Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Summary

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Abstract

Architektura rozgałęzionych organów, takich jak płuca, nerki i gruczoły sutkowe, powstaje w wyniku procesu rozwojowego rozgałęzionej morfogenezy, która jest regulowana przez różne rozpuszczalne i fizyczne sygnały w mikrośrodowisku. Opisana tutaj jest metoda stworzona do badania procesu rozgałęziania się morfogenezy poprzez tworzenie zaprojektowanych trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonym kształcie i rozmiarze, które są całkowicie osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Metoda ta umożliwia tworzenie układów identycznych tkanek i umożliwia kontrolę różnych czynników środowiskowych, w tym geometrii tkanek, odstępów i składu ECM. Metodę tę można również połączyć z szeroko stosowanymi technikami, takimi jak mikroskopia sił trakcyjnych (TFM), aby uzyskać więcej informacji na temat interakcji między komórkami i otaczającym je ECM. Protokół może być wykorzystany do badania różnych procesów komórkowych i tkankowych poza rozgałęzioną morfogenezą, w tym inwazji raka.

Introduction

Rozwój rozgałęzionych tkanek nabłonkowych, znany jako rozgałęziona morfogeneza, jest regulowany przez czynniki komórkowe, fizyczne i środowiskowe. W gruczole sutkowym rozgałęziona morfogeneza jest procesem iteracyjnym, w którym kierowana zbiorowa migracja komórek tworzy architekturę przypominającą drzewo. Pierwszym krokiem jest pierwotne utworzenie pąków z przewodów mlecznych, a następnie inicjacja gałęzi i wydłużenie^1,2. Inwazja gałęzi do otaczającego zrębu jest indukowana przez ogólnoustrojowe uwalnianie hormonów steroidowych w okresie dojrzewania. Nowe pierwotne pąki następnie inicjują się z końców istniejących gałęzi, a proces ten kontynuuje tworzenie d....

Protocol

1. Przygotowanie roztworów

1. Aby przygotować roztwór insuliny o stężeniu 5 mg/ml, należy rozcieńczyć sproszkowany zapas insuliny 5 mM kwasem solnym (HCl) w dH₂O (500 mg insuliny w 100 ml rozpuszczalnika). Przygotować 100 ml rozpuszczalnika, dodając 50 μl stężonego HCl do 100 ml wody destylowanej (dH₂O).
2. Aby przygotować 1x roztwór PBS, rozcieńczyć 10x roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do 1x z dH₂O w sterylnych warunkach.
3. Przygotować roztwór elastomeru polidimetylosiloksanu (PDMS) w następujący sposób: wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 (w:w).

Results

Ogólny schemat mikrofabrykacji tkanki nabłonka sutka

Ogólny schemat procedury mikrofabrykacji, przedstawiający przebieg pracy eksperymentalnej, jest pokazany na rysunku 1. Efektem końcowym jest szereg tkanek nabłonkowych o identycznej geometrii i odstępach, które są całkowicie osadzone w żelu ECM. W reprezentatywnym doświadczeniu wykorzystano mysie komórki nabłonka sutka EpH4 hodowane w żelu z bydlęcego kolagenu typu I w stężen.......

Discussion

Opisany powyżej protokół przedstawia metodę wytwarzania identycznych tkanek nabłonkowych o określonym kształcie, umożliwiającą przestrzenną kontrolę naprężeń mechanicznych doświadczanych przez komórki w tkance. Forma elastomerowa służy do tworzenia ubytków w kolagenie typu I, które są następnie wypełniane komórkami nabłonkowymi i pokrywane dodatkową warstwą kolagenu, tak aby komórki były całkowicie zamknięte w środowisku matrycy kolagenowej 3D. Dalsza hodowla tych tkanek i leczenie czynnikami wzrostu w celu wywołania roz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Kleje Ellsworth Sylgard	184
Utwardzacz PDMS	Kleje Ellsworth	Sylgard 184
Litograficznie wzorzysty silikonowy mistrz	własnej produkcji	N/A
Plastikowa łódź do ważenia	Fisher Scientific	08-732-115
Szalki Petriego o średnicy 100 mm	BioExpress	D-2550-2
Alkohol etylowy 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Przygotuj 70% roztwór EtOH (v:v) mieszając z dH2O
Żyletka	Amerykańska maszynka do golenia	620179
1:1 Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni : Szynka" s F12 Mieszanka składników odżywczych (DMEM/F12) (1:1)	Hyklon	SH30023FS
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulina	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamycyna	Life Technologies	15750-060
10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Bydło kolagen typu I (niepepsynizowany)	Koken	IAC-50
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Zakrzywiona pęseta ze stali nierdzewnej	Dumont	7
Naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm	BioExpress	T-2881-6
15 ml probówki stożkowe	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
Okrągłe szkiełka nakrywkowe #1, średnica 15 mm	Bellco Glass Inc.	Specjalne zamówienie
0,05% 1x Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldehyd	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer		N9300260 Detergent
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Zawieszony w dH2O w stężeniu 50 mg/ml
Królicze przeciwciało przeciw myszom	FAK Life Technologie	AMO0672
Koza anty-królik Przeciwciało Alexa 488	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Służy do kodowania kolorami map częstotliwości pikseli.
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	Darmowe oprogramowanie do analizy obrazów służące do progowania, rejestrowania i nakładania obrazów w celu stworzenia mapy częstotliwości pikseli. Wtyczka StackReg została użyta do rejestracji obrazów binarnych.