym stosunku, jak opisano w kroku 1.3 i dokładnie wymieszaj. Umieść mieszaninę w komorze próżniowej na 15-30 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które zostały wprowadzone podczas procesu mieszania.
  2. Wlej odgazowany roztwór do plastikowej łódki wagowej lub szalki Petriego zawierającej krzemowy wzorzec litograficznie wzorzysty z cechami pożądanej geometrii. Aby uzyskać najlepsze wyniki, utwardź roztwór PDMS w temperaturze 60 °C przez ~12 godz.
    Uwaga: Wzorce krzemowe są wysoce konfigurowalne; W protokole tym wykorzystuje się struktury prostokątne o wymiarach 50 μm x 200 μm x 50 μm oddalone od siebie o 200 μm. Wzorce krzemowe mogą być wykonane przy użyciu standardowych technik fotolitografii. Krótko mówiąc, fotorezystor na bazie żywicy epoksydowej jest powlekany wirowo na płytce krzemowej. Maska szczegółowo opisująca pożądane cechy stempla jest umieszczana na wierzchu płytki pokrytej fotorezystem, która jest następnie wystawiana na działanie światła UV. Pożądane cechy, które nie są blokowane przez maskę, są wystawione na działanie światła, a fotorezyst w tych miejscach zostaje usieciowany, podczas gdy pozostała część powłoki fotorezystu jest rozpuszczalna i może zostać zmyta.
  3. Po utwardzeniu PDMS wokół pożądanych cech na wzorcu krzemowym, wyjmij PDMS i master z plastikowego pojemnika. Ostrożnie oddziel PDMS od płytki krzemowej i usuń nadmiar PDMS z okolic nadrukowanych elementów za pomocą czystej żyletki.
  4. Teraz wytnij PDMS z nadrukowanymi cechami w indywidualne prostokątne stemple (~8 mm x 5 mm) za pomocą żyletki. Przechowuj je stroną do góry na czystej szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  5. Dodatkowo należy skorzystać z rozwiązania PDMS opisanego w kroku 1.3, aby wykonać podpory dla prostokątnych stempli.
  6. Za pomocą powlekarki wirowej rozprowadzić ~2-3 g roztworu PDMS równomiernie na szalce Petriego o średnicy 100 mm i utwardzić PDMS przez ~12 godzin w temperaturze 60 °C, jak w kroku 2.1. Następnie za pomocą żyletki pokrój cienką warstwę PDMS na prostokąty (~5 mm x 2 mm).
    Uwaga: Dla każdego stempla PDMS wykonanego w kroku 2.3 potrzebne są dwie podpory. Podpory mogą być przechowywane na szalce Petriego o średnicy 100 mm, która zawiera stemple PDMS.
  7. Zanim stemple i nośniki PDMS będą mogły być używane do hodowli komórkowych, należy je wysterylizować przez zanurzenie w 70% etanolu i wysuszyć za pomocą aspiratora w komorze bezpieczeństwa biologicznego (kaptur do hodowli komórkowych).

3. Przygotowanie tkanek nabłonkowych 3D

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj kroplę około 50 μl 1% BSA w PBS na górze każdego stempla. Umieścić stemplowanie pokryte kropelkami w temperaturze 4 °C na co najmniej 4 godziny, aby zapewnić adsorpcję BSA na powierzchni stempla.
  2. Zassać roztwór BSA ze stempli PDMS.
  3. Powierzchnie stempli należy przemyć dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowych (powinno wystarczyć 50 μl na przemycie na stempel), odsysając po każdym praniu.
  4. Manipuluj wysterylizowanymi stemplami i podporami PDMS za pomocą zakrzywionej pęsety ze stali nierdzewnej. W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozłóż jedno naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm dla każdego stempla PDMS. W każdym naczyniu ułóż dwie podpory PDMS oddalone od siebie o odległość nieco mniejszą niż długość stempli PDMS.
  5. Za pomocą pęsety wysterylizuj tyle okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych (15 mm średnicy, #1), ile jest znaczków PDMS, używając 70% etanolu. Odessać nadmiar płynu z szkiełek nakrywkowych, trzymając je pęsetą. Umyte szkiełka nakrywkowe należy przechowywać na osobnej szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  6. Dozuj ~50 μl mieszanki kolagenowej, aby równomiernie pokryć powierzchnię każdego stempla PDMS.
  7. Podnieś pęsetą każdy stempel PDMS pokryty kolagenem i delikatnie je odwróć. Opuść odwrócone stemple na górze podpór PDMS ułożonych w kulturze tkankowej o średnicy 35 mm wydrążonej w taki sposób, aby kolagen znajdował się między stemplem a dnem naczynia do hodowli tkankowej. Inkubować naczynia w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  8. Dozuj ~ 50 μl pozostałej mieszanki kolagenu na każde z okrągłych szkiełek nakrywkowych (później zostaną one umieszczone na zmodyfikowanych tkankach, aby całkowicie zamknąć je w kolagenie) i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  9. Uzyskaj naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm zawierające komórki nabłonkowe (np. EpH4 mysie komórki nabłonkowe sutka) przy ~40% zbieganiu. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej i przemyć raz 10 ml 1x PBS. Dodać 2 ml trypsyny do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
  10. Dodać 8 ml świeżej pożywki hodowlanej do naczynia do hodowli tkankowej zawierającej trypsynizowane komórki, odrywając od naczynia wszelkie pozostałe przylegające komórki. Delikatnie wymieszać pipetując i przenieść mieszaninę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 100 × g przez 5 minut.
  11. Odessać supernatant z rurki stożkowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do hodowli komórkowych. Za pomocą hemocytometru policz komórki, aby określić stężenie zawiesiny. Dostosuj objętość zawiesiny, aby uzyskać końcowe stężenie ~106-10 7komórek/ml.
  12. Usunąć zżelowane próbki kolagenu z inkubatora. Za pomocą pęsety delikatnie podnieś stemple PDMS prosto do góry, aby oderwać je od uformowanego kolagenu i wyrzucić.
  13. Dozować ~30 μl skoncentrowanej zawiesiny komórkowej na powierzchnię każdego żelu kolagenowego zawierającego uformowane ubytki o pożądanej geometrii. Obserwuj komórki pod mikroskopem jasnego pola za pomocą obiektywu 10X/0,25 NA, delikatnie potrząsając szalkami na boki, aby ułatwić osadzanie się komórek w jamach. Ubytki należy wypełnić w ciągu ~5 min.
  14. Aby usunąć nadmiar komórek z okolic jam, przechyl każde naczynie do hodowli tkankowych na bok i delikatnie dozuj ~400 μl pożywki do hodowli komórkowych na powierzchnię żelu kolagenowego. Odessać płyn i powtórzyć pranie jeszcze 1-2 razy, sprawdzając żele kolagenowe pod mikroskopem pomiędzy każdym praniem.
  15. Po usunięciu nadmiaru komórek z okolic wypełnionych komórkami jam w formie kolagenowej, należy umieścić szalki z kultur tkankowych w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 15 minut. Następnie za pomocą pęsety delikatnie odwróć pokryte kolagenem szkiełka nakrywkowe i umieść je na wypełnionych komórkami formach kolagenowych tak, aby kolagen z szkiełek nakrywkowych utworzył czapeczkę nad jamami wypełnionymi komórkami. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  16. Gdy nakrętki kolagenowe przylgną do wypełnionej komórkami formy kolagenowej, powoli dozuj ~ 2-2,5 ml pożywki do hodowli komórkowych na szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu żeli. Hodować próbki w temperaturze 37 °C przez 1-3 dni.
    Uwaga: 24 godziny po pierwszym wysiewie tkanki nabłonkowe można potraktować czynnikami wzrostu, takimi jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) lub czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) w celu wywołania rozgałęzień.

4. Immunofluorescencja i analiza obrazu

  1. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z szalek do hodowli tkankowych i dodać tyle roztworu utrwalającego, aby pokryć żele zawierające komórki. Inkubuj naczynia w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min.
  2. Odessać utrwalacz, napełnić szalki do kultur tkankowych 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. Powtórz dwa razy przez trzy prania.
  3. Aby oznaczyć jądra: Odessać PBS z naczynia do hodowli tkankowej i zastąpić roztworem Hoechsta. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut. Aby wybarwić FAK lub inny marker, który jest wykrywalny za pomocą przeciwciał, przejdź do kroku 4.5.
  4. Odessać roztwór do znakowania jądrowego i przemyć żele zawierające komórki trzykrotnie 1x PBS, jak w kroku 4.2. Barwione próbki można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  5. Aby wybarwić w celu uzyskania interesującego białka: Odessać PBS z szalek do hodowli tkankowych, dodać 300 μl 0,3% PBST i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  6. Odessać PBS, przykryć żele buforem blokującym i inkubować na wytrząsarce (200 obr./min) w temperaturze pokojowej przez ~4 godziny.
  7. Odessać bufor blokujący, przykryć żele pierwszorzędowym roztworem przeciwciała i inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego, dodać 0,3% roztwór PBST i inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min w temperaturze pokojowej przez 30 min. Odsysać PBST i powtarzać co 30 minut przez 3-4 godziny.
  9. Powtórzyć kroki 4.7 i 4.8, tym razem inkubując z drugorzędowym roztworem przeciwciała. Owiń naczynia do hodowli tkankowych folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu przeciwciała wtórnego. Po ostatnim umyciu wybarwione próbki można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  10. Aby uwidocznić próbki, użyj obiektywu 10X/0,30 NA skoncentrowanego na płaszczyźnie środkowej tkanek nabłonkowych.
  11. Aby uwidocznić jądra komórkowe, należy zobrazować utrwalone próbki oznaczone markerem jądrowym za pomocą obiektywu 10X/0,30 NA w świetle UV.
  12. Aby zobrazować próbki barwione pod kątem białka będącego przedmiotem zainteresowania, zobrazuj za pomocą obiektywu 10X/0,30 NA na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.
  13. Aby utworzyć mapy częstotliwości barwienia białek wielu tkanek (zwykle 50 lub więcej) o identycznej geometrii początkowej, najpierw zaimportuj każdy z obrazów za pomocą standardowego oprogramowania do analizy obrazów (patrz Materiały) i przekonwertuj je na 8-bitową skalę szarości.
  14. Aby progizować te obrazy, przekonwertuj je na binarne (tj. półcienie/czerń i biel), definiując punkt odcięcia skali szarości; wartości skali szarości poniżej progu stają się czarne, a te powyżej progu stają się białe. Następnie połącz każdy z pojedynczych obrazów binarnych w jeden stos obrazów.
  15. Następnie zarejestruj ułożone w stos obrazy (tj. wyrównaj je lub dopasuj) w oprogramowaniu do analizy. Wiele pakietów oprogramowania do analizy obrazu jest dostarczanych z bezpłatną wtyczką rejestracyjną.
    1. Użyj każdego obrazu w stosie jako szablonu do wyrównania następnego obrazu, tak aby obrazy w całym stosie były wyrównywane przez propagację. Na koniec nałóż (wyświetl) obrazy w wyrównanym stosie obrazów na podstawie średniej intensywności, aby utworzyć pojedynczy obraz z mapą częstotliwości pikseli. Ten obraz można następnie oznaczyć kolorami za pomocą wybranego oprogramowania do edycji obrazu10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny schemat mikrofabrykacji tkanki nabłonka sutka

Ogólny schemat procedury mikrofabrykacji, przedstawiający przebieg pracy eksperymentalnej, jest pokazany na rysunku 1. Efektem końcowym jest szereg tkanek nabłonkowych o identycznej geometrii i odstępach, które są całkowicie osadzone w żelu ECM. W reprezentatywnym doświadczeniu wykorzystano mysie komórki nabłonka sutka EpH4 hodowane w żelu z bydlęcego kolagenu typu I w stężen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół przedstawia metodę wytwarzania identycznych tkanek nabłonkowych o określonym kształcie, umożliwiającą przestrzenną kontrolę naprężeń mechanicznych doświadczanych przez komórki w tkance. Forma elastomerowa służy do tworzenia ubytków w kolagenie typu I, które są następnie wypełniane komórkami nabłonkowymi i pokrywane dodatkową warstwą kolagenu, tak aby komórki były całkowicie zamknięte w środowisku matrycy kolagenowej 3D. Dalsza hodowla tych tkanek i leczenie czynnikami wzrostu w celu wywołania roz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z NIH (HL118532, HL120142, CA187692), Fundacji Davida i Lucile Packardów, Fundacji Camille i Henry'ego Dreyfusów oraz Burroughs Welcome Fund. A.S.P. było częściowo wspierane przez Charlotte Elizabeth Procter Honorific Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polidimetylosiloksan (PDMS)Kleje Ellsworth Sylgard184
Utwardzacz PDMSKleje EllsworthSylgard 184
Litograficznie wzorzysty silikonowy mistrzwłasnej produkcjiN/A
Plastikowa łódź do ważeniaFisher Scientific08-732-115
Szalki Petriego o średnicy 100 mmBioExpressD-2550-2
Alkohol etylowy 200 ProofPharmco-Aaper111000200Przygotuj 70% roztwór EtOH (v:v) mieszając z dH2O
ŻyletkaAmerykańska maszynka do golenia620179
1:1 Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni : Szynka" s F12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12) (1:1)HyklonSH30023FS
płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150H
10x Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Life Technologies14185-052
InsulinaSigma AldrichI6634-500MG
GentamycynaLife Technologies15750-060
10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher ScientificBP399-500
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma Aldrich221465-500G
Bydło kolagen typu I (niepepsynizowany)KokenIAC-50
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA-7906
Zakrzywiona pęseta ze stali nierdzewnejDumont7
Naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mmBioExpressT-2881-6
15 ml probówki stożkoweBioExpressC-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock TubeUSA Scientific1615-5500
Okrągłe szkiełka nakrywkowe #1, średnica 15 mmBellco Glass Inc.Specjalne zamówienie
0,05% 1x Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
ParaformaldehydVWR100503-916
Triton X-100Perkin ElmerN9300260 Detergent
HGFSigma AldrichH 9661Zawieszony w dH2O w stężeniu 50 mg/ml
Królicze przeciwciało przeciw myszomFAK Life TechnologieAMO0672
Koza anty-królik Przeciwciało Alexa 488Life TechnologiesA-11034
Adobe PhotoshopAdobeN/ASłuży do kodowania kolorami map częstotliwości pikseli.
FIJI (ImageJ)NIHN/ADarmowe oprogramowanie do analizy obrazów służące do progowania, rejestrowania i nakładania obrazów w celu stworzenia mapy częstotliwości pikseli. Wtyczka StackReg została użyta do rejestracji obrazów binarnych.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
  3. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  4. Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
  5. Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
  6. Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
  7. Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
  8. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
  10. Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458(2015).
  11. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
  12. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  13. Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
  14. Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe tkanki nab onkowemorfogeneza rozga nikael kolagenowystempla PDMSmikroskopia si trakcyjnychwysiew kom rekgeometria tkankiopracowanie HGFkinaza adhezji ogniskowej

Powiązane artykuły