Artykuł metodologiczny

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54294

⸱

25 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Imaging and Neurovascular Research Laboratory, Dongguk University College of Medicine, 2Biomedical Research Center, Korea Institute of Science and Technology, 3Research Institute of Advanced Materials, Department of Materials Science and Engineering, Seoul National University, 4Departments of Radiology and Cancer Systems Imaging, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Streszczenie

Bezpośrednie obrazowanie skrzepliny wizualizuje główną przyczynę zawału zakrzepowo-zatorowego. Możliwość bezpośredniego obrazowania skrzepliny pozwala na znacznie lepsze badanie udaru niż poleganie na pomiarach pośrednich i będzie silnym i solidnym narzędziem do badań naczyniowych. Stosujemy podejście do obrazowania optycznego, które znakuje skrzepliny za pomocą markera skrzepliny do obrazowania molekularnego - sondy fluorescencyjnej w bliskiej podczerwieni (NIRF) Cy5.5, która jest kowalencyjnie połączona z niciami fibryny skrzepliny przez enzymatyczne działanie aktywowanego czynnika krzepnięcia XIIIa podczas procesu dojrzewania skrzepu. Podejście oparte na mikrotomografii komputerowej (microCT) wykorzystuje nanocząstki złota poszukujące skrzepliny (AuNPs) funkcjonalizowane w celu celowania w główny składnik skrzepu: fibrynę. W artykule opisano szczegółowy protokół połączonego obrazowania zakrzepowo-zatorowego in vivo mikroCT i NIRF ex vivo w mysim modelu udaru zatorowego. Pokazujemy, że in vivo mikroCT i ukierunkowane na fibrynę glikol-chitozan AuNPs (fib-GC-AuNPs) mogą być wykorzystywane do wizualizacji zarówno skrzeplin in situ, jak i zatorowych zakrzepów mózgowych. Opisano również zastosowanie bezpośredniego obrazowania skrzeplin in vivo za pomocą mikrotomografii komputerowej do seryjnego monitorowania efektów terapeutycznych trombolizy za pośrednictwem tkankowego aktywatora plazminogenu. Po ostatniej sesji obrazowania wykazujemy za pomocą obrazowania ex vivo NIRF zakres i rozmieszczenie resztkowej choroby zakrzepowo-zatorowej w mózgu. Na koniec opisano ilościowe analizy obrazowe danych z obrazowania mikroCT i NIRF. Połączona technika bezpośredniego obrazowania skrzepliny pozwala na porównanie dwóch niezależnych metod wizualizacji skrzepliny: obszaru sygnału fluorescencyjnego związanego z zakrzepem w obrazowaniu NIRF ex vivo z objętością hipergęstych skrzeplin mikroCT in vivo.

Wprowadzenie

Jedna na 6 osób będzie miała udar w pewnym momencie swojego życia. Udar niedokrwienny jest zdecydowanie najczęstszym typem udaru i stanowi około 80 procent wszystkich przypadków udaru. Ponieważ choroba zakrzepowo-zatorowa powoduje większość tych udarów niedokrwiennych, rośnie zainteresowanie bezpośrednim obrazowaniem skrzepliny.

Oszacowano, że około 2 miliony komórek mózgowych umiera podczas każdej minuty niedrożności tętnicy środkowej mózgu1, co doprowadziło do sloganu "Czas to Mózg". Badania tomografii komputerowej (CT) można wykonać szybko i są one powszechnie dostępne; z tego powodu tomografia komputerowa pozostaje obrazowaniem z wyboru we wstępnej diagnostyce i leczeniu nadostrego udaru niedokrwiennego. Tomografia komputerowa jest szczególnie cenna przy podejmowaniu krytycznych decyzji na wczesnym etapie: podawania tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) do trombolizy i/lub triażu do wewnątrznaczyniowego pobierania skrzepów2. Obecne obrazowanie skrzepliny za pomocą tomografii komputerowej nie może jednak seryjnie śledzić zakrzepowo-zatorowości mózgu in vivo, ponieważ wykorzystuje metody pośrednie do wykazania skrzeplin: po zmętnieniu puli krwi za pomocą kontrastu jodowego, skrzepliny są wykazywane jako ubytki w wypełnieniu naczyń. Istnieją limity dawek i ryzyko związane z wielokrotnym podawaniem jodowego kontrastu, które wykluczają wielokrotne obrazowanie skrzeplin w ten sposób.

Dlatego istnieje krytyczna potrzeba bezpośredniego obrazowania skrzeplin mózgowych u pacjentów po udarze, aby umożliwić szybsze i lepsze podejmowanie decyzji dotyczących leczenia. Proponujemy osiągnąć ten cel poprzez zwiększenie wartości tomografii komputerowej, obecnie stosowanej metody obrazowania pierwszej linii w leczeniu udaru mózgu, z wykorzystaniem nanoszczególnego środka do obrazowania molekularnego poszukującego skrzepliny.

Pokazaliśmy użycie tego środka za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT), wysokorozdzielczej wersji obrazowania ex vivo lub in vivo (małe zwierzęta), która pozwala na szybkie pozyskiwanie danych3,4. Nawet przy stosunkowo słabym kontraście tkanek miękkich dostępnym dla mikrotomografii komputerowej małych zwierząt (znacznie gorszym niż w przypadku skanerów wielkości człowieka), środek do obrazowania był w stanie wyszukać i oznaczyć skrzepliny, powodując ich hipergęstość w tomografii komputerowej, "znak gęstego naczynia" wzmocniony przez obrazowanie molekularne.

Uzupełniając technikę tomografii komputerowej, nasza grupa wcześniej opracowała technikę optycznego bezpośredniego obrazowania skrzepliny za pomocą sondy fluorescencyjnej bliskiej podczerwieni (NIRF) Cy5.5 do wizualizacji obciążenia skrzepliną mózgową5. Jest to technika stosowana ex vivo na mózgach pośmiertnych, ale jest bardzo czuła i służy do potwierdzania danych in vivo w warunkach badawczych.

Posiadanie zarówno technik obrazowania skrzeplin opartych na CT, jak i NIRF, pozwala nam porównywać i zestawiać te techniki w celu uzyskania bardzo pouczających danych na temat roli obrazowania skrzepliny i skrzepliny w procesie rozwoju udaru niedokrwiennego.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół połączonej techniki obrazowania in vivo mikroCT i ex vivo NIRF w celu bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej w mysim modelu udaru zatorowego. Te proste i solidne metody są przydatne w pogłębianiu naszej wiedzy na temat chorób zakrzepowych, umożliwiając dokładną ocenę in vivo obciążenia/dystrybucji skrzepliny oraz charakterystykę dynamicznej ewolucji skrzepliny w szybki i ilościowy sposób in vivo podczas terapii, a następnie dane ex vivo, które służą jako standard kontrolny i referencyjny dla potwierdzenia wyników obrazowania in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach przedstawione w tym protokole zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dongguk w Ilsan oraz przeprowadzone zgodnie z zasadami i procedurami określonymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt.

1. Przygotowanie egzogennie uformowanego skrzepu znakowanego markerem fluorescencyjnym (Rysunek 1)

  1. Znieczulij mysz w komorze indukcyjnej za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z 30% tlenu (1,5 l/min 100% tlenu). Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, obserwując napięcie mięśniowe i potwierdzając brak odruchu szczypania palca u nogi.
  2. Umieść zwierzę na sterylnej serwicie w pozycji leżącej i utrzymuj je pod narkozą za pomocą maski inhalacyjnej i 2% izofluranu zmieszanego z 30% tlenem. Wykonaj następujące procedury przy użyciu technik aseptycznych i sterylnych fartuchów / masek / rękawiczek / narzędzi. Utrzymuj sterylne warunki, czyszcząc i odkażając obszar eksperymentalny 70% alkoholem przed i po zabiegach.
  3. Zbierz około 300 ~ 1,000 μl krwi tętniczej po punkcji serca6. Wymieszaj 70 μl krwi pełnej z 30 μl sondyC15 5 (stężenie 20 μmol/l), sondą fluorescencyjną Cy5.5 czułą na aktywność sieciującą fibrynę aktywowanego enzymu krzepnięcia czynnika XIII (FXIIIa), aby fluorescencyjnie oznaczyć skrzep (ryc. 1A). Mieszaninę krwi należy wstrzyknąć za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml (igła o rozmiarze 23) do rurki polietylenowej o długości 20 cm (PE-50, średnica wewnętrzna 0,58 mm). Rurki PE muszą być wysterylizowane (lub certyfikowane przez producenta jako sterylne), a skrzepy muszą być przygotowane w sposób aseptyczny w kapturze do hodowli tkankowych.
  4. Zweryfikuj śmierć zwierzęcia, obserwując brak oddychania i tętna serca.
  5. Pozostawić probówkę z krwią w temperaturze pokojowej na 2 godziny, a następnie w temperaturze 4 °C na 22 godziny i wykonać następujące procedury, jak opisano wcześniej7.
  6. Pokrój rurkę zawierającą skrzeplinę na kawałki o długości 1,5 cm. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), wyprowadzić skrzeplinę na 6-dołkową płytkę zawierającą PBS, delikatnie wstrzykując PBS do każdego kawałka probówki. Umyj skrzepliny trzykrotnie PBS (ryc. 1B).
  7. Załaduj dystalną końcową część rurki PE-10 o długości 15 cm (średnica wewnętrzna 0,28 mm) skrzepliną o długości 1,5 cm, ostrożnie rysując przemytą skrzeplinę, unikając pęcherzyków powietrza, za pomocą wypełnionej solą fizjologiczną strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 30, którą wkłada się do bliższego końca probówki.
  8. Połącz rurkę PE-10 obciążoną skrzepliną z rurką PE-50 o długości 3 cm (średnica wewnętrzna 0,58 mm) zmodyfikowaną tak, aby miała zwężający się koniec (ID 200 μm), który zostanie umieszczony w obszarze bifurkacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) – tętnicy mózgowej przedniej (ACA) tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) w mysim modelu udaru zatorowego (ryc. 1C).

2. Modelowanie mysiego modelu udaru zakrzepowo-zatorowego (Rysunek 2)

  1. Znieczulij inną mysz, która ma być głaskana, jak wcześniej opisano7 w komorze indukcyjnej, używając 3% izofluranu zmieszanego z 30% tlenu (1,5 l/min). Meloksykam (5 mg/kg) należy wstrzyknąć podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, obserwując napięcie mięśniowe i potwierdzając brak odruchu szczypania palca u nogi.
  2. Nałóż niewielką ilość maści weterynaryjnej na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Wykonaj następujące zabiegi chirurgiczne przy użyciu technik aseptycznych i sterylnych fartuchów / masek / rękawiczek / narzędzi. Utrzymuj sterylne warunki, czyszcząc i odkażając obszar operacyjny 70% alkoholem przed, w trakcie i po operacji.
  3. Przesuń mysz na stół operacyjny. Umieść zwierzę na sterylnej serwety w pozycji leżącej i utrzymuj je pod narkozą za pomocą maski inhalacyjnej i 2% izofluranu. Następnie należy ustawić temperaturę ciała na poziomie 36,5 °C za pomocą koca homeotermicznego z informacją zwrotną z termometru doodbytniczego.
  4. Po chirurgicznym przygotowaniu z użyciem betadyny i 70% alkoholu, wykonaj 1 cm pionowe nacięcie za pomocą skalpela na skórze głowy między lewym uchem a okiem. Przyklej dystalny koniec światłowodu laserowego przepływomierza dopplerowskiego do odsłoniętej lewej powierzchni kości skroniowej (1 mm po lewej i 4 mm poniżej bregmy). Następnie rozpocznij monitorowanie przepływu dopplerowskiego (rysunek 2A).
  5. Połóż zwierzę. Wyprostuj szyję, pociągając za górny przedni ząb za pomocą sznurka przymocowanego do szpilki i ogol obszar szyi. Następnie wykonaj 3 cm pionowe nacięcie linii środkowej, rozłóż je i odsłoń lewy obszar bańki szyjnej, preparując okołonaczyniowe tkanki miękkie. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.
  6. Podwiązać lewą bliższą tętnicę szyjną wspólną (CCA) za pomocą sterylnego czarnego jedwabnego szwu 6-0 i podwiązać lewą ICA i lewą tętnicę skrzydłowo-podniebienną (PPA) za pomocą sterylnych czarnych jedwabnych szwów 7-0.
  7. Kauteryzować lewą górną tętnicę tarczycową, która jest gałęzią lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej za pomocą monopolarnej kauteryzacji elektrycznej, i podwiązywać lewą bliższą tętnicę szyjną zewnętrzną zewnętrzną luźno i bardziej dystalnie za pomocą sterylnych czarnych jedwabnych szwów 7-0.
  8. Za pomocą mikronożyczek wykonaj mały otwór (o średnicy około 0,2 ~ 0,25 μm) między podwiązanymi miejscami ECA.
  9. Wprowadzić cewnik zawierający skrzeplinę do otworu w ECA, jednocześnie poluzowując proksymalne podwiązanie ECA. Ponownie zaciśnij bliższe podwiązanie ECA po wsunięciu cewnika do CCA, aby zacisnąć cewnik na miejscu.
  10. Kauteryzować, aby przeciąć dystalną część ECA, która jest dystalna w stosunku do dystalnego miejsca podwiązania, i obrócić wolną proksymalną ECA zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyrównać ją w kierunku ICA podczas wyjmowania cewnika z CCA. Następnie należy przesunąć cewnik o około 9 mm do obszaru rozwidlenia MCA − ACA dystalnego ICA natychmiast po poluzowaniu podwiązania ICA. Następnie dokręć podwiązanie ICA.
  11. Umieścić skrzeplinę w obszarze rozwidlenia, delikatnie naciskając strzykawkę o pojemności 1 ml w celu wstrzyknięcia skrzepliny. Sprawdź zmniejszenie dopplerowskiego przepływu krwi w mózgu (CBF), który powinien być obniżony o 30% lub mniej w porównaniu z wartością wyjściową, jeśli skrzeplina pomyślnie zamknęła naczynie (ryc. 2B).
  12. Usunąć cewnik i natychmiast i mocno podwiązać miejsce proksymalne ECA. Ponadto należy rozciągnąć CCA i PPA.
  13. Zamknij miejsce nacięcia za pomocą jedwabnych szwów 6-0. Przerwij znieczulenie po kontynuowaniu monitorowania dopplerowskiego przez wymagany okres czasu (w tym przypadku przez 30 minut po wstrzyknięciu skrzepliny). Włóż mysz z powrotem do pustej klatki i utrzymuj ją w cieple za pomocą lampy grzewczej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie uzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.

3. Obrazowanie in vivo mikrotomografii komputerowej skrzepliny mózgowej (Rysunek 3)

  1. Ponownie znieczulić mysz 2% izofluranem, jak opisano w kroku 2.1, w określonym wcześniej punkcie czasowym (w tym przypadku 1 godzina) po wystąpieniu udaru zatorowego z powodu umieszczenia skrzepliny w tętnicy mózgowej. Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, potwierdzając brak odruchu szczypania palca u nogi. Nałóż niewielką ilość maści weterynaryjnej na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Zawiesić ponownie nanocząstki złota ukierunkowane na fibrynę (fib-GC-AuNP4) w stężeniu 10 mg Au/ml w 10 mM PBS i sonikować środek do obrazowania skrzepliny przez 30 minut, aby zapewnić rozpuszczenie i dyspersję nanocząstek. Wstrzyknąć 300 μl fib-GC-AuNP (10 mg/ml) do żyły prącia.
  3. Umieść zwierzę na łóżku maszyny do mikrotomografii komputerowej i wyprostuj szyję, pociągając górny przedni ząb za pomocą sznurka przymocowanego do szpilki, aby zmniejszyć artefakty ruchu.
  4. Po 5 minutach od wstrzyknięcia fib-GC-AuNP należy rozpocząć uzyskiwanie obrazów mózgu za pomocą mikrotomografii komputerowej. Do opisanych tutaj eksperymentów należy użyć następujących parametrów obrazowania: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm3 pole widzenia, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm3 rozmiar woksela, 100 milisekund na klatkę, 1 uśrednianie, 360 wyświetleń, 512 x 512 matryca rekonstrukcyjna, 600 warstw, czas skanowania 64 s.
  5. Włóż mysz z powrotem do pustej klatki i utrzymuj ją w cieple za pomocą lampy grzewczej. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie uzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
  6. Przekształć surowe dane obrazu do formatu DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) za pomocą polecenia "Start" w panelu "Rekonstrukcja" w pakiecie oprogramowania zainstalowanym w skanerze microCT.
  7. W przypadku analiz ilościowych obrazów (w kroku 6) przekształć dane DICOM do formatu TIFF przy użyciu dostępnego na rynku pakietu oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Do analiz jakościowych, a także analiz ilościowych w prostszy i szybszy sposób, należy skorzystać z pakietu oprogramowania i oryginalnych obrazów o grubości 0,054 mm w formacie DICOM do wygenerowania nowego zestawu obrazów osiowych i koronalnych renderowanych tak, aby miały grubość 1 lub 2 mm (w tym przypadku 2 mm), jak poniżej.
    1. Wybierz folder DICOM w drzewie "Źródło danych", kliknij prawym przyciskiem myszy i zaimportuj folder do "MasterDB" lub "PrivateDB".
    2. Kliknij "MasterDB" lub "PrivateDB" w drzewie "Źródło danych" i wybierz zaimportowany folder. Po kliknięciu zakładki "3D" w skrajnym lewym panelu, gdy pojawi się okno "Opcje ładowania", naciśnij "OK", aby zaimportować sekwencję obrazów z folderu jako stos.
    3. Zmień reprezentację obrazu na format projekcji o maksymalnej intensywności (MIP), klikając słowo "MRP" w oknach obrazu osiowego i koronalnego, a następnie wybierając opcję "MIP" w menu podręcznym. Następnie zmień grubość obrazu na 2 mm po kliknięciu 'TH : 0 [mm]' w tych samych oknach.
    4. Korzystając z paska nawigatora 3D o szerokości 2 mm, który pozwala na eksplorację stosu obrazów i krojenie go pod odpowiednim kątem i w odpowiednim miejscu, przygotuj obraz przekroju osiowego o grubości 2 mm z pełnym pokryciem okręgu Willisa (COW), w którym znajdują się skrzepliny. Kliknij przycisk przechwytywania (ikona aparatu) w panelu "Wyjście". Zapisz obraz w formacie TIFF.
  9. Następnie przygotuj pięć obrazów przekroju koronalnego o grubości 2 mm, które obejmują ciągłość od płata czołowego do móżdżku.
    1. Najpierw przygotuj drugi plasterek, ostrożnie wyrównując pasek nawigatora na obrazie osiowym, tak aby obraz koronalny mógł jak najlepiej uwidocznić skrzepliny MCA − ACA.
    2. Następnie przygotuj pozostałe cztery plasterki w ciągły sposób. Kliknij przycisk przechwytywania (ikona aparatu) w panelu "Wyjście". Zapisz obrazy w formacie TIFF.

4. Tromboliza i obrazowanie in vivo mikrotomografii komputerowej skrzepliny mózgowej (Ryc. 3)

  1. Przygotuj probówkę PE-10 o długości 100 cm z igłą o rozmiarze 30 na jednym końcu i strzykawką o pojemności 1 ml na drugim końcu. Napełnij probówkę solą fizjologiczną (600 μl) lub tPA (tutaj 24 mg/kg, 600 μl), unikając pęcherzyków powietrza.
  2. Ponownie znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 2.1. Wprowadzić końcówkę igły do żyły prącia zwierzęcia. Ostrożnie ułóż zwierzę na łóżku urządzenia do mikrotomografii komputerowej. Następnie unieruchomić i ustabilizować dożylnie wstrzykniętą część układu cewnika, przyklejając ją taśmą do łóżka.
  3. Wykonaj kontrolną sesję obrazowania jako punkt odniesienia przed leczeniem. Następnie wstrzyknąć 60 μl soli fizjologicznej lub tPA, wciskając tłok strzykawki do układu cewnika. Po wstrzyknięciu bolusa należy rozpocząć podawanie pozostałego roztworu (540 μl) przez pewien czas (w tym przypadku 30 minut).
  4. Uzyskać obrazy mikrotomografii komputerowej przy użyciu tych samych parametrów, co w kroku 3.4, w określonych wcześniej punktach czasowych: tutaj, po 3 i 24 godzinach od wstrzyknięcia bolusa. Aby wykonać następujące obrazowanie skrzepliny NIRF ex vivo mózgu, należy poddać zwierzę eutanazji pod narkozą przez zwichnięcie szyjki macicy.

5. Obrazowanie skrzepliny ex vivo NIRF i barwienie tkanki mózgowej chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) (Rysunek 4)

  1. Po dekapitacji usuń skórę głowy i przetnij czaszkę nożyczkami od otworu wielkiego w kierunku szwu strzałkowego. Usuń sklepienie czaszki, ostrożnie podnosząc krawędzie naciętej czaszki za pomocą nożyczek, unikając obrażeń leżącego poniżej mózgu, odsłaniając w ten sposób półkule.
  2. Wytnij nerwy wzrokowe w podstawie mózgu jak najbliżej powierzchni mózgu, ponieważ mogą one pokrywać się z okręgiem tętnic Willisa, które powinny być uwidocznione w obrazowaniu NIRF. Następnie, aby wyraźnie uwidocznić kształt litery Y "MCA / ACA / dystalne ICA" do obrazowania skrzepliny NIRF, wytnij dystalne ICA tak daleko, jak to możliwe, do powierzchni mózgu po delikatnym ściśnięciu podstawy móżdżku, aby odsłonić punkty cięcia (ryc. 4A).
  3. Wykonaj obrazowanie NIRF (wzbudzenie / emisja, 675/690 nm; ekspozycja 1 sekunda) usuniętej tkanki mózgowej z jej podstawą skierowaną do góry (ryc. 4B, C), która wizualizuje fluorescencyjnie znakowaną chorobę zakrzepowo-zatorową w tętnicach krowy (ryc. 4D). Następnie wykonaj dodatkowe obrazowanie z wierzchołkiem mózgu skierowanym do góry, co uwidoczni korową chorobę zakrzepowo-zatorową. Unikaj wysuszania mózgu, nakładając kilka kropel soli fizjologicznej na tkankę.
  4. Za pomocą urządzenia brain matrix zgodnie z instrukcjami producenta szybko przygotuj plastry mózgu o grubości 2 mm koronalnie: 6 sztuk plastrów o grubości 2 mm (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm od bregmy). Unikaj wysuszania wycinków mózgu za pomocą kropli soli fizjologicznej i wykonaj obrazowanie NIRF zarówno przedniej, jak i tylnej powierzchni sekcji.
  5. Umieść plastry mózgu w 2% roztworze chlorku trifenylotetrazolu (TTC) na 20 minut, unikając ekspozycji na światło. Następnie przenieś plastry do 4% roztworu formaldehydu w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło.

6. Kwantyfikacja obszaru skrzepliny za pomocą obrazów MicroCT i oprogramowania ImageJ (1.49d) (Rysunek 5)

  1. Otwórz obrazy (Rysunek 5A).
    1. Otwórz pliki sekwencji obrazów, aby utworzyć plik stosu, wybierając opcję "Plik > importuj > sekwencji obrazów" lub "Otwórz plik >". Przekonwertuj obrazy na 8-bitową skalę szarości za pomocą opcji "Typ obrazu > > 8-bitowy".
  2. Przelicz jednostkę z cala na milimetr (Rysunek 5A).
    1. Gdy jeden piksel w plikach obrazu CT odpowiada 0,053 mm, użyj opcji "Analizuj > ustaw skalę", aby wprowadzić odpowiednio "1", "0,053" i "mm" odpowiednio dla "Odległości w pikselach", "Znanej odległości" i "Jednostki długości".
    2. Jeśli dostępna jest (tylko) podziałka liniowa, za pomocą narzędzia "Linia prosta" narysuj linię o długości równej długości podziałki liniowej. Następnie użyj opcji "Analizuj > ustaw skalę", aby wprowadzić długość podziałki liniowej w milimetrach.
  3. Odejmowanie tła (rysunek 5B)
    1. Korzystając z opcji "Edytuj> Zaznaczenie> Określ", umieść okrągły lub prostokątny obszar zainteresowania (ROI) na obszarze miąższu mózgu bez skrzepliny lub hipergęstych obszarów związanych z kośćmi. Ponieważ określony zwrot z inwestycji ma zastosowanie do każdego wycinka stosu, sprawdź, czy nie nakłada się on na obszary hipergęste w każdym wycinku.
    2. Wybierz "Wtyczka > ROI > odjęcie BG od ROI" i wprowadź 2.0 w polu "Liczba standardowych odchyleń od średniej".
  4. Segmentacja hipergęstych zmian zakrzepowo-zatorowych (ryc. 5C)
    1. Wybierz opcję "Dostosuj > próg obrazu >" i wprowadź wartości "Dolny poziom progu" i "Górny poziom progu" odpowiednio jako 22 i 255. Wybierz opcję "Powyżej/Poniżej", aby wyświetlić piksele poniżej dolnej wartości progowej na niebiesko, piksele z progiem w skali szarości, a piksele powyżej górnej wartości progowej na zielono.
    2. Użyj narzędzia "Zaznaczanie odręczne", aby narysować ROI, które otaczają hipergęste zmiany związane z chorobą zakrzepowo-zatorową bez uwzględniania obszarów kostnych. Podczas rysowania naciskaj [shift] lub [alt], aby dodać lub usunąć region.
      Uwaga: Jeśli hipergęste zmiany zakrzepowo-zatorowe są oddalone od struktur kostnych, zamiast "Narzędzia do zaznaczania odręcznego" można bezpiecznie użyć "Narzędzia różdżki" bez zmiany jego poziomu "Tolerancja".
  5. Kwantyfikacja zmian segmentowych (ryc. 5D)
    1. Użyj opcji "Analizuj > ustaw pomiary", aby wybrać "Obszar", "Średnia wartość szarości" i "Zintegrowana gęstość (obszar X średnia)". Zaznacz następujące opcje: "Ogranicz do progu" i "Wyświetl etykietę". Użyj opcji "Analizuj > mierz", aby uzyskać dane ilościowe. Następnie zapisz wyniki jako plik ".xls".
    2. Zapisz plik stosu w formacie TIFF. Ponadto użyj opcji "Analizuj narzędzia > > menedżera ROI", aby zapisać zwrot z inwestycji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazy microCT wyjściowe, uzyskane in vivo po podaniu fib-GC-AuNP (10 mg/ml, 300 µl) 1 h po udarze zatorowym, wyraźnie zwizualizowały zakrzep mózgowy w obszarze rozwidlenia MCA – ACA dystalnej tętnicy szyjnej wewnętrznej (Rysunek 6). Obrazowanie microCT w obserwacji nie wykazało zmian w zakrzepie COW po leczeniu solą fizjologiczną. Jednakże leczenie tPA wykazało stopniowe rozpuszczanie zakrzepu COW (niebieskie groty strzałek na Rysunku 6). Wynik ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykazaliśmy zastosowanie dwóch uzupełniających się technik obrazowania molekularnego do bezpośredniego obrazowania skrzepliny w eksperymentalnych modelach udaru zatorowego: nanocząstki złota ukierunkowanej na fibrynę (fib-GC-AuNP) do obrazowania in vivo opartego na mikrotomografii komputerowej oraz celowanej sondy obrazowania optycznego FXIIIa do obrazowania fluorescencyjnego ex vivo .

Po dożylnym podaniu fib-GC-AuNPs, skrzepliny stały się widoczne dla CT jako gęste struktury...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

D-E.K., J-Y. K, C-H. A i K.K. są właścicielami patentów na nanocząstkę złota ukierunkowaną na fibrynę (10-1474063-0000, Koreański Urząd ds. Własności Intelektualnej). Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Projekt R&D Koreańskiej Technologii Opieki Zdrowotnej, Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej (HI12C1847, HI12C0066), Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych (2010-0019862) oraz program Globalnego Laboratorium Badawczego (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) Narodowej Fundacji Badawczej, finansowany przez rząd koreański.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Machines
microCTNanoFocusRay, JeonJu, KoreaNFR Polaris-G90
NIRFRoper-scientific, Tucson, AZcoolsnap-Ez
Laserowy przepływomierz dopplerowskiPerimed, Sztokholm, SzwecjaPeriFlux System 5000
Mikroskop chirurgicznyLeica Microsystems, Seul, KoreaEZ4HD
Aparat do znieczulenia wziewnegoPerkinElmer, Massachusetts, USAXGI-8
Software
NFR controlNanoFocusRay, JeonJu, KoreaOprogramowanie sterujące mikrotomografiąNFR Polaris-G90
LucionInfinitt, Seul, KoreaOprogramowanie do obrazowania 3DLucion
Wykres laboratoryjny 7ADInstruments, Kolorado, USAWykres laboratoryjny 7rCBF
Oprogramowanie ImageJWanye Rasband, NIH, USAAnaliza obrazowania1.49d
Urządzenia/instrumenty
Pompa infuzyjnaHarvard, Massachusetts, USApompa 22(55-2226)
Koc homeotermicznyPanlab, Barcelona, HiszpaniaHB101
Kieszonkowy kauteryzatorDaejong, Seul, KoreaDJE-39
Matryca mózguTed Pella, CA, USA15003o przekroju koronalnym
Natsume, Tokio, JaponiaSP-45 (PE-50)ID 0,58 mm średnica zewnętrzna 0,96 mm
rurka PE-10Natsume, Tokio, JaponiaSP-10 (PE-10)ID 0,28 mm OD 0,61 mm
igła o średnicy 30sungshim-medical, Seul, Korea
StrzykawkaCPL-medical, Ansan, Korea1 & 3 cc
GauzePanamedic, Cheonan, Korea
TapeScotch, Seul, Korea3M-810
Mikro kleszczeFine Science Tools, Vancouver, Kanada  11253-27Dumont #L5
Micro scissorFine Science Tools, Vancouver, Kanada15000-03Vannas spring
ScissorFine Science Tools, Vancouver, Kanada14084-088,5 cm
jedwabny szewAilee, Busan, KoreaSK6071, SK7286-0 i 7-0
odczynniki
meloksykamYuhan, Seul, Korea
maść weterynaryjnaNovartis, Bazylea, Szwajcaria
10% jodu powidonu (betadyna)Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3Sigma, Missouri, Stany Zjednoczone157740-5G
TTCAmresco, Ohio, USA0765-100g
IsofluraneHana-Pham, Gyeonggi, KoreaIfran100 ml
PBSWelgene, Daegu, KoreaLB001-02500 ml
NanocząstkiSynteza
C15 środekSynteza
Tkankowy aktywator plazminogenuBoehringer Ingelheim, Biberach, NiemcyrtPA(aktyliza)20 mg
Sól fizjologicznaDaihan Pham, Seul, Korea48N3AF3Pojemność 20 ml
System obrazowania rurka PE-50 złota optyczny

Bibliografia

  1. Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
  2. Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
  3. Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
  4. Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
  5. Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
  6. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  7. Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. Fisher, M. 92, Elsevier. 43-66 (2009).
  8. Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
  9. Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
  10. Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
  11. Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
  12. Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
  13. Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
  14. Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
  15. Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
  16. Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
  17. Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. Jr In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
  18. Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
  19. Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
  20. Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanocz steczki z ota celowane w fibrynwizualizacja skrzepuaktywator plazminogenu tkankowegomodel udaru zatorowegoilo ciowa analiza obrazumikro CT in vivoobrazowanie NIRF ex vivo

Powiązane artykuły