Artykuł metodologiczny

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

DOI:

10.3791/54298

⸱

16 lipca 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrata komórek β produkujących insulinę jest główną cechą cukrzycy. Podczas gdy badane są różne potencjalne terapie zastępcze, ekspansja endogennych komórek β wysp trzustkowych wytwarzających insulinę pozostaje atrakcyjną strategią. β-komórki mają ograniczoną spontaniczną aktywność regeneracyjną; W związku z tym kluczowym wysiłkiem badawczym jest dokładne zrozumienie szlaków molekularnych, które hamują wzrost komórek β, oraz zidentyfikowanie leków zdolnych do przezwyciężenia tych ograniczeń. W niniejszym artykule przedstawiono zautomatyzowaną, opartą na obrazie metodę badań przesiewowych komórek pierwotnych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji małych cząsteczek promujących replikację komórek β. Udało się przezwyciężyć kilka ograniczeń związanych z wcześniejszymi metodologiami. Po pierwsze, użycie pierwotnych komórek wysp trzustkowych, a nie unieśmiertelnionej linii komórkowej, maksymalizuje zachowanie ograniczeń wzrostu in vivo. Po drugie, zastosowanie hodowli komórek wysp trzustkowych o mieszanym składzie, a nie linii komórek β, pozwala na identyfikację zarówno stymulatorów wzrostu o ograniczonym pochodzeniu, jak i ogólnych. Po trzecie, technika ta umożliwia praktyczne wykorzystanie pierwotnych wysepek, które są zasobem ograniczającym, dzięki zastosowaniu formatu 384 odwiertów. Po czwarte, szkodliwa zmienność eksperymentalna związana z nieregularną jakością hodowli wysp trzustkowych jest przezwyciężana poprzez optymalizację parametrów izolacji, dyspersji, posiewu i hodowli. Po piąte, trudności związane z dokładnym i spójnym pomiarem niskiego wskaźnika replikacji podstawowej komórek endokrynnych wysp trzustkowych zostały przezwyciężone dzięki zoptymalizowanym parametrom barwienia immunologicznego, zautomatyzowanemu pozyskiwaniu i analizie danych; Automatyzacja jednocześnie zwiększa przepustowość i ogranicza stronniczość eksperymentatorów. Godnymi uwagi ograniczeniami tego testu są stosowanie rozproszonych kultur wysepek, które zakłócają architekturę wysp, stosowanie wysepek gryzoni zamiast ludzkich oraz nieodłączne ograniczenia przepustowości i kosztów związane z użyciem komórek pierwotnych. Co ważne, strategię tę można łatwo dostosować do badań nad replikacją ludzkich wysp trzustkowych. Test ten doskonale nadaje się do badania mitogennego wpływu substancji na komórki β oraz mechanizmów molekularnych regulujących wzrost komórek β.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca obejmuje zbiór zaburzeń, które mają wspólny punkt końcowy w postaci zaburzonej homeostazy glukozy. Chociaż mechanizmy chorobowe podtypów cukrzycy są różne, ich wspólną konsekwencją jest zmniejszenie masy β komórek, czyli utrata zdolności do produkcji insuliny1,2. Obecnie strategie leczenia cukrzycy polegają na przewlekłym podawaniu insuliny egzogennej, farmakologicznej stymulacji produkcji insuliny lub zwiększaniu wrażliwości insulinowej, a rzadziej na przeszczepianiu wysp trzustkowych lub całej trzustki3,4. Niestety, sukces tych strategii jest krótkotrwały i/lub nie podsumowuje w wystarczającym stopniu funkcji endogennej produkcji insuliny. Pomimo użyteczności opracowania metody stymulowania regeneracji komórek β, takie podejście nie istnieje. W związku z tym głównym celem badań nad cukrzycą jest opracowanie metod generowania nowych komórek β lubzwiększania endogennej masy komórek β 5. Chociaż regeneracja komórek β ze źródeł odnawialnych, takich jak embrionalne komórki macierzyste, postępuje, obawy dotyczące bezpieczeństwa i wydajności sprawiają, że poszukiwanie alternatywnych strategii, w tym ekspansji dojrzałych komórek β, staje się priorytetem6,7. Co ważne, dominującym źródłem nowych komórek β in vivo są istniejące wcześniej komórki β, a nie wyspecjalizowane komórki progenitorowe8,9. Chociaż wydaje się, że komórki β mają ograniczoną zdolność replikacji, niewielki wzrost masy komórek β (~ 30%) może być wystarczający do przywrócenia homeostazy glukozy u wielu diabetyków. Co więcej, farmakologiczna stymulacja masy β komórek in situ jest potencjalnie niedrogą i skalowalną strategią leczenia. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i scharakteryzowania małych cząsteczek, które stymulują wzrost komórek β.

Różne metody eksperymentalne in vitro mogą być używane do identyfikacji produktów genów i/lub molekuł, które promują pierwotną replikację komórek β. Wczesne próby pomiaru indukcji replikacji komórek β wykorzystywały hodowlę trzustki płodu gryzoni lub nienaruszone izolowane kultury wysp trzustkowych do pomiaru [3H] inkorporacji tymidyny, inkorporacji BrdU lub ciał mitotycznych w populacji barwionej aldehydowo-tioninową lub insuliną w odpowiedzi na określone warunki leczenia10,11. Te podejścia in vitro i ich zbliżone warianty mają kilka ograniczeń. Do istotnych niedoborów należą: (1) wykorzystanie komórek płodowych, które w przeciwieństwie do dojrzałych komórek β wykazują wysoki współczynnik replikacji komórek podstawowych β i są regulowane wzrostem w wyraźny sposób12; (2) subiektywny charakter zależnego od eksperymentatora oceniania zdarzeń replikacji β komórek; (3) pracochłonny i czasochłonny charakter zależnego od eksperymentatora liczenia zdarzeń replikacji β komórek opóźnia wydajność eksperymentalną; (4) Użycie inkorporacji/barwienia/wyglądu jądra do identyfikacji zdarzeń replikacji i nienakładającego się barwienia cytoplazmatycznego do identyfikacji komórek β prowadzi do błędnego przypisania bezpośrednich zdarzeń replikacji komórek innych niż β komórkom β.

Ostatnio dojrzałe pierwotne komórki β były używane do oceny wpływu nadekspresji transgenu, jak również produktu genu lub leczenia związkiem na replikację komórek β13-16. Jednak badania te opierały się również na subiektywnym liczeniu zdarzeń replikacji, barwieniu cytoplazmatycznym lub niespecyficznych metodach identyfikacji komórek β i / lub pracochłonnych krokach ograniczających przepustowość, np. indywidualnym posiewaniu komórek metodą szkiełkową lub osadzaniu i przetwarzaniu nienaruszonej parafiny wysp trzustkowych17. Warto zauważyć, że metodologia badań przesiewowych replikacji komórek β człowieka oparta na obrazie, podobna do przedstawionej w niniejszym dokumencie, została opublikowana18; Nie wykazano jednak skutecznego stosowania tego testu, a wykorzystanie ludzkich wysp trzustkowych do pierwotnych badań przesiewowych może nie być zasadniczo wykonalne.

Alternatywną strategią identyfikacji substancji wspomagających replikację jest ocena indukcji wzrostu linii β-komórkowych. Początkowe wysiłki dotyczyły przekształconych linii komórek β, takich jak komórki min6 lub komórki INS 832/1314,19-21. Jednak te linie komórkowe wykazują nieskrępowany wzrost i wykazują niewielkie podobieństwo do dobrze zróżnicowanych komórek β22. W związku z tym zdolność do indukcji wzrostu jest minimalna, ma niejasne znaczenie i czasami jest trudna do podsumowania. Ulepszona strategia badań przesiewowych opartych na liniach komórkowych wykorzystuje "odwracalnie przekształcone" komórki, które są zatrzymywane w przypadku braku zależnej od tetracykliny (doksycykliny) ekspresji antygenu T SV4023,24. Nie jest jednak jasne, czy komórki te powracają do "normalnego" stanu podobnego do β komórkowego po usunięciu doksycykliny. Niestety, użycie tych komórek przyniosło uogólnione związki stymulujące wzrost, które nie wydają się mieć natychmiastowej użyteczności. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie linii komórkowych do badania regulacji wzrostu typu komórki wykazującej minimalną spontaniczną aktywność replikacyjną może mieć ograniczone zastosowanie.

Przedstawiona tutaj platforma przesiewowa replikacji komórek β wykorzystuje dojrzałe pierwotne komórki β szczurów do zachowania regulacji wzrostu in vivo w możliwym zakresie, hodowle komórek wysp trzustkowych o mieszanym składzie komórkowym, aby umożliwić identyfikację ograniczonych przez linię działań promujących wzrost, formatowanie wielodołkowe w celu maksymalizacji przepustowości i zautomatyzowanej analizy w celu wyeliminowania stronniczości i ułatwienia przepustowości. Udane wykorzystanie tej platformy umożliwiło identyfikację kilku związków, które promują replikację komórek β25,26. Ponadto test został wykorzystany do badań zależności struktura-aktywność i eksperymentów z epistazą chemiczną, aby zapewnić mechanistyczny wgląd w molekularną regulację replikacji komórek β. Zaprezentowana platforma została z powodzeniem zaadaptowana do badania szlaków replikacji komórek β w oparciu o lentiwirusowe RNAi25. Ograniczenia testu obejmują ograniczoną skalowalność (wykorzystanie komórek pierwotnych), użycie komórek wysp trzustkowych gryzonia zamiast ludzkich (chociaż test może być dostosowany do badań nad ludzkimi wyspami trzustkowymi), wydatki związane z obrazowaniem opartym na przeciwciałach i wykorzystaniem pierwotnych wysp trzustkowych, wykorzystanie rozproszonych wysepek trzustkowych (zakłócona architektura wysp trzustkowych) w celu ułatwienia automatycznego pozyskiwania obrazów oraz zależność od dostępności zautomatyzowanego mikroskopu z możliwością akwizycji i analizy obrazu. Chociaż idealna byłaby łatwa metodologia badań przesiewowych in vivo w celu identyfikacji produktów genowych lub związków stymulujących regenerację komórek β in situ, taka platforma nie jest jeszcze dostępna27. W związku z tym opisana platforma jest odpowiednia dla badaczy zainteresowanych badaniem większości aspektów replikacji komórek β.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został przeprowadzony zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) ze Szkoły Medycznej Uniwersytetu Stanforda. Opisany protokół jest skalowany do izolacji wysp trzustkowych od sześciu samców szczurów Sprague Dawley o wadze 250 - 300 g (8 - 9 tygodni), co jest wystarczające do wygenerowania 228 dołków z 384-dołkową płytką do oceny replikacji komórek wysp trzustkowych.

1. Przygotowanie materiału

  1. Przygotować pożywkę powlekającą przed rozpoczęciem izolacji wysp trzustkowych, zbierając kondycjonowane podłoże komórek raka pęcherza szczura 804G utrzymywanych w stanie zbiegu przez 3 dni (20 ml RPMI1640) w 15-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej 28. Przefiltrować sterylnie i przechowywać (-20 °C) kondycjonowane media do późniejszego użycia.
  2. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (jeden 12-centymetrowy ząbkowany kleszcz tkankowy, jeden cienki nożyczki 11,5 cm, jeden 14,5 cm nożyczki chirurgiczne, dwa zakrzywione kleszcze 16 cm, jeden zakrzywiony hemostat 12 cm, jeden 12-centymetrowy uchwyt skalpela) i jedno sito do tkanek o oczkach 30 przed rozpoczęciem izolacji wysp trzustkowych.
  3. Przygotuj roztwór do wytrawiania trzustki, rozpuszczając 60%:40% mieszaninę oczyszczonych kolagenaz klasy I: II (całkowita aktywność kolagenazy 300 000 - 400 000 jednostek) w 60 ml 1x Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) uzupełniony wapniem i magnezem. Załadować 10 ml buforu do wytrawiania trzustki do 10 ml strzykawek (sześciu) za pomocą igły 1" 22 G i umieścić na lodzie.
    Uwaga: Na szczura wstrzykuje się 10 ml roztworu wytrawiającego. Skaluj odpowiednio.
  4. Przygotuj 4,5 ml koktajlu znieczulającego w wentylowanym kapturze, mieszając 1,3 ml ketaminy (100 mg/ml), 0,2 ml ksylazyny (100 mg/ml) i 3 ml PBS. Przygotuj koktajl znieczulający w ciągu 1 godziny od rozpoczęcia izolacji wysp trzustkowych.
  5. Przygotować bufor do przemywania przez dodanie 25 ml surowicy cielęcej nowonarodzonego cielęcia do 500 ml HBSS. Umieść bufor do mycia na lodzie do późniejszego wykorzystania.
  6. Przygotuj 1 butelkę pożywki z wysp trzustkowych, która zawiera 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) o niskim poziomie glukozy, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 000 jednostek/ml penicyliny i 5 000 μg/ml streptomycyny.
  7. Przygotować pożywkę funkcyjną wysp trzustkowych z roztworu funkcyjnego/żywotności (500 ml) z 2% FBS, 2 mM glutaminy, 5 mM glukozy, 5 000 jednostek/ml penicyliny i 5 000 μg/ml streptomycyny. Przechowywać nośnik funkcji wysepki (4 °C) do późniejszego wykorzystania.
  8. Przygotować 40 ml buforu blokującego, dodając 2,5 ml surowicy osła i 0,12 ml trytonu X-100 do 37,38 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać bufor blokujący (4 °C) do późniejszego użycia.
  9. Uzyskać wymagane przeciwciała przed rozpoczęciem protokołu.
    Uwaga: Współbarwienie PDX-1 (TRITC) i Ki-67 (FITC) jest stosowane do pierwotnego przesiewowego badania przesiewowego replikacji komórek β. W przypadku analizy replikacji specyficznej dla linii należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne w celu uzyskania dodatkowych markerów tożsamości komórki (insuliny, glukagonu, wimentyny lub somatostatyny; TRITC) wraz z barwieniem jądrowym (DAPI), PDX (Cy5) i Ki-67 (FITC). Można również stosować alternatywne markery replikacji, np. PCNA.
  10. Przygotuj plan leczenia składający się z 228 dołków, w którym każdy stan leczenia jest wykonywany w czterech częściach. Obejmują studzienki dodatnie (5-jodotubercydyna [1 μM] lub dipirydamol [15 μM]) i kontrolne nośnika (rozcieńczenie DMSO 1:666).

2. Perfuzja trzustki

  1. Znieczulić szczury przez wstrzyknięcie domięśniowe rozcieńczonego roztworu koktajlu znieczulającego (0,30 ml/100 g masy ciała). Gdy szczur jest w pełni znieczulony i nie reaguje na szkodliwe bodźce, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Umieść uśpionego szczura w pozycji leżącej (orientacja czaszkowo-ogonowa) na stosie ręcznika papierowego i spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.
  3. Otwórz jamę brzuszną za pomocą nacięcia w kształcie litery U (podstawa w okolicy łonowej) i cofnij skórę w kierunku rostralnym nad klatką piersiową, aby odsłonić jamę brzuszną.
  4. Ostrożnie chwyć dwunastnicę za pomocą dwóch par zakrzywionych kleszczy, zlokalizuj wejście dwunastnicy do wspólnego przewodu żółciowego (zwieracza Oddi) i zaciśnij otwór dwunastnicy na brodawce za pomocą zakrzywionego hemostatu.
  5. Podnieś zakrzywiony hemostat używany do zaciskania brodawki wspólnego przewodu żółciowego i chwyć przewód żółciowy w pobliżu wątroby za pomocą zakrzywionych kleszczy. Użyj rozwarstwienia za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby wyizolować i odsłonić przewód żółciowy.
  6. Zmień pozycję szczura z głową bliższą i dystalnymi stopami.
  7. Kankaniulować wspólny przewód żółciowy (CBD) na lub tylko dystalnie do połączenia torbielowatych i wspólnych przewodów wątrobowych za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z roztworem do trawienia trzustki i powoli wstrzykiwać 10 ml roztworu do trawienia trzustki. Podczas wstrzykiwania podeprzyj CBD rękojeścią skalpela. Zmień położenie igły, jeśli przewód i trzustka nie mogą się napompować.
  8. Usuń napompowaną trzustkę za pomocą zakrzywionych kleszczy i cienkich nożyczek, aby oddzielić ją od zstępującej okrężnicy, jelit, żołądka i śledziony. Umieść napompowaną trzustkę na lodzie w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml roztworu do trawienia trzustki.
    Uwaga: Aby uzyskać maksymalną wydajność wysepek, zbierz całą trzustkę w ciągu 30 minut i umieść tylko 1 lub 2 trzustki w każdej probówce do wytrawiania o pojemności 50 ml.

3. Dysocjacja trzustki

  1. Po zebraniu całej trzustki umieść probówki wytrawiające w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut. Delikatnie obracaj rurki co 3 minuty.
  2. Po 15 minutach energicznie wstrząsnąć (pionowo) probówkami 10 razy i dodać 10 ml buforu do mycia na zimno. Energicznie potrząśnij rurkami jeszcze 5 razy i połóż na lodzie.
  3. Napełnij probówki wytrawiające do 50 ml buforem do płukania na zimno i wymieszaj, odwracając probówki 5 razy.
  4. Odwirować probówki o sile 97 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę i odlać sklarowany nad osadem. Uważaj, aby nie usunąć granulowanej tkanki.
  5. Dodać 25 ml buforu do płukania i ponownie zawiesić tkankę, delikatnie wirując. Powtórz kroki 3.4 i 3.5 jeszcze dwa razy.
  6. Umieścić sito tkankowe o oczkach 30 na sterylnej zlewce o pojemności 250 ml i wylać zawiesinę tkanek na sito. Przepłukać probówkę do wytrawiania dodatkowymi 20 ml buforu do przemywania i wylać na siatkę. Na tym etapie usuwana jest niestrawiona tkanka trzustkowa i tłuszczowa.
  7. Przefiltrowany materiał przelać do dwóch świeżych probówek o pojemności 50 ml i otoczkować tkankę, wirując pod ciśnieniem 97 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zdekantować probówki supernatant i odwrócić w celu odprowadzenia nadmiaru buforu.

4. Oczyszczanie wysepek

  1. Dodać 20 ml zimnego roztworu polisarozy/ditrizoinianu sodu (o gęstości 1,119 g/ml) do granulowanej tkanki trzustki. Równomiernie zawiesić zawartość każdej probówki, delikatnie pipetując w górę i w dół pięć razy.
  2. Delikatnie nałożyć roztwór polisacharozy/ditrizoinianu sodu na 10 ml HBSS. Utrzymuj ostry interfejs cieczy, powoli dodając HBSS wzdłuż ścianki rury.
  3. Odwirować strawioną trzustkę przy sile 560 x g przez 15 minut (4 °C) z powolnym przyspieszaniem i bez hamowania.
  4. Zebrać warstwę wysepek z granicy faz za pomocą pipety o pojemności 10 ml i umieścić wysepki w świeżych probówkach o pojemności 50 ml. Na tym etapie nie należy sadzić wysepek w puli.
  5. Dodać 40 ml buforu do przemywania do każdej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 1 minutę w temperaturze 140 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Odlać sklarowany osad i ponownie zawiesić zebrane wysepki w 50 ml buforu do płukania, kilkakrotnie odwracając probówki. Odwirowywać probówki przez 1 minutę przy 97 x g w temperaturze 4 °C, aby zebrać wysepki w postaci osadu.
  7. Odlej bufor do płukania i powtórz pranie. Wprowadzić wysepki do okapu do hodowli tkankowej i odessać supernatant.
  8. Zawiesić każdą probówkę z wysepkami w 6 ml pożywki z wysepek.
  9. Przenieść wysepki z każdej probówki o pojemności 50 ml do studzienki z sześciodołkowym naczyniem do hodowli tkankowych. Zakręć 6-dołkową miską, aby zebrać wysepki na środku studzienki i obserwować jakość i czystość wysepek pod mikroskopem.
  10. Ręcznie zebrać wysepki za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieść pobrane wysepki do sąsiedniej studzienki zawierającej 6 ml pożywki z wysepek. Powtarzaj wirowanie i zbieranie wysepek, aż do osiągnięcia czystości > 90%.
  11. Przenieść oczyszczone wyspy trzustkowe do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 20 ml pożywki z wysp trzustkowych.
  12. Umieścić wysepki w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ) na noc (ryc. 1A).
  13. Przygotowując komórki wysp trzustkowych, należy pokryć studzienki płytki 384-dołkowej 40 μl pożywki kondycjonowanej 804G na studzienkę. Inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych.

5. Dyspersja i poszycie komórek wysp trzustkowych

  1. Następnego dnia delikatnie oderwij wysepki od 10-centymetrowego naczynia za pomocą skrobaczki do komórek i przenieś wysepki do probówki o pojemności 50 ml.
  2. Wysepki osadzać przez odwirowanie przez 1 minutę przy 22 x g w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
  3. Umyć wysepki 20 ml ciepłego PBS i zdekantować jak wyżej.
  4. Ponownie zawiesić wyspy trzustkowe w 0,25% trypsyny (150 μl na trzustkę szczura) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Odpipetować wyspy trzustkowe w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety 1 ml po 5 i 10 minutach inkubacji.
  5. Po 10 minutach ocenić pod mikroskopem próbkę trypsynizowanych wysp o objętości 20 μl, aby zapewnić pełne trawienie i policzyć komórki wysp trzustkowych za pomocą hemocytometru. Jeśli pozostaną niestrawione wysepki, kontynuuj inkubację przez dodatkowe 3 - 5 minut i pipetuj w górę i w dół jeszcze 10 razy. W razie potrzeby powtórz czynność.
    Uwaga: Typowa wydajność wynosi ~ 125 000 - 150 000 komórek wysp trzustkowych na szczura.
  6. Wyjąć z inkubatora 384-dołkową płytkę pokrytą pożywką kondycjonowaną przez 804G i usunąć pożywkę za pomocą 12-dołkowego aspiratora kolektora.
  7. Zawiesić komórki wysp trzustkowych o gęstości 45 000 komórek na ml w pożywce z funkcją wysp trzustkowych i podać 70 μl (3 150 komórek) na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej (ryc. 1B).
    Uwaga: Ponieważ komórki β znajdujące się w zewnętrznych studzienkach mają tendencję do migracji w kierunku obwodu płytki, użyj rzędów od C do N i kolumn od 4 do 21, aby umieścić 228 dołków z komórkami wysp trzustkowych wyizolowanymi od 6 szczurów.
  8. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 48 godzin, aby umożliwić przyleganie komórek.

6. Leczenie, utrwalanie i barwienie hodowli komórek wysp trzustkowych

  1. Przygotować 200 μl podłoża i związków (warunki obróbki przeprowadza się poczwórnie) o stężeniu 2x w pożywce z funkcją wysp trzustkowych. Ułóż związki na sterylnej 96-dołkowej płytce, aby ułatwić pipetowanie wielodołkowe.
  2. Ostrożnie usunąć pożywkę z wysepek za pomocą 12-dołkowego aspiratora kolektora i zastąpić pożywką z funkcją wysepek (35 μl/dołek) za pomocą 12-dołkowej pipety. Usuwaj i wymieniaj nośniki z jednego rzędu na raz, aby ograniczyć ryzyko wysuszenia (Rysunek 1C).
  3. Rozpocznij leczenie, przenosząc 35 μl/studzienkę 2x roztworów złożonych. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na czas leczenia trwający 48 godzin.
  4. Po 48 godzinach od zabiegu zdekantować pożywkę zabiegową, odwracając płytkę.
  5. Delikatnie przemyć komórki wysp trzustkowych 50 μl na studzienkę 1x PBS (1 min). Dodaj PBS za pomocą pipety wielokanałowej.
  6. Zdekantować PBS i utrwalić komórki, dodając 50 μl na studzienkę zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w 1x PBS. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Umyj komórki trzy razy (po 5 minut każda), odwracając płytkę w celu usunięcia PFA i delikatnie dodając 60 μl PBS na studzienkę, jak powyżej.
  8. Przygotować 15 ml roztworu do pobierania antygenu, mieszając 14,25 ml formamidu i 0,75 ml 0,15 M cytrynianu sodu (pH 6). Przygotuj roztwór do pobierania antygenu bezpośrednio przed użyciem.
  9. Usunąć PBS ze studzienek, odwracając płytkę i dodać 60 μl roztworu do pobierania antygenu do każdej studzienki. Podgrzewać płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez 45 minut. Podczas tej inkubacji umieść blok grzewczy na wierzchu płytki, aby zapobiec wypaczeniu płytki wielodołkowej.
    Uwaga: Woda powinna znajdować się w połowie wysokości spódnicy płyty; Płyta nie powinna być zanurzona.
  10. Wyjmij płytkę z łaźni wodnej i pozwól jej ostygnąć przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że płyta nie jest zniekształcona przez oględziny.
  11. Przemyć komórki 60 μl na studzienkę 1x PBS trzy razy (5 minut każde). Dodaj PBS za pomocą pipety wielokanałowej i zdekantuj PBS, odwracając płytkę.
  12. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 40 μl buforu blokującego na studzienkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący, odwracając płytkę i dekantując.
  13. Dodać 40 μl mysich przeciwciał anty-ludzkich Ki-67 (1:200) i kozich przeciwciał anty-ludzkich PDX-1 (1:100) rozcieńczonych w buforze blokującym do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  14. Następnego dnia zdekantować roztwór przeciwciał i przemyć komórki 1x PBS trzy razy (po 5 minut każde), jak opisano powyżej. Zdekantować PBS.
  15. Dodać 40 μl na studzienkę rozcieńczonej (1:200) biotynylowanej anty-mysiej IgG osła i sprzężonej z rodaminą anty-koziej IgG osła w buforze blokującym. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  16. Umyj komórki 1x PBS trzy razy po 5 minut każda. Dodać 40 μl rozcieńczonej (1:400 w buforze blokującym) streptawidyny sprzężonej z fluoresceiną do każdej studzienki. Inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Umyj komórki 1x PBS trzy razy po 5 minut każda. Dodać 40 μl DAPI na studzienkę (300 nM w buforze blokującym) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  18. Umyj komórki 1x PBS dwa razy i pozostaw komórki w 40 μl 1x PBS. Płyta jest teraz gotowa do analizy.

7. Analiza replikacji β-komórkowej

Uwaga: Należy ustanowić protokół testu dla mikroskopu przesiewowego o wysokiej zawartości stosowanego do pomiaru replikacji komórek β. W swojej najprostszej kompozycji protokół ten jest dwukolorowym testem, w którym znacznik tożsamości jest używany do definiowania komórek β (komórki PDX-1+), a marker replikacji (Ki-67) służy do definiowania zdarzeń podziału komórki.

  1. Zidentyfikuj obiekty (β komórki) na podstawie średniej intensywności fluorescencji barwienia PDX-1 (filtr 549 nm) w przybliżonym okręgu (długość: szerokość < 1,6) w oczekiwanym obszarze pikseli jądra komórkowego β (rysunek 2A).
  2. Następnie ustal ustawienia w celu identyfikacji zdarzeń replikacji (dodatnia wartość Ki-67) w oparciu o średnią intensywność fluorescencji (filtr 485 nm) w obszarze PDX-1+ (Rysunek 2B).
    Uwaga: Czasy ekspozycji muszą być stałe, aby umożliwić porównanie intensywności pikseli na różnych obrazach. Parametry protokołu testu są dostosowywane w taki sposób, aby wywołania maszyn konsekwentnie wykluczały niespecyficzne barwienia, zanieczyszczenia i agregacje komórek, które mogłyby niekorzystnie wpłynąć na jakość danych.
  3. Analizuj co najmniej 500 β-komórek na studzienkę, aby zmaksymalizować dokładność i ograniczyć zmienność.
    Uwaga: Oczekuje się, że podstawowy wskaźnik replikacji komórek β w kulturach wysp trzustkowych szczurów wyniesie 0,5 - 3%. Zazwyczaj 40 obrazów na studzienkę jest więcej niż wystarczające do zidentyfikowania 500 komórek β.
  4. Przed analizą całej płytki należy przeanalizować wybrane studzienki poddane działaniu ujemnej (potraktowanej DMSO) i kontrolnej dodatniej (5-jodotubercydyna [1 μM] lub dipirydamol [15 μM]), aby ocenić ważność protokołu testu. Gdy test zostanie prawidłowo ustalony, związki kontroli dodatniej wywołują co najmniej dwukrotny wzrost odsetka replikujących się komórek β.
  5. Przeczytaj całą tabliczkę po zatwierdzeniu protokołu testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić replikację komórek β lub α, wymagany jest protokół testu czterokolorowego. Po pierwsze, obiekty są identyfikowane za pomocą barwienia DAPI (kanał 1, 386 nm). Następnie zliczane są β-komórki (zdarzenie 1): obiekty, które wykazują współekspresję PDX-1+ (kanał 2, 650 nm) i insulinę okołojądrową (kanał 3, 549 nm). Następnie zliczane są replikujące się komórki β (zdarzenie 2): β komórki (zdarzenie 1), które wykazują współekspresję Ki-67 (kanał 4, 485 nm) (ryc. 3)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne metody badania szlaków molekularnych, które kontrolują wzrost i regenerację komórek β, są ważnymi narzędziami dla badaczy zajmujących się cukrzycą. W niniejszym artykule przedstawiono platformę przesiewową opartą na wysepkach szczurzych w celu identyfikacji i scharakteryzowania małocząsteczkowych stymulatorów replikacji komórek β.

Podczas gdy większość aspektów tego protokołu jest łatwo wykonywana przez doświadczonych badaczy, kilka kroków wymaga szczególnej techniki. Po pierws...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIDDK DK098143 i DK101530 z NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) i SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
250 g samiec Samiec Sprague Dawly RatCharles RiverStain # 400
12 cm zęby kleszcze tisuueFine Science Tools11021-12
Cienkie nożyczki 11,5 cmFine Science Tools14058-11
Nożyczki chirurgiczne 14,5 cmFine Science Tools14001-14
16 cm zakrzywione kleszczeFine Science Tools11003-16
12 cm zakrzywiony hepostatFine Science Tools13011-12
12 cm rękojeść skalpelaFine Science Tools10003-12
Sito do tkanek-30 oczekBellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375 000 jednostek CDAVitaCyte005-1030
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (Ca++ i Mg++)Gibco24020-117
Ketamina HCl (200 mg/20 ml)JHP PharmaceuticalsNDC# 42023-113-10do przygotowania koktajlu znieczulającego 
Ksylazyna (5 g/50 ml)LLOYDNADA# 139-236do przygotowania koktajlu znieczulającego 
Histopaque 1077SigmaH-1077do histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119do histopaque 1100
Surowica dla noworodków cielęcych 500 mlHycloneSH30118.03
Zbilansowany roztwór soli HanksaHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucos HycloneSH30021.01
Funkcjonalność/Rentowność Rozwiązanie Mediatech99-768-CV
RPMI1640 media HyclonSH30096.01do produkcji kondycjonowanej pożywki
Linia komórkowa raka pęcherza moczowego szczura 804GDostępna na żądaniedo przygotowania kondycjonowanej pożywki
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowanaGibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
Penicylina (5,000 IU/ml/Strptomycyna (5 mg/ml) MP Biomedicals1670049
Formamid 500 mlFisher BioReagentsBP227-500
Roztwór demaskujący antygen 250 ml (pH 6,0)Vector LaboratoriesH-3300do wytworzenia 0,15 M roztworu sitrynianu sodu
Dekstroza, bezwodnyEMD ChemikaliaDX0145-1do wytworzenia 1 M roztworu glukozy
Nomal Donkey Serum (proszek)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
Mysie przeciwciało anty-ludzkie Ki67BD Biosciences556003
Kozie przeciwciało anty-ludzkie PDX-1R& D SystemsAF2419
Poliklonalne przeciwciało antyinsulinowe świnki morskiejDako2016-08
Poliklonalne przeciwciało antyglukagonowe królikaDako2014-06
Poliklonalne przeciwciało anty-somatostatynowe królikaDako2011-08
Poliklonalne przeciwciało anty-wimentynowe kurczakaabcamab24525
Biotyna-SP-sprzężona, Osioł Anty-Mysz IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, Alex Mąka 488 sprzężona InvitrogenS32354
IgG  osła sprzężonego z rodaminąJackson ImmunoResearch705-025-147
IgG  IgG  osła sprzężonego z rodaminąJackson ImmunoResearch706-025-148
IgG przeciw królikom sprzężonym z rodaminą osiołJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy5-sprzężony osioł IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Cy 5-sprzężony z osłem IgG anty-koziJackson ImmunoResearch705-175-147
Cy 5-sprzężony osioł IgG IgGJackson ImmunoResearch711-175-152
Cy 5-sprzężony z osiołem IgG przeciwko kurczakomJackson ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
Jednorazowy zbiornik na odczynniki 25 mlSorenson BioScience39900
384 dołk,/przezroczysty, płytka poddana hodowli tkankowejBD Falcon353962
96 dołk,/przezroczysty, płytka poddana działaniu kultur tkankowychCostar3603
Pipetor wielokanałowyCostar4880
12-kanałowy aspirator próżniowyDrummond3-000-096
Skrobak do komórekFalcon353085
Izotempowa kąpiel wodna Model 2223 Przyrząd do
: ArrayScan VTIThermo Scientific
badań przesiewowych o wysokiej zawartości firmy Fisher Scientific

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600(2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Replikacja kom rek betakom rki wysepek trzustkowychwysokoprzepustowe badanie przesiewowe high content screeningprotok izolacji wysepekzautomatyzowana analiza obrazowaniaimmunobarwienie Ki 67format p ytki 384 do kowejpierwotna hodowla kom rkowametoda dysocjacji trypsynoczyszczanie w gradiencie g sto ci

Powiązane artykuły