Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Podsumowanie

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Streszczenie

Carbohydraty active enzymes (CAZymes) pełnią wiele ról in vivo i są szeroko stosowane w przetwórstwie przemysłowym w przemyśle biopaliwowym, tekstylnym, detergentowym, papierniczym i spożywczym. Głębsze zrozumienie CAZymes jest ważne zarówno z punktu widzenia biologii podstawowej, jak i przemysłu. W przyrodzie występuje ogromna liczba CAZymów (zwłaszcza w mikroorganizmach), a setki tysięcy zostały skatalogowane i opisane w bazie danych carbohydrate active enzyme (CAZy). Jednak tempo odkrywania domniemanych enzymów przewyższyło naszą zdolność do biochemicznego scharakteryzowania ich aktywności. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest to, że postępy w sekwencjonowaniu genomu i transkryptomu, wraz z powiązanymi narzędziami bioinformatycznymi, pozwalają na szybką identyfikację potencjalnych CAZymes, ale technologia określania cech biochemicznych enzymu rozwija się wolniej. Aby wypełnić tę lukę technologiczną, opisano tutaj nowatorski zestaw do testów o wysokiej przepustowości oparty na nierozpuszczalnych podłożach chromogennych. Wyprodukowano dwa różne typy substratów: substraty Chromogenne Polymer Hydrogel (CPH) (wykonane z oczyszczonych polisacharydów i białek) orazrozpuszczalne wC hromogenne substraty Biomass (ICB) (wykonane ze złożonych materiałów biomasowych). Zarówno substraty CPH, jak i ICB są dostarczane w 96-dołkowym systemie testów o wysokiej przepustowości. Substraty CPH mogą być wykonane w czterech różnych kolorach, co umożliwia ich mieszanie ze sobą, a tym samym zwiększa wydajność testów. Protokół opisuje test na 96-dołkowej płytce i ilustruje, w jaki sposób ten test może być wykorzystany do badania przesiewowego aktywności enzymów, koktajli enzymatycznych i bulionów.

Wprowadzenie

Techniki eksploracji genomów i metagenomów rozwinęły się szybko w ostatnich latach, podobnie jak średnio- i wysokoprzepustowe strategie klonowania i ekspresji rekombinowanych enzymów. Co więcej, zasoby bioinformatyczne i związane z nimi depozyty, takie jak (CAZy)^1,2, znacznie się rozwinęły. Wykorzystanie różnorodności enzymów mikrobiologicznych do celów przemysłowych wiąże się jednak z poważnymi wyzwaniami, a empiryczne określenie aktywności enzymów stało się obecnie poważnym wąskim gardłem. Na przykład szacuje się, że przy użyciu obecnych metod możemy bezpiecznie przewidzieć aktywność nie więcej niż 4% białek w bazie danych CAZy. Chociaż dostępnych jest wiele metod monitorowania aktywności enzymów, wszystkie mają pewne ograniczenia. Dostępne są sprawdzone techniki oparte na chromatografii w połączeniu ze spektrometrią mas do oceny oligomerycznych fragmentów aktywności hydrolazy glikozylowej (GH)^3,4. Jednak te podejścia są pracochłonne i na ogół mają niską przepustowość. Metody oparte na pomiarze cukrów redukujących, takie jak kwas dinitrosalicylowy⁵ i testy Nelsona-Somogyi'ego⁶, są szeroko stosowane do oceny aktywności GH. Jednak testy te mają ograniczoną przepustowość i mogą być podatne na reakcje uboczne. Poszczególne chromogenne substraty polisacharydowe, takie jak usieciowane azuryny (AZCL), są szeroko stosowane do oznaczania aktywności enzymatycznej, ale zakup wszystkich substratów osobno i ręczne rozprowadzanie proszków substratowych na płytce testowej może być kłopotliwe i kosztowne⁷.

Opracowaliśmy nową generację substratów chromogennego polimeru hydrożelowego (CPH) opartych na barwnikach chlorotriazynowych, które w połączeniu z 96-dołkową płytką filtracyjną tworzą wysokoprzepustowy system testowy. Opracowano dodatkowe substraty z nierozpuszczalnej biomasy chromogenicznej (ICB), które dostarczają informacji na temat dostępności substratów w złożonych mieszaninach polimerowych, takich jak te, które występują w biomasie lignocelulozowej. Każde podłoże może być wyprodukowane w jednym z czterech kolorów, a różne kolorowe podłoża można łączyć w jednej studzience. W tym protokole pokazano, że metodologia ta może być stosowana do szerokiej gamy polisacharydów i białek oraz potencjału do badań przesiewowych GH, litycznych monooksygenaz polisacharydowych (LPMO) i proteaz. Przewidziano specjalne protokoły stosowania płytek 96-dołkowych, a reprezentatywne wyniki ilustrują wysoką skuteczność zestawów substratów CPH i ICB jako narzędzi do badań przesiewowych enzymów.

Jedną z istotnych zalet opisanych zestawów testowych, niezależnie od substratu, jest to, że zestawy są gotowe do użycia w ciągu 15 minut, po etapie aktywacji. Eliminuje to konieczność czasochłonnego montażu testu z surowców substratowych, jak ma to miejsce w przypadku niektórych innych metod⁷. Substraty CPH i ICB charakteryzują się doskonałym przechowywaniem (co najmniej rok w temperaturze pokojowej), stabilnym pH i temperaturą ⁸ i nie wymagają specjalistycznego sprzętu ani szkolenia. Testy CPH lub ICB opierają się na 96-dołkowej płytce filtracyjnej, w której przeprowadza się reakcję z enzymem. Jeśli enzym jest aktywny z danym substratem, generowane są rozpuszczalne barwione oligomery, wytwarzające kolorowy supernatant, który można następnie przefiltrować do zwykłej 96-dołkowej płytki z klarowną studnią za pomocą kolektora próżniowego lub wirówki ⁸.

Substraty są barwione barwnikami chlorotriazynowymi, które absorbują w zakresie widzialnym (VIS), a poszczególne kolory (czerwony, niebieski, żółty i zielony) mogą być rozwiązane za pomocą regresji liniowej, jeśli różne substraty CPH o różnych kolorach są mieszane w jednym dołku, a enzym działa na więcej niż jeden substrat. Otrzymaną płytkę z supernatantami można zmierzyć za pomocą standardowego czytnika płytek mikromiareczkowych, zdolnego do pomiaru absorbancji w zakresie VIS. Mieszanie różnych substratów o różnych kolorach w jednym dołku zwiększa przepustowość systemu testowego, do łącznej liczby 384 eksperymentów na 96-dołkowej płytce (4 różne podłoża o różnych kolorach na studzienkę).

Substraty CPH dostarczają cennego narzędzia do oceny specyficznej aktywności enzymu, podczas gdy substraty ICB są używane do oceny zdolności enzymu do trawienia składnika w kontekście złożonych mieszanin substratów, które enzymy zwykle napotykają w biomasie. Chociaż substraty ICB nie dostarczają informacji o specyficzności poszczególnych enzymów, są jednak użytecznymi narzędziami do oceny komercyjnej wydajności enzymów, koktajli lub bulionów.

Protokół

1. Test chromogeniczny z substratami CPH w formacie płytki 96-dołkowej

1. Aktywacja płytki zestawu do oznaczania
   1. Aktywować 96-dołkową płytkę zestawu testowego filtra (zawierającego niebieski CPH-ksylan) (wykaz materiałów) poprzez dodanie 200 μl roztworu aktywacyjnego (otrzymanego z zestawem) do każdej studzienki, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej bez mieszania.
   2. Zastosować podciśnienie za pomocą kolektora próżniowego (z blokiem dystansowym wewnątrz i dowolną standardową, przezroczystą 96-dołkową płytką jako płytką zbiorczą) w celu usunięcia pozostałego roztworu aktywacyjnego. Na tym etapie można również użyć wirówki o stężeniu 2 700 x g przez 10 minut zamiast kolektora próżniowego.
   3. Umyj podłoża CPH, dodając 100 μl sterylnej wody i zastosuj podciśnienie (lub siłę odśrodkową) w celu usunięcia stabilizatora. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, a płytki będą teraz gotowe do użycia.
2. Reakcja enzymatyczna
   UWAGA: Zawsze należy uwzględnić sam bufor jako kontrolę ujemną i, jeśli to możliwe, wcześniej scharakteryzowane enzymy jako kontrole dodatnie. Należy użyć statystycznie odpowiedniej liczby powtórzeń. Substraty CPH są stabilne w zakresie pH od 3,0 do 10,0, a całkowita objętość roztworu enzymatycznego na końcu buforu w każdym dołku nie powinna przekraczać 180 μl. Zamiast oczyszczonego roztworu enzymatycznego można również użyć ekstraktu roślinnego lub bulionu kulturowego.
   1. Dodać 150 μl 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 μl roztworu endocelulazy (do końcowego stężenia 1 U/ml) do każdego dołka na płytce zestawu do oznaczania.
   2. Umieść płytkę produktu (płytkę z przezroczystym dołkiem kompatybilną z czytnikiem płytek do mikromiareczkowania) pod płytką zestawu do testów, aby zebrać wszelkie potencjalne wycieki z płytki reakcyjnej podczas wytrząsania.
   3. Inkubować płytkę zestawu do oznaczania w temperaturze 25 °C przez 30 minut w wytrząsarce poziomej z prędkością 150 obr./min.
      UWAGA: Mieszanie reakcji na płytce zestawu testowego podczas inkubacji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnego i powtarzalnego wyniku. Podłoża CPH są stabilne w temperaturze do 90 °C. Czas inkubacji należy wydłużyć do 24 godzin w przypadku badania bulionów hodowlanych zawierających nieznane stężenia enzymów z substratami CPH. Należy pamiętać, że odpowiednie czasy inkubacji zależą od aktywności enzymu (enzymów), ale ogólnie rzecz biorąc, jeśli nie ma wykrywalnej aktywności w ciągu 24 godzin, jest prawdopodobne, że enzym nie zdegraduje badanego substratu. Aktywny enzym rozkłada nierozpuszczalne chromogenne polisacharydy substratu CPH do rozpuszczalnych chromogennych oligosacharydów, które są widoczne jako kolorowy supernatant.
   4. Umieść czystą płytę produktu wewnątrz kolektora próżniowego z blokiem dystansowym w środku.
   5. Umieść płytkę zestawu testowego na górze i zastosuj podciśnienie (maksymalne podciśnienie -60 kPa). Możliwe jest również użycie wirówki o stężeniu 2.700 x g przez 10 min.
      UWAGA: Przesącz zawierający barwne oligosacharydy jako produkt reakcji znajduje się teraz na tabliczce produktu w celu dalszej analizy⁸.
3. Wykrywanie i kwantyfikacja
   1. Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience na płycie produktu jest w przybliżeniu taka sama poprzez oględziny.
   2. Odczytać absorbancję płytki zbiorczej przy długości fali 595 nm dla niebieskiego CPH-ksylanu za pomocą czytnika płytek.
   3. Przeprowadzając analizę danych, należy odjąć wartości kontroli ujemnej tylko w buforze od wartości z dołków, w których dodano enzym. Obliczyć wartość średnią i błąd standardowy średnich (SEM) z dołków replik⁸.

2. Test chromogeniczny z substratami ICB w formacie 96-dołkowym

1. Reakcja enzymatyczna
   1. Dodać 150 μl 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 μl 31 U/ml roztworu endo-ksylanazy do każdego dołka na płytce zestawu do oznaczania zawierającej czerwoną słomę pszenną ICB (końcowe stężenie enzymu w studzience: 1 U/ml).
      UWAGA: Płytki zestawu testowego (96-dołkowe płytki filtracyjne zawierające substraty ICB) są produkowane zgodnie z opisem w literaturze (patrz Wykaz materiałów). Substraty ICB są stabilne w o pH w zakresie od 3,0 do 10,0. Zawsze należy uwzględnić sam bufor jako kontrolę ujemną, enzymy handlowe jako kontrolę pozytywną i użyć statystycznie odpowiedniej liczby replik.
      1. Nie aktywuj substratów ICB, takich jak płytka substratu CPH, ale usuń stabilizator, przemywając trzykrotnie 100 μl wody, a następnie filtrując próżniowo lub odwirowując.
   2. Umieść płytkę produktu pod płytą podłoża, aby zebrać potencjalny wyciek z płyty podłoża podczas wytrząsania.
   3. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C, wytrząsając z prędkością 150 obr./min przez 2 godz.
      UWAGA: Aktywny enzym rozkłada nierozpuszczalne chromogenne polisacharydy w podłożu ICB na rozpuszczalne oligosacharydy, które są widoczne jako kolorowy supernatant. Podłoża ICB są stabilne w temperaturze do 90 °C. Czas inkubacji należy wydłużyć do 24 godzin, jeśli stosuje się nieoczyszczone enzymy, takie jak buliony hodowlane.
   4. Umieść płytkę produktu wewnątrz kolektora próżniowego z blokiem dystansowym w środku.
   5. Umieścić płytkę zestawu do oznaczania na wierzchu i zastosować podciśnienie (maksymalne podciśnienie -60 kPa) lub użyć wirówki, aby przefiltrować produkt z płytki zestawu do oznaczania do dołka płytki produktu.
      UWAGA: Przesącz zawierający barwne oligosacharydy jako produkt reakcji znajduje się teraz na płytce zbiorczej^w celu dalszej analizy 8.
2. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe
   1. Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience płytki zbiorczej jest w przybliżeniu taka sama, przeprowadzając oględziny.
   2. Odczytać absorbancję płytki zbiorczej przy długości fali 517 nm dla czerwonej słomy pszennej ICB za pomocą czytnika płytek.
   3. Podczas przeprowadzania analizy danych – odejmij bufor – tylko wartości kontroli ujemnej od wartości z dołków, do których dodano enzym. Obliczyć wartość średnią i błąd standardowy średnich (SEM) z dołków replik⁸,
      UWAGA: W przypadku badań przesiewowych nieznanych enzymów sugerujemy wykonanie serii rozcieńczeń w celu uzyskania bardziej szczegółowych danych na temat dynamicznego zakresu aktywności enzymu.

Wyniki

Wysoka przepustowość i zdolność multipleksowania tego testu opiera się na nierozpuszczalnych substratach chromogennego polimeru (lub białka) hydrożelu (CPH) ułożonych w 96-dołkowych płytkach filtracyjnych. Enzymy, jak również kontrole ujemne, dodaje się do płytki zestawu do oznaczania (rysunek 1A), a enzymy rozkładają odpowiedni substrat, wytwarzając kolorowy supernatant (rysunek 1B). Po zakończeniu reakcji supernatant przenosi się do płytki produktu o przezroczystej studzience, a absorbancję można zmierzyć bezpośrednio za pomocą spektrofotometru odpowiedniego dla płytek 96-dołkowych (rysunek 1C).

Przykład reakcji CPH-arabinoksylanu na ksylanazę przy różnych stężeniach enzymu (0,00 - 0,75 U/ml) jest pokazany na rysunku 1D, gdzie malejące stężenie enzymu można zaobserwować wizualnie. Bardziej szczegółowa spektrofotometryczna kwantyfikacja może być wykorzystana do wykreślenia absorbancji w funkcji stężenia enzymu (rysunek 1E). Intensywność sygnału odpowiada aktywności enzymu. Odtwarzalność testu jest pokazana za pomocą słupków błędu (błąd standardowy średniej, SEM, trzech replik). Bardziej szczegółowe doświadczenia dotyczące odtwarzalności tego testu zostały opublikowane w innym miejscu⁸.

Rysunek 1. Leczenie CPH-arabinoksylanem ksylanazą za pomocą ksylanazy. A) Schemat płytki zestawu do oznaczania z substratem CPH (np. CPH-arabinoksylanem) załadowanym do 96-dołkowych dołków na płytkach filtracyjnych tuż przed dodaniem enzymów 1 i 2 oraz kontrolą tylko buforową (enzym 1 wykazywał aktywność endo-ksylanazy); B) Degradacja CPH-arabinoksylanu przez enzym 1 wytworzyła kolorowy supernatant; C) Po wspomaganej próżniowo filtracji supernatantów do płytki produktu, absorbancja jest mierzona spektrofotometrycznie; D) tabliczka produktu zawierająca produkty reakcji po potraktowaniu CPH-arabinoksylanem w 4 różnych kolorach o różnych stężeniach endo-β-1,4-ksylanazy w 100 mM buforze octanu sodu, pH 4,5 przez 60 min w temperaturze pokojowej; E) Oznaczanie ilościowe produktów reakcji z D za pomocą spektrofotometrii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Istnieją różne opcje wykorzystania tego testu w badaniach przesiewowych enzymów. Jedną z opcji jest użycie 96-dołkowej płytki zawierającej różne polisacharydy do badań przesiewowych, np. niewielką liczbę (oczyszczonych) endoenzymów o nieznanej aktywności. W takim przypadku wynik pokaże, które polisacharydy ulegają degradacji przez enzym docelowy. Aby wykazać tę zasadę, endocelulazę przetestowano na różnych podłożach CPH w temperaturze 25 °C. Trzy różne stężenia enzymów (0,5 U/ml, 1,0 U/ml i 5 U/ml) inkubowano przez 30 minut. Wynik jest wyraźnie widoczny na tabliczce produktu (rysunek 2A). Karta produktu dla tej endocelulazy dostarczona przez dostawcę określa aktywność uboczną dla ksylolukanu (tamaryndowca), jęczmienia β-glukanu, glukomannanu, ksylanu brzozowego i niską aktywność uboczną dla galaktomannanu. W związku z tym stwierdzono aktywność dodatkową wobec celulazy wobec CPH-β-glukanu (jęczmień), CPH-ksyllukanu (tamaryndowiec), CPH-ksylanu (drewno bukowe) i niską aktywność wobec CPH-galaktomannanu (Figura 2B). Glukomannan nie był testowany. Te same substraty CPH trawiono dostępnymi na rynku enzymami (trzy różne stężenia enzymów: 0,1 U/ml, 0,5 U/ml i 1,0 U/ml) stosowanymi jako kontrole pozytywne w tych samych warunkach co w poprzednim eksperymencie. Wszystkie substraty uległy degradacji przez enzym kontroli pozytywnej, a intensywność sygnału wzrosła wraz z wyższym stężeniem enzymu (ryc. 2C).

Rysunek 2. Osiem różnych substratów CPH inkubowano pod wpływem mieszania w temperaturze 25 °C przez 30 minut. A) Płytka produktu z różnych substratów CPH trawiona za pomocą endocelulazy, w różnych stężeniach. B) Kwantyfikacja aktywności i różnych działań ubocznych endocelulazy. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z trzech replik. C) Aktywność różnych enzymów handlowych w stosunku do odpowiedniego substratu CPH (endocelulazy i 2-HE-celulozy; E-LAMSE i CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH-β-glukan (jęczmień); E-XYAN4 i CPH-ksylan, E-XEGP i CPH-ksyllukan, E-BLAAM i CPH-amylozy, E-BMACJ i CPH-galaktomannan; wszystkie enzymy firmy Megazyme). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z dwóch replik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nierozpuszczalne substraty z biomasy chromogenicznej (ICB) są użytecznym dodatkiem do repertuaru substratów chromogenicznych, ponieważ zachowują częściowo naturalny układ polisacharydów w ścianach komórkowych roślin, które są głównym składnikiem biomasy. Substraty CPH i ICB są używane w naszym przykładzie do analizy wydzielanych enzymów Phanerochaete chrysosporium podczas uprawy w płynnym podłożu. Układ płytek zestawu do oznaczania pokazano na rysunku 3A, z 19 substratami CPH i 5 substratami ICB (4 dołki dla każdego substratu, rysunek 3B). P. chrysosporium hodowano przez trzy dni, a następnie analizowano supernatant hodowli. W związku z tym do każdej studzienki przeniesiono 125 μl buforu 200 mM i dodano 25 μl supernatantu hodowlanego. Przetestowano trzy różne warunki pH przy użyciu buforu octanu sodu o pH 4,0, buforu fosforanu sodu o pH 6,0 lub pH 8,0 (rysunek 3C). Płytkę inkubowano, wytrząsając (150 obr./min) w temperaturze 25 °C przez 2 godziny.

Produkty reakcji zostały przeniesione na tabliczkę produktu (Rysunek 3D) i przeanalizowane. P. chrysosporium wytwarza enzymy do degradacji różnych glukanów, skrobi i ksylanów (ryc. 3E). Niższe sygnały można było wykryć dla hemiceluloz arabinanu (burak cukrowy) i pektyki galaktanu, a także dla RGI (soi). Wytworzone enzymy były bardziej aktywne w warunkach kwaśnych (pH 4,0) niż w warunkach obojętnych lub lekko zasadowych (pH 8,0). Niższa aktywność w stosunku do substratów ICB (ryc. 3F) pokazuje, że gdy polisacharydy znajdują się w bardziej naturalnym kontekście, wydajność enzymu nie jest taka sama jak w przypadku czystego polisacharydu i dlatego substraty ICB wykazują bardziej realistyczny pogląd na wydajność enzymu, jeśli został zastosowany do surowego lub wstępnie poddanego obróbce materiału roślinnego.

Rysunek 3. Badanie przesiewowe supernatantu hodowli z 3-dniowej płynnej kultury Phanerochaete chrysosporium przy użyciu płytki wielosubstratowej zawierającej 19 substratów CPH i 5 substratów ICB. A) Schemat układu płyt z 4 dołkami dla każdego indywidualnego podłoża (szare tło = substraty CPH, pomarańczowe tło = podłoża ICB). B) Zdjęcie płytki testowej zawierającej substrat. C) Schemat przedstawiający warunki buforowe użyte w tym doświadczeniu (200 mM octan sodu o pH 4,0, fosforan sodu o pH 6,0 i fosforan sodu o pH 8,0). D) zdjęcie tabliczki produktu po 2 godzinach w temperaturze 25 °C. E) Absorbancje wykryto przy długości fali 517 nm i wykreślono dla każdego pojedynczego substratu CPH, a F) wyniki substratu ICB dla odpowiednich enzymów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Substraty chromogenne mogą być również wykorzystane do badania efektów synergicznych poprzez użycie mieszaniny różnych kolorowych substratów CPH w jednym dołku i analizę supernatantu reakcji po leczeniu przy użyciu pojedynczych enzymów lub koktajli enzymatycznych.

W poniższym przykładzie pokazanym na rysunku 4, czerwone substraty CPH-celulozowe i żółte CPH-ksylan zostały zmieszane ze sobą w mniej więcej równym stosunku w 96-dołkowych dołkach z płytkami filtracyjnymi. Rysunek 4A przedstawia zabarwione produkty reakcji po 1-godzinnym traktowaniu w temperaturze pokojowej bez enzymu (kontrola), celulozy (2 U/ml), ksylu ksylazy ksylowej (1 U/ml) i mieszaniny obu enzymów (3 powtórzenia dla każdego podejścia) w 100 mM buforze octanu sodu o pH 4,5. Do analizy produkt reakcji określono ilościowo spektrofotometrycznie, skanując widmo absorbancji od 350 nm do 700 nm (rysunek 4B). Często sama kontrola wzrokowa może dać wskazówkę, czy enzym działa na jeden czy na wiele substratów, jednak zarejestrowane widma absorbancji pochodzące z różnych barwników można również rozwiązać za pomocą prostej regresji liniowej⁸, aby uzyskać dokładniejsze wskazanie stopnia degradacji każdego substratu z mieszaniny.

Użycie substratów CPH jako mieszanin znacznie zwiększa wydajność testu, umożliwiając badanie przesiewowe na maksymalnie 4 różnych substratach w jednym eksperymencie (jeden odwiert). W przedstawionym przykładzie zastosowano cztery różne podłoża: niebieski CPH-β-glukan (jęczmień), żółty CPH-ksylan (drewno bukowe), zielony CPH-amylozy i czerwony CPH-pektowy galaktan (łubin). Układ płytki substratowej pokazano na rysunku 4C, a rysunek płytki testowej na rysunku 4D. Reakcję prowadzono w 100 mM buforze octanu sodu o pH 4,5 przez 30 min w temperaturze 25 °C i 150 obr./min. Pierwsze pojedyncze enzymy o rosnącym stężeniu enzymu przetestowano z odpowiednim substratem CPH (Figura 4E), a kolorowy supernatant otrzymano zgodnie z oczekiwaniami na tabliczce produktu (Rysunek 4F, rząd 1A - 12D). Rząd E zawierał dwa różne substraty CPH, żółty CPH-ksylan i niebieski CPH-β-glukan, które uległy degradacji z różnymi proporcjami odpowiednich enzymów endo-ksylanazy i endoglukanazy. Po reakcji wynik jest widoczny na tabliczce produktu: kolor produktu reakcji był ciemniejszy zielono-niebieski, gdy obecnych było więcej endoglukanazy (Figura 4F, 4E-6E) i zmienił się w jaśniejszy żółto-zielony, gdy stężenie endo-ksylanazy wzrosło (Figura 4F, 10-12E). To samo widać w rzędzie F, gdzie dwa substraty, czerwony CPH-pektykowy galaktan i żółty CPH-ksylan zostały zdegradowane przez endo-galaktanazę i endo-ksylanazę. Obecne były wszystkie cztery różnokolorowe substraty CPH (Figura 4F, 1G-12F), a pojedyncze enzymy degradowały odpowiedni substrat CPH, a dodając dodatkowe enzymy, otrzymano kombinację kolorowych produktów reakcji.

Rysunek 4. Połączenie dwóch różnych substratów CPH, czerwonej CPH-celulozy i żółtej CPH-ksylanu, poddanych działaniu różnych enzymów. A) Supernatanty reakcyjne po potraktowaniu dwóch substratów endocelulazą (cel) lub endo-ksylanazą (ksyl) lub obydwoma enzymami. B) Widma absorbancji supernatantów reakcyjnych. Połączenie czterech różnych substratów CPH poddanych działaniu różnych enzymów. C) Schemat płytki substratowej zawierającej substraty CPH: niebieski CPH-β-glukan (jęczmień), żółty CPH-ksylan (drewno bukowe), zielony CPH-amyloza i czerwony CPH-pektowy galaktan (łubin). D) Rysunek płytki testowej zawierającej różne substraty CPH. E) Schemat tabliczki produktu przedstawiający stosunek dodanych enzymów (stężenia nominalne (NC): glu = 1 U/ml endoglukanazy, ksyl = 1 U/ml endo-ksylanazy, amy = 5 U/ml endo-amylazy i gal = 0,5 U/ml endo-galaktanazy). F) Zdjęcie tabliczki produktu po 30 minutach inkubacji w temperaturze 25 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

)

substrat	źródło
CPH-2-hydroksyetyloceluloza	Nie dotyczy
(CPH-2-HE-celuloza)
CPH-amylopektyna	ziemniak
CPH-amyloza	ziemniak
CPH-arabinan	burak cukrowy
CPH-arabinoksylan	pszenica
CPH-kazeina	Mleko krowie
CPH-chitozan	pochodzenie zwierzęce
CPH-curdlan	Alcaligenes faecalis (Alcaligenes faecalis)
CPH-dekstran	Leuconostoc spp.
CPH-galaktomannan	chleb świętojański
CPH-laminaryna	Laminaria digitata
CPH-lichenan	Islandzki mech
CPH-metyloceluloza	N/a
CPH-pachyman	Poria cocos
CPH-pektowy galaktan	ziemniak
CPH-pullulan	Aureobasidium pullulans
CPH-rhamnogalakturonan I (RG I)	ziemniak
CPH-rhamnogalacturonan I (-Gal)*	ziemniak
CPH-ramnogalakturonowy	Ziarno soi
CPH-ksylan	Beechwood
CPH-ksylolukan	Tamaryndowca
CPH-β-glukan z jęczmienia	jęczmień
CPH-β-glukan z owsa	owies
CPH-β-glukan z drożdży	drożdże
ICB-Arabidopsis (rzodkiewnik)	Liście rozety Arabidopsis thaliana Col-0 (dorosła roślina)
ICB-Nasiona Arabidopsis	Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity)
Wytłoki z trzciny cukrowej ICB	Saccharum officinarum (suszona dorosła roślina, łodyga i liście)
ICB-celuloza krystaliczna (bibuła filtracyjna)	komercyjny papier chromatograficzny Whatman 3MM Chr
ICB-nasiona kozieradki	Nasiona Trigonella spp.
ICB-konopie	Cannabis spp. (suszona dorosła roślina, łodyga i liście)
ICB-nasiona łubinu	Nasiona Lupinus angustifolius
ICB-pyłek P. pratense	Pyłek Phleum pratense
ICB-świerk	Picea spp. (frezowany pień drzewa)
Tytoń ICB	liście Nicotiana benthamiana (młoda roślina)
Słoma pszenna ICB	Triticum spp. (suszona dorosła roślina, łodyga i liście)
Wierzba ICB	Salix spp. (suszona dorosła roślina, zmielony pień drzewa)
ICB-Sorgo (Sorgo	Sorgo spp. (liście dorosłej rośliny)
*(β-1,4-D-galaktanowe łańcuchy boczne usunięte za pomocą endo-β-1,4-D-galaktanazy)

Tabela 1. Lista dostępnych substratów chromogenicznego hydrożelu polimerowego (CPH) i nierozpuszczalnej biomasy chromogenicznej (ICB).

Dyskusja

Używamy nowej generacji wielokolorowych substratów CPH i ICB, które są oparte na barwnikach chlorotriazynowych (pełna lista substratów w tabeli 1) ułożonych w specjalnie zaprojektowanym komercyjnym zestawie testowym. W wyniku trawienia enzymatycznego substratów powstają małe, rozpuszczalne, barwione produkty, które są wykrywalne w roztworze testowym i mogą być określone ilościowo za pomocą czytnika płytek⁹. Test ten jest przeznaczony do oceny enzymów działających endologicznie, a czułość testu jest podobna do tez z użyciem substratów usieciowanych azuryny (AZCL)¹⁰, podczas gdy inne metody są dostępne dla enzymów egzodziałających ^11,12. Ograniczenie tego zestawu testowego polega na wykrywaniu aktywności endoenzymów, ponieważ CPH, jak również substraty ICB, nie ulegają degradacji przez egzoenzymy, najprawdopodobniej z powodu przeszkód sterycznych wynikających z cząsteczek barwnika i środka sieciującego⁸.

Test wykonywany jest w formacie 96-dołkowym, a w dołkach zachodzą indywidualne reakcje. Reakcja musi zostać wymieszana na płytce, aby uzyskać powtarzalne dane. Powstałe supernatanty są filtrowane do płytki produktu, gdzie absorbancję każdego dołka można określić ilościowo za pomocą spektrometrii absorbancji. Podstawowe zasady i układ testu przedstawiono na rysunku 1. Test składa się z płytki testowej (96-dołkowej płytki filtracyjnej) z substratami, a po inkubacji z enzymami supernatant jest filtrowany do przezroczystej płytki dołkowej i odczytywane są absorbancje, zapewniając półilościowy pomiar specyficzności i aktywności enzymu. Wykazano, że ten test przesiewowy z użyciem substratów CPH może być również stosowany w formacie płytki agarowej, gdzie rozpuszczalne produkty reakcji tworzą kolorową aureolę po całonocnej inkubacji. ⁸

Zestawy testowe mogą być używane do badań przesiewowych oczyszczonych enzymów i ich potencjalnych działań ubocznych, jak pokazano na rysunku 2. Działania uboczne mogą wynikać z pojedynczego enzymu i jego rozwiązłej specyficzności, ale także z faktu, że analizowana próbka jest mieszaniną różnych enzymów i należy zbadać ich efekt synergiczny. Dodatkowo, jak wykazano w poprzednich badaniach, jako źródło enzymów można stosować koktajle enzymatyczne, mikrobiotę^{jelitową 13} i buliony z kultur grzybów⁸ , a także endogenne enzymy roślinne i bakterie (dane niepublikowane).

Substraty ICB dotyczą złożonych mieszanin składników ściany komórkowej często spotykanych w przemysłowych procesach rozkładu biomasy. Substraty te mają na celu ocenę dostępności polisacharydów i dostarczają informacji o tym, jak skutecznie zoptymalizować koktajle degradacyjne w celu uzyskania bardziej wydajnej degradacji. Jak pokazano na rysunku 3 , substraty CPH i ICB mogą być stosowane w badaniach przesiewowych enzymów obok siebie - ujawniając bogactwo informacji na temat specyficzności i aktywności enzymu zarówno w kontekście preferowanego substratu (CPH), jak i bardziej naturalnego kompleksu zawierającego inne składniki oprócz preferowanego substratu, bardziej naśladując zespół makromolekularny występujący w naturze (ICB). Zastosowanie wielu kolorów pozwala na jednoczesne wykrywanie różnych aktywności enzymatycznych w stosunku do kilku substratów, co zwiększa wysoką przepustowość i multipleksowalność testu. Widma różnych barwników można rozwiązać za pomocą prostej regresji liniowej, a w większości przypadków aktywność na wielu substratach można zaobserwować wyłącznie za pomocą oględzin. Symulowany przykład takiego eksperymentu i jego wyniki przedstawiono na rysunku 4.

Ten zestaw narzędzi testowych i wszechstronność jego zastosowania bardzo dobrze nadają się do badań przesiewowych pierwszego poziomu enzymów i bulionów hodowlanych o nieznanej aktywności. Najważniejszymi aspektami tego testu są jego wysoka przepustowość, możliwość dostosowania, łatwość użycia i elastyczność. Mając to na uwadze, wierzymy, że ten nowatorski zestaw narzędzi znacznie poprawi i przyspieszy procesy badań przesiewowych enzymów w zastosowaniach przemysłowych i akademickich.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
płytki zestawu testowego	Glycospot	dostosowany zestaw testowy płytki
			do aktywacji substratów CPH
350 ml płyta odbiorcza blok dystansowy do kolektora próżniowego	Blok dystansowy	Pall Corporation	5015
96-dołkowa płyta filtracyjna MultiScreen HV, 0,45 i mikro; m, przezroczysta, niesterylna	Płytka do MSHVN4510 testowego	Millipore
96-dołkowe mikropłytki, polipropylenowa	Greiner Bio-One	651201	płytka zbiorcza po umyciu podłoży Nunc
MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Scientific	269620	tabliczka produktowa
Pompa membranowa MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	pompa próżniowa używana z kolektorem
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (& Holm)	wytrząsarka pozioma
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96-dołkowy czytnik absorbancji płytek
Kolektor próżniowy	Pall Corporation	5017	kolektor próżniowy
endo-celulaza (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	celulaza [cel]
endo-β-1,4-mannaza (Cellvibrio japonicus)	Mannaza Megazyme	E-BMACJ	[man]
endo-β-1,3-glukanaza (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE	β-glukanaza [glu]
endo-β-1,4-D-galaktanaza (Aspergillus niger)	Galaktanaza Megazyme	E-EGALN	[gal]
endo-β-1,4-ksylanaza M4 (Aspergillus niger)	Ksylanaza Megazyme	E-XYAN4	[xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazyme	E-XEGP	ksyllukanaza [xg]
&alfa;-amylaza (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM	amylaza [amy]