Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Podsumowanie

Prezentujemy przejściową transgenezę i knockdown genu u Ciona intestinalis, siostrzanej grupie strunowców kręgowców, przy użyciu technik mikroiniekcji i elektroporacji. Takie metody ułatwiają genomikę funkcjonalną u tego prostego bezkręgowca, który charakteryzuje się podstawowymi cechami kręgowców, w tym struną grzbietową i nabłonkiem czuciowym głowy, a także wieloma ortologiami genów związanych z chorobami ludzkimi.

Streszczenie

Proste organizmy modelowe są instrumentalne dla badań in vivo procesów różnicowania rozwojowego i komórkowego. Obecnie ewolucyjny dystans do człowieka wynikający z konwencjonalnych systemów modelowania bezkręgowców oraz złożoność genomów kręgowców stanowią kluczowe wyzwania dla modelowania normalnych i patologicznych warunków człowieka. Strunowca Ciona intestinalis to strunowca bezkręgowców, który wyłonił się ze wspólnego przodka z kręgowcami i może reprezentować cechy na styku bezkręgowców i kręgowców. Wspólny plan budowy ciała ze znacznie prostszym składem komórkowym i genomowym powinien ujawnić powiązania sieci regulacji genów (GRN) i funkcjonalne odczyty genomiczne wyjaśniające zjawiska w stanie kręgowców. Zwarty genom Ciona, ustalonej linii embrionalnej z kilkoma podziałami i dużymi komórkami, w połączeniu z wszechstronnymi narzędziami społecznościowymi sprzyja efektywnym analizom funkcjonalnym genów w tym organizmie. W tym miejscu przedstawiamy kilka kluczowych metod dla tego obiecującego organizmu modelowego, który należy do najbliższej grupy siostrzanej kręgowców. Przedstawiamy protokoły przejściowej transgenezy przez elektroporację, wraz z knockdownem genów za pośrednictwem mikroiniekcji, które razem zapewniają środki do badania funkcji genów i genomowych elementów regulatorowych. Rozszerzamy nasze protokoły, aby dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób bazy danych społeczności są wykorzystywane do projektowania in silico eksperymentów regulacyjnych lub funkcjonalnych genów. Przykładowe badanie pokazuje, w jaki sposób można uzyskać nowe informacje na temat wzajemnych oddziaływań i ich kwantyfikacji wybranych czynników neuronalnych zachowanych między Cioną a człowiekiem. Ponadto pokazujemy przykłady zróżnicowanej lokalizacji subkomórkowej w komórkach embrionalnych, po elektroporacji DNA u zygot Ciona. Na koniec omawiamy potencjał tych protokołów do adaptacji do interferencji genów specyficznych dla tkanek za pomocą pojawiających się metod edycji genów. Metody in vivo zastosowane w projekcie Ciona pozwalają przezwyciężyć główne niedociągnięcia klasycznych organizmów modelowych w dążeniu do rozwikłania konserwatywnych mechanizmów w programie rozwoju struny, istotnych dla badań nad komórkami macierzystymi, odkrywania leków i późniejszego zastosowania klinicznego.

Wprowadzenie

Ostatnio, sekwencja genomu i transkrybowane repertuary genów stały się dostępne w wielu organizmach modelowych. Jednak określenie funkcjonalnych powiązań genów i tego, w jaki sposób te połączenia są wbudowane w DNA w celu wykonywania aktywności transkrypcyjnej w embrionalnym czasie i przestrzeni, pozostaje głównym wyzwaniem, zwłaszcza u kręgowców. Złożoność interakcji regulacyjnych i złożoność genomów^1,2, zwłaszcza u kręgowców, spowalniają skuteczne analizy funkcjonalne, w szczególności na poziomie DNA in vivo. Rzeczywiście, obecnie nie analizuje się GRN od zapłodnienia do końcowego, terminalnie zróżnicowanego stanu rozwijającego się organizmu.

Puchaci C. intestinalis reprezentują organizm modelowy, w którym możliwe mogą być takie pełne analizy GRN. Ma niezduplikowany genom typowy dla bezkręgowców z niewielką redundancją. Kręgowce, w przeciwieństwie do nich, przeszły dwie rundy duplikacji genomu, które wygenerowały większe rodziny genów i funkcjonalne zróżnicowanie, ale także redundancję między paralogami. Zwarte sekwencje cis-regulatorowe (jednostki kontrolne GRN) C. intestinalis i niezmienna linia embrionalna z niewielką liczbą komórek przypominają C. elegans. Co więcej, jego unikalna pozycja filogenetyczna jako bezkręgowej grupy siostrzanej kręgowców w obrębie strunowców pozwala na obserwację rozwojową, w rozdzielczości komórkowej, tworzącego się planu ciała strunowca^3-6.

Kluczową kwestią, która zapewnia przyszły sukces genomiki funkcjonalnej w organizmach modelowych, jest generowanie dużej liczby embrionów do ilościowych zaburzeń in vivo. Przełomem w genomice funkcjonalnej Ciona był rozwój techniki mikroiniekcji w jajach Ciona ⁷ oraz możliwość szybkiego uzyskania wielu przejściowo transgenicznych zwierząt za pomocą elektroporacji in vivo w setkach zygot Ciona ^8,9. W tym miejscu po raz pierwszy przedstawiamy bardziej pracochłonną technikę mikroiniekcji do celowania w pojedyncze geny, która pozostaje metodą z wyboru w przypadku knockdownu genów za pośrednictwem morfoliny (MO), w szczególności transkryptów matczynych. Oligonukleotydy MO zazwyczaj celują w inicjator ATG lub miejsca splicingu RNA i zakłócają translację białek. Następnie pokazujemy, w jaki sposób elektroporacja w zapłodnionych komórkach jajowych Ciona pozwala na ilościową analizę dużej liczby zarodków, otwierając w ten sposób drogi do efektywnej analizy wzmacniaczy in vivo oraz specyficznych dla tkanek podejść do wzmocnienia lub utraty funkcji, z możliwością jednoczesnych manipulacji i analiz. Dalej pokazujemy, w jaki sposób narzędzia społecznościowe Ciona są wykorzystywane do przewidywania in silico regionów regulacyjnych i wydajnego klonowania w pełni otwartych ramek odczytu (ORF) w wektorach ekspresji. Na koniec wykazujemy zróżnicowane subkomórkowe lokalizacje fluorescencyjnie znakowanych lub znakowanych białek po nadekspresji przez elektroporację.

Protokół

1. Preparaty do mikroiniekcji i elektroporacji u jaj i zygot Ciona

1. Przygotować 10 l sztucznej wody morskiej z HEPES (ASWH) do hodowli zarodków. Rozpuścić 420 mM NaCl, 9 mM KCl, 10 mM CaCl₂·2H₂O, 24,5 mM MgCl₂·6H₂O, 25,5 mM MgSO₄·_7H2O i 2,15 mM_NaHCO3 w wodzie podwójnie destylowanej (ddH₂O) mieszając przez noc. Dodaj 5 mM HEPES pH 8,0 i sprawdź/dostosuj pH do 8,0. Przechowuj ASWH w temperaturze 4 °C. Podgrzej go do 18 °C i przefiltruj bibułą filtracyjną przed użyciem.
2. Przygotuj 20x inaktywowany roztwór dechorionacyjny: 20% tioglikolan sodu, 1% pronaza w ASWH. Przechowywać 500 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i przed użyciem rozcieńczyć do końcowej objętości 10 ml ASWH.
3. Przygotuj od 15 do 20 naczyń hodowlanych dla jaj/zarodków. Wlej rozpuszczoną 1% agarozę w ASWH do szalek Petriego o średnicy 3,5, 5, 9 lub 15 cm, pokrywając je cienką warstwą o grubości 1-2 mm. Pozwól agarozie zastygnąć i przykryj talerze ASWH. Przechowuj je w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 1-2 tygodnie. Wymień ASWH przed użyciem.
4. Przygotuj specjalne naczynia do iniekcji.
   1. Wlej warstwę stopionej 1% agarozy o grubości 5-7 mm na 5-centymetrową szalkę Petriego i umieść formę na agarozie (taką jak zamek błyskawiczny przyklejony do plastikowego szkiełka nakrywkowego), aby po zestaleniu agarozy powstało wgłębienie, które może pomieścić jaja. Przygotuj od 4 do 5 naczyń do wstrzykiwań i przykryj ASWH. Przechowywać w temperaturze 4 °C i przed użyciem zastąpić świeżym ASWH. Do wstrzykiwań należy używać wyłącznie świeżych płytek (maksymalnie jednodniowych).
5. Przygotować bufor do barwienia β-galaktozydazy (LacZ): 1 mM MgCl₂·6H₂O, 3 mM K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O, 3 mM K₃[Fe(CN)₆] w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 0,05% Tween). Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C. Przygotować substrat LacZ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-Galaktopiranozyd (X-gal, 10 U/ml) w porcjach 40 mg/ml w dimetyloformamidzie (DMF) i przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
6. Namocz pipety Pasteura w wodzie z kranu na noc, aby zapobiec przywieraniu zarodków.
7. Przygotować igły do wstrzykiwań.
   1. Ustaw ściągacz do mikropipet w warunkach takich jak ciepło 425, ciąg 75, prędkość 75 i czas 200 (na podstawie testu rampy filamentu 415).
   2. Pociągnij od 4 do 5 szklanych kapilar zawierających filament, aby uzyskać od 8 do 10 długich, cienkich igieł zwykle zamkniętych na końcówce. Przechowuj igły w bezpyłowym pudełku na igły, przymocowanym do podwójnej taśmy klejącej na podwyższonym wsporniku, aby uniknąć złamania końcówek i co jest wygodne do napełniania igłą.
      UWAGA: Przetestuj otrzymane igły, wstrzykując kilka jaj z zielonym barwnikiem witalnym (jak opisano w sekcji 6) i dostosuj warunki ciągnięcia igły, aby uzyskać kształt końcówki, który pozwala na precyzyjne i powtarzalne wstrzykiwanie, jak opisano w punkcie 6.6.
8. Przygotować roztwór do wstrzykiwań. Przygotować 4 μl roztworu do wstrzykiwań, np. składającego się z 1 μl 2 mM MO, 2 μl 10 μg/μl zielonego barwnika witalnego i 1 μl ddH₂O. Dodać końcowe stężenie 0,05-0,5 μg/μl zamkniętego mRNA lub 20 ng/μl plazmidowego DNA zgodnie z pytaniem eksperymentalnym. Dobrze wymieszaj. Przechowywać na lodzie, jeśli roztwór zawiera mRNA.

2. Zbiór gamet

1. Dorosłe osobniki Ciona należy przeprowadzić preparację w pomieszczeniu z embrionami chłodzonymi w temperaturze 18 °C. Użyj małych nożyczek i zacznij od końca, który jest przeciwległy syfonom po stronie wydechu (krótszego) syfonu, pod którym przebiega jajowód i przewód nasienny.
2. Odsłoń jajowód i delikatnie wykonaj nacięcie w jajowodzie za pomocą końcówki nożyczek. Wrzuć wypływające jaja bezpośrednio do 6-dołkowej płytki zawierającej ASWH, delikatnie naciskając jajowód zamkniętymi nożyczkami, usuwając jaja. Przenieść pozostałe jaja za pomocą pipety Pasteura wstępnie przepłukanej ASWH.
3. Złóż jaja od różnych zwierząt w różnych studniach. Obserwuj jakość jaj pod lunetą preparacyjną.
   UWAGA: Dobrze rozwinięte jaja są okrągłe i mają kolor różowy do lekko żółtego. Są otoczone niekomórkową powłoką witelinową, kosmówką, która tworzy dobrze zdefiniowaną przestrzeń periwitelinową wokół jaja. Kosmówka jest związana z komórkami testowymi w jej wnętrzu i komórkami pęcherzykowymi w kształcie gwiazdy na zewnątrz. Jaja niskiej jakości często nie mają przestrzeni okołojajowej lub komórek pęcherzykowych. Wydają się mniej okrągłe, bardziej ziarniste lub mają inny kolor. Niedojrzałe oocyty są mniejsze i mają srebrnobiały kolor.
4. Przeciąć nasienie nożyczkami i zebrać skoncentrowane plemniki do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą oddzielnej pipety Pasteura. Zbierz plemniki od różnych zwierząt (co najmniej dwóch) w tej samej probówce. Przechowywać plemniki w temperaturze 4 °C przez kilka dni.

3. Zapłodnienie

1. Pobrać plemniki i komórki jajowe w temperaturze 18 °C, jak opisano w kroku 2.
2. Aktywuj plemniki.
   1. Przygotować 1 ml ASWH w probówce o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 50 μl 1 M Tris pH 9,5. Następnie dodaj 20 μl zagęszczonej spermy i delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.
   2. Sprawdź aktywację plemników w kropli nasienia umieszczonej na pokrywie małej szalki Petriego lub szkiełku podstawowym i obserwuj pod lunetą sekcyjną. Plemniki powinny pływać gorączkowo.
3. Dodaj 100-200 μl aktywowanego roztworu nasienia do każdej studzienki jajowej (zawierającej od 100 do 1000 jaj), dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół, aby jaja unosiły się w pożywce. Odczekaj 10 minut bez przesuwania zarodków.

4. Dechorionacja jaj i zarodków

1. Rozcieńczyć 500 μl podwielokrotności 20-krotnego roztworu dechorionacyjnego do 10 ml w ASWH. Aktywować roztwór dechorionacyjny, dodając kroplami 200 μl 2,5 M NaOH do 10 ml 1x roztworu dechorionacyjnego. Utworzy się mleczny osad. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.
2. Zebrać jaja lub zygoty (po 10 minutach oczekiwania w kroku 3.3) do szklanych probówek za pomocą pipety Pasteura. Zbierz jaja od 2 do 3 zwierząt w jednej probówce (około 1,000-5,000 jaj / probówkę). Osad za pomocą wirówki ręcznej poprzez wirowanie z dużą prędkością (1 200 x g) przez około 20 sekund, aby utworzyć osad zarodka na dnie probówki. Powoli zatrzymaj wirówkę i wyjmij ASWH za pomocą pipety Pasteura.
3. Dodać 4 ml aktywowanego roztworu dechorionacyjnego do granulowanych jaj/zygot w każdej probówce. Zawieś jaja/zygoty, delikatnie pipetując je w górę iw dół za pomocą pipety Pasteura uzdatnionej wodą z kranu, zwieńczonej małą gumową gruszką. Roztwór powinien zmienić kolor na żółtawy po 1-3 minutach.
4. Postępuj zgodnie z dechorionacją, usuwając małą porcję dechorionującej zawiesiny jaja/zygoty za pomocą pipety Pasteura. Umieść kroplę na szkiełku i obserwuj pod lunetą sekcyjną. Pipetuj jaja/zygoty w górę i w dół i sprawdzaj co 20-30 sekund.
   UWAGA: Najpierw odrywają się komórki pęcherzykowe, następnie kosmówka zmienia kolor na żółty i nieprzezroczysty, a na końcu odłącza się od zygot. Różowe dechorionowane jaja/zygoty opadną na dno szklanej rurki. Dechorionacja nie powinna trwać dłużej niż maksymalnie 5 minut.
5. Napełnij probówkę ASWH, gdy 50% jaj/zygot zostanie zdechorionowanych.
   UWAGA: Bardzo delikatnie wirować (8 x g) przez około 10-15 sekund, co odpowiada bardzo niskiej prędkości, wystarczającej do osadzenia zdekorionowanych jaj/zarodków. Powoli zatrzymaj wirówkę, aby nie zaburzyć osadu jaj/zygot na dnie probówki.
6. Usuń prawie cały płyn ze szklanej rurki, w tym pływający materiał z niecałkowicie zdekorionowanymi jajami/zygotami i zastąp ASWH. Powoli pipetować w górę i w dół, aby umyć i delikatnie odwirować ponownie, jak w kroku 4.2. Alternatywnie poczekaj, aż zygoty uspokoją się grawitacyjnie. Umyj jeszcze raz, aż nie pozostaną żadne resztki kosmówki.
7. Przenieś jaja/zygoty do świeżo wypłukanych naczyń hodowlanych za pomocą pipety Pasteura. Trzymaj zygoty (nie jaja) w małej gęstości (około 200 zarodków na 10 cm naczynie), aby uniknąć ich sklejania. Hodować zarodki do pożądanego stadium w temperaturach od 13 do 20 °C. Alternatywnie, należy naelektryzować zygoty (etap 5) lub wstrzyknąć niezapłodnione komórki jajowe (etap 6).

5. Elektroporacja

1. Zapłodnić jaja i zdechorionować zygoty w temperaturze 18 °C, jak w sekcjach 3 i 4. Dostarczyć od 50 do 400 jaj na próbkę do elektroporacji.
2. Przygotować 50 μl plazmidowego DNA w probówce o pojemności 1,5 ml (maks. 100 μg plazmidowego DNA w 50 μl ddH₂O) i dodać 200 μl 0,95 M mannitolu. Dobrze wymieszaj, wirując.
3. Wysyłka i osad grawitacyjny zdechorionowanych zygot w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml. Usuń ASWH do oznaczenia 100 μl na probówce.
4. Postępuj kolejno dla każdej probówki zygoty w następujący sposób: dodaj roztwór DNA/mannitolu za pomocą pipety Pasteura. Delikatnie wymieszaj z zygotami i natychmiast pobierz zawiesinę DNA/mannitol/zygota i przenieś do 4-milimetrowej kuwety do elektroporacji.
5. Umieść kuwetę natychmiast w uchwycie do elektroporacji i daj pojedynczy impuls o długości 16 ms przy napięciu 50 V.
6. Wyjmij zygoty z kuwety za pomocą tej samej pipety Pasteura i rozłóż je na szalce hodowlanej zawierającej świeży i przefiltrowany ASWH. Odpipetować zygoty, zanim zaczną się rozszczepiać, około 1 godziny po zapłodnieniu (hpf) w temperaturze 18 °C.
7. Przepłukać pipetę między próbkami w zlewce z ASWH.
8. Hodować zygoty w temperaturze 15-20 °C, przy wystarczająco niskiej gęstości około 200 zarodków na 10 cm naczynie, aby uniknąć ich sklejania.

6. Mikroiniekcja

1. Przygotować pozbawione kosmówki jaja do wstrzyknięcia.
   1. Dechorionację jaj należy usunąć oddzielnie od 2 do 4 zwierząt, jak opisano w punkcie 4. Przechowuj niezapłodnione i zdechorionowane jaja w oddzielnych małych naczyniach hodowlanych pokrytych agarozą. Umyj jajka kilka razy w naczyniach, aby usunąć zanieczyszczenia.
   2. Test zapłodnić małymi partiami odkorionowanych jaj (około 50) od każdego osobnika. Do każdej porcji należy użyć osobnego naczynia o średnicy 5 cm i nanieść 2 μl aktywowanego nasienia (krok 3.2). Dobrze wymieszaj, obracając naczynia i rozłóż jajka w naczyniu, przesuwając naczynia na boki. Trzymaj plemniki i jajeczka razem przez około 10 minut bez ruchu.
   3. Wyeliminuj maksymalną ilość plemników w następujący sposób: przenieś zapłodnione jaja do świeżej naczynia hodowlanej lub spłucz dwukrotnie świeżym ASWH. Rozszczepione zarodki należy pozostawić w nienaruszonym stanie do stadium 32 komórek (w temperaturze 18 °C przez około 3 godziny po zapłodnieniu). Do mikroiniekcji należy wybrać jaja z najlepiej rozwijającej się partii (najlepszy procent zapłodnienia i najbardziej regularny wzór rozszczepienia).
2. Ustawić igły iniekcyjne.
   1. Wypełnij 4 igły iniekcyjne w pozycji pionowej, aby umożliwić przepływ grawitacyjny wzdłuż filamentu. Umieść 0,5 μl roztworu do wstrzykiwań (krok 1.8) zawierającego zielony barwnik witalny na tylnym końcu igieł, które są umieszczone czubkiem igły w dół. Poczekaj, aż płyn wypełni końcówkę igły na dole.
   2. Ustaw igły poziomo i napełnij je olejem mineralnym za pomocą cienkiej i długiej metalowej lub plastikowej końcówki do pipety. Powoli nałożyć roztwór do wstrzykiwań na olej mineralny, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza podczas napełniania igły.
3. Ustaw mikromanipulator w pomieszczeniu chłodzonym o temperaturze 18 °C.
   1. Podłączyć plastikową rurkę uchwytu igły do szklanej strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej olejem mineralnym. Napełnij rurkę i uchwyt igły olejem i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza.
   2. Włóż igłę do uchwytu igły i umieść uchwyt na mikromanipulatorze.
   3. Wyregulować ruch uchwytu igły wzdłuż linii prostej pod kątem 45° w stosunku do powierzchni.
4. Ustawić jaja pozbawione kosmówki wzdłuż wgłębienia agarozy w naczyniu do wstrzykiwań, tak aby jaja mogły być wstrzykiwane pojedynczo pod mikroskopem preparacyjnym.
5. W razie potrzeby złamać końcówkę igły, delikatnie dociskając igłę do agarozy lub do kawałka szklanego szkiełka nakrywkowego umieszczonego na agarozie. Lekko docisnąć pokrętło strzykawki, aby sprawdzić, czy końcówka igły jest otwarta (zielona zawartość igły zostanie usunięta).
6. Niezapłodnione jaja należy wstrzykiwać jeden po drugim, najpierw wprowadzając igłę do komórki jajowej i lekko zasysając, aby przerwać błonę jajową, a następnie wstrzykując. Wstrzyknąć zielony roztwór do wstrzykiwań w środek komórki jajowej maksymalnie do 1/3 średnicy komórki. (Odpowiada to około 30 pl dla średnicy jaja 140 μm).
7. Przenieść wstrzyknięte niezapłodnione jaja do świeżego naczynia hodowlanego i inkubować je w temperaturze 15-18 °C aż do zapłodnienia.
8. Zapłodnić wstrzyknięte komórki jajowe świeżo aktywowanymi plemnikami, tak jak w przypadku zapłodnień testowych (krok 6.1.2). Wyeliminuj maksymalną ilość plemników, przenosząc zygoty do świeżego naczynia hodowlanego. Rozłóż zarodki i nie zaburzaj ich w fazach rozszczepienia (do stadium 32 komórek).
9. Hodowla zarodków do pożądanego stadium w temperaturze między 13 a 20 °C.
10. Zbierz zarodki, obracając je na środku płytki i przenosząc do silikonowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Napraw i zamontuj lub zamontuj (kroki 7 i 8).
11. Porównaj uzyskane fenotypy z kontrolnymi zarodkami, którym wstrzyknięto.
    UWAGA: Wstrzyknij drugi, nienakładający się MO, który jest ukierunkowany na ten sam transkrypt, aby uzyskać identyczne fenotypy. Uratuj określony fenotyp (fenotypy) MO za pomocą zmodyfikowanego mRNA kodującego interesujące Cię białko, ale które nie jest rozpoznawane przez MO. Wstrzyknij kontrolny MO, który nie daje fenotypu.

7. Barwienie LacZ

1. Zbierz zarodki na pożądanym etapie w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml i utrwal je w 0,2% aldehydzie glutarowym w 1 ml ASWH przez maksymalnie 15 do 30 minut.
2. Myć 2x 10 min 1 ml 1x PBT.
3. Spłukać raz w 500 μl buforu barwiącego LacZ. Zastąp 1 ml buforu barwiącego uzupełnionym substratem X-Gal (użyj 10 μl/ml 40 mg/ml X-Gal Stock). Przenieś zarodki na 12-dołkową płytkę, aby lepiej obserwować barwienie.
4. Wysiaduj w ciemności. Inkubację zmieniać od 0,5 godziny do nocy w temperaturze 4 °C, w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37 °C, w zależności od siły czynnika wyrażającego LacZ.
5. Umyj zarodki do 4 razy w 1 ml 1X PBT, aby usunąć bufor barwiący.
6. Post-fix przez 10 minut w temperaturze pokojowej z 2% paraformaldehydem (PFA) w 1 ml 1x PBT lub 0,2% aldehydu glutarowego w 1 ml 1x PBT w celu interpretacji i wizualizacji barwionych zarodków.

8. Montaż fluorescencyjnie oznakowanych Wmbryos

1. Utrwal zarodki w pożądanym stadium rozwojowym przez 20 minut w 2% PFA w 1 ml ASWH.
2. Umyj zarodki 2x w 1 ml 1x PBT. Unikaj ekspozycji na światło, trzymając zarodki w ciemności.
3. Przenieś do 50 zarodków na jedno szkiełko. Najpierw usuń maksymalną ilość PBT za pomocą pipety i ostrożnie za pomocą ręcznika papierowego.
4. Dodać 20-25 μl podłoża montażowego.
5. Dodaj szkiełko nakrywkowe, ustawiając je pod kątem (najpierw z jednej strony) i powoli opuszczaj je spiczastym przedmiotem (igłą, kleszkami, końcówką pipety), unikając pęcherzyków, aż próbka zostanie przykryta. Przymocuj szkiełko nakrywkowe na jego krawędziach za pomocą kropek przezroczystego lakieru do paznokci.
6. Po wyschnięciu uszczelnij całe szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Mikroiniekcja w badaniach nad sieciami regulacji genów

Zarodki ascydii Ciona intestinalis są bardzo odpowiednie do badań nad funkcjami genów lub regulacją genetyczną na poziomie linii komórkowej i z rozdzielczością komórkową. mRNA, MO lub znaczniki mogą być mikroinjektowane do niezapłodnionej komórki jajowej lub do poszczególnych blastomerów po zapłodnieniu. Knockdown genu za pomocą MO z wykorzystaniem techniki mikroiniekcji opisano w kroku 6. MO specyficznie celują w mRNA wybranych genów i zapobiegają ich translacji na białko. Indukowany przez MO brak funkcji (LOF) genów rozwojowych zmienia ekspresję szerokiego spektrum genów poniżej w kaskadzie, co w ogólnym ujęciu pozwala wglądu w embrionalną sieć regulacyjną genów (GRN)¹⁰. Takie analizy u Ciona dostarczyły pierwszego pełnego schematu regulacyjnego całego zarodka u metazoa¹¹. Rysunek 1 przedstawia przykład wykorzystania mikroiniekcji do badania regulacji nadrzędnej ekspresji konserwowanego czynnika transkrypcyjnego mieliny u Ci (Ci-MYT) na etapie gastruli zarodków Ciona. W badaniu za pomocą hybrydyzacji in situ (ISH), endogenną ekspresję (Rysunek 1a, schematycznie na Rysunku 1a') obserwuje się w prekursorach 6-rzędowej płytki neuralnej, w szczególności mózgu (rzędy III/IV, na czerwono) i rdzenia kręgowego (rzęd I, na zielono). Dodatkowo, regulację nadrzędną Ci-MYT analizowano poprzez iniekcję MO celujących w kilka czynników, które są ekspresowane w prekursorach neuralnych lub sąsiednio przed początkiem ekspresji Ci-MYT (Rysunek 1b-g). Knockdown wczesnych czynników embrionalnych, takich jak czynnik transkrypcyjny Forkhead box A-a (FoxA-a) oraz czynnik wzrostu fibroblastów 9/16/20 (FGF9/16/20) (Rysunek 1b lub 1c, odpowiednio), eliminuje całkowitą ekspresję Ci-MYT. Inne czynniki transkrypcyjne wpływają na ekspresję Ci-MYT tylko częściowo, co skutkuje indukowanym przez MO obniżeniem poziomu ekspresji w podgrupie prekursorów mózgu (niebieskie groty strzałek na Rysunku 1d, f i g). Odwrotnie, ekspresja Ci-MYT jest aktywowana ektopowo po obniżeniu poziomu Nodal (Rysunek 1e, czerwone groty strzałek), co sugeruje, że Nodal normalnie hamuje ekspresję Ci-MYT w tych bocznych prekursorach rdzenia nerwowego.

Elektroporacja dla efektywnych badań nad funkcją genów i enhancerami

Elektroporacja plazmidowego DNA do zygot Ciona jest wydajną metodą przejściowej transgenezy i późniejszej obserwacji zmian fenotypowych in vivo. W przeciwieństwie do mikroiniekcji mRNA, elektroporacja umożliwia tkankowo specyficzną nadekspresję, w której regiony kodujące geny (ORF, otwarte ramki odczytu) są ekspresowane pod kontrolą tkankowo specyficznych driverów. Stanowią one zazwyczaj regiony regulacyjne cis znanych genów (takich jak enhancer brachyury dla ekspresji w prekursorach notochordu⁸). Z kolei elektroporacja jest przydatna do wydajnej analizy nowych regionów regulacyjnych, w których geny reporterowe (LacZ lub zielone białko fluorescencyjne, GFP) ujawniają swoją aktywność in vivo. Schemat identyfikacji i późniejszej analizy za pomocą elektroporacji takiego nowego regionu regulacyjnego (dla Ci-MYT) przedstawiono na Rysunku 2.

Szeroki zestaw danych społeczności Ciona, łatwo dostępnych w przeglądarkach genomu specyficznych dla ascydii^12,13, takich jak Ascidian Network for In situ Expression and Embryological Data (ANISEED)^23, jest analizowany w celu identyfikacji regionów regulatorowych in silico (Rysunek 2A). Następujące klonowanie tych regionów do wektorów ekspresyjnych za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR) umożliwia testowanie in vivo za pomocą elektroporacji (Rysunek 2B). Zrzut ekranu z przeglądarki genomu na Rysunku 2A przedstawia region powyżej (upstream) modelu transkrypcyjnego KH dla Ci-MYT (widoczne są trzy pierwsze eksony, zaznaczone na pomarańczowo, oraz dwa introny). Różne ścieżki przeglądarki genomu adnotują przewidywane funkcjonalne dane genomowe dla tego regionu, takie jak dane z immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)¹⁴ (tutaj pokazane dla ZicL, Ci-zinc finger of the cerebellum L), konserwacja sekwencji między dwoma pokrewnymi gatunkami Ciona^15,24 lub zajętość nukleosomów^16,17 (od góry do dołu na Rysunku 2A). Zazwyczaj egzonowe regiony kodujące białka są wysoce konserwatywne (ścieżka dopasowania na Rysunku 2A). Dodatkowe piki wysokiej konserwacji pojawiają się w regionach niekodujących powyżej (upstream) oraz w pierwszym intronie. Dwa z nich są przewidywane jako wolne od nukleosomów zgodnie z algorytmem opartym na sekwencji^16,17 (czerwone ramki na Rysunku 2A), co sugeruje dostępność dla czynników transkrypcyjnych. Rzeczywiście, sygnały Chip-on-ChIP¹⁴ dla wiązania czynnika transkrypcyjnego Ci-ZicL (zielone paski na Rysunku 2A) są wzbogacone w tych dwóch konserwatywnych regionach. Co więcej, korzystając z interfejsu²⁵, który wyszukuje potencjalne miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych, zidentyfikowaliśmy miejsca ZIC znajdujące się w sekwencjach genomowych zaznaczonych klastrami ChIP Ci-ZicL (pomarańczowe strzałki i sekwencje z podkreślonym rdzeniem ZIC, Rysunek 2A). Wiązanie czynnika transkrypcyjnego Ci-ZicL w konserwatywnych i przewidywanych jako wolnych od nukleosomów regionach regulatorowych Ci-MYT jest spójne z obniżeniem ekspresji Ci-MYT zaobserwowanym w eksperymentach z knockdownem za pomocą wstrzykiwania MO skierowanych przeciwko ZicL (Rysunek 1d).

Po wyznaczeniu in silico potencjalnych regionów regulacyjnych cis dla ekspresji Ci-MYT, regiony te są powielane metodą PCR z genomowego DNA Ciona i wprowadzane poprzez klonowanie rekombinacyjne do plazmidów reporterowych LacZ¹⁹. Następnie konstrukcje te są wprowadzane metodą elektroporacji do zapłodnionych jaj Ciona (Rysunek 2B), a ich aktywność jest analizowana za pomocą barwienia LacZ (Rysunek 3).

Rysunek 3 pokazuje, że dzięki takiemu podejściu in silico możliwe było zidentyfikowanie dwóch oddzielnych sekwencji cis-regulatorowych, które odtwarzają domeny ekspresji mRNA Ci-MYT (por. Rysunek 1a). Zazwyczaj embriony przejściowo transgeniczne, w które wprowadzono plazmidowe DNA poprzez elektroporację, wykazują mozaikową ekspresję tylko w tych komórkach, które włączyły DNA. Mozaikowa ekspresja LacZ jest zatem sterowana przez pmyt-R3 i występuje we wszystkich prekursorach, które wykazują również ekspresję mRNA Ci-MYT, tj. w prekursorach płytki neuronalnej tylnego rzędu I oraz przednich rzędów III/IV na etapach gastruli i wczesnej neuruli (Rysunek 3a, b, odpowiednio fioletowe i czerwone groty strzałek). W przeciwieństwie do tego, pmyt-R5 jest aktywny tylko w tylnych (rząd I) prekursorach płytki neuronalnej i zaczyna działać w późniejszym etapie neuruli (Rysunek 3c, czerwone groty strzałek). Te dwa regiony kodują zatem dwa oddzielne aspekty przestrzenne i czasowe regulacji genu Ci-myt. Co ciekawe, oba regiony regulatorowe barwią również dodatkowe prekursory niewidoczne w ISH, zwłaszcza w przedniej i bocznej części płytki neuronalnej oraz w mięśniach (Rysunek 3a, b, odpowiednio różowe, białe i żółte groty strzałek). Taka szersza ekspresja może wskazywać na elementy represyjne, które nie są zawarte w wyizolowanych fragmentach regulatorowych (jak w przypadku Nodal, który represuje boczny los neuronalny, patrz Rysunek 1e) lub na niskie poziomy ekspresji wykryte dzięki akumulacji enzymatycznego sygnału LacZ.

Oprócz badań nad enhancerami, elektroporacja u Ciona ułatwia również analizy funkcjonalne genów kodujących u Ciona poprzez ich nadekspresję. Społeczności naukowej udostępniono obszerną kolekcję pełnowymiarowych ORF Ciona, które dodatkowo adnotowano pod kątem ortologów ludzkich, w tym genów związanych z chorobami¹⁸. Poszczególne geny lub grupy genów z tej biblioteki cDNA pełnych ORF, kompatybilnej z klonowaniem rekombinacyjnym (Rysunek 2B), są łatwo przenoszone do wektorów docelowych zawierających odpowiednie drivery w celu ekspresji w embrionach. Powstałe klony ekspresyjne mogą być ponadto współelektroporowane z reporterowymi konstruktami regulacyjnymi cis w celu przetestowania ich domniemanej roli w aktywacji enhancerów. Rysunek 2B ilustruje izolację klonów pełnych ORF dla czynników transkrypcyjnych Ci-ZicL i Ci-GATAa oraz ich rekombinację do zaadaptowanych wektorów docelowych, które mogą zawierać znaczniki translacyjne¹⁹ (np. zielony fluorescencyjny znacznik Venus lub znacznik hemaglutyniny wirusowej (HA)) oraz driver tkankowo specyficzny, taki jak region regulacyjny Friend Of Gata (driver pfog) dla wczesnej ekspresji panektodermalnej¹⁵ zastosowany w niniejszym badaniu. Efekt nadekspresji Ci-ZicL w tkankach ektodermalnych i neuroektodermalnych analizowano poprzez współelektroporację reporterów pmyt-R3>LacZ oraz pmyt-R5>LacZ (Rysunek 3b', b'' oraz c', c'', odpowiednio). Nasze analizy elektroporacyjne sugerują, że Ci-ZicL może aktywować ekspresję Ci-MYT poprzez regiony enhancerowe pmyt-R3 i pmyt-R5, ponieważ oba konstrukty reporterowe wykazały ektopową ekspresję LacZ w regionach ektodermalnych (zielone groty strzałek na Rysunku 3b', b'' oraz c', c''). Jak pokazano na Rysunku 3d, elektroporacja DNA plazmidowego w setkach jaj Ciona pozwala na statystycznie istotną kwantyfikację zmian ekspresji, co zilustrowano dla ektopowej ekspresji pmyt-R3>LacZ przy zależnej od stężenia panektodermalnej ekspresji Ci-ZicL.

Elektroporacja w celu lokalizacji subkomórkowej in vivo

Rysunek 4 przedstawia lokalizację subkomórkową znakowanych czynników transkrypcyjnych po ich ekspresji za pomocą elektroporacji w blastomerach ektodermalnych z wykorzystaniem dostosowanych konstruktów ekspresyjnych (schematycznie przedstawionych w Rycina 2B). Poprzez znakowanie czynników transkrypcyjnych na końcu C (takich jak Ci-GATAa) z tagiem Venus (Rycina 4b) lub znacznik HA (Rycina 4c) i nadmierną ekspresję tych genów w tkankach ektodermalnych (pfogmożna było zaobserwować, że in vivo, 'Ci- GATAa lokalizuje się głównie w jądrach komórkowych, co jest oczekiwane w przypadku czynnika transkrypcyjnego, podczas gdy ekspresja Venus jest powszechna, obejmując również cytoplazmę. Podobne eksperymenty można przeprowadzić w celu zbadania dynamiki lokalizacji subkomórkowej w czasie dla pojedynczych czynników transkrypcyjnych lub ich kombinacji, co może ujawnić ich ko-lokalizację z zastosowaniem różnych znaczników.

Rycina 1: Ocena regulacji Ci-MYT poprzez mikroiniekcję w jajach Ciona. Ekspresja mRNA Ci-MYT w embrionach typu dzikiego (WT) i wstrzykniętych Morpholino (MO). (a) Wzorzec ekspresji Ci-MYT typu WT w płytce neuralnej. (a') Schematyczne przedstawienie barwionych prekursorów w płytce neuralnej (NP). Rząd I/II: posteriorowy los neuralny; rząd III/IV: anteriorowy los neuralny; rząd V/VI: los czułków (palps). (b-g) Ekspresja Ci-MYT po mikroiniekcji różnych MO w celu wyciszenia wskazanych genów uczestniczących we wczesnej sieci regulacji genów (GRN) Ciona (zdjęcia adaptowane z Imai et al., 2006)¹¹. Ci-MYT, czynnik transkrypcyjny mieliny Ci; WT, typ dziki; niebieskie groty strzałek: utrata sygnału Ci-MYT; czerwone groty strzałek: ektopowy sygnał Ci-MYT. Pasek skali = 100 µm odnosi się do wszystkich obrazów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Schemat wyszukiwania regionów enhancerowych in silico oraz klonowania rekombinacyjnego dla przejściowej transgenezy poprzez elektroporację w embrionach Ciona. (A) Zrzut ekranu z przeglądarki genomu ascydii ANISEED²³ identyfikuje sekwencje regulacyjne powyżej genu Ci-myt. Czerwone ramki zaznaczają dwa potencjalne regiony cis-regulacyjne, pmyt-R3 (scaffold_196:76883..77079) oraz pmyt-R5 (scaffold_196:75856..76041), które wybrano do analizy za pomocą elektroporacji. Nazwy ścieżek: ZicL probes: dane ChIP-on-Chip¹⁴; KH2012 Transcripts: modele transkrypcyjne Ciona intestinalis; Alignment Score Cs/Ci LastZ: konserwacja sekwencji między Ciona savignyi (Cs)/Ciona intestinalis (Ci)^15,24; Segal 2006 predicted nucleosome occupancy version 1: algorytm obliczeniowy wyszkolony na kurczaku przez Segal et al., 2006¹⁶, zastosowany do Ci zgodnie z Khoueiry et al., 2010¹⁷. Zielone słupki: piki ChIP Ci-ZicL¹⁴; pomarańczowe strzałki: przewidywane miejsca wiązania ZIC; GCTG: rdzeniowa sekwencja wiązania ZIC. (B) Schemat generowania konstruktów do nadekspresji z pełnej biblioteki cDNA ORF Ciona, rekombinowanych do wektorów docelowych zawierających tkankowo specyficzne promotory (pfog) i znaczniki białkowe, następnie współelektroporowanych z konstruktami reporterowymi (takimi jak pmyt-R3>LacZ lub pmyt-R5>LacZ) w celu odczytu in vivo. Ci-MYT, czynnik transkrypcyjny Ci-myelin; Ci-ZicL, czynnik transkrypcyjny Ci-Zinc finger of the cerebellum L; pfog, region regulacyjny Ci-Friend of GATA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Elektroporowane zarodki Ciona wykazujące indukowaną przez Ci-ZicL czasowo-przestrzenną regulację cis białka Ci-MYT. Przedstawiono zabarwione LacZ zarodki w stadium środkowej gastruli (mG)/późnej gastruli (lG) lub wczesnej neuruli (eN), które zostały poddane ko-elektroporacji konstruktami pmyt-R3>LacZ lub pmyt-R5>LacZ oraz konstruktem kontrolnym (pfog>mCherry) lub pfog>ZicL. Driver pfog¹⁹ pośredniczy w ektopowej (pan-zwierzęcej) ekspresji ZicL w ektodermie i neuroektodermie, co powoduje ektopowe barwienie LacZ w tych komórkach. (a) Aktywność pmyt-R3 LacZ w zarodkach w stadium mG/lG (małe groty strzałek, panel lewy) lub w odpowiadających im kolorystycznie obszarach schematycznych (niebieskie kółka, panel prawy); widok wegetatywny (vg). Rząd I/II: tylny los neuronalny; Rząd III/IV: przedni los neuronalny; Rząd V/VI: los wypustek (palp). (b) Aktywność pmyt-R3 w stadium eN w tkankach analogicznie jak w a. (b') Ektopowa aktywność pmyt-R3 po ko-elektroporacji Ci-ZicL zaznaczona zielonymi grotami strzałek. (b'') Te same zarodki co w b', z biegunem zwierzęcym skierowanym do góry (an). (c) Aktywność pmyt-R5 LacZ w stadium eN (c') Ektopowa aktywność pmyt-R5 po ko-elektroporacji Ci-ZicL zaznaczona zielonymi grotami strzałek. (c'') Te same zarodki co w c', ale z biegunem zwierzęcym skierowanym do góry (an). (d) Ilościowe zestawienie reprezentatywnych eksperymentów dla nadaktywacji pmyt-R3 przez Ci-ZicL przy niskich stężeniach. Przedstawiono jeden powtórzony biologiczny. Ci-MYT, czynnik transkrypcyjny mieliny Ci; Ci-ZicL, czynnik transkrypcyjny Ci-Zinc finger of the cerebellum L; Ci-FOG, Ci-Friend of GATA; WT, typ dziki; mG, środkowa gastrula; lG, późna gastrula; eN, wczesna neurula; an, widok zwierzęcy; vg, widok wegetatywny; nls LacZ, sygnał lokalizacji jądrowej dla LacZ. Pasek skali = 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Różnicowa lokalizacja subkomórkowa białek po elektroporacji. Lokalizacja białek znakowanych Venus lub hemaglutyniną (HA), nadeksprymowanych w komórkach ektodermalnych przy użyciu promotora pfog¹⁹. (a-c) obrazy DIC. (a', b') odpowiadające im obrazy fluorescencyjne. (c') odpowiadający obraz fluorescencyjny po immunohistochemicznym znakowaniu z użyciem TRITC. Pasek skali = 100 µm odnosi się do wszystkich obrazów. DIC, mikroskopia kontrastowa różnicowego interferencyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Istnieją dwie główne techniki generowania transgenicznych zarodków Ciona : mikroiniekcja RNA lub DNA i elektroporacja DNA. Te techniki perturbacji genów w zarodkach Ciona zostały po raz pierwszy zastosowane w latach 90. XX wieku^7,8 i od tego czasu były sukcesywnie udoskonalane, a obecnie stosowane w Ciona (i innych rodzajach puchatych)²⁰ na całym świecie.

Krytyczne kroki w protokole

Udana transgeneza do gamet Ciona , które można łatwo pobrać od dorosłych zwierząt, zależy od wielu krytycznych czynników. Jakość gamet zależy od sezonu tarła (zazwyczaj od maja do grudnia na północnym Atlantyku, zmieniającego się wraz z temperaturą wody i natlenieniem), od jakości wody morskiej w akwariach (przy prawidłowym zasoleniu dorosłe osobniki pozostają zdrowe przez 2-4 tygodnie) i wreszcie od prawidłowego obchodzenia się z gametami po ekstrakcji od dorosłych, jak opisano poniżej dla różnych etapów protokołu.

Na etapach przygotowania, inkubacja pipet Pasteura z wodą z kranu zapobiegnie przywieraniu zarodków, a wstępna inkubacja w wodzie morskiej na szalkach Petriego pokrytych agarozą usunie toksyczne substancje uwalniane z agarozy. Ogólnie rzecz biorąc, potrawy można przygotować do 2 tygodni przed użyciem, przechowywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć rozwoju bakterii i spłukać na świeżo przed użyciem. Jednodniowe, małe naczynia wydają się najlepsze do wstrzykiwań.

Skuteczność i długość dechorionacji jest kluczowym krokiem w protokole, ponieważ długotrwałe leczenie komórek jajowych/zarodków zaszkodzi rozwojowi. Staranne przygotowanie (bez wstrząsania) i prawidłowe przechowywanie (w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia) pozwala zachować jakość roztworu dechorionacyjnego. Proteazy w roztworze tracą skuteczność, jeśli są zbyt gwałtownie mieszane podczas przygotowywania lub z czasem, zwłaszcza jeśli są przechowywane w temperaturze pokojowej przez dłuższe godziny/dni. Zoptymalizowaliśmy ten krytyczny krok, używając świeżego roztworu do dechorionacji, wygodnie przygotowanego z zamrożonych porcji 20-krotnego roztworu podstawowego.

Prawidłowe obchodzenie się z delikatnymi komórkami jajowymi/zarodkami z odwążówką jest niezbędne, a strzyżenie lub dźganie zarodków podczas pipetowania będzie szkodliwe. Podczas pipetowania zarodki są utrzymywane w jak największym stopniu w zawiesinie (poprzez delikatne "przedmuchiwanie" płynu w celu ich zawirowania, a następnie płynne, ale szybkie pipetowanie), trzymając szklaną pipetę w pozycji pionowej, a nie poziomej. Ostrożność ta ma zastosowanie do wszystkich etapów pipetowania w celu mycia, ponownego zawieszania i przenoszenia komórek jajowych/zarodków do i z probówek, kuwet lub płytek, przed i po utrwaleniu. Po utrwaleniu należy również zwrócić szczególną uwagę na oddzielenie urządzeń pipetujących dla żywych i utrwalonych zarodków, aby uniknąć toksyczności spowodowanej pozostałościami utrwalaczy.

Mikroiniekcja jest dość trudna w przypadku jaj/zarodków Ciona ze względu na ich mały rozmiar i sprężystość błony witelinowej i zależy w decydującym stopniu od zoptymalizowanego rozmiaru końcówki igły do wstrzykiwań, idealnego kąta iniekcji (ruch igły w jednej linii, wzdłuż promienia jaja) i precyzyjnie dostrojonego, ręcznego łamania błony witeliny (przez odsysanie przed aspiracją do wstrzyknięcia). To ostatnie jest możliwe tylko wtedy, gdy pęcherzyki powietrza zostaną całkowicie wyeliminowane z rurki iniekcyjnej, która zawiera olej mineralny w celu wygładzenia ciśnienia ssania/wtrysku. Ponadto najmniejsze kawałki kurzu lub resztek jaj zatykają igłę i można ich łatwo uniknąć dzięki czystym warunkom pracy i etapom płukania jaj przed przeniesieniem na naczynie iniekcyjne. Po wstrzyknięciu, przeniesienie jaj na świeże szalki pozwoli uniknąć toksycznych skutków spowodowanych martwymi zarodkami, które nie przeżyły procedury iniekcji.

Rozwiązywanie problemów

Potencjalne problemy w procedurze można rozwiązać, stosując następujące rozwiązania. Niskie wskaźniki zapłodnienia mogą wynikać z niewystarczającej aktywacji plemników, niskiej czystości komórek jajowych lub dużych objętości zapłodnienia. Używaj świeżo zebranych i mniej rozcieńczonych nasienia. Sprawdź ruch plemników po aktywacji. Przed zapłodnieniem umyć jaja ASWH, jak opisano w kroku 4.2. Zmniejsz objętość wody i zmniejsz ilość jaj w naczyniu/studzience do zapłodnienia. Utraty zarodków na etapach przygotowania można uniknąć, dodając kroplę roztworu dechorionacyjnego w celu skuteczniejszego odwirowania niezdekorionowanych komórek jajowych/zarodków. Czas dechorionacji powinien być zoptymalizowany, ponieważ częściowo zdekorionowane jaja nie osadzają się, a przedłużająca się dechorionacja jest toksyczna, powodując eksplozję zarodków.

Rozwój asynchroniczny może wynikać z resztek plemników uwolnionych podczas sekcji. Przechowuj partie jaj oddzielnie od różnych zwierząt, aby uniknąć niekontrolowanego zapłodnienia krzyżowego. Nieprawidłowy rozwój może mieć różne przyczyny. Na początku i na końcu sezonu, po rozdzieleniu zarodków pochodzących od różnych osobników, można wybrać najlepsze partie. Unikaj zakłócania zarodków przez 10 minut po zapłodnieniu, aby uniknąć zakłócania ich segregacji ooplazmatycznej. Upewnij się, że zarodki nie zaczęły się dzielić podczas przenoszenia, ponieważ pipetowanie oddziela siostrzane blastomery i powoduje częściowe zarodki. Użyj mniej plemników do zdekorionowanych komórek jajowych, aby uniknąć polispermii. Używaj świeżo przygotowanych, ale opłukanych potraw z agarozy. Upewnij się, że urządzenie do pipetowania nie zawiera utrwalaczy. Trzymaj zarodki kontrolne, które nie zostały zdekorionowane i nie zostały poddane elektroporacji, aby wykryć, na którym etapie rozwój został zakłócony. Uzupełnij zarodki antybiotykami, jeśli dojdzie do zanieczyszczenia i rozkładu.

Jeśli urządzenie do wstrzykiwań jest "zatkane", otwór igły do wstrzykiwań można zweryfikować poprzez usunięcie części jego poplamionej zawartości. Zatykający się materiał można zetrzeć, ostrożnie przeciągając końcówkę igły przez agarozę. Należy usunąć pęcherzyki powietrza z rurki iniekcyjnej i (lub) igły. Zmienić igłę, aby lepiej kontrolować objętość wstrzyknięcia, ponieważ końcówka igły może pęknąć lub zatkać się podczas wstrzyknięcia. Opłucz jajka i umieść je w czystym naczyniu do wstrzykiwań, jeśli w naczyniu nagromadziły się zanieczyszczenia. Odwirować roztwór do wstrzykiwań przed napełnieniem świeżych igieł w celu osadzenia wszelkich małych cząstek lub kryształów. Pomocne jest również ćwiczenie iniekcji tylko z niezbędnym barwnikiem. Sprawdź technikę wstrzykiwania, zapładniając jaja z wstrzyknięciami i bez iniekcji. Wreszcie, konsultacja z doświadczonym kolegą może być pomocna w poprawie techniki wstrzykiwania.

Aby kontrolować efekty niezamierzone, drugi nienakładający się MO i ratunek ze zmodyfikowanym mRNA, które nie jest rozpoznawane przez MO, może wiernie wykluczyć niespecyficzne efekty fenotypowe w Ciona.

Mikroiniekcja: znaczenie i ograniczenia

Mikroiniekcja w Ciona została wykorzystana do wygenerowania pierwszego planu dla całej sieci regulacji genów zarodka (GRN) w strunowcu¹¹. Jednak pomimo tak niezwykłego osiągnięcia, mikroiniekcja w zarodkach Ciona ma ograniczenia ze względu na stosunkowo mały rozmiar (0,14 mm średnicy) jaj Ciona . W porównaniu z innymi gatunkami strunowców, w których obce DNA/mRNA jest wprowadzane przez mikroiniekcje, jaja Ciona są stosunkowo trudne w obsłudze, a odsetek wstrzykiwanych zarodków Ciona na eksperyment pozostaje niski (średnio od 30 do 50 zarodków na eksperyment), co utrudnia analizy ilościowe. Niemniej jednak, w przypadku niepokojących czynników matczynych w Ciona, mikroiniekcja MO jest metodą z wyboru również do badania ich udziału w jarzmowym początku rozwoju od 16 do 32 stadiów komórkowych¹⁵. Ponadto możliwe jest, choć znacznie trudniejsze, mikroiniekcja pojedynczych blastomerów do stadium 16-32 komórek. Wreszcie, mikroiniekcja pozostaje najbardziej efektywną techniką generowania transgenicznych zarodków (poprzez wstrzyknięcie mRNA lub DNA) u gatunków puchatych innych niż Ciona, dla których nie istnieją w pełni zoptymalizowane protokoły elektroporacji.

Elektroporacja: znaczenie i ograniczenia

Aby przezwyciężyć niską liczbę i inne ograniczenia związane z mikroiniekcją, większość społeczności Ciona stosowała elektroporację plazmidowego DNA od czasu jej opracowania i opublikowania jako zoptymalizowany i znormalizowany protokół przez Zellera i in. w 2004^roku. Rzeczywiście, tysiące transgenicznych zarodków Ciona mogą zostać wygenerowane w ciągu jednej godziny, a nawet 500 zarodków jest jednocześnie elektropostowanych w jednej kuwecie za pomocą pojedynczego impulsu 50 V o długości 16 ms. Podejście polegające na generowaniu ogromnej liczby transgenicznych embrionów jest nadal unikalne wśród organizmów modelowych strunowców. Doprowadziło to do tego, że Ciona szybko została uznana za potężny system modelowy do przeprowadzania analiz in vivo potencjalnych regionów cis-regulatorowych i lokalizacji komórkowej/subkomórkowej, czego przykładem jest tutaj.

Chociaż elektroporacja w zygotach Ciona zasadniczo zrewolucjonizowała dziedzinę badań nad grn strunowy, technika ta napotyka jednak pewne ograniczenia. Po pierwsze, plazmidy są przejściowo wprowadzane do zarodków Ciona i najprawdopodobniej są dziedziczone jako układy pozachromosomalne, co sprawia, że stabilność elektroporowanego plazmidowego DNA jest spekulatywna. Co więcej, bardzo trudne, a być może nawet niemożliwe jest kontrolowanie kopii elektroporowanych plazmidów, które zostaną pobrane przez zygotę, co spowoduje fluktuacje fenotypowe. Kolejnym problemem, który utrudnia interpretację wyników elektroporacji, jest zjawisko, które nazywamy mozaicyzmem. Elektroporowane plazmidowe DNA może być pobierane w różnych pozycjach zarodka w stadium jednokomórkowym; który określa, które i ile ćwiartek zygoty otrzyma plazmid, który zostanie odziedziczony przez potomne blastomery. Takie różnice w oczywisty sposób utrudniają interpretację efektów ilościowych. Jednak większość problemów związanych ze zmiennością elektroporacji rozwiązuje odpowiednia ilość próbek biologicznych, z liczeniem i statystykami komórek LacZ (lub GFP), które są łatwo dostępne w jednej partii.

Wszechstronność i potencjał elektroporacji w inżynierii genetycznej

Elektroporacja ostatecznie pozwala na średnioprzepustowe badania przesiewowe potencjalnych regionów cis-regulatorowych i ilościowe analizy funkcji genów po sklonowaniu do plazmidów reporterowych lub ekspresyjnych. Ze względu na zwarty genom Ciona, identyfikacja i klonowanie potencjalnych regionów regulacyjnych jest dość proste³. Strategię wykorzystania bogactwa danych społecznościowych przedstawiono na rysunku 2A. Klonowanie plazmidów reporterowych i kodujących geny jest dodatkowo ułatwione dzięki generowaniu zestawów wektorów¹⁹ dostosowanych do metody Cina, kompatybilnych z GATEWAY oraz kompatybilnej biblioteki ORF o pełnej długości¹⁸. Oba narzędzia są dostępne dla społeczności i pozwalają na wydajną, wolną od restrykcji rekombinację czynników regulacyjnych i regionów kodujących, jak pokazano na rysunku 2B.

W ostatnich latach elektroporacja została z powodzeniem zaadaptowana do uzyskania ukierunkowanej na tkankę manipulacji genami za pomocą plazmidów, które wyrażają narzędzia do edycji genów, takie jak komponenty CRISPR/Cas9, pod kontrolą specyficznych dla tkanek czynników^21,22. Takie podejścia szybko poszerzą naszą wiedzę na temat dynamiki GRN i potencjalnie konserwatywnych mechanizmów sygnałowych, w tym kodów czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w tworzenie tkanek i stopniowe wychodzenie z pluripotencji. Co więcej, specyficzne tkankowo podejścia do utraty lub wzmocnienia funkcji (za pomocą CRISPR/Cas9 lub nadekspresji) za pomocą elektroporacji będą miały zasadnicze znaczenie dla badania ortologów Ciona genów związanych z chorobami ludzkimi. Rzeczywiście, katalogi ortologów Ciona genów chorób ludzkich i ich pełnowymiarowych klonów kodujących ORF są łatwo dostępne do analizy w Ciona¹⁸. Ze względu na duplikacje całego genomu u kręgowców, większość ludzkich genów posiada funkcjonalnie nadmiarowe paralogi, które komplikują analizy funkcji genów¹. Ciona , jako prostszy system z typowym układem tkanek strunowców u larw, powinna odkryć fundamentalne role tak ważnych, często funkcjonalnie zachowanych genów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lab ze stałą temp. (~18 ° C)			Do pracy z zarodkami
Ciona intestinalis dorosłych	UPMC - Station Biologique, Roscoff, Francja		Do zbierania gamet
NaCl	Roth	3957.1	Dla ASWH
KCl	Roth	6781.1	Dla ASWH
CaCl2x2H2O	Roth	A119.1	Dla ASWH
MgCl2x6H2O	Roth	2189.1	Dla ASWH
MgS04x7H2O	Roth	P027.2	Dla ASWH
NaHCO3	Roth	6885.1	Dla ASWH
Hepes	Roth	HN78.3	Do
tioglikolanu sodu ASWH	Sigma	MZ-6	do dechorionacji
pronazy	Sigma	T0632-100G	do dechorionacji
D-Mannitol	Sigma Aldrich	M9546-250G	Do elektroporacji
plazmidowego DNA (przygotowanie >1&mikro; g/&mikro; l)	Macherey-Nagel	740410.100	Do elektroporacji lub mikroiniekcji
Agaroza	dowolny dostawca		Do powlekania naczyń do hodowli zarodków
Plastikowe szalki Petriego	VWR	612-2079	Pokryte 1% agarozą w ASWH, pokryte ASWH
Małe nożyczki	dowolny dostawca		Do wycinania gamet
NaOH	Roth	6771.1	Do aktywacji roztworu dechorionacyjnego
Tris	Roth	5429.3	1 M pH 9,5, do aktywacji plemników
Pipety Pasteura	VWR	612-1701	Uzdatniony przez zanurzenie w wodzie z kranu na co najmniej 12 godzin
Wirówka ręczna	Hettich Zentrifugen	1011	Użyj szklanych probówek wirówkowych
1,5 ml Probówki Eppendorf	Sigma	T3406-250EA
2 ml Probówki Eppendorf	Sigma	T3531-200EA
Elektroporator kwadratowy	Bio Rad Gene Pulser Xcell
Kuwety do elektroporacji 4 mm	Eurogentec	CE-0004-50
Szkiełka nakrywkowe	Sto Premium	PR248212600
Szkiełka podstawowe	VWR	ECN 613-1551
Aldehyd glutarowy	Sigma	G6257-10ML	Do utrwalania w barwieniu LacZ
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-500G	Do utrwalania próbek fluorescencyjnych
Vectashield	Vector	H-1000	Do mocowania próbek fluorescencyjnych
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside)	Roth	2315.2	LacZ; zapas w 40 mg/ml DMF (dimetyloformamid)
K4Fe(CN)6• 3H2O	Merck	4984	Do buforu barwiącego LacZ
K3Fe(CN)6	Merck	4973	Do bufora barwiącego
LacZ Na22HPO4	Roth	4984.2	Dla PBT
KH2PO4	Roth	3904.2	Dla PBT
Animacja	Sigma	SLBJ5103V	Do
oleju mineralnego	Sigma	M8410	Testowana hodowla zarodków
Green Vital Dye	Fast Green Sigma	F7251	do mikroiniekcji; 10&mikro; g/&mikro; l
Ściągacz do mikropipet (płonący/brązowy)	Sutter Instruments	Model P-97	Do ciągnięcia igieł iniekcyjnych
Kapilary ze szkła borokrzemianowego GC100TF-10	Harvard Apparatus Ltd. UK	30-0038	1,0 mm OD x 0,78 mm ID, zawierające filament, do mikroiniekcji
Mikromanipulator	Narishige	MWS-2	Trzyosiowy olejowy układ hydrauliczny; do precyzyjnego ruchu 3D podczas wtrysku
Uchwyt do wstrzykiwań	Narishige	1M-H1	Do trzymania igieł iniekcyjnych, cały system wypełniony olejem mineralnym
Strzykawka All Glass Walter	Graf & Co GmbH & Co. KG	Nr 95199.10427A4	10 ml FortunaOptima; wypełniony olejem mineralnym, do precyzyjnego dostrojenia ciśnienia mikroiniekcji
Morfolinos	GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA		Wstrzyknięcie w 0,25-0,5 mM
z czapeczką	mRNA Ambion mMessage zestaw		Wstrzyknięcie w 0,05-0,5 i mikro; g/&mikro; l
Wstrzyknięcie plazmidowego DNA			przy 20 ng / & mikro; l
Zestaw do klonowania rekombinacyjnego	Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen	11789-013
Zestaw do klonowania rekombinacyjnego	Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen	11791-019
anty-HA tag	abcam	ab9110	do immunofluorescencji, użyj 1:400 w 3% BSA / PBT
TRITC kozie przeciwciało anty-królicze	Jackson	111-025-144	do immunofluorescencji użyj 1:300 w 3% BSA/PBT

PBT mMashine przeciwciało