Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Carbohydraty active enzymes (CAZymes) pełnią wiele ról in vivo i są szeroko stosowane w przetwórstwie przemysłowym w przemyśle biopaliwowym, tekstylnym, detergentowym, papierniczym i spożywczym. Głębsze zrozumienie CAZymes jest ważne zarówno z punktu widzenia biologii podstawowej, jak i przemysłu. W przyrodzie występuje ogromna liczba CAZymów (zwłaszcza w mikroorganizmach), a setki tysięcy zostały skatalogowane i opisane w bazie danych carbohydrate active enzyme (CAZy). Jednak tempo odkrywania domniemanych enzymów przewyższyło naszą zdolność do biochemicznego scharakteryzowania ich aktywności. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest to, że postępy w sekwencjonowaniu genomu i transkryptomu, wraz z powiązanymi narzędziami bioinformatycznymi, pozwalają na szybką identyfikację potencjalnych CAZymes, ale technologia określania cech biochemicznych enzymu rozwija się wolniej. Aby wypełnić tę lukę technologiczną, opisano tutaj nowatorski zestaw do testów o wysokiej przepustowości oparty na nierozpuszczalnych podłożach chromogennych. Wyprodukowano dwa różne typy substratów: substraty Chromogenne Polymer Hydrogel (CPH) (wykonane z oczyszczonych polisacharydów i białek) orazrozpuszczalne wC hromogenne substraty Biomass (ICB) (wykonane ze złożonych materiałów biomasowych). Zarówno substraty CPH, jak i ICB są dostarczane w 96-dołkowym systemie testów o wysokiej przepustowości. Substraty CPH mogą być wykonane w czterech różnych kolorach, co umożliwia ich mieszanie ze sobą, a tym samym zwiększa wydajność testów. Protokół opisuje test na 96-dołkowej płytce i ilustruje, w jaki sposób ten test może być wykorzystany do badania przesiewowego aktywności enzymów, koktajli enzymatycznych i bulionów.
Wprowadzenie
Techniki eksploracji genomów i metagenomów rozwinęły się szybko w ostatnich latach, podobnie jak średnio- i wysokoprzepustowe strategie klonowania i ekspresji rekombinowanych enzymów. Co więcej, zasoby bioinformatyczne i związane z nimi depozyty, takie jak (CAZy)1,2, znacznie się rozwinęły. Wykorzystanie różnorodności enzymów mikrobiologicznych do celów przemysłowych wiąże się jednak z poważnymi wyzwaniami, a empiryczne określenie aktywności enzymów stało się obecnie poważnym wąskim gardłem. Na przykład szacuje się, że przy użyciu obecnych metod możemy bezpiecznie przewidzieć aktywność nie więcej niż 4% białek w bazie danych CAZy. Chociaż dostępnych jest wiele metod monitorowania aktywności enzymów, wszystkie mają pewne ograniczenia. Dostępne są sprawdzone techniki oparte na chromatografii w połączeniu ze spektrometrią mas do oceny oligomerycznych fragmentów aktywności hydrolazy glikozylowej (GH)3,4. Jednak te podejścia są pracochłonne i na ogół mają niską przepustowość. Metody oparte na pomiarze cukrów redukujących, takie jak kwas dinitrosalicylowy5 i testy Nelsona-Somogyi'ego6, są szeroko stosowane do oceny aktywności GH. Jednak testy te mają ograniczoną przepustowość i mogą być podatne na reakcje uboczne. Poszczególne chromogenne substraty polisacharydowe, takie jak usieciowane azuryny (AZCL), są szeroko stosowane do oznaczania aktywności enzymatycznej, ale zakup wszystkich substratów osobno i ręczne rozprowadzanie proszków substratowych na płytce testowej może być kłopotliwe i kosztowne7.
Opracowaliśmy nową generację substratów chromogennego polimeru hydrożelowego (CPH) opartych na barwnikach chlorotriazynowych, które w połączeniu z 96-dołkową płytką filtracyjną tworzą wysokoprzepustowy system testowy. Opracowano dodatkowe substraty z nierozpuszczalnej biomasy chromogenicznej (ICB), które dostarczają informacji na temat dostępności substratów w złożonych mieszaninach polimerowych, takich jak te, które występują w biomasie lignocelulozowej. Każde podłoże może być wyprodukowane w jednym z czterech kolorów, a różne kolorowe podłoża można łączyć w jednej studzience. W tym protokole pokazano, że metodologia ta może być stosowana do szerokiej gamy polisacharydów i białek oraz potencjału do badań przesiewowych GH, litycznych monooksygenaz polisacharydowych (LPMO) i proteaz. Przewidziano specjalne protokoły stosowania płytek 96-dołkowych, a reprezentatywne wyniki ilustrują wysoką skuteczność zestawów substratów CPH i ICB jako narzędzi do badań przesiewowych enzymów.
Jedną z istotnych zalet opisanych zestawów testowych, niezależnie od substratu, jest to, że zestawy są gotowe do użycia w ciągu 15 minut, po etapie aktywacji. Eliminuje to konieczność czasochłonnego montażu testu z surowców substratowych, jak ma to miejsce w przypadku niektórych innych metod7. Substraty CPH i ICB charakteryzują się doskonałym przechowywaniem (co najmniej rok w temperaturze pokojowej), stabilnym pH i temperaturą 8 i nie wymagają specjalistycznego sprzętu ani szkolenia. Testy CPH lub ICB opierają się na 96-dołkowej płytce filtracyjnej, w której przeprowadza się reakcję z enzymem. Jeśli enzym jest aktywny z danym substratem, generowane są rozpuszczalne barwione oligomery, wytwarzające kolorowy supernatant, który można następnie przefiltrować do zwykłej 96-dołkowej płytki z klarowną studnią za pomocą kolektora próżniowego lub wirówki 8.
Substraty są barwione barwnikami chlorotriazynowymi, które absorbują w zakresie widzialnym (VIS), a poszczególne kolory (czerwony, niebieski, żółty i zielony) mogą być rozwiązane za pomocą regresji liniowej, jeśli różne substraty CPH o różnych kolorach są mieszane w jednym dołku, a enzym działa na więcej niż jeden substrat. Otrzymaną płytkę z supernatantami można zmierzyć za pomocą standardowego czytnika płytek mikromiareczkowych, zdolnego do pomiaru absorbancji w zakresie VIS. Mieszanie różnych substratów o różnych kolorach w jednym dołku zwiększa przepustowość systemu testowego, do łącznej liczby 384 eksperymentów na 96-dołkowej płytce (4 różne podłoża o różnych kolorach na studzienkę).
Substraty CPH dostarczają cennego narzędzia do oceny specyficznej aktywności enzymu, podczas gdy substraty ICB są używane do oceny zdolności enzymu do trawienia składnika w kontekście złożonych mieszanin substratów, które enzymy zwykle napotykają w biomasie. Chociaż substraty ICB nie dostarczają informacji o specyficzności poszczególnych enzymów, są jednak użytecznymi narzędziami do oceny komercyjnej wydajności enzymów, koktajli lub bulionów.
Protokół
1. Test chromogeniczny z substratami CPH w formacie płytki 96-dołkowej
- Aktywacja płytki zestawu do oznaczania
- Aktywować 96-dołkową płytkę zestawu testowego filtra (zawierającego niebieski CPH-ksylan) (wykaz materiałów) poprzez dodanie 200 μl roztworu aktywacyjnego (otrzymanego z zestawem) do każdej studzienki, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej bez mieszania.
- Zastosować podciśnienie za pomocą kolektora próżniowego (z blokiem dystansowym wewnątrz i dowolną standardową, przezroczystą 96-dołkową płytką jako płytką zbiorczą) w celu usunięcia pozostałego roztworu aktywacyjnego. Na tym etapie można również użyć wirówki o stężeniu 2 700 x g przez 10 minut zamiast kolektora próżniowego.
- Umyj podłoża CPH, dodając 100 μl sterylnej wody i zastosuj podciśnienie (lub siłę odśrodkową) w celu usunięcia stabilizatora. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, a płytki będą teraz gotowe do użycia.
- Reakcja enzymatyczna
UWAGA: Zawsze należy uwzględnić sam bufor jako kontrolę ujemną i, jeśli to możliwe, wcześniej scharakteryzowane enzymy jako kontrole dodatnie. Należy użyć statystycznie odpowiedniej liczby powtórzeń. Substraty CPH są stabilne w zakresie pH od 3,0 do 10,0, a całkowita objętość roztworu enzymatycznego na końcu buforu w każdym dołku nie powinna przekraczać 180 μl. Zamiast oczyszczonego roztworu enzymatycznego można również użyć ekstraktu roślinnego lub bulionu kulturowego.- Dodać 150 μl 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 μl roztworu endocelulazy (do końcowego stężenia 1 U/ml) do każdego dołka na płytce zestawu do oznaczania.
- Umieść płytkę produktu (płytkę z przezroczystym dołkiem kompatybilną z czytnikiem płytek do mikromiareczkowania) pod płytką zestawu do testów, aby zebrać wszelkie potencjalne wycieki z płytki reakcyjnej podczas wytrząsania.
- Inkubować płytkę zestawu do oznaczania w temperaturze 25 °C przez 30 minut w wytrząsarce poziomej z prędkością 150 obr./min.
UWAGA: Mieszanie reakcji na płytce zestawu testowego podczas inkubacji ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnego i powtarzalnego wyniku. Podłoża CPH są stabilne w temperaturze do 90 °C. Czas inkubacji należy wydłużyć do 24 godzin w przypadku badania bulionów hodowlanych zawierających nieznane stężenia enzymów z substratami CPH. Należy pamiętać, że odpowiednie czasy inkubacji zależą od aktywności enzymu (enzymów), ale ogólnie rzecz biorąc, jeśli nie ma wykrywalnej aktywności w ciągu 24 godzin, jest prawdopodobne, że enzym nie zdegraduje badanego substratu. Aktywny enzym rozkłada nierozpuszczalne chromogenne polisacharydy substratu CPH do rozpuszczalnych chromogennych oligosacharydów, które są widoczne jako kolorowy supernatant. - Umieść czystą płytę produktu wewnątrz kolektora próżniowego z blokiem dystansowym w środku.
- Umieść płytkę zestawu testowego na górze i zastosuj podciśnienie (maksymalne podciśnienie -60 kPa). Możliwe jest również użycie wirówki o stężeniu 2.700 x g przez 10 min.
UWAGA: Przesącz zawierający barwne oligosacharydy jako produkt reakcji znajduje się teraz na tabliczce produktu w celu dalszej analizy8.
- Wykrywanie i kwantyfikacja
- Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience na płycie produktu jest w przybliżeniu taka sama poprzez oględziny.
- Odczytać absorbancję płytki zbiorczej przy długości fali 595 nm dla niebieskiego CPH-ksylanu za pomocą czytnika płytek.
- Przeprowadzając analizę danych, należy odjąć wartości kontroli ujemnej tylko w buforze od wartości z dołków, w których dodano enzym. Obliczyć wartość średnią i błąd standardowy średnich (SEM) z dołków replik8.
2. Test chromogeniczny z substratami ICB w formacie 96-dołkowym
- Reakcja enzymatyczna
- Dodać 150 μl 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 μl 31 U/ml roztworu endo-ksylanazy do każdego dołka na płytce zestawu do oznaczania zawierającej czerwoną słomę pszenną ICB (końcowe stężenie enzymu w studzience: 1 U/ml).
UWAGA: Płytki zestawu testowego (96-dołkowe płytki filtracyjne zawierające substraty ICB) są produkowane zgodnie z opisem w literaturze (patrz Wykaz materiałów). Substraty ICB są stabilne w o pH w zakresie od 3,0 do 10,0. Zawsze należy uwzględnić sam bufor jako kontrolę ujemną, enzymy handlowe jako kontrolę pozytywną i użyć statystycznie odpowiedniej liczby replik.- Nie aktywuj substratów ICB, takich jak płytka substratu CPH, ale usuń stabilizator, przemywając trzykrotnie 100 μl wody, a następnie filtrując próżniowo lub odwirowując.
- Umieść płytkę produktu pod płytą podłoża, aby zebrać potencjalny wyciek z płyty podłoża podczas wytrząsania.
- Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C, wytrząsając z prędkością 150 obr./min przez 2 godz.
UWAGA: Aktywny enzym rozkłada nierozpuszczalne chromogenne polisacharydy w podłożu ICB na rozpuszczalne oligosacharydy, które są widoczne jako kolorowy supernatant. Podłoża ICB są stabilne w temperaturze do 90 °C. Czas inkubacji należy wydłużyć do 24 godzin, jeśli stosuje się nieoczyszczone enzymy, takie jak buliony hodowlane. - Umieść płytkę produktu wewnątrz kolektora próżniowego z blokiem dystansowym w środku.
- Umieścić płytkę zestawu do oznaczania na wierzchu i zastosować podciśnienie (maksymalne podciśnienie -60 kPa) lub użyć wirówki, aby przefiltrować produkt z płytki zestawu do oznaczania do dołka płytki produktu.
UWAGA: Przesącz zawierający barwne oligosacharydy jako produkt reakcji znajduje się teraz na płytce zbiorczejw celu dalszej analizy 8.
- Dodać 150 μl 100 mM buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 μl 31 U/ml roztworu endo-ksylanazy do każdego dołka na płytce zestawu do oznaczania zawierającej czerwoną słomę pszenną ICB (końcowe stężenie enzymu w studzience: 1 U/ml).
- Wykrywanie i oznaczanie ilościowe
- Sprawdź, czy objętość cieczy w każdej studzience płytki zbiorczej jest w przybliżeniu taka sama, przeprowadzając oględziny.
- Odczytać absorbancję płytki zbiorczej przy długości fali 517 nm dla czerwonej słomy pszennej ICB za pomocą czytnika płytek.
- Podczas przeprowadzania analizy danych – odejmij bufor – tylko wartości kontroli ujemnej od wartości z dołków, do których dodano enzym. Obliczyć wartość średnią i błąd standardowy średnich (SEM) z dołków replik8,
UWAGA: W przypadku badań przesiewowych nieznanych enzymów sugerujemy wykonanie serii rozcieńczeń w celu uzyskania bardziej szczegółowych danych na temat dynamicznego zakresu aktywności enzymu.
Wyniki
Wysoka przepustowość i zdolność do multipleksowania tego testu opierają się na nierozpuszczalnych substratach z chromogennego hydrożelu polimerowego (lub białkowego) (CPH) rozmieszczonych w 96-dołkowych płytkach filtracyjnych. Do płytki zestawu testowego dodaje się enzymy oraz kontrole negatywne (Rysunek 1A), a enzymy degradują odpowiedni substrat, tworząc zabarwiony nadsącz (Rysunek 1B). Po zakończeniu reakcji nadsącz jest przenoszony do przezroczystej płytki produktowej, a absorbancję można zmierzyć bezpośrednio za pomocą spektrofotometru przystosowanego do płytek 96-dołkowych (Rysunek 1C).
Przykład zależności dawka-odpowiedź CPH-arabinoksylanu na ksylanazę przy różnych stężeniach enzymu (0,00 - 0,75 U/ml) przedstawiono na Rysunku 1D, gdzie spadek stężenia enzymu można zaobserwować wizualnie. Do wykreślenia zależności absorbancji od stężenia enzymu można wykorzystać bardziej szczegółową analizę spektrofotometryczną (Rysunek 1E). Intensywność sygnału odpowiada aktywności enzymu. Powtarzalność testu jest przedstawiona za pomocą słupków błędu (standardowy błąd średniej, SEM, z trzech powtórzeń). Bardziej szczegółowe eksperymenty dotyczące powtarzalności tego testu zostały opublikowane w innym miejscu8.
Rysunek 1. Obróbka CPH-arabino ksylanu ksylanazą. A) Schemat płytki zestawu testowego z substratem CPH (np. CPH-arabino ksylanem) naniesionym do studzienek płytki filtrującej 96-dołkowej tuż przed dodaniem enzymów 1 i 2 oraz kontroli z samym buforem (enzym 1 wykazywał aktywność endo-ksylanazy); B) Degradacja CPH-arabino ksylanu przez enzym 1 spowodowała powstanie barwnego nadfiltratu; C) Po filtracji nadfiltratów wspomaganej próżniowo do płytki z produktami, absorbancja jest mierzona spektrofotometrycznie; D) Płytka z produktami zawierająca produkty reakcji po obróbce CPH-arabino ksylanu w 4 różnych kolorach różnymi stężeniami endo-β-1,4-ksylanazy w 100 mM buforze octanu sodu, pH 4,5 przez 60 min w temperaturze pokojowej; E) Ilościowe oznaczenie produktów reakcji z punktu D przy użyciu spektrofotometrii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Istnieje kilka różnych opcji wykorzystania tego testu w przesiewaniu enzymów. Jedną z nich jest zastosowanie płytki 96-dołkowej zawierającej różne polisacharydy do celów przesiewowych, np. niewielka liczba (oczyszczonych) endo-enzymy o nieznanej aktywności. W takim przypadku wynik wskaże, które polisacharydy ulegają degradacji przez badany enzym. Aby zaprezentować tę zasadę, w ramach... endoaktywność celulazy przebadano w obecności różnych substratów CPH przy 25 °CTrzy różne stężenia enzymu (0,5 U/ml, 1,0 U/ml i 5 U/ml) inkubowano przez 30 min. Wynik jest wyraźnie widoczny na płytce z produktem (Rycina 2A). Karta produktu dla tego endocelulaza dostarczona przez dostawcę wykazuje aktywność poboczną wobec ksyloglukanu (tamaryndowiec), β-glukanu jęczmienia, glukomannanu, ksylanu drewna brzozy oraz niską aktywność poboczną wobec galaktomannanu. Zgodnie z tym stwierdzono aktywność dodatkową poza celulazą wobec CPH-β-glukanu (jęczmień), CPH-ksyloglukanu (tamaryndowiec), CPH-ksylanu (drewno buka) oraz niską aktywność wobec CPH-galaktomannanuRysunek 2B). Nie badano glukomannanu. Te same substraty CPH trawiono dostępnymi komercyjnie enzymami (trzy różne stężenia enzymu: 0,1 U/ml, 0,5 U/ml i 1,0 U/ml) wykorzystanymi jako kontrole pozytywne w tych samych warunkach co w poprzednim eksperymencie. Wszystkie substraty zostały rozłożone przez enzym kontroli pozytywnej, a intensywność sygnału wzrastała wraz z wyższym stężeniem enzymu (Rycina 2C).
Rycina 2. Osiem różnych podłoży CPH inkubowano w warunkach mieszania w 25 °C przez 30 min. A) Płytka z produktami różnych substratów CPH poddanych trawieniu za pomocą endo–celulaza w różnych stężeniach. B) Ilościowe oznaczenie aktywności oraz różnych aktywności pobocznych endo-celulaza. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z trzech powtórzeń. C) Aktywność różnych komercyjnych enzymów wobec odpowiadających im substratów CPH (endo-celulaza i celuloza 2-HE; E-LAMSE oraz CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH-β-glukan (jęczmienia); E-XYAN4 i CPH-ksylan, E-XEGP i CPH-ksyloglukan, E-BLAAM i CPH-amyloza, E-BMACJ i CPH-galaktomannan; wszystkie enzymy pochodzą z firmy Megazyme). Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej dla dwóch powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Nierozpuszczalne chromogenne podłoża biomasowe (ICB) stanowią użyteczne uzupełnienie zestawu podłoży chromogennych, ponieważ częściowo zachowują naturalny układ polisacharydów w ścianach komórkowych roślin, które są głównym składnikiem biomasy. W naszym przykładzie podłoża CPH i ICB zostały wykorzystane do analizy enzymów wydzielanych przez Phanerochaete chrysosporium hodowanego w medium ciekłym. Układ płytki zestawu analitycznego przedstawiono na Rysunku 3A, z 19 podłożami CPH i 5 podłożami ICB (4 dołki dla każdego podłoża, Rysunek 3B). P. chrysosporium hodowano przez trzy dni, a następnie przeanalizowano nadsącz kultur. W związku z tym do każdego dołka przeniesiono 125 µl buforu 200 mM i dodano 25 µl nadsączu z hodowli. Przetestowano trzy różne warunki pH, stosując bufor octanowy pH 4,0, bufor fosforanowy pH 6,0 lub pH 8,0 (Rysunek 3C). Płytkę inkubowano z wytrząsaniem (150 rpm) w temperaturze 25 °C przez 2 h.
Produkty reakcji przeniesiono na płytkę z produktami (Rysunek 3D) i poddano analizie. P. chrysosporium produkowało enzymy do degradacji różnych glukanów, skrobi i ksylanów (Rysunek 3E). Słabsze sygnały wykryto dla hemiceluloz: arabinanu (burak cukrowy) i pektynianu galaktylowego, a także dla RGI (soja). Produkowane enzymy wykazywały większą aktywność w warunkach kwasowych (pH 4.0) niż w warunkach neutralnych lub lekko zasadowych (pH 8.0). Niższa aktywność wobec substratów ICB (Rysunek 3F) wykazuje, że gdy polisacharydy znajdują się w bardziej naturalnym kontekście, wydajność enzymu nie jest taka sama jak w przypadku czystego polisacharydu; dlatego substraty ICB dają bardziej realistyczny obraz wydajności enzymu w przypadku jego zastosowania do surowego lub wstępnie potraktowanego materiału roślinnego.
Rysunek 3. Przesiewanie supernatantu hodowli z 3-dniowej hodowli płynnej Phanerochaete chrysosporium z wykorzystaniem płytki wielopodłoża zawierającej 19 substratów CPH i 5 substratów ICB. A) Schemat układu płytki z 4 studzienkami dla każdego pojedynczego substratu (szare tło = substraty CPH, pomarańczowe tło = substraty ICB). B) Zdjęcie płytki testowej zawierającej substraty. C) Schemat przedstawiający warunki buforowe zastosowane w tym doświadczeniu (200 mM octanu sodu pH 4,0, fosforanu sodu pH 6,0 i fosforanu sodu pH 8,0). D) zdjęcie płytki z produktem po 2 h w 25 °C. E) Absorbancje mierzono przy 517 nm i przedstawiono dla każdego pojedynczego substratu CPH oraz F) wyniki dla substratów ICB dla odpowiednich enzymów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Substraty chromogeniczne mogą być również wykorzystywane do badania efektów synergistycznych poprzez zastosowanie mieszaniny substratów CPH o różnych kolorach w jednej studzience i analizę supernatantu po reakcji po poddaniu go działaniu pojedynczych enzymów lub koktajli enzymatycznych.
W poniższym przykładzie przedstawionym na Rysunku 4, czerwone podłoża CPH-celuloza i żółte CPH-ksylan zostały zmieszane w przybliżeniu w równym stosunku w dołkach 96-dołkowej płytki filtrującej. Rysunek 4A przedstawia kolorowe produkty reakcji po 1 h inkubacji w temperaturze pokojowej bez enzymu (kontrola), z celulazą cel (2 U/ml), ksylanazą xyl (1 U/ml) oraz z mieszaniną obu enzymów (3 powtórzenia dla każdego podejścia) w 100 mM buforze octanu sodu o pH 4,5. Do analizy wykorzystano spektrofotometryczną kwantyfikację produktów reakcji poprzez skanowanie widma absorbancji w zakresie od 350 nm do 700 nm (Rysunek 4B). Często sama inspekcja wizualna może dać wskazówkę, czy enzym działa na jedno czy na wiele podłoży, jednak zarejestrowane widma absorbancji pochodzące od różnych barwników mogą zostać również rozdzielone za pomocą prostej regresji liniowej8, aby uzyskać dokładniejszą informację o stopniu degradacji każdego podłoża z mieszaniny.
Wykorzystanie podłoży CPH w formie mieszanin znacznie zwiększa przepustowość analizy, umożliwiając przesiewanie do 4 różnych substratów w jednym doświadczeniu (jednej studzience). W przedstawionym przykładzie użyto czterech różnych substratów: niebieskiego CPH-β-glukanu (jęczmień), żółtego CPH-ksylanu (buk), zielonej CPH-amylozy oraz czerwonego CPH-galaktanu pektynowego (łubin). Układ płytki z substratami pokazano na Rysunku 4C, a zdjęcie płytki do analizy na Rysunku 4D. Reakcję przeprowadzono w 100 mM buforze octanu sodu o pH 4,5 przez 30 min w temperaturze 25 °C i przy 150 rpm. Najpierw przetestowano pojedyncze enzymy przy zwiększających się stężeniach z odpowiadającymi im podłożami CPH (Rysunek 4E), a w płytce z produktami otrzymano oczekiwany kolorowy naddatek (Rysunek 4F, rzędy 1A - 12D). Rząd E zawierał dwa różne podłoża CPH: żółty CPH-ksylan i niebieski CPH-β-glukan, które degradowano przy różnych stosunkach odpowiednich enzymów: endo-ksylanazy i endo-glukanazy. Po zakończeniu reakcji wynik jest widoczny na płytce z produktami: kolor produktu reakcji był ciemniejszy zielono-niebieski, gdy obecna była większa ilość endo-glukanazy (Rysunek 4F, 4E-6E) i zmieniał się w jaśniejszy żółto-zielony, gdy wzrastało stężenie endo-ksylanazy (Rysunek 4F, 10-12E). To samo zaobserwowano w rzędzie F, gdzie dwa substraty – czerwony CPH-galaktan pektynowy i żółty CPH-ksylan – degradowano za pomocą endo-galaktanazy i endo-ksylanazy. Obecne były wszystkie cztery różne kolorowe podłoża CPH (Rysunek 4F, 1G-12F), a pojedyncze enzymy degradowały odpowiednie podłoże CPH; po dodaniu dodatkowych enzymów otrzymano kombinację kolorowych produktów reakcji.
Rysunek 4. Kombinacja dwóch różnych substratów CPH, czerwonej celulozy-CPH i żółtego ksylanu-CPH, poddanych działaniu różnych enzymów. A) Nadnadkrywy reakcyjne po traktowaniu dwóch substratów endo-celulazą (cel) lub endo-ksylanazą (xyl) lub obydwoma enzymami. B) Widma absorbancji nadnadkrywów reakcyjnych. Kombinacja czterech różnych substratów CPH poddanych działaniu różnych enzymów. C) Schemat płytki z substratami zawierającej substraty CPH: niebieski β-glukan-CPH (jęczmień), żółty ksylan-CPH (buk), zielona amyloza-CPH i czerwony galaktan pektynowy-CPH (łubin). D) Zdjęcie płytki testowej zawierającej różne substraty CPH. E) Schemat płytki z produktami przedstawiający stosunek dodanych enzymów (stężenia nominalne (NC): glu = 1 U/ml endo-glukanazy, xyl = 1 U/ml endo-ksylanazy, amy = 5 U/ml endo-amylazy i gal = 0,5 U/ml endo-galaktanazy). F) Zdjęcie płytki z produktami po 30 min inkubacji w 25 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Substrat | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. |
| CPH-2-hydroksyetyloceluloza | Brak danych |
| (CPH-2-HE-celuloza) | |
| amylopektyna CPH | ziemniak |
| amyloza CPH | ziemniak |
| CPH-arabinan | burak cukrowy |
| CPH-arabinoksylan | pszenica |
| kazeina CPH | mleko krowie |
| CPH-chitozan | pochodzenia zwierzęcego |
| CPH-kurdlan | Alcaligenes faecalis |
| CPH-dekstran | Leuconostoc spp. |
| CPH-galaktomanan | robakia |
| CPH-laminaryna | Laminaria digitata |
| CPH-lichenan | prusznica islandzka |
| metyloceluloza CPH | Brak danych |
| CPH-pachyman | Poria cocos |
| galaktan pektynowy CPH | ziemniak |
| CPH-pullulan | Aureobasidium pullulans |
| CPH-ramnogalakturonan I (RG I) | ziemniak |
| CPH-ramnogalakturonan I (-Gal)* | ziemniak |
| CPH-ramnogalakturonan | soja |
| CPH-ksylan | drewno bukowe |
| CPH-ksyloglukan | tamarynda |
| CPH-β-glukan z jęczmienia | jęczmień |
| CPH-β-glukan z owsa | owies |
| CPH-β-glukan z drożdży | drożdże |
| ICB-Arabidopsis | Liście rozety z Arabidopsis thaliana Col-0 (roślina dorosła) |
| nasiona Arabidopsis z ICB | Arabidopsis thaliana |
| bagasa-ICB | Saccharum officinarum (wysuszona dorosła roślina, łodyga i liście) |
| ICB-celuloza krystaliczna (papier filtracyjny) | komercyjny papier chromatograficzny Whatman 3MM Chr |
| nasiona fenugreku ICB | Trigonella spp. nasiona |
| ICB-konopie | Cannabis spp. (suszone dorosłe rośliny, łodygi i liście) |
| nasiona łubinu ICB | *Lupinus angustifolius* nasiona |
| pyłek ICB P. pratense | Phleum pratense pyłek kwiatowy |
| ICB-świerk | Picea spp. (przetworzony pień drzewa) |
| ICB-tytoń | liście z *Nicotiana benthamiana* (młoda roślina) |
| ICB-słoma pszenna | Triticum spp. (suszone dorosłe rośliny, łodygi i liście) |
| wierzba-ICB | Salix spp. (wysuszona dorosła roślina, zmielony pień drzewa) |
| ICB-Sorghum | Sorghum spp. (liście z dorosłej rośliny) |
| *(łańcuchy boczne β-1,4-D-galaktanu usunięte za pomocą endo-β-1,4-D-galaktanaza) | |
Tabela 1. Lista dostępnych podłoży z chromogenicznego hydrożelu polimerowego (CPH) oraz nierozpuszczalnej biomasy chromogenicznej (ICB).
Dyskusja
Używamy nowej generacji wielokolorowych substratów CPH i ICB, które są oparte na barwnikach chlorotriazynowych (pełna lista substratów w tabeli 1) ułożonych w specjalnie zaprojektowanym komercyjnym zestawie testowym. W wyniku trawienia enzymatycznego substratów powstają małe, rozpuszczalne, barwione produkty, które są wykrywalne w roztworze testowym i mogą być określone ilościowo za pomocą czytnika płytek9. Test ten jest przeznaczony do oceny enzymów działających endologicznie, a czułość testu jest podobna do tez z użyciem substratów usieciowanych azuryny (AZCL)10, podczas gdy inne metody są dostępne dla enzymów egzodziałających 11,12. Ograniczenie tego zestawu testowego polega na wykrywaniu aktywności endoenzymów, ponieważ CPH, jak również substraty ICB, nie ulegają degradacji przez egzoenzymy, najprawdopodobniej z powodu przeszkód sterycznych wynikających z cząsteczek barwnika i środka sieciującego8.
Test wykonywany jest w formacie 96-dołkowym, a w dołkach zachodzą indywidualne reakcje. Reakcja musi zostać wymieszana na płytce, aby uzyskać powtarzalne dane. Powstałe supernatanty są filtrowane do płytki produktu, gdzie absorbancję każdego dołka można określić ilościowo za pomocą spektrometrii absorbancji. Podstawowe zasady i układ testu przedstawiono na rysunku 1. Test składa się z płytki testowej (96-dołkowej płytki filtracyjnej) z substratami, a po inkubacji z enzymami supernatant jest filtrowany do przezroczystej płytki dołkowej i odczytywane są absorbancje, zapewniając półilościowy pomiar specyficzności i aktywności enzymu. Wykazano, że ten test przesiewowy z użyciem substratów CPH może być również stosowany w formacie płytki agarowej, gdzie rozpuszczalne produkty reakcji tworzą kolorową aureolę po całonocnej inkubacji. 8
Zestawy testowe mogą być używane do badań przesiewowych oczyszczonych enzymów i ich potencjalnych działań ubocznych, jak pokazano na rysunku 2. Działania uboczne mogą wynikać z pojedynczego enzymu i jego rozwiązłej specyficzności, ale także z faktu, że analizowana próbka jest mieszaniną różnych enzymów i należy zbadać ich efekt synergiczny. Dodatkowo, jak wykazano w poprzednich badaniach, jako źródło enzymów można stosować koktajle enzymatyczne, mikrobiotęjelitową 13 i buliony z kultur grzybów8 , a także endogenne enzymy roślinne i bakterie (dane niepublikowane).
Substraty ICB dotyczą złożonych mieszanin składników ściany komórkowej często spotykanych w przemysłowych procesach rozkładu biomasy. Substraty te mają na celu ocenę dostępności polisacharydów i dostarczają informacji o tym, jak skutecznie zoptymalizować koktajle degradacyjne w celu uzyskania bardziej wydajnej degradacji. Jak pokazano na rysunku 3 , substraty CPH i ICB mogą być stosowane w badaniach przesiewowych enzymów obok siebie - ujawniając bogactwo informacji na temat specyficzności i aktywności enzymu zarówno w kontekście preferowanego substratu (CPH), jak i bardziej naturalnego kompleksu zawierającego inne składniki oprócz preferowanego substratu, bardziej naśladując zespół makromolekularny występujący w naturze (ICB). Zastosowanie wielu kolorów pozwala na jednoczesne wykrywanie różnych aktywności enzymatycznych w stosunku do kilku substratów, co zwiększa wysoką przepustowość i multipleksowalność testu. Widma różnych barwników można rozwiązać za pomocą prostej regresji liniowej, a w większości przypadków aktywność na wielu substratach można zaobserwować wyłącznie za pomocą oględzin. Symulowany przykład takiego eksperymentu i jego wyniki przedstawiono na rysunku 4.
Ten zestaw narzędzi testowych i wszechstronność jego zastosowania bardzo dobrze nadają się do badań przesiewowych pierwszego poziomu enzymów i bulionów hodowlanych o nieznanej aktywności. Najważniejszymi aspektami tego testu są jego wysoka przepustowość, możliwość dostosowania, łatwość użycia i elastyczność. Mając to na uwadze, wierzymy, że ten nowatorski zestaw narzędzi znacznie poprawi i przyspieszy procesy badań przesiewowych enzymów w zastosowaniach przemysłowych i akademickich.
Oświadczenia
Złożono dwa wnioski patentowe dotyczące 96-dołkowego testu substratowego CPH na płytce i 96-dołkowego testu substratowego ICB (WO2015036000 i Dania PA 2015 70311).
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Prof. J. Paulowi Knoxowi (University of Leeds, Wielka Brytania), który udostępnił jego laboratoria do filmowania, oraz Susan E. Marcus za doskonałą pomoc techniczną. JS docenia projekt WallTraC (Siódmy Program Ramowy Komisji Europejskiej (umowa o grant nr: 263916) oraz projekt Biomasa dla XXI wieku (Duńska fundacja innowacji; nr sprawy: 103408). SKK dziękuje projektowi SET4Future (Duńska Rada ds. Badań Strategicznych), Bio-Value Strategic założonemu przez Duńską Radę Badań Strategicznych, Duńską Radę ds. Technologii i Innowacji (nr sprawy grantowej: 0603-00522B) oraz A Biology-driven Approach for Understanding Enzymatic Degradation of Complex Polysachcharide Systems (nr sprawy grantowej: 107279) za dofinansowanie. Niniejszy artykuł odzwierciedla jedynie poglądy autorów. Unia Europejska nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie informacji zawartych w niniejszym dokumencie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| płytki zestawu testowego | Glycospot | dostosowany zestaw testowy płytki | |
| do aktywacji substratów CPH | |||
| 350 ml płyta odbiorcza blok dystansowy do kolektora próżniowego | Blok dystansowy | Pall Corporation | 5015 |
| 96-dołkowa płyta filtracyjna MultiScreen HV, 0,45 i mikro; m, przezroczysta, niesterylna | Płytka do MSHVN4510 testowego | Millipore | |
| 96-dołkowe mikropłytki, polipropylenowa | Greiner Bio-One | 651201 | płytka zbiorcza po umyciu podłoży Nunc |
| MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Scientific | 269620 | tabliczka produktowa |
| Pompa membranowa MZ 2 NT | Vacuubrand | 732000 | pompa próżniowa używana z kolektorem |
| Infors HT Ecotron | Infors HT | 4950132 (& Holm) | wytrząsarka pozioma |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | 10067-750 (VWR) | 96-dołkowy czytnik absorbancji płytek |
| Kolektor próżniowy | Pall Corporation | 5017 | kolektor próżniowy |
| endo-celulaza (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) | Megazyme | E-CELTR | celulaza [cel] |
| endo-β-1,4-mannaza (Cellvibrio japonicus) | Mannaza Megazyme | E-BMACJ | [man] |
| endo-β-1,3-glukanaza (Trichoderma spp.) | Megazyme | E-LAMSE | β-glukanaza [glu] |
| endo-β-1,4-D-galaktanaza (Aspergillus niger) | Galaktanaza Megazyme | E-EGALN | [gal] |
| endo-β-1,4-ksylanaza M4 (Aspergillus niger) | Ksylanaza Megazyme | E-XYAN4 | [xyl] |
| endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) | Megazyme | E-XEGP | ksyllukanaza [xg] |
| &alfa;-amylaza (Bacillus licheniformis) | Megazyme | E-BLAAM | amylaza [amy] |
Bibliografia
- Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).
- Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
- Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).
- Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).
- Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
- Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).
- Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33 (4), 798(2002).
- Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
- Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).
- Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282(2013).
- Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).
- Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).
- Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).
Przedruki i uprawnienia
