Artykuł metodologiczny

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

DOI:

10.3791/54305

⸱

23 sierpnia 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzymy hydrolizujące adenozynotrifosforan lub ATPazy odgrywają kluczową rolę w różnorodnym wachlarzu funkcji komórkowych. Te dynamiczne białka mogą generować energię do prac mechanicznych, takich jak transport i degradacja białek, transport substancji rozpuszczonych i ruchy komórkowe. Opisany tutaj protokół jest podstawowym testem do pomiaru aktywności in vitro oczyszczonych ATPaz w celu charakterystyki funkcjonalnej. Białka hydrolizują ATP w reakcji, w wyniku której uwalnia się nieorganiczny fosforan, a ilość uwolnionego fosforanu jest następnie oznaczana ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego. Ten wysoce elastyczny protokół można dostosować do pomiaru aktywności ATPazy w testach kinetycznych lub końcowych. Przedstawiono tutaj reprezentatywny protokół oparty na aktywności i wymaganiach EpsE, ATPazy AAA+ biorącej udział w wydzielaniu typu II w bakterii Vibrio cholerae. Ilość oczyszczonego białka potrzebna do pomiaru aktywności, długość testu oraz czas i liczba odstępów między próbkami, skład buforu i soli, temperatura, kofaktory, stymulanty (jeśli występują) itp. mogą różnić się od opisanych tutaj, a zatem konieczna może być pewna optymalizacja. Protokół ten zapewnia podstawowe ramy do charakteryzowania ATPaz i może być wykonywany szybko i łatwo dostosowywany w razie potrzeby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATPazy są integralnymi enzymami w wielu procesach we wszystkich królestwach życia. ATPazy działają jak silniki molekularne, które wykorzystują energię hydrolizy ATP do zasilania tak różnorodnych reakcji, jak transport, rozwijanie i składanie białek; replikacja i transkrypcja; metabolizm komórkowy; ruch mięśni; ruchliwość komórek; i pompowanie jonów1-3. Niektóre ATPazy są białkami transbłonowymi zaangażowanymi w transport substancji rozpuszczonych przez błony, inne są cytoplazmatyczne i mogą być związane z błoną biologiczną, taką jak błona plazmatyczna lub błony organelli.

ATPazy AAA+ (ATPazy związane z różnymi aktywnościami komórkowymi) tworzą dużą grupę ATPaz, które mają pewną sekwencję i konserwację strukturalną. Białka te zawierają konserwatywne motywy wiążące nukleotydy, takie jak pudełka Walker-A i -B, i tworzą oligomery (zwykle heksamery) w stanie aktywnym1. Duże zmiany konformacyjne w tych białkach po wiązaniu nukleotydów zostały scharakteryzowane wśród różnych członków rodziny AAA+. EpsE jest ATPazą AAA + i należy do podrodziny wydzielania bakteryjnego typu II/IV NTPaz4-6. EpsE zasila wydzielanie typu II (T2S) w Vibrio cholerae, czynniku wywołującym cholerę. Układ T2S jest odpowiedzialny za wydzielanie szerokiej gamy białek, takich jak czynnik wirulencji toksyna, który powoduje obfitą wodnistą biegunkę, gdy V. cholerae kolonizuje ludzkie jelito cienkie7.

Techniki ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro są zróżnicowane, ale zazwyczaj mierzą uwalnianie fosforanów za pomocą barwników, fluorescencyjnych lub radioaktywnych substratów8-11. Opisujemy podstawową metodę oznaczania aktywności ATPazy in vitro oczyszczonych białek za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na dostępnym na rynku substracie zawierającym zieleń malachitową, który mierzy uwolniony fosforan nieorganiczny (Pi). Przy niskim pH zielony molibdenian malachitu tworzy kompleks z liczbą Pi, a poziom tworzenia kompleksu można zmierzyć przy 650 nm. Ten prosty i czuły test może być wykorzystany do funkcjonalnego scharakteryzowania nowych ATPaz i oceny ról potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów, do określenia znaczenia domen i / lub specyficznych reszt lub do oceny wpływu poszczególnych zabiegów na aktywność enzymatyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przeprowadź reakcję hydrolizy ATP z oczyszczonym białkiem

  1. Przygotować zapasy wszystkich niezbędnych odczynników do inkubacji z oczyszczonym białkiem.
    1. Przygotować 5x bufor HEPES/NaCl/glicerol (HNG) zawierający 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl i 5% glicerolu (lub inny bufor do oznaczania, jeśli dotyczy).
    2. Przygotuj 100 mM MgCl2 (lub inny metal, jeśli ATPaza jest zależna od metalu) w wodzie.
    3. Przygotuj świeże 100 mM ATP w 200 mM Tris Base (nie dostosowuj dalej pH) przy użyciu ATP o wysokiej czystości. Podziel i przechowuj zapas ATP w temperaturze -20 °C nie dłużej niż kilka tygodni, ponieważ ATP rozkłada się z czasem, i powstrzymaj się od zamrażania i rozmrażania zapasów ATP.
    4. Premiks MgCl2 i ATP w stosunku 1:1 tuż przed rozpoczęciem reakcji hydrolizy ATP.
  2. Przygotować i oznaczyć probówki o pojemności 1,5 ml do pobierania próbek w regularnych odstępach czasu przez cały czas trwania reakcji. Przygotować probówki do pobierania próbek o czasie 0 oraz o czasie 15, 30, 45 i 60 min.
    UWAGA: Alternatywnie próbki należy pobierać tylko w czasie 0 i w punkcie końcowym.
    1. Dodać 245 μl 1x bufor HNG do każdej probówki w celu rozcieńczenia próbek pobranych z reakcji hydrolizy ATP w stosunku 1:50.
  3. Przygotować kąpiel z suchego lodu i etanolu do szybkiego zamrażania próbek, aby zatrzymać reakcję. W gumowym wiaderku na lód lub innym bezpiecznym (nieplastikowym) pojemniku dodaj kilka kawałków suchego lodu i ostrożnie wlej tyle 70-100% etanolu, aby pokryć suchy lód.
  4. Rozcieńczyć oczyszczone białko w 1x buforze HNG, w zależności od potrzeb (zwykle 5-10 μM) i przechowywać na lodzie.
  5. Ustaw reakcje hydrolizy ATP.
    1. W oddzielnych probówkach o pojemności 0,5 ml do każdej próbki dodać następujące odczynniki (w kolejności):H2O, (do końcowej objętości 30 μl), 6 μl 5x HNG lub innego buforu, 3 μl 100 mM mieszaniny MgCl2-ATP i 0,25-5 μM białka.
    2. Obejmują one warunek kontroli ujemnej tylko buforu, w którym nie dodaje się białka.
  6. Usunąć 5 μl z reakcji w czasie 0, rozcieńczyć w stosunku 1:50 w przygotowanej probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 245 μl buforu HNG i natychmiast zamrozić próbkę w łaźni suchego lodu/etanolu.
  7. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C, aby umożliwić hydrolizę ATP przez 1 godzinę. W każdym odstępie czasu (15, 30, 45 i 60 min) usunąć 5 μl podwielokrotności z reakcji i dodać do znakowanych probówek zawierających bufor HNG, jak w kroku 1.6.
  8. Po zakończeniu reakcji hydrolizy ATP rozcieńczone próbki przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. Aby upewnić się, że wszystkie próbki są całkowicie zamrożone, odczekaj co najmniej 10 minut przed kontynuowaniem.

2. Inkubuj próbki zawierające wolne Pi za pomocą odczynnika do wykrywania

  1. Rozcieńczone próbki zawierające podwielokrotności reakcji hydrolizy ATP rozmrozić w każdym punkcie czasowym (otrzymanym z etapów 1.6 i 1.7) w temperaturze pokojowej.
  2. Ustawić 96-dołkową płytkę zawierającą próbki i wzorce fosforanów.
    1. W probówce o pojemności 0,5 ml rozcieńczyć wzorzec fosforanowy (dostarczony z odczynnikiem do wykrywania liczby Pi) od 800 μM do 40 μM, dodając 5,5 μl wzorca 800 μM do 104,5 μl buforu HNG. Dobrze wymieszać i dodać 100 μl tego 40 μM wzorca Pi do dołka A1 na 96-dołkowej płytce.
    2. Dodać 50 μl buforu HNG do studzienek B1-H1 w celu szeregowych rozcieńczeń 1:1 wzorca Pi.
    3. Usunąć 50 μl z 40 μM Pi z dołka A1 i dodać do 50 μl buforu do oznaczania w basenie B1, wymieszać i usunąć 50 μl z basenika B1 i dodać do dołka C1, kontynuując rozcieńczenia przez basenik G1. Po wymieszaniu wyrzucić 50 μl z dołka G1, aby upewnić się, że każda studzienka ma taką samą objętość. Cóż, H1 powinien zawierać tylko bufor, aby utworzyć standard Pi od 40 do 0 μM.
      UWAGA: Jeśli do próbek dodano dodatkowy czynnik (taki jak inhibitor), należy utworzyć krzywą wzorcową zawierającą ten czynnik w celu kontroli zmian w uwalnianiu lub absorbancji fosforanów w tych warunkach.
    4. Dodać 50 μl każdej próbki w dwóch egzemplarzach do płytki. Dodaj próbki z tego samego punktu czasowego w kolumnach pionowo (próba 1 raz 0 = A2, A3; próbka 2 raz 0 = B2, B3) i różne punkty czasowe poziomo. Pozwala to na uzyskanie do 8 próbek i 5 punktów czasowych na płytkę.
  3. Użyj sterylnego pipetu, aby usunąć wystarczającą ilość odczynnika do wykrywania Pi w kolorze zieleni malachitowej/molibdenianu, aby dodać 100 μl do każdej z studzienek zawierających próbki i wzorce (potrzebny odczynnik (ml) = 0,1 x liczba próbek i wzorców) i dodać do naczynia w celu łatwego pipetowania za pomocą pipety wielokanałowej. Nie wlewaj odczynnika detekcyjnego bezpośrednio do naczynia, ponieważ istnieje prawdopodobieństwo zanieczyszczenia Pi.
  4. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 μl odczynnika do wykrywania liczby Pi do każdej studzienki i wymieszaj, ostrożnie pipetując w górę i w dół stałą liczbę razy bez wprowadzania pęcherzyków, najlepiej w kolejności od ostatnich punktów czasowych do pierwszych punktów czasowych.
  5. Inkubować płytkę przez 25 minut w temperaturze pokojowej lub zgodnie ze wskazówkami producenta.

3. Ilościowe określanie wyników za pomocą czytnika mikropłytek

  1. Odczytać absorbancję próbek przy długości fali 650 nm za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji.
  2. Utwórz krzywą standardową liczby Pi. Korzystając z oprogramowania do tworzenia wykresów, narysuj na wykresie wartości absorbancji dla próbek wzorcowych Pi w funkcji stężenia, aby znaleźć równanie użyte do rozwiązania ilości fosforanu w każdej próbce.
  3. Obliczyć aktywność ATPazy dla każdej próbki, kalibrując ją z wzorcem fosforanowym. Uwolniony fosforan = (OD650 - punkt przecięcia Y)/nachylenie.
    1. Uśrednij całkowitą liczbę Pi z duplikatów każdej próbki. Od tej liczby odejmij odczyt absorbancji kontroli tylko z buforem. Pomnóż to przez współczynnik rozcieńczenia (w naszym przykładzie 50).
    2. Określ nmol Pi uwalniane na μmol białka. Wykres tych wartości dla każdego punktu czasowego w teście kinetycznym powinien dać pasowania liniowe co najmniej R = 0,99 (rysunek 1); W przeciwnym razie test można dostosować z większą lub mniejszą ilością białka lub dłuższym lub krótszym czasem inkubacji.
  4. W razie potrzeby należy przedstawić wyniki jako nmol Pi/μmol białka/min (rysunki 2, 3) lub jako nmol Pi/μg białka/min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność in vitro ATPazy T2S EpsE może być stymulowana przez kooczyszczanie EpsE z cytoplazmatyczną domeną EpsL (EpsE-cytoEpsL) i dodanie kwaśnej fosfolipidowej kardiolipiny12. Możliwe jest również określenie roli poszczególnych reszt EpsE w hydrolizie ATP poprzez porównanie aktywności typu dzikiego (WT) z wariantowymi formami białka za pomocą tego testu. W tym przypadku efekt podstawienia dwóch reszt lizyny w domenie wiążącej EpsE mierzy się, porównując aktywność ATP...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jest to ogólny protokół pomiaru aktywności ATPazy in vitro oczyszczonych białek w celu charakterystyki biochemicznej. Ta metoda jest łatwa do optymalizacji; Na przykład dostosowanie ilości białka, składu i soli, temperatury oraz zmiana długości i interwałów testu (w tym zwiększenie całkowitej liczby interwałów) może poprawić ilościową ocenę aktywności. Dostępne na rynku odczynniki na bazie zieleni malachitowej są bardzo czułe i mogą wykrywać niewielkie ilości wolnego fosforanu (~50 pmol w 100 μl). Ze względu na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować za dofinansowanie z grantu National Institutes of Health RO1AI049294 (dla M. S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor HEPESFisherBP310-500
Chlorek soduFisherBP358-212
Chlorek magnezuFisherBP214-500
Adenozynotrifosforan (ATP)FisherBP41325
96-dołkowe płytki (przezroczyste, płaskodenne)VWR82050-760
BIOMOL GreenEnzo Life SciencesBML-AK111Preferowany odczynnik do wykrywania fosforanów. Uwaga: działa drażniąco.
mikropłytekBioTek Synergy lub porównywalne
Prism 5GraphPad
Czytnik oprogramowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
  2. Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).
  3. Maxson, M. E., Grinstein, S. The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump. J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).
  4. Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).
  5. Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae. J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).
  6. Camberg, J. L., Sandkvist, M. Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE. J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).
  7. Sandkvist, M. Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).
  8. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  9. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation. J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  10. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).
  11. Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides. Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).
  12. Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids. EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).
  13. McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein. J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).
  14. Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).
  15. Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).
  16. Savvides, S. N., et al. VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion. EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).
  17. Sanghera, J., Li, R., Yan, J. Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity. Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).
  18. Sherman, D. J., et al. Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).
  19. Zhang, X., et al. Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).
  20. Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza in vitrooznaczanie fosforan wziele malachitowahydroliza ATPoczyszczanie bia ekanaliza kinetycznaanaliza punktu ko cowegoanaliza kolorymetrycznapomiar absorbancji

Powiązane artykuły