Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Podsumowanie

Prezentujemy przejściową transgenezę i knockdown genu u Ciona intestinalis, siostrzanej grupie strunowców kręgowców, przy użyciu technik mikroiniekcji i elektroporacji. Takie metody ułatwiają genomikę funkcjonalną u tego prostego bezkręgowca, który charakteryzuje się podstawowymi cechami kręgowców, w tym struną grzbietową i nabłonkiem czuciowym głowy, a także wieloma ortologiami genów związanych z chorobami ludzkimi.

Streszczenie

Proste organizmy modelowe są instrumentalne dla badań in vivo procesów różnicowania rozwojowego i komórkowego. Obecnie ewolucyjny dystans do człowieka wynikający z konwencjonalnych systemów modelowania bezkręgowców oraz złożoność genomów kręgowców stanowią kluczowe wyzwania dla modelowania normalnych i patologicznych warunków człowieka. Strunowca Ciona intestinalis to strunowca bezkręgowców, który wyłonił się ze wspólnego przodka z kręgowcami i może reprezentować cechy na styku bezkręgowców i kręgowców. Wspólny plan budowy ciała ze znacznie prostszym składem komórkowym i genomowym powinien ujawnić powiązania sieci regulacji genów (GRN) i funkcjonalne odczyty genomiczne wyjaśniające zjawiska w stanie kręgowców. Zwarty genom Ciona, ustalonej linii embrionalnej z kilkoma podziałami i dużymi komórkami, w połączeniu z wszechstronnymi narzędziami społecznościowymi sprzyja efektywnym analizom funkcjonalnym genów w tym organizmie. W tym miejscu przedstawiamy kilka kluczowych metod dla tego obiecującego organizmu modelowego, który należy do najbliższej grupy siostrzanej kręgowców. Przedstawiamy protokoły przejściowej transgenezy przez elektroporację, wraz z knockdownem genów za pośrednictwem mikroiniekcji, które razem zapewniają środki do badania funkcji genów i genomowych elementów regulatorowych. Rozszerzamy nasze protokoły, aby dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób bazy danych społeczności są wykorzystywane do projektowania in silico eksperymentów regulacyjnych lub funkcjonalnych genów. Przykładowe badanie pokazuje, w jaki sposób można uzyskać nowe informacje na temat wzajemnych oddziaływań i ich kwantyfikacji wybranych czynników neuronalnych zachowanych między Cioną a człowiekiem. Ponadto pokazujemy przykłady zróżnicowanej lokalizacji subkomórkowej w komórkach embrionalnych, po elektroporacji DNA u zygot Ciona. Na koniec omawiamy potencjał tych protokołów do adaptacji do interferencji genów specyficznych dla tkanek za pomocą pojawiających się metod edycji genów. Metody in vivo zastosowane w projekcie Ciona pozwalają przezwyciężyć główne niedociągnięcia klasycznych organizmów modelowych w dążeniu do rozwikłania konserwatywnych mechanizmów w programie rozwoju struny, istotnych dla badań nad komórkami macierzystymi, odkrywania leków i późniejszego zastosowania klinicznego.

Wprowadzenie

Ostatnio, sekwencja genomu i transkrybowane repertuary genów stały się dostępne w wielu organizmach modelowych. Jednak określenie funkcjonalnych powiązań genów i tego, w jaki sposób te połączenia są wbudowane w DNA w celu wykonywania aktywności transkrypcyjnej w embrionalnym czasie i przestrzeni, pozostaje głównym wyzwaniem, zwłaszcza u kręgowców. Złożoność interakcji regulacyjnych i złożoność genomów^1,2, zwłaszcza u kręgowców, spowalniają skuteczne analizy funkcjonalne, w szczególności na poziomie DNA in vivo. Rzeczywiście, obecnie nie analizuje się GRN od zapłodnienia do końcowego, terminalnie zróżnicowanego stanu rozwijającego się organizmu.

Puchaci C. intestinalis reprezentują organizm modelowy, w którym możliwe mogą być takie pełne analizy GRN. Ma niezduplikowany genom typowy dla bezkręgowców z niewielką redundancją. Kręgowce, w przeciwieństwie do nich, przeszły dwie rundy duplikacji genomu, które wygenerowały większe rodziny genów i funkcjonalne zróżnicowanie, ale także redundancję między paralogami. Zwarte sekwencje cis-regulatorowe (jednostki kontrolne GRN) C. intestinalis i niezmienna linia embrionalna z niewielką liczbą komórek przypominają C. elegans. Co więcej, jego unikalna pozycja filogenetyczna jako bezkręgowej grupy siostrzanej kręgowców w obrębie strunowców pozwala na obserwację rozwojową, w rozdzielczości komórkowej, tworzącego się planu ciała strunowca^3-6.

Kluczową kwestią, która zapewnia przyszły sukces genomiki funkcjonalnej w organizmach modelowych, jest generowanie dużej liczby embrionów do ilościowych zaburzeń in vivo. Przełomem w genomice funkcjonalnej Ciona był rozwój techniki mikroiniekcji w jajach Ciona ⁷ oraz możliwość szybkiego uzyskania wielu przejściowo transgenicznych zwierząt za pomocą elektroporacji in vivo w setkach zygot Ciona ^8,9. W tym miejscu po raz pierwszy przedstawiamy bardziej pracochłonną technikę mikroiniekcji do celowania w pojedyncze geny, która pozostaje metodą z wyboru w przypadku knockdownu genów za pośrednictwem morfoliny (MO), w szczególności transkryptów matczynych. Oligonukleotydy MO zazwyczaj celują w inicjator ATG lub miejsca splicingu RNA i zakłócają translację białek. Następnie pokazujemy, w jaki sposób elektroporacja w zapłodnionych komórkach jajowych Ciona pozwala na ilościową analizę dużej liczby zarodków, otwierając w ten sposób drogi do efektywnej analizy wzmacniaczy in vivo oraz specyficznych dla tkanek podejść do wzmocnienia lub utraty funkcji, z możliwością jednoczesnych manipulacji i analiz. Dalej pokazujemy, w jaki sposób narzędzia społecznościowe Ciona są wykorzystywane do przewidywania in silico regionów regulacyjnych i wydajnego klonowania w pełni otwartych ramek odczytu (ORF) w wektorach ekspresji. Na koniec wykazujemy zróżnicowane subkomórkowe lokalizacje fluorescencyjnie znakowanych lub znakowanych białek po nadekspresji przez elektroporację.

Protokół

1. Preparaty do mikroiniekcji i elektroporacji u jaj i zygot Ciona

1. Przygotować 10 l sztucznej wody morskiej z HEPES (ASWH) do hodowli zarodków. Rozpuścić 420 mM NaCl, 9 mM KCl, 10 mM CaCl₂·2H₂O, 24,5 mM MgCl₂·6H₂O, 25,5 mM MgSO₄·_7H2O i 2,15 mM_NaHCO3 w wodzie podwójnie destylowanej (ddH₂O) mieszając przez noc. Dodaj 5 mM HEPES pH 8,0 i sprawdź/dostosuj pH do 8,0. Przechowuj ASWH w temperaturze 4 °C. Podgrzej go do 18 °C i przefiltruj bibułą filtracyjną przed użyciem.
2. Przygotuj 20x inaktywowany roztwór dechorionacyjny: 20% tioglikolan sodu, 1% pronaza w ASWH. Przechowywać 500 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i przed użyciem rozcieńczyć do końcowej objętości 10 ml ASWH.
3. Przygotuj od 15 do 20 naczyń hodowlanych dla jaj/zarodków. Wlej rozpuszczoną 1% agarozę w ASWH do szalek Petriego o średnicy 3,5, 5, 9 lub 15 cm, pokrywając je cienką warstwą o grubości 1-2 mm. Pozwól agarozie zastygnąć i przykryj talerze ASWH. Przechowuj je w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 1-2 tygodnie. Wymień ASWH przed użyciem.
4. Przygotuj specjalne naczynia do iniekcji.
   1. Wlej warstwę stopionej 1% agarozy o grubości 5-7 mm na 5-centymetrową szalkę Petriego i umieść formę na agarozie (taką jak zamek błyskawiczny przyklejony do plastikowego szkiełka nakrywkowego), aby po zestaleniu agarozy powstało wgłębienie, które może pomieścić jaja. Przygotuj od 4 do 5 naczyń do wstrzykiwań i przykryj ASWH. Przechowywać w temperaturze 4 °C i przed użyciem zastąpić świeżym ASWH. Do wstrzykiwań należy używać wyłącznie świeżych płytek (maksymalnie jednodniowych).
5. Przygotować bufor do barwienia β-galaktozydazy (LacZ): 1 mM MgCl₂·6H₂O, 3 mM K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O, 3 mM K₃[Fe(CN)₆] w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 0,05% Tween). Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C. Przygotować substrat LacZ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-Galaktopiranozyd (X-gal, 10 U/ml) w porcjach 40 mg/ml w dimetyloformamidzie (DMF) i przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
6. Namocz pipety Pasteura w wodzie z kranu na noc, aby zapobiec przywieraniu zarodków.
7. Przygotować igły do wstrzykiwań.
   1. Ustaw ściągacz do mikropipet w warunkach takich jak ciepło 425, ciąg 75, prędkość 75 i czas 200 (na podstawie testu rampy filamentu 415).
   2. Pociągnij od 4 do 5 szklanych kapilar zawierających filament, aby uzyskać od 8 do 10 długich, cienkich igieł zwykle zamkniętych na końcówce. Przechowuj igły w bezpyłowym pudełku na igły, przymocowanym do podwójnej taśmy klejącej na podwyższonym wsporniku, aby uniknąć złamania końcówek i co jest wygodne do napełniania igłą.
      UWAGA: Przetestuj otrzymane igły, wstrzykując kilka jaj z zielonym barwnikiem witalnym (jak opisano w sekcji 6) i dostosuj warunki ciągnięcia igły, aby uzyskać kształt końcówki, który pozwala na precyzyjne i powtarzalne wstrzykiwanie, jak opisano w punkcie 6.6.
8. Przygotować roztwór do wstrzykiwań. Przygotować 4 μl roztworu do wstrzykiwań, np. składającego się z 1 μl 2 mM MO, 2 μl 10 μg/μl zielonego barwnika witalnego i 1 μl ddH₂O. Dodać końcowe stężenie 0,05-0,5 μg/μl zamkniętego mRNA lub 20 ng/μl plazmidowego DNA zgodnie z pytaniem eksperymentalnym. Dobrze wymieszaj. Przechowywać na lodzie, jeśli roztwór zawiera mRNA.

2. Zbiór gamet

1. Dorosłe osobniki Ciona należy przeprowadzić preparację w pomieszczeniu z embrionami chłodzonymi w temperaturze 18 °C. Użyj małych nożyczek i zacznij od końca, który jest przeciwległy syfonom po stronie wydechu (krótszego) syfonu, pod którym przebiega jajowód i przewód nasienny.
2. Odsłoń jajowód i delikatnie wykonaj nacięcie w jajowodzie za pomocą końcówki nożyczek. Wrzuć wypływające jaja bezpośrednio do 6-dołkowej płytki zawierającej ASWH, delikatnie naciskając jajowód zamkniętymi nożyczkami, usuwając jaja. Przenieść pozostałe jaja za pomocą pipety Pasteura wstępnie przepłukanej ASWH.
3. Złóż jaja od różnych zwierząt w różnych studniach. Obserwuj jakość jaj pod lunetą preparacyjną.
   UWAGA: Dobrze rozwinięte jaja są okrągłe i mają kolor różowy do lekko żółtego. Są otoczone niekomórkową powłoką witelinową, kosmówką, która tworzy dobrze zdefiniowaną przestrzeń periwitelinową wokół jaja. Kosmówka jest związana z komórkami testowymi w jej wnętrzu i komórkami pęcherzykowymi w kształcie gwiazdy na zewnątrz. Jaja niskiej jakości często nie mają przestrzeni okołojajowej lub komórek pęcherzykowych. Wydają się mniej okrągłe, bardziej ziarniste lub mają inny kolor. Niedojrzałe oocyty są mniejsze i mają srebrnobiały kolor.
4. Przeciąć nasienie nożyczkami i zebrać skoncentrowane plemniki do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą oddzielnej pipety Pasteura. Zbierz plemniki od różnych zwierząt (co najmniej dwóch) w tej samej probówce. Przechowywać plemniki w temperaturze 4 °C przez kilka dni.

3. Zapłodnienie

1. Pobrać plemniki i komórki jajowe w temperaturze 18 °C, jak opisano w kroku 2.
2. Aktywuj plemniki.
   1. Przygotować 1 ml ASWH w probówce o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 50 μl 1 M Tris pH 9,5. Następnie dodaj 20 μl zagęszczonej spermy i delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.
   2. Sprawdź aktywację plemników w kropli nasienia umieszczonej na pokrywie małej szalki Petriego lub szkiełku podstawowym i obserwuj pod lunetą sekcyjną. Plemniki powinny pływać gorączkowo.
3. Dodaj 100-200 μl aktywowanego roztworu nasienia do każdej studzienki jajowej (zawierającej od 100 do 1000 jaj), dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół, aby jaja unosiły się w pożywce. Odczekaj 10 minut bez przesuwania zarodków.

4. Dechorionacja jaj i zarodków

1. Rozcieńczyć 500 μl podwielokrotności 20-krotnego roztworu dechorionacyjnego do 10 ml w ASWH. Aktywować roztwór dechorionacyjny, dodając kroplami 200 μl 2,5 M NaOH do 10 ml 1x roztworu dechorionacyjnego. Utworzy się mleczny osad. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.
2. Zebrać jaja lub zygoty (po 10 minutach oczekiwania w kroku 3.3) do szklanych probówek za pomocą pipety Pasteura. Zbierz jaja od 2 do 3 zwierząt w jednej probówce (około 1,000-5,000 jaj / probówkę). Osad za pomocą wirówki ręcznej poprzez wirowanie z dużą prędkością (1 200 x g) przez około 20 sekund, aby utworzyć osad zarodka na dnie probówki. Powoli zatrzymaj wirówkę i wyjmij ASWH za pomocą pipety Pasteura.
3. Dodać 4 ml aktywowanego roztworu dechorionacyjnego do granulowanych jaj/zygot w każdej probówce. Zawieś jaja/zygoty, delikatnie pipetując je w górę iw dół za pomocą pipety Pasteura uzdatnionej wodą z kranu, zwieńczonej małą gumową gruszką. Roztwór powinien zmienić kolor na żółtawy po 1-3 minutach.
4. Postępuj zgodnie z dechorionacją, usuwając małą porcję dechorionującej zawiesiny jaja/zygoty za pomocą pipety Pasteura. Umieść kroplę na szkiełku i obserwuj pod lunetą sekcyjną. Pipetuj jaja/zygoty w górę i w dół i sprawdzaj co 20-30 sekund.
   UWAGA: Najpierw odrywają się komórki pęcherzykowe, następnie kosmówka zmienia kolor na żółty i nieprzezroczysty, a na końcu odłącza się od zygot. Różowe dechorionowane jaja/zygoty opadną na dno szklanej rurki. Dechorionacja nie powinna trwać dłużej niż maksymalnie 5 minut.
5. Napełnij probówkę ASWH, gdy 50% jaj/zygot zostanie zdechorionowanych.
   UWAGA: Bardzo delikatnie wirować (8 x g) przez około 10-15 sekund, co odpowiada bardzo niskiej prędkości, wystarczającej do osadzenia zdekorionowanych jaj/zarodków. Powoli zatrzymaj wirówkę, aby nie zaburzyć osadu jaj/zygot na dnie probówki.
6. Usuń prawie cały płyn ze szklanej rurki, w tym pływający materiał z niecałkowicie zdekorionowanymi jajami/zygotami i zastąp ASWH. Powoli pipetować w górę i w dół, aby umyć i delikatnie odwirować ponownie, jak w kroku 4.2. Alternatywnie poczekaj, aż zygoty uspokoją się grawitacyjnie. Umyj jeszcze raz, aż nie pozostaną żadne resztki kosmówki.
7. Przenieś jaja/zygoty do świeżo wypłukanych naczyń hodowlanych za pomocą pipety Pasteura. Trzymaj zygoty (nie jaja) w małej gęstości (około 200 zarodków na 10 cm naczynie), aby uniknąć ich sklejania. Hodować zarodki do pożądanego stadium w temperaturach od 13 do 20 °C. Alternatywnie, należy naelektryzować zygoty (etap 5) lub wstrzyknąć niezapłodnione komórki jajowe (etap 6).

5. Elektroporacja

1. Zapłodnić jaja i zdechorionować zygoty w temperaturze 18 °C, jak w sekcjach 3 i 4. Dostarczyć od 50 do 400 jaj na próbkę do elektroporacji.
2. Przygotować 50 μl plazmidowego DNA w probówce o pojemności 1,5 ml (maks. 100 μg plazmidowego DNA w 50 μl ddH₂O) i dodać 200 μl 0,95 M mannitolu. Dobrze wymieszaj, wirując.
3. Wysyłka i osad grawitacyjny zdechorionowanych zygot w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml. Usuń ASWH do oznaczenia 100 μl na probówce.
4. Postępuj kolejno dla każdej probówki zygoty w następujący sposób: dodaj roztwór DNA/mannitolu za pomocą pipety Pasteura. Delikatnie wymieszaj z zygotami i natychmiast pobierz zawiesinę DNA/mannitol/zygota i przenieś do 4-milimetrowej kuwety do elektroporacji.
5. Umieść kuwetę natychmiast w uchwycie do elektroporacji i daj pojedynczy impuls o długości 16 ms przy napięciu 50 V.
6. Wyjmij zygoty z kuwety za pomocą tej samej pipety Pasteura i rozłóż je na szalce hodowlanej zawierającej świeży i przefiltrowany ASWH. Odpipetować zygoty, zanim zaczną się rozszczepiać, około 1 godziny po zapłodnieniu (hpf) w temperaturze 18 °C.
7. Przepłukać pipetę między próbkami w zlewce z ASWH.
8. Hodować zygoty w temperaturze 15-20 °C, przy wystarczająco niskiej gęstości około 200 zarodków na 10 cm naczynie, aby uniknąć ich sklejania.

6. Mikroiniekcja

1. Przygotować pozbawione kosmówki jaja do wstrzyknięcia.
   1. Dechorionację jaj należy usunąć oddzielnie od 2 do 4 zwierząt, jak opisano w punkcie 4. Przechowuj niezapłodnione i zdechorionowane jaja w oddzielnych małych naczyniach hodowlanych pokrytych agarozą. Umyj jajka kilka razy w naczyniach, aby usunąć zanieczyszczenia.
   2. Test zapłodnić małymi partiami odkorionowanych jaj (około 50) od każdego osobnika. Do każdej porcji należy użyć osobnego naczynia o średnicy 5 cm i nanieść 2 μl aktywowanego nasienia (krok 3.2). Dobrze wymieszaj, obracając naczynia i rozłóż jajka w naczyniu, przesuwając naczynia na boki. Trzymaj plemniki i jajeczka razem przez około 10 minut bez ruchu.
   3. Wyeliminuj maksymalną ilość plemników w następujący sposób: przenieś zapłodnione jaja do świeżej naczynia hodowlanej lub spłucz dwukrotnie świeżym ASWH. Rozszczepione zarodki należy pozostawić w nienaruszonym stanie do stadium 32 komórek (w temperaturze 18 °C przez około 3 godziny po zapłodnieniu). Do mikroiniekcji należy wybrać jaja z najlepiej rozwijającej się partii (najlepszy procent zapłodnienia i najbardziej regularny wzór rozszczepienia).
2. Ustawić igły iniekcyjne.
   1. Wypełnij 4 igły iniekcyjne w pozycji pionowej, aby umożliwić przepływ grawitacyjny wzdłuż filamentu. Umieść 0,5 μl roztworu do wstrzykiwań (krok 1.8) zawierającego zielony barwnik witalny na tylnym końcu igieł, które są umieszczone czubkiem igły w dół. Poczekaj, aż płyn wypełni końcówkę igły na dole.
   2. Ustaw igły poziomo i napełnij je olejem mineralnym za pomocą cienkiej i długiej metalowej lub plastikowej końcówki do pipety. Powoli nałożyć roztwór do wstrzykiwań na olej mineralny, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza podczas napełniania igły.
3. Ustaw mikromanipulator w pomieszczeniu chłodzonym o temperaturze 18 °C.
   1. Podłączyć plastikową rurkę uchwytu igły do szklanej strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej olejem mineralnym. Napełnij rurkę i uchwyt igły olejem i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza.
   2. Włóż igłę do uchwytu igły i umieść uchwyt na mikromanipulatorze.
   3. Wyregulować ruch uchwytu igły wzdłuż linii prostej pod kątem 45° w stosunku do powierzchni.
4. Ustawić jaja pozbawione kosmówki wzdłuż wgłębienia agarozy w naczyniu do wstrzykiwań, tak aby jaja mogły być wstrzykiwane pojedynczo pod mikroskopem preparacyjnym.
5. W razie potrzeby złamać końcówkę igły, delikatnie dociskając igłę do agarozy lub do kawałka szklanego szkiełka nakrywkowego umieszczonego na agarozie. Lekko docisnąć pokrętło strzykawki, aby sprawdzić, czy końcówka igły jest otwarta (zielona zawartość igły zostanie usunięta).
6. Niezapłodnione jaja należy wstrzykiwać jeden po drugim, najpierw wprowadzając igłę do komórki jajowej i lekko zasysając, aby przerwać błonę jajową, a następnie wstrzykując. Wstrzyknąć zielony roztwór do wstrzykiwań w środek komórki jajowej maksymalnie do 1/3 średnicy komórki. (Odpowiada to około 30 pl dla średnicy jaja 140 μm).
7. Przenieść wstrzyknięte niezapłodnione jaja do świeżego naczynia hodowlanego i inkubować je w temperaturze 15-18 °C aż do zapłodnienia.
8. Zapłodnić wstrzyknięte komórki jajowe świeżo aktywowanymi plemnikami, tak jak w przypadku zapłodnień testowych (krok 6.1.2). Wyeliminuj maksymalną ilość plemników, przenosząc zygoty do świeżego naczynia hodowlanego. Rozłóż zarodki i nie zaburzaj ich w fazach rozszczepienia (do stadium 32 komórek).
9. Hodowla zarodków do pożądanego stadium w temperaturze między 13 a 20 °C.
10. Zbierz zarodki, obracając je na środku płytki i przenosząc do silikonowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Napraw i zamontuj lub zamontuj (kroki 7 i 8).
11. Porównaj uzyskane fenotypy z kontrolnymi zarodkami, którym wstrzyknięto.
    UWAGA: Wstrzyknij drugi, nienakładający się MO, który jest ukierunkowany na ten sam transkrypt, aby uzyskać identyczne fenotypy. Uratuj określony fenotyp (fenotypy) MO za pomocą zmodyfikowanego mRNA kodującego interesujące Cię białko, ale które nie jest rozpoznawane przez MO. Wstrzyknij kontrolny MO, który nie daje fenotypu.

7. Barwienie LacZ

1. Zbierz zarodki na pożądanym etapie w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml i utrwal je w 0,2% aldehydzie glutarowym w 1 ml ASWH przez maksymalnie 15 do 30 minut.
2. Myć 2x 10 min 1 ml 1x PBT.
3. Spłukać raz w 500 μl buforu barwiącego LacZ. Zastąp 1 ml buforu barwiącego uzupełnionym substratem X-Gal (użyj 10 μl/ml 40 mg/ml X-Gal Stock). Przenieś zarodki na 12-dołkową płytkę, aby lepiej obserwować barwienie.
4. Wysiaduj w ciemności. Inkubację zmieniać od 0,5 godziny do nocy w temperaturze 4 °C, w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37 °C, w zależności od siły czynnika wyrażającego LacZ.
5. Umyj zarodki do 4 razy w 1 ml 1X PBT, aby usunąć bufor barwiący.
6. Post-fix przez 10 minut w temperaturze pokojowej z 2% paraformaldehydem (PFA) w 1 ml 1x PBT lub 0,2% aldehydu glutarowego w 1 ml 1x PBT w celu interpretacji i wizualizacji barwionych zarodków.

8. Montaż fluorescencyjnie oznakowanych Wmbryos

1. Utrwal zarodki w pożądanym stadium rozwojowym przez 20 minut w 2% PFA w 1 ml ASWH.
2. Umyj zarodki 2x w 1 ml 1x PBT. Unikaj ekspozycji na światło, trzymając zarodki w ciemności.
3. Przenieś do 50 zarodków na jedno szkiełko. Najpierw usuń maksymalną ilość PBT za pomocą pipety i ostrożnie za pomocą ręcznika papierowego.
4. Dodać 20-25 μl podłoża montażowego.
5. Dodaj szkiełko nakrywkowe, ustawiając je pod kątem (najpierw z jednej strony) i powoli opuszczaj je spiczastym przedmiotem (igłą, kleszkami, końcówką pipety), unikając pęcherzyków, aż próbka zostanie przykryta. Przymocuj szkiełko nakrywkowe na jego krawędziach za pomocą kropek przezroczystego lakieru do paznokci.
6. Po wyschnięciu uszczelnij całe szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Mikroiniekcja do badań sieci regulacji genów

Zarodki jelita Ciona są dobrze przystosowane do badań funkcjonalnych genów lub regulacji genów na poziomie linii komórkowej i z rozdzielczością komórkową. mRNA, MO lub znaczniki mogą być mikrowstrzykiwane do niezapłodnionej komórki jajowej lub do pojedynczych blastomerów po zapłodnieniu. Knockdown genów za pośrednictwem MO przy użyciu techniki mikroiniekcji opisano w kroku 6. MO są specyficznie ukierunkowane na mRNA wybranych genów i zapobiegają ich translacji do białka. Utrata funkcji (LOF) genów rozwojowych za pośrednictwem MO zmienia ekspresję szerokiej gamy genów niższego szczebla, ogólnie odsłaniając wgląd w embrionalny GRN¹⁰. Tego rodzaju analizy przeprowadzone w Ciona dostarczyły pierwszego pełnego planu regulacyjnego zarodka w metazoan¹¹. Rycina 1 przedstawia przykład wykorzystania mikroiniekcji do badania wcześniejszej regulacji ekspresji konserwatywnego czynnika transkrypcyjnego Ci-mieliny (Ci-MYT) na etapie gastruli zarodków Ciona. Monitorowana przez hybrydyzację in situ (ISH), endogenna ekspresja (ryc. 1a, schematycznie przedstawiona na rycinie 1a') obserwuje się w 6-rzędowych prekursorach płytki nerwowej, w szczególności w mózgu (rzędy III/IV, na czerwono) i rdzeniu kręgowym (rząd I, na zielono). Ponadto regulację Ci-MYT przeanalizowano za pomocą wstrzyknięcia MO ukierunkowanego na kilka czynników, które ulegają ekspresji w prekursorach neuronalnych lub sąsiadują z nimi przed wystąpieniem ekspresji Ci-MYT (Figura 1b-g). Knockdown MO wczesnych czynników embrionalnych, takich jak czynnik transkrypcyjny A-a (FoxA-a) i czynnik wzrostu fibroblastów 9/16/20 (FGF9/16/20) (odpowiednio figura 1b lub 1c) eliminuje ogólną ekspresję Ci-MYT. Inne czynniki transkrypcyjne tylko częściowo wpływają na ekspresję Ci-MYT, powodując regulację w dół za pośrednictwem MO w podzbiorze prekursorów mózgu (niebieskie groty strzałek na rycinie 1d, f i g). I odwrotnie, ekspresja Ci-MYT jest ektopowo aktywowana po regulacji w dół węzła (ryc. 1e, czerwone groty strzałek), co sugeruje, że węzeł normalnie tłumi ekspresję Ci-MYT w tych bocznych prekursorach rdzenia nerwowego.

Elektroporacja dla efektywnych badań funkcjonalnych genów i wzmacniaczy

Elektroporacja plazmidowego DNA do zygot Ciona jest skuteczną metodą przejściowej transgenezy i późniejszej obserwacji zmian fenotypowych in vivo. W przeciwieństwie do mikroiniekcji mRNA, elektroporacja pozwala na nadekspresję specyficzną dla tkanki, w której regiony kodujące geny (ORF, otwarte ramki odczytu) ulegają ekspresji pod kontrolą czynników specyficznych dla tkanki. Zwykle stanowią one regiony cis-regulatorowe dobrze znanych genów (takich jak wzmacniacz brachyury do ekspresji w prekursorach struny grzbietowej⁸). Z drugiej strony, elektroporacja ma zasadnicze znaczenie dla efektywnej analizy nowych regionów regulatorowych, w których geny reporterowe (LacZ lub białko zielonej fluorescencji, GFP) ujawniają swoją aktywność in vivo. Przebieg procesu identyfikacji i późniejszej analizy za pośrednictwem elektroporacji takiego nowego regionu regulatorowego (dla Ci-MYT) przedstawiono na rysunku 2.

Szeroki repertuar danych społeczności Ciona, łatwo dostępnych w przeglądarkach genomu specyficznych dla ascidian^12,13, takich jak Ascidian Network for In situ Expression and Embryological Data (ANISEED)^23, jest sprawdzany pod kątem identyfikacji in silico regionów regulatorowych (Rysunek 2A). Późniejsze klonowanie tych regionów w wektory ekspresyjne oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwala na testowanie za pośrednictwem elektroporacji in vivo (Figura 2B). Zrzut ekranu przeglądarki genomu na rysunku 2A pokazuje region poprzedzający model transkryptu KH dla Ci-MYT (widoczne są pierwsze trzy eksony w kolorze pomarańczowym i dwa introny). Różne ścieżki przeglądarki genomu adnotują funkcjonalne dane genomu przewidywane dla tego regionu, takie jak dane immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)¹⁴ (tutaj pokazane dla ZicL, palca Ci-cynkowego móżdżku L), zachowanie sekwencji między dwoma spokrewnionymi gatunkami Ciona ^15,24 lub zajętość nukleosomów^16,17 (od góry do dołu na rysunku 2A). Ogólnie rzecz biorąc, egzoniczne regiony kodujące białka są wysoce konserwatywne (ścieżka wyrównania na rysunku 2A). Dodatkowe wysokie szczyty ochrony pojawiają się w regionach niekodujących w górę rzeki i w pierwszym intronie. Przewiduje się, że dwa z nich są wolne od nukleosomów zgodnie z algorytmem opartym na sekwencji^16,17 (czerwone ramki na rysunku 2A), co sugeruje dostępność do czynników transkrypcyjnych. Rzeczywiście, sygnały Chip-on-ChIP¹⁴ dotyczące wiązania czynnika transkrypcyjnego Ci-ZicL (zielone paski na rysunku 2A) są wzbogacone w tych dwóch konserwatywnych regionach. Ponadto, korzystając z interfejsu²⁵, który poszukuje potencjalnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego, zidentyfikowaliśmy miejsca ZIC zlokalizowane w sekwencjach genomu oznaczonych klastrami Ci-ZicL ChIP (pomarańczowe strzałki i sekwencje z podkreślonym rdzeniem ZIC, figura 2A). Wiązanie czynnika transkrypcyjnego Ci-ZicL w konserwatywnych i przewidywalnie wolnych od nukleosomów regionach regulatorowych Ci-MYT jest zgodne z regulacją w dół ekspresji Ci-MYT obserwowaną w eksperymentach knockdown za pośrednictwem MO ukierunkowanych na ZicL (Figura 1d).

Po określeniu potencjalnych regionów cis-regulatorowych in silico dla ekspresji Ci-MYT, są one amplifikowane metodą PCR z genomowego DNA Ciona i wstawiane przez klonowanie rekombinacyjne do plazmidów reporterowych LacZ¹⁹. Konstrukty są następnie elektroporowane do zapłodnionych jaj Ciona (ryc. 2B) i analizowane pod kątem ich aktywności przez barwienie LacZ (ryc. 3).

Rysunek 3 pokazuje, że dzięki takiemu podejściu in silico możliwe było zidentyfikowanie dwóch oddzielnych sekwencji cis-regulatorowych, które rekapitulują domeny ekspresji mRNA Ci-MYT (porównaj Rysunek 1a). Ogólnie rzecz biorąc, przejściowo transgeniczne zarodki elektroporowane plazmidowym DNA wykazują mozaikową ekspresję tylko w tych komórkach, które zawierają DNA. Ekspresja LacZ mozaiki jest zatem napędzana przez pmyt-R3 i można ją znaleźć we wszystkich prekursorach, które również wyrażają mRNA Ci-MYT, tj. Prekursory płytki nerwowej tylnego rzędu I i przednich rzędów III / IV w stadiach gastruli i wczesnych stadiów nerwowych (ryc. 3a, b, odpowiednio fioletowe i czerwone groty strzałek). W przeciwieństwie do tego, pmyt-R5 jest aktywny tylko w tylnych (rząd I) prekursorach płytki nerwowej i zaczyna się w późniejszym stadium neuruli (ryc. 3c, czerwone groty strzałek). Te dwa regiony kodują zatem dwa odrębne przestrzenne i czasowe aspekty regulacji genu Ci-myt. Co ciekawe, oba regiony regulatorowe barwią również dodatkowe prekursory, których nie zaobserwowano w ISH, zwłaszcza w przedniej i bocznej płytce nerwowej oraz w mięśniach (ryc. 3a, b, odpowiednio różowe, białe i żółte groty strzałek). Taka szersza ekspresja może wskazywać na elementy represyjne, które nie są zawarte w izolowanych fragmentach regulatorowych (takich jak w przypadku węzła, który hamuje boczny los neuronów, patrz rysunek 1e) lub na niskie poziomy ekspresji wykrywane przy akumulacji sygnału enzymatycznego LacZ.

Oprócz badań nad wzmacniaczami, elektroporacja w Ciona ułatwia również analizę funkcjonalną genów kodujących Ciona poprzez ich nadekspresję. Duża kolekcja pełnowymiarowych ORF-ów Ciona jest dostępna dla społeczności, a ponadto została opisana dla ludzkich ortologów, w tym geny związane z chorobą¹⁸. Pojedyncze geny lub grupy genów z tej pełnej biblioteki cDNA ORF zgodnej z rekombinacją i klonowaniem (Figura 2B) są łatwo przenoszone do wektorów docelowych zawierających odpowiednie sterowniki, które ulegają ekspresji w zarodkach. Uzyskane klony ekspresji mogą być ponadto elektroporowane z cis-regulatorowymi konstruktami reporterowymi w celu przetestowania ich przypuszczalnej roli w aktywacji wzmacniacza. Rysunek 2B ilustruje izolację pełnych klonów ORF dla czynników transkrypcyjnych Ci-ZicL i Ci-GATAa oraz ich rekombinację do dostosowanych wektorów docelowych, które mogą zawierać znaczniki translacyjne¹⁹ (np. zielony fluorescencyjny znacznik Wenus lub wirusowy znacznik hemaglutyniny (HA)) oraz specyficzny dla tkanki czynnik, taki jak region regulatorowy Friend Of Gata (sterownik pfog) dla wczesnej ekspresji pan-ektodermalnej¹⁵ wykorzystane w niniejszym badaniu. Wpływ nadekspresji Ci-ZicL w tkankach ektodermalnych i neuroektodermalnych analizowano przez koelektroporację reporterów pmyt-R3>LacZ i pmyt-R5>LacZ (Figura 3b', b '' i c', c'', odpowiednio). Nasze analizy elektroporacji sugerują, że Ci-ZicL może aktywować ekspresję Ci-MYT poprzez regiony wzmacniające pmyt-R3 i pmyt-R5, ponieważ oba konstrukty reporterowe wykazywały ektopową ekspresję LacZ w regionach ektodermalnych (zielone strzałki na rysunku 3b', b '' i c', c'',). Jak pokazano na rysunku 3d, elektroporacja plazmidowego DNA w setkach jaj Ciona pozwala na statystycznie istotną kwantyfikację zmian ekspresji, zilustrowaną dla ektopowej ekspresji pmyt-R3>LacZ przy zależnej od stężenia, panektodermalnej ekspresji Ci-ZicL.

Elektroporacja do lokalizacji subkomórkowej in vivo

Rysunek 4 przedstawia subkomórkową lokalizację oznaczonych czynników transkrypcyjnych, gdy są wyrażane podczas elektroporacji w blastomerach ektodermalnych przy użyciu dostosowanych konstrukcji ekspresji (schematyzowanych na rysunku 2B). Poprzez C-końcowe znakowanie czynników transkrypcyjnych (takich jak Ci-GATAa) znacznikiem Wenus (Figura 4b) lub znacznikiem HA (Figura 4c) i nadekspresją ich w tkankach ektodermalnych (pfog), możemy zaobserwować, że in vivo, 'Ci-GATAa jest głównie zlokalizowany w jądrach, zgodnie z oczekiwaniami dla czynnika transkrypcyjnego, podczas gdy ekspresja Venus jest wszechobecna, w tym cytoplazma. Podobne eksperymenty można przeprowadzić w celu zbadania dynamiki lokalizacji subkomórkowej w czasie, poszczególnych lub kombinacji czynników transkrypcyjnych, prawdopodobnie ujawniając ich kolokalizację z różnymi znacznikami.

Rycina 1: Ocena regulacji Ci-MYT za pomocą mikroiniekcji do jaj Ciona. Ekspresja mRNA Ci-MYT w zarodkach z wstrzykniętymi WT i Morpholino (MO). (a) Wzorzec ekspresji WT Ci-MYT w płytce nerwowej. a') Schematyczne przedstawienie barwionych prekursorów w płytce neuronowej (NP). Rząd I/II: tylny los nerwowy; rząd III/IV: los neuronów przednich; rząd V/VI: los palpowy. (b-g) Ekspresja Ci-MYT po mikrowstrzyknięciu różnych MO w celu powalenia wskazanych genów, które uczestniczą we wczesnym Ciona GRN (zdjęcia zaadaptowane z Imai i wsp., 2006)¹¹. Ci-MYT, czynnik transkrypcyjny Ci-mieliny; WT, typ dziki; niebieskie groty strzałek: utrata sygnału Ci-MYT; czerwone groty: ektopowy sygnał Ci-MYT. Podziałka liniowa = 100 μm odnosi się do wszystkich obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przebieg pracy w poszukiwaniu in silico regionów wzmacniających i klonowaniu rekombinacyjnym w celu transgenezy przejściowej przez elektroporację w zarodkach Ciona. (A) Migawka z przeglądarki genomu worka ANISEED²³ identyfikuje sekwencje regulatorowe Ci-myt. Czerwone ramki oznaczają dwa potencjalne obszary cis-regulatorowe, pmyt-R3 (scaffold_196:76883..77079) i pmyt-R5 (scaffold_196:75856..76041), które zostały wybrane do analizy za pomocą elektroporacji. Nazwy ścieżek: sondy ZicL: dane ChIP-on-Chip¹⁴; Transkrypty KH2012: Modele transkryptów Ciona intestinalis; Alignment Score Cs/Ci LastZ: zachowanie sekwencji między Ciona savignyi (Cs)/Ciona intestinalis (Ci)^15,24; Segal 2006 przewidywał zajętość nukleosomów wersja 1: algorytm obliczeniowy wyszkolony przez pisklę przez Segal i wsp., 2006¹⁶ zastosowany do Ci, jak w Khoueiry i wsp., 2010¹⁷. Zielone paski: Ci-ZicL ChIP piki¹⁴; pomarańczowe strzałki: przewidywane lokalizacje ZIC; GCTG: rdzenne miejsce wiązania ZIC. (B) Schemat generowania konstruktów nadekspresji z biblioteki cDNA ORF o pełnej długości, rekombinowanych w wektory docelowe zawierające sterowniki specyficzne dla tkanek (pfog) i znaczniki białkowe następnie elektroporowane z konstruktami reporterowymi (takimi jak pmyt-R3>LacZ lub pmyt-R5>LacZ) w celu odczytu in vivo. Ci-MYT, czynnik transkrypcyjny Ci-mieliny; Ci-ZicL, palec Ci-cynkowy czynnika transkrypcyjnego L móżdżku; pfog, region regulacyjny Ci-Friend of GATA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Elektroporowane zarodki Ciona wykazujące indukowaną przez Ci-ZicL czasoprzestrzenną regulację cis-CIT Ci-MYT. Pokazano zarodki barwione LacZ w środkowym stadium gastruli (mG)/późnej gastruli (lG) lub wczesnej neuruli (eN), które były koelektroporowane z pmyt-R3>LacZ lub pmyt-R5>LacZ i konstruktem kontrolnym (pfog>mCherry) lub pfog>ZicL. Sterownik pfog ¹⁹ pośredniczy w ektopowej (panzwierzęcej) ekspresji ZicL w ektodermie i neuroektodermie i powoduje ektopowe barwienie LacZ w tych komórkach. oraz pmyt-R3 powiedział: Aktywność LacZ w zarodkach w stadium mG/lG (małe groty strzałek, lewy panel) lub w odpowiednio kolorowych obszarach schematycznych (niebieskie kółka, prawy panel); Widok roślinny (VG). Rząd I/II: tylny los nerwowy; Rząd III/IV: los przednich neuronów; Rząd V/VI: los palpowy. (b) aktywność pmyt-R3 w stadiach eN w tkankach, jak w a. (b') Ektopowa aktywność pmyt-R3 podczas koelektroporacji Ci-ZicL jest oznaczona zielonymi grotami strzałek. (b'') Te same zarodki co w b', zorientowane zwierzęcie biegun do góry (an). oraz pmyt-R5 powiedział: Aktywność LacZ w stadiach eN (c') Ektopowa aktywność pmyt-R5 podczas koelektroporacji Ci-ZicL jest oznaczona zielonymi grotami strzałek. (c'') Te same zarodki co w c', ale zorientowane zwierzę biegun do góry (an). d) Kwantyfikacja reprezentatywnych doświadczeń dla nadmiernej aktywacji pmyt-R3 Ci-ZicL w niskich stężeniach. Reprezentowane jest jedno powtórzenie biologiczne. Ci-MYT, czynnik transkrypcyjny Ci-mieliny; Ci-ZicL, palec Ci-cynkowy czynnika transkrypcyjnego L móżdżku; Ci-FOG, Ci-Przyjaciel GATA; WT, typ dziki; mG, środkowa gastrula; lG, późna gastrula; eN, wczesna neuronula; an, widok na zwierzęta; VG, widok roślinny; nls LacZ, sygnał lokalizacji jądrowej dla LacZ. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Różnicowa lokalizacja subkomórkowa białek po elektroporacji. Lokalizacja białek znakowanych Wenus lub hemaglutyniny (HA) z nadekspresją w komórkach ektodermalnych przy użyciu sterownika pfog ¹⁹. lit. a-c) Obrazy DIC. a', b') Odpowiednie obrazy fluorescencyjne. c') Odpowiedni obraz fluorescencyjny po immunologicznym znakowaniu histologicznym za pomocą TRITC. Podziałka liniowa = 100 μm odnosi się do wszystkich obrazów. DIC, kontrast zakłóceń różnicowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Istnieją dwie główne techniki generowania transgenicznych zarodków Ciona : mikroiniekcja RNA lub DNA i elektroporacja DNA. Te techniki perturbacji genów w zarodkach Ciona zostały po raz pierwszy zastosowane w latach 90. XX wieku^7,8 i od tego czasu były sukcesywnie udoskonalane, a obecnie stosowane w Ciona (i innych rodzajach puchatych)²⁰ na całym świecie.

Krytyczne kroki w protokole

Udana transgeneza do gamet Ciona , które można łatwo pobrać od dorosłych zwierząt, zależy od wielu krytycznych czynników. Jakość gamet zależy od sezonu tarła (zazwyczaj od maja do grudnia na północnym Atlantyku, zmieniającego się wraz z temperaturą wody i natlenieniem), od jakości wody morskiej w akwariach (przy prawidłowym zasoleniu dorosłe osobniki pozostają zdrowe przez 2-4 tygodnie) i wreszcie od prawidłowego obchodzenia się z gametami po ekstrakcji od dorosłych, jak opisano poniżej dla różnych etapów protokołu.

Na etapach przygotowania, inkubacja pipet Pasteura z wodą z kranu zapobiegnie przywieraniu zarodków, a wstępna inkubacja w wodzie morskiej na szalkach Petriego pokrytych agarozą usunie toksyczne substancje uwalniane z agarozy. Ogólnie rzecz biorąc, potrawy można przygotować do 2 tygodni przed użyciem, przechowywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć rozwoju bakterii i spłukać na świeżo przed użyciem. Jednodniowe, małe naczynia wydają się najlepsze do wstrzykiwań.

Skuteczność i długość dechorionacji jest kluczowym krokiem w protokole, ponieważ długotrwałe leczenie komórek jajowych/zarodków zaszkodzi rozwojowi. Staranne przygotowanie (bez wstrząsania) i prawidłowe przechowywanie (w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia) pozwala zachować jakość roztworu dechorionacyjnego. Proteazy w roztworze tracą skuteczność, jeśli są zbyt gwałtownie mieszane podczas przygotowywania lub z czasem, zwłaszcza jeśli są przechowywane w temperaturze pokojowej przez dłuższe godziny/dni. Zoptymalizowaliśmy ten krytyczny krok, używając świeżego roztworu do dechorionacji, wygodnie przygotowanego z zamrożonych porcji 20-krotnego roztworu podstawowego.

Prawidłowe obchodzenie się z delikatnymi komórkami jajowymi/zarodkami z odwążówką jest niezbędne, a strzyżenie lub dźganie zarodków podczas pipetowania będzie szkodliwe. Podczas pipetowania zarodki są utrzymywane w jak największym stopniu w zawiesinie (poprzez delikatne "przedmuchiwanie" płynu w celu ich zawirowania, a następnie płynne, ale szybkie pipetowanie), trzymając szklaną pipetę w pozycji pionowej, a nie poziomej. Ostrożność ta ma zastosowanie do wszystkich etapów pipetowania w celu mycia, ponownego zawieszania i przenoszenia komórek jajowych/zarodków do i z probówek, kuwet lub płytek, przed i po utrwaleniu. Po utrwaleniu należy również zwrócić szczególną uwagę na oddzielenie urządzeń pipetujących dla żywych i utrwalonych zarodków, aby uniknąć toksyczności spowodowanej pozostałościami utrwalaczy.

Mikroiniekcja jest dość trudna w przypadku jaj/zarodków Ciona ze względu na ich mały rozmiar i sprężystość błony witelinowej i zależy w decydującym stopniu od zoptymalizowanego rozmiaru końcówki igły do wstrzykiwań, idealnego kąta iniekcji (ruch igły w jednej linii, wzdłuż promienia jaja) i precyzyjnie dostrojonego, ręcznego łamania błony witeliny (przez odsysanie przed aspiracją do wstrzyknięcia). To ostatnie jest możliwe tylko wtedy, gdy pęcherzyki powietrza zostaną całkowicie wyeliminowane z rurki iniekcyjnej, która zawiera olej mineralny w celu wygładzenia ciśnienia ssania/wtrysku. Ponadto najmniejsze kawałki kurzu lub resztek jaj zatykają igłę i można ich łatwo uniknąć dzięki czystym warunkom pracy i etapom płukania jaj przed przeniesieniem na naczynie iniekcyjne. Po wstrzyknięciu, przeniesienie jaj na świeże szalki pozwoli uniknąć toksycznych skutków spowodowanych martwymi zarodkami, które nie przeżyły procedury iniekcji.

Rozwiązywanie problemów

Potencjalne problemy w procedurze można rozwiązać, stosując następujące rozwiązania. Niskie wskaźniki zapłodnienia mogą wynikać z niewystarczającej aktywacji plemników, niskiej czystości komórek jajowych lub dużych objętości zapłodnienia. Używaj świeżo zebranych i mniej rozcieńczonych nasienia. Sprawdź ruch plemników po aktywacji. Przed zapłodnieniem umyć jaja ASWH, jak opisano w kroku 4.2. Zmniejsz objętość wody i zmniejsz ilość jaj w naczyniu/studzience do zapłodnienia. Utraty zarodków na etapach przygotowania można uniknąć, dodając kroplę roztworu dechorionacyjnego w celu skuteczniejszego odwirowania niezdekorionowanych komórek jajowych/zarodków. Czas dechorionacji powinien być zoptymalizowany, ponieważ częściowo zdekorionowane jaja nie osadzają się, a przedłużająca się dechorionacja jest toksyczna, powodując eksplozję zarodków.

Rozwój asynchroniczny może wynikać z resztek plemników uwolnionych podczas sekcji. Przechowuj partie jaj oddzielnie od różnych zwierząt, aby uniknąć niekontrolowanego zapłodnienia krzyżowego. Nieprawidłowy rozwój może mieć różne przyczyny. Na początku i na końcu sezonu, po rozdzieleniu zarodków pochodzących od różnych osobników, można wybrać najlepsze partie. Unikaj zakłócania zarodków przez 10 minut po zapłodnieniu, aby uniknąć zakłócania ich segregacji ooplazmatycznej. Upewnij się, że zarodki nie zaczęły się dzielić podczas przenoszenia, ponieważ pipetowanie oddziela siostrzane blastomery i powoduje częściowe zarodki. Użyj mniej plemników do zdekorionowanych komórek jajowych, aby uniknąć polispermii. Używaj świeżo przygotowanych, ale opłukanych potraw z agarozy. Upewnij się, że urządzenie do pipetowania nie zawiera utrwalaczy. Trzymaj zarodki kontrolne, które nie zostały zdekorionowane i nie zostały poddane elektroporacji, aby wykryć, na którym etapie rozwój został zakłócony. Uzupełnij zarodki antybiotykami, jeśli dojdzie do zanieczyszczenia i rozkładu.

Jeśli urządzenie do wstrzykiwań jest "zatkane", otwór igły do wstrzykiwań można zweryfikować poprzez usunięcie części jego poplamionej zawartości. Zatykający się materiał można zetrzeć, ostrożnie przeciągając końcówkę igły przez agarozę. Należy usunąć pęcherzyki powietrza z rurki iniekcyjnej i (lub) igły. Zmienić igłę, aby lepiej kontrolować objętość wstrzyknięcia, ponieważ końcówka igły może pęknąć lub zatkać się podczas wstrzyknięcia. Opłucz jajka i umieść je w czystym naczyniu do wstrzykiwań, jeśli w naczyniu nagromadziły się zanieczyszczenia. Odwirować roztwór do wstrzykiwań przed napełnieniem świeżych igieł w celu osadzenia wszelkich małych cząstek lub kryształów. Pomocne jest również ćwiczenie iniekcji tylko z niezbędnym barwnikiem. Sprawdź technikę wstrzykiwania, zapładniając jaja z wstrzyknięciami i bez iniekcji. Wreszcie, konsultacja z doświadczonym kolegą może być pomocna w poprawie techniki wstrzykiwania.

Aby kontrolować efekty niezamierzone, drugi nienakładający się MO i ratunek ze zmodyfikowanym mRNA, które nie jest rozpoznawane przez MO, może wiernie wykluczyć niespecyficzne efekty fenotypowe w Ciona.

Mikroiniekcja: znaczenie i ograniczenia

Mikroiniekcja w Ciona została wykorzystana do wygenerowania pierwszego planu dla całej sieci regulacji genów zarodka (GRN) w strunowcu¹¹. Jednak pomimo tak niezwykłego osiągnięcia, mikroiniekcja w zarodkach Ciona ma ograniczenia ze względu na stosunkowo mały rozmiar (0,14 mm średnicy) jaj Ciona . W porównaniu z innymi gatunkami strunowców, w których obce DNA/mRNA jest wprowadzane przez mikroiniekcje, jaja Ciona są stosunkowo trudne w obsłudze, a odsetek wstrzykiwanych zarodków Ciona na eksperyment pozostaje niski (średnio od 30 do 50 zarodków na eksperyment), co utrudnia analizy ilościowe. Niemniej jednak, w przypadku niepokojących czynników matczynych w Ciona, mikroiniekcja MO jest metodą z wyboru również do badania ich udziału w jarzmowym początku rozwoju od 16 do 32 stadiów komórkowych¹⁵. Ponadto możliwe jest, choć znacznie trudniejsze, mikroiniekcja pojedynczych blastomerów do stadium 16-32 komórek. Wreszcie, mikroiniekcja pozostaje najbardziej efektywną techniką generowania transgenicznych zarodków (poprzez wstrzyknięcie mRNA lub DNA) u gatunków puchatych innych niż Ciona, dla których nie istnieją w pełni zoptymalizowane protokoły elektroporacji.

Elektroporacja: znaczenie i ograniczenia

Aby przezwyciężyć niską liczbę i inne ograniczenia związane z mikroiniekcją, większość społeczności Ciona stosowała elektroporację plazmidowego DNA od czasu jej opracowania i opublikowania jako zoptymalizowany i znormalizowany protokół przez Zellera i in. w 2004^roku. Rzeczywiście, tysiące transgenicznych zarodków Ciona mogą zostać wygenerowane w ciągu jednej godziny, a nawet 500 zarodków jest jednocześnie elektropostowanych w jednej kuwecie za pomocą pojedynczego impulsu 50 V o długości 16 ms. Podejście polegające na generowaniu ogromnej liczby transgenicznych embrionów jest nadal unikalne wśród organizmów modelowych strunowców. Doprowadziło to do tego, że Ciona szybko została uznana za potężny system modelowy do przeprowadzania analiz in vivo potencjalnych regionów cis-regulatorowych i lokalizacji komórkowej/subkomórkowej, czego przykładem jest tutaj.

Chociaż elektroporacja w zygotach Ciona zasadniczo zrewolucjonizowała dziedzinę badań nad grn strunowy, technika ta napotyka jednak pewne ograniczenia. Po pierwsze, plazmidy są przejściowo wprowadzane do zarodków Ciona i najprawdopodobniej są dziedziczone jako układy pozachromosomalne, co sprawia, że stabilność elektroporowanego plazmidowego DNA jest spekulatywna. Co więcej, bardzo trudne, a być może nawet niemożliwe jest kontrolowanie kopii elektroporowanych plazmidów, które zostaną pobrane przez zygotę, co spowoduje fluktuacje fenotypowe. Kolejnym problemem, który utrudnia interpretację wyników elektroporacji, jest zjawisko, które nazywamy mozaicyzmem. Elektroporowane plazmidowe DNA może być pobierane w różnych pozycjach zarodka w stadium jednokomórkowym; który określa, które i ile ćwiartek zygoty otrzyma plazmid, który zostanie odziedziczony przez potomne blastomery. Takie różnice w oczywisty sposób utrudniają interpretację efektów ilościowych. Jednak większość problemów związanych ze zmiennością elektroporacji rozwiązuje odpowiednia ilość próbek biologicznych, z liczeniem i statystykami komórek LacZ (lub GFP), które są łatwo dostępne w jednej partii.

Wszechstronność i potencjał elektroporacji w inżynierii genetycznej

Elektroporacja ostatecznie pozwala na średnioprzepustowe badania przesiewowe potencjalnych regionów cis-regulatorowych i ilościowe analizy funkcji genów po sklonowaniu do plazmidów reporterowych lub ekspresyjnych. Ze względu na zwarty genom Ciona, identyfikacja i klonowanie potencjalnych regionów regulacyjnych jest dość proste³. Strategię wykorzystania bogactwa danych społecznościowych przedstawiono na rysunku 2A. Klonowanie plazmidów reporterowych i kodujących geny jest dodatkowo ułatwione dzięki generowaniu zestawów wektorów¹⁹ dostosowanych do metody Cina, kompatybilnych z GATEWAY oraz kompatybilnej biblioteki ORF o pełnej długości¹⁸. Oba narzędzia są dostępne dla społeczności i pozwalają na wydajną, wolną od restrykcji rekombinację czynników regulacyjnych i regionów kodujących, jak pokazano na rysunku 2B.

W ostatnich latach elektroporacja została z powodzeniem zaadaptowana do uzyskania ukierunkowanej na tkankę manipulacji genami za pomocą plazmidów, które wyrażają narzędzia do edycji genów, takie jak komponenty CRISPR/Cas9, pod kontrolą specyficznych dla tkanek czynników^21,22. Takie podejścia szybko poszerzą naszą wiedzę na temat dynamiki GRN i potencjalnie konserwatywnych mechanizmów sygnałowych, w tym kodów czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w tworzenie tkanek i stopniowe wychodzenie z pluripotencji. Co więcej, specyficzne tkankowo podejścia do utraty lub wzmocnienia funkcji (za pomocą CRISPR/Cas9 lub nadekspresji) za pomocą elektroporacji będą miały zasadnicze znaczenie dla badania ortologów Ciona genów związanych z chorobami ludzkimi. Rzeczywiście, katalogi ortologów Ciona genów chorób ludzkich i ich pełnowymiarowych klonów kodujących ORF są łatwo dostępne do analizy w Ciona¹⁸. Ze względu na duplikacje całego genomu u kręgowców, większość ludzkich genów posiada funkcjonalnie nadmiarowe paralogi, które komplikują analizy funkcji genów¹. Ciona , jako prostszy system z typowym układem tkanek strunowców u larw, powinna odkryć fundamentalne role tak ważnych, często funkcjonalnie zachowanych genów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lab ze stałą temp. (~18 ° C)			Do pracy z zarodkami
Ciona intestinalis dorosłych	UPMC - Station Biologique, Roscoff, Francja		Do zbierania gamet
NaCl	Roth	3957.1	Dla ASWH
KCl	Roth	6781.1	Dla ASWH
CaCl2x2H2O	Roth	A119.1	Dla ASWH
MgCl2x6H2O	Roth	2189.1	Dla ASWH
MgS04x7H2O	Roth	P027.2	Dla ASWH
NaHCO3	Roth	6885.1	Dla ASWH
Hepes	Roth	HN78.3	Do
tioglikolanu sodu ASWH	Sigma	MZ-6	do dechorionacji
pronazy	Sigma	T0632-100G	do dechorionacji
D-Mannitol	Sigma Aldrich	M9546-250G	Do elektroporacji
plazmidowego DNA (przygotowanie >1&mikro; g/&mikro; l)	Macherey-Nagel	740410.100	Do elektroporacji lub mikroiniekcji
Agaroza	dowolny dostawca		Do powlekania naczyń do hodowli zarodków
Plastikowe szalki Petriego	VWR	612-2079	Pokryte 1% agarozą w ASWH, pokryte ASWH
Małe nożyczki	dowolny dostawca		Do wycinania gamet
NaOH	Roth	6771.1	Do aktywacji roztworu dechorionacyjnego
Tris	Roth	5429.3	1 M pH 9,5, do aktywacji plemników
Pipety Pasteura	VWR	612-1701	Uzdatniony przez zanurzenie w wodzie z kranu na co najmniej 12 godzin
Wirówka ręczna	Hettich Zentrifugen	1011	Użyj szklanych probówek wirówkowych
1,5 ml Probówki Eppendorf	Sigma	T3406-250EA
2 ml Probówki Eppendorf	Sigma	T3531-200EA
Elektroporator kwadratowy	Bio Rad Gene Pulser Xcell
Kuwety do elektroporacji 4 mm	Eurogentec	CE-0004-50
Szkiełka nakrywkowe	Sto Premium	PR248212600
Szkiełka podstawowe	VWR	ECN 613-1551
Aldehyd glutarowy	Sigma	G6257-10ML	Do utrwalania w barwieniu LacZ
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-500G	Do utrwalania próbek fluorescencyjnych
Vectashield	Vector	H-1000	Do mocowania próbek fluorescencyjnych
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside)	Roth	2315.2	LacZ; zapas w 40 mg/ml DMF (dimetyloformamid)
K4Fe(CN)6• 3H2O	Merck	4984	Do buforu barwiącego LacZ
K3Fe(CN)6	Merck	4973	Do bufora barwiącego
LacZ Na22HPO4	Roth	4984.2	Dla PBT
KH2PO4	Roth	3904.2	Dla PBT
Animacja	Sigma	SLBJ5103V	Do
oleju mineralnego	Sigma	M8410	Testowana hodowla zarodków
Green Vital Dye	Fast Green Sigma	F7251	do mikroiniekcji; 10&mikro; g/&mikro; l
Ściągacz do mikropipet (płonący/brązowy)	Sutter Instruments	Model P-97	Do ciągnięcia igieł iniekcyjnych
Kapilary ze szkła borokrzemianowego GC100TF-10	Harvard Apparatus Ltd. UK	30-0038	1,0 mm OD x 0,78 mm ID, zawierające filament, do mikroiniekcji
Mikromanipulator	Narishige	MWS-2	Trzyosiowy olejowy układ hydrauliczny; do precyzyjnego ruchu 3D podczas wtrysku
Uchwyt do wstrzykiwań	Narishige	1M-H1	Do trzymania igieł iniekcyjnych, cały system wypełniony olejem mineralnym
Strzykawka All Glass Walter	Graf & Co GmbH & Co. KG	Nr 95199.10427A4	10 ml FortunaOptima; wypełniony olejem mineralnym, do precyzyjnego dostrojenia ciśnienia mikroiniekcji
Morfolinos	GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA		Wstrzyknięcie w 0,25-0,5 mM
z czapeczką	mRNA Ambion mMessage zestaw		Wstrzyknięcie w 0,05-0,5 i mikro; g/&mikro; l
Wstrzyknięcie plazmidowego DNA			przy 20 ng / & mikro; l
Zestaw do klonowania rekombinacyjnego	Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen	11789-013
Zestaw do klonowania rekombinacyjnego	Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen	11791-019
anty-HA tag	abcam	ab9110	do immunofluorescencji, użyj 1:400 w 3% BSA / PBT
TRITC kozie przeciwciało anty-królicze	Jackson	111-025-144	do immunofluorescencji użyj 1:300 w 3% BSA/PBT