Artykuł metodologiczny

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

DOI:

10.3791/54315

⸱

20 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z czynników ograniczających przyjęcie i rozwój medycyny spersonalizowanej jest niezdolność do opracowania narzędzi diagnostycznych do badania indywidualnych niuansów w ekspresji od pacjenta do pacjenta. Obecne metodologie, które próbują rozdzielić komórki, aby wypełnić tę niszę, powodują zakłócenie ekspresji fizjologicznej, co sprawia, że technika separacji jest bezużyteczna jako narzędzie diagnostyczne. W tym protokole opisujemy funkcjonalizację i optymalizację powierzchni pod kątem wychwytywania i uwalniania komórkowego. Ta funkcjonalizowana powierzchnia integruje biotynylowane przeciwciała ze szklaną powierzchnią funkcjonalizowaną aminosilem (APTES), destiobiotyną i streptawidyną. Uwalnianie komórek jest ułatwione dzięki wprowadzeniu biotyny, która umożliwia zebranie i oczyszczenie komórek uchwyconych przez powierzchnię. Uwalnianie to odbywa się poprzez ukierunkowanie wtórnej cząstki destiobiotyny, co skutkuje znacznie łagodniejszym paradygmatem uwalniania. To zmniejszenie ostrych odczynników i sił ścinających zmniejsza zmiany w ekspresji komórkowej. Funkcjonalizowana powierzchnia wychwytuje do 80% komórek w mieszaninie pojedynczej komórki i wykazała 50% wychwytywania w mieszaninie dwukomórkowej. Badane są zastosowania tej technologii w badaniach nad ksenoprzeszczepami i separacją nowotworów. Opisano również techniki kwantyfikacji do weryfikacji powierzchni, takie jak czytnik płytek i analizy ImageJ.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody separacji komórek metodą laboratoryjną (np. sortowanie komórek aktywowane fluorescencją1, mikro-dysekcja laserowa2, immunomagnetyczna separacja kulek1) mogą zająć kilka godzin przygotowania i sortowania. Te duże skale czasowe mogą wpływać na reakcje fizjologiczne i poziomy ekspresji, co skutkuje analizami, które nie są reprezentatywne dla odpowiedzi fizjologicznej3. Potrzebne są systemy, które mogą szybko i skutecznie izolować określone typy komórek bez zakłócania poziomów receptorów na powierzchni komórki, aby poprawić izolację i wzbogacanie komórek do zastosowań biomedycznych. Dlatego uzasadnieniem dla naszego podejścia jest opracowanie łagodnego podejścia do izolacji komórek.

Koncepcja "laboratorium na chipie" oferuje obietnicę szybszej o rzędy wielkości (od godzin do minut) izolacji komórek, a najczęściej polega na wychwytywaniu komórek na powierzchni i uwalnianiu komórek lub zawartości wewnątrzkomórkowej za pomocą metod fizycznych4,5 lub chemicznych6. Chociaż podejścia te oferują kilka korzyści, takich jak identyfikacja ekspresji białka7,8, identyfikacja ekspresji RNA9-11, a nawet dostarczanie komórek do hodowli in vitro 12,13, wielu z tych technik nie można przełożyć na diagnostykę, taką jak profilowanie receptorów komórkowych, ze względu na ich niefizjologiczne środowisko. Enzymatyczne środki liftingujące, takie jak kolagenazy, mogą również wpływać na te ilości receptorów14,15, co oznacza, że techniki kwantyfikacji receptorów komórkowych, które wykorzystują te środki podnoszące, nie będą generować dokładnych danych fizjologicznych. Liza komórkowa zapobiega różnicowaniu się między natywnymi receptorami powierzchniowymi a tymi, które zostały wcześniej zinternalizowane16. Protokół ten opisuje szybkie i delikatne podejście do izolacji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Czyszczenie powierzchni szkła i przygotowanie odczynników

  1. Umieść szklaną powierzchnię w maszynie plazmowej tlenu na 5 minut przy 50% mocy, aby ją wyczyścić.
  2. Przygotować 2,5 ml 2% odtworzonego (3-aminopropylo) trietoksysilanu (APTES), dodając 50 μl APTES i 2,45 ml etanolu w stożkowej probówce.

2. Funkcjonalność APTES i DSB

  1. Dodaj roztwór APTES na powierzchnie. Pipeta 150 μl na dołek dla płytek 8-dołkowych. Odpipetować 100 μl na studzienkę dla płytek 24-dołkowych. Pipeta 1,1 ml do naczyń szklanych o wymiarach 60 x 15 mm. Przykryj powierzchnie, aby zapobiec parowaniu i nierównomiernemu rozprowadzaniu roztworu APTES. Umieść powierzchnie na wytrząsarce platformowej na 50 minut w temperaturze pokojowej, co spowoduje równomierne rozłożenie warstwy APTES.
    UWAGA: APTES to aminozlan, który tworzy pierwszą warstwę powierzchni. Jeśli używasz innej powierzchni, heurystycznie określ objętość roztworu potrzebną do pokrycia powierzchni.
  2. Wybierz temperaturę piekarnika, gdy powierzchnie znajdują się na shakerze: Podgrzej do 55 °C przez 2 godziny dla płytek 8-dołkowych i płytek 24-dołkowych. Podgrzewaj naczynia szklane do temperatury 90 °C przez 1 godzinę.
  3. Spłucz powierzchnie etanolem.
    1. Podawaj wymaganą ilość etanolu, odnosząc się do użytej powierzchni. Dodaj 150 μl etanolu do każdego dołka na 8 dołków. Dodaj 125 μl etanolu do każdego dołka na 24 płytki. Dodaj 1,1 ml etanolu do szklanych naczyń.
    2. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Spłukać jeszcze dwa razy za pomocą etanolu.
      UWAGA: Jeśli którakolwiek ze szklanych płyt studzienki ma w sobie plastik, nie podgrzewaj jej powyżej 65 °C, ponieważ plastik zacznie się topić i wypaczać.
  4. Suszyć 100% azotem gazowym dozowanym ze zbiornika. Umieść powierzchnie w piekarniku.
  5. Przygotować 2,5 ml roztworu d-destiobiotyny (DSB), łącząc 1,5 mg/ml DSB w 37,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i 5 mg/ml 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) w 2462,5 μl 0,1 M hydratu kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego (MES) (pH 6). Następnie połącz oba rozwiązania.
  6. Dodać 1 μl 2-β merkaptoetanolu po 15 minutach do roztworu, aby wygasić reakcję między DSB i EDC. Wyjmij z piekarnika gorące powierzchnie ze szkła funkcjonalnego APTES. Odczekaj 5-10 minut, aż szklane powierzchnie ostygną.
  7. Dodaj bufor MES do spłukania, używając ilości w zależności od powierzchni. Dodać 150 μl buforu MES do każdej studzienki na 8 płytek dołkowych. Dodać 125 μl buforu MES do każdego dołka na 24 płytki. Dodać 1,1 ml buforu MES do naczyń szklanych.
  8. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Przepłukać jeszcze dwa razy buforem MES.
  9. Nałóż roztwór DSB na powierzchnie, aby umożliwić im inkubację. Dodać 150 μl roztworu DSB na dołek dla 8 płytek dołkowych. Dodać 100 μl roztworu DSB na dołek dla 24 płytek. Dodać 1,1 ml do szklanych naczyń roztworu DSB.
  10. Umieść szklane powierzchnie pokryte DSB na adamp ręcznik papierowy wewnątrz szalki Petriego. Przykryć i inkubować w lodówce o temperaturze 4°C przez 18-24 godziny.

3. Funkcjonalizacja streptawidyny

  1. Opłucz każdą szklaną powierzchnię trzykrotnie 1 ml 1,0x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Rozcieńczyć roztwór podstawowy streptawidyny (SAv) do 0,4 mg/ml (zalecane).
    UWAGA: PBS jest izotoniczny, więc może być stosowany jako pożywka do rozcieńczania i płukania. PBS jest stosowany jako rozpuszczalnik dla SAv, a zatem nie wpływa na zdolność SAv do wiązania się z powierzchnią.
  2. Nanieść 0,4 mg/ml roztworu SAv równomiernie na powierzchnie, tak aby na dnie szklanki utworzyła się cienka warstwa, dobrać ilość roztworu w zależności od powierzchni. W przypadku płytek 8-dołkowych dodać 150 μl 0,4 mg/ml roztworu SAv na dołek. W przypadku płytek 24-dołkowych dodać 100 μl 0,4 mg/ml roztworu SAv na studzienkę. W przypadku naczyń szklanych dodać 1,1 ml 0,4 mg/ml roztworu SAv.
  3. Przykryj i przenieś talerze na szalkę Petriego o średnicy 14 cm, aby zatrzymać wilgoć. Inkubować szalkę Petriego w lodówce przez 18-24 godz.
    UWAGA: Niezbędne jest stosowanie stałych objętości APTES, DSB i SAv na każdej powierzchni.
  4. Przepłukać każdą szklaną powierzchnię trzykrotnie 150 μl PBS w celu usunięcia SAv. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię.
  5. Zwilż ręcznik papierowy wodą dejonizowaną i umieść ręcznik papierowy płasko na 14-centymetrowej szalce Petriego otaczającej talerze, aby zatrzymać wilgoć w studzienkach. Przykryj szalkę Petriego zawierającą studzienki. Inkubować szalkę Petriego w lodówce o temperaturze 4 °C z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1) do momentu, gdy będzie potrzebna.

4. Przechwytywanie i uwalnianie komórek

  1. Rozpocząć od kolby (kolb) T175 komórek przeznaczonych do eksperymentu. Odessać pożywkę z kolby(-ów). Pozostałe podłoże przepłukać 5 ml PBS o temperaturze pokojowej. Odessać PBS z kolby(-i).
  2. Dodać 10 ml nieenzymatycznego środka liftingującego, takiego jak roztwór do dysocjacji komórek, do kolby komórek T-175. Umieścić kolbę w inkubatorze na 6 minut, aby umożliwić wyjęcie komórek z kolby.
  3. Po 6 minutach dodaj 10 ml zimnego roztworu soli Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; Patrz Lista materiałów), aby dezaktywować czynnik podnoszący. Pobrać 20 μl komórek, aby policzyć liczbę komórek w roztworze za pomocą hemacytometru.
    UWAGA: W zależności od funkcjonalizowanych powierzchni użytych w eksperymencie przechwytywania, liczba potrzebnych komórek jest różna. W przypadku funkcjonalizowanych płytek 8-dołkowych należy użyć 300 000 komórek na dołek. W przypadku funkcjonalizowanych naczyń szklanych użyj 1,1 miliona komórek. W przypadku funkcjonalizowanych płytek 24-dołkowych zaleca się 125 000 komórek. Więcej informacji na temat zliczania komórek znajduje się w Suplemencie.
  4. Powtórzyć kroki 4.1-4.3 dla innej kolby komórek, jeśli obecna jest mniejsza liczba komórek niż jest to potrzebne w doświadczeniu. Połącz zawiesiny komórek i ponownie przelicz komórki, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek w roztworze.
  5. Odwirować zawiesinę komórek w wirówce o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad ze skoncentrowanych komórek. Znajdź odpowiednią ilość HBSS, aby dodać ją do zawiesiny komórek, aby uzyskać stężenie 1 x 106 komórek na ml, a następnie odessać supernatant z odwirowanych komórek i dodać obliczoną objętość. Objętość tę można obliczyć za pomocą równań zawartych w suplemencie.
  6. Pipetować w górę i w dół (rozcierać), aby ponownie zawiesić komórki w roztworze i zmniejszyć zlepianie się komórek w roztworze, co może zmniejszyć wiązanie przeciwciał. Podziel roztwór komórkowy na oddzielne roztwory kontrolne i eksperymentalne. Wyświetl plik uzupełniający dla komponentów i obliczeń.
  7. Dodać biotynylowane przeciwciała do odpowiednich roztworów komórkowych zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C na mieszalniku typu "end -over-end.
    UWAGA: W przypadku komórek MCF7GFP zaleca się przeciwciała HLA-ABC 0,5 mg/ml lub 0,5 mg/ml. W przypadku makrofagów RAW zaleca się 1 mg/ml mCD11b w połowie objętości, aby uwzględnić różnice w rozcieńczeniu. W przypadku ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zaleca się 0,5 mg/ml hCD31.
  8. Umyj funkcjonalizowaną powierzchnię szkła za pomocą HBSS. W tym eksperymencie zalecana jest płytka 8-dołkowa.
    1. Dodać 150 μl HBSS do każdego dołka na 8 dołków. Spłucz jeszcze dwa razy za pomocą HBSS. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C.
  9. Dodaj roztwory komórkowe do studzienek i odczekaj 45 minut, aż komórki zaczną inkubować na lodzie na wytrząsarce. Przygotować roztwór biotyny w sterylnym HBSS, używając obliczonych objętości zgodnie z opisem w suplemencie.
  10. Usunąć roztwór komórkowy ze szklanych studzienek za pomocą HBSS.
    1. Delikatnie odpipetować 150 μl HBSS do każdego dołka. Następnie odpipetować HBSS. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię.
    2. Powtórz jeszcze dwa razy. Po umyciu dodaj HBSS do studzienek, aby komórki były mokre.
  11. Dodaj 150 μl 20 mM roztworu biotyny do każdej odpowiedniej studzienki uwalniającej, a następnie odczekaj 20 minut, aby umożliwić reakcję.
  12. Przypomnij sobie niespecyficznie związane komórki, przemywając HBSS, jak wspomniano powyżej, a następnie, jeśli używasz komórek znakowanych fluorescencyjnie, przystąp do obrazowania fluorescencyjnego komórek. Zobrazuj również żywe komórki w kolbie (jako kontrolę, aby porównać z komórkami w studzience). W przypadku stosowania komórek transfekowanych białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wzbudzenie wyniesie 470 nm, a emisja 515 nm.

5. Optymalizacja przeciwciał: Miareczkowanie przeciwciał

  1. Zacznij od wyjęcia komórek z kolby T75 lub T175, jak wyjaśniono w kroku 4.1- 4.3.
    UWAGA: Objętości te są skalibrowane dla płytek 24-dołkowych, ale można je zmienić, aby dopasować je do dowolnych powierzchni funkcjonalizowanych szkłem za pomocą testów heurystycznych. Reprezentatywne miareczkowanie przeciwciał przedstawiono na rysunku 1.
  2. Policzyć komórki za pomocą hemekytometru, a następnie odwirować roztwór komórek w stożkowej probówce o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić komórki do 1 miliona komórek na ml, korzystając z obliczeń opisanych w suplemencie.
  3. Podzielić 1 milion komórek na ml roztworu na sześć różnych roztworów po 500 μl w różnych probówkach wirówkowych do roztworów przeciwciał (Ab).
    1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy przeciwciała do 10 μg/ml, 1 μg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml. Utworzyć kontrole, używając 100 μl buforu barwnikowego (PBS + 1% azydek sodu + 1% BSA) i 500 μl komórek do kontroli bez Ab. Do ślepej próby kontrolnej (brak Ab i brak komórek) należy użyć roztworu 300 μl PBS.
      UWAGA: UWAGA: Azydek sodu jest niezwykle toksyczny, wybuchowy i należy zachować szczególną ostrożność podczas jego używania. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) i stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego.
  4. Połączyć i inkubować roztwory Ab z roztworami komórkowymi w mieszalniku typu end-over-end w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przepłukać funkcjonalizowane płytki 24-dołkowe trzykrotnie HBSS. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię.
  5. Porcję 125 μl każdego roztworu próbki do odpowiednich dobrze funkcjonalizowanych APTES, DSB i SAv. Inkubować w temperaturze 4 °C lub na lodzie przez 45 minut na szklanej powierzchni. Spłucz powierzchnię HBSS trzy razy, aby usunąć niespecyficznie przyczepione komórki. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. NIE płucz dolnego rzędu, ponieważ są to elementy sterujące.
  6. Dodać 150 μl HBSS do każdej umytej studzienki, umieścić 24-dołkowe płytki na lodzie, a następnie użyć czytnika płytek do pomiaru fluorescencji komórek GFP (wzbudzenie 485 nm / emisja 528 nm) .

6. Optymalizacja komórek: Miareczkowanie komórek

  1. Podnieś ogniwa, jak wspomniano w krokach 4.1 -4.3.
  2. Policz komórki za pomocą hemekytometru. Odwirować roztwór komórek w stożkowej probówce o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić komórki do 1 miliona komórek na ml.
    UWAGA: Więcej informacji na temat stosowania hemacytometru można znaleźć w Suplemencie.
  3. Odpipetować 1,6 ml z roztworu komórkowego dla 1,6 miliona komórek i umieścić w stożkowej probówce. Pobrać pipetą 800 μl komórek z roztworu komórkowego na 800 000 komórek i umieścić w stożkowej probówce. Odpipetować 80 μl z puli komórek dla 80 000 komórek i umieścić w stożkowej probówce. Odpipetować 8 μl z puli na 8 000 komórek i umieścić w stożkowej probówce.
    UWAGA: Stężenia są podane dla pomiarów na płytce 8-dołkowej, powtórzyć w razie potrzeby. Przykład wyjścia płyty pokazano na rysunku 2.
  4. Pobrać cztery roztwory podstawowe i wirować w wirówce o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić wszystkie roztwory podstawowe w 400 μl HBSS.
  5. Dodać 1,6 μl przeciwciała 100 ng/ml do 1,6 miliona komórek, 0,8 μl do 800 000 komórek i 0,5 μl do wszystkich innych zapasów. Inkubować przeciwciało przez 30 minut w mieszalniku typu end-of-end przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć funkcjonalizowaną powierzchnię szkła trzykrotnie HBSS.
    UWAGA: Funkcjonalizowana płytka 8-dołkowa jest zalecana do ilościowego oznaczania pod mikroskopem, podczas gdy funkcjonalizowana płytka 24-dołkowa jest zalecana do ilościowego oznaczania czytnika płytek. Stężenie przeciwciał dla 8000 komórek nie zostało zmniejszone, aby czynnikiem ograniczającym powierzchnię wychwytywania nie był brak przeciwciał w roztworze, ale raczej właściwości wychwytywania powierzchni.
  6. Nanieść 150 μl roztworów próbek do każdej studzienki. Zastosuj 1,6 miliona komórek do pierwszej kolumny studzienek po lewej stronie. Zastosuj zasób 800 000 komórek do drugiej kolumny od lewej. Zastosuj zasób 80 000 komórek do trzeciej kolumny od lewej. Na koniec zastosuj zasób 8 000 komórek do ostatniej kolumny. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
    UWAGA: Zapas 1,6 miliona komórek służy jako najwyższe stężenie do przetestowania i jest dwukrotnie większą ilością komórek, która jest zwykle używana w eksperymentach separacji komórek (600 000 komórek na studzienkę) Zapas 800 000 komórek służy jako kontrola eksperymentu, ponieważ jest to typowe stężenie komórkowe, które jest używane w eksperymentach separacji komórek (3 000 000 komórek na studzienkę). Zapas 80 000 komórek służy jako dziesięciokrotne rozcieńczenie do testowania niższych stężeń do wychwytywania komórek (30 000 komórek na studzienkę). Zapas 8000 komórek służy jako stukrotne rozcieńczenie do użycia jako test sprawdzający dolną granicę separacji komórkowej (3000 komórek na studzienkę).
  7. Spłucz HBSS trzy razy. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Zbierz wszystkie prania.
  8. Zobrazować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, w przypadku użycia płytek 8-dołkowych wykonać zdjęcia każdej powierzchni i nałożyć 150 μl biotyny na każdą powierzchnię przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. Po godzinie spłucz studzienki uwalniające biotynę HBSS 3 razy, tak jak poprzednio. Zbierz wszystkie popłuczyny ze studzienek do zliczenia za pomocą hemocytometru i zobrazuj studzienki uwalniające.
  9. Nałożyć 150 μl 20 mM nadmiaru roztworu biotyny do odpowiednich studzienek uwalniających biotynę na 1 godzinę, jeśli używasz płytek 24-dołkowych, a następnie przepłukać te studzienki 3 razy HBSS. Określić ilościowo płytki 24-dołkowe za pomocą czytnika płytek. Użyj hemytometru, aby policzyć komórki ze wszystkich zebranych dobrze popłuczeń.

7. Analiza obrazu

Uwaga: Pakiet oprogramowania FIJI (http://fiji.sc/Fiji) jest zalecany do analizy obrazu. Początkowo obrazy zostały przekonwertowane na obraz w skali szarości, a następnie jasność/kontrast został zmieniony, aby wydobyć komórki.

  1. Załaduj obraz i przekonwertuj go na skalę szarości, klikając kartę obrazu, a następnie przewijając w dół do "Typ", a następnie klikając "8 bitów".
  2. Zwiększ kontrast obrazu, klikając kartę obrazu, a następnie przewijając do "Dostosuj". Kliknij "Jasność i kontrast", a następnie użyj pasków przewijania, aby wyróżnić komórki. Jeśli używasz obrazów fluorescencyjnych, odwróć obrazy, aby komórki były bardziej zdefiniowane.
  3. Załaduj wtyczkę do ImageJ o nazwie ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html), aby przeanalizować obrazy.
  4. Otwórz plik ITCN. Gdy pojawi się okno dialogowe, w którym użytkownik z kilkoma parametrami monituje o oszacowanie rozmiaru komórki, najpierw ustaw minimalną szerokość interesującej go komórki. Kliknij opcję "Wykryj ciemne szczyty", jeśli obraz jest fluorescencyjny, a komórki są przyciemnione.
  5. Początkowo ustaw wartość progową na 2, a następnie naciśnij przycisk "Policz". Pojawi się nowo policzona wersja obrazu z czerwonymi kropkami wyznaczającymi miejsca, w których zostały policzone komórki.
  6. Dostosuj parametr progu i szerokości, aby uzyskać dokładniejsze dane komórkowe, definiując rozmiar "komórki". Uwaga: Liczba zliczonych komórek będzie wyświetlana w oknie dialogowym po prawej stronie. Zmiana parametrów da różną liczbę zliczonych komórek.
  7. Kontynuuj iterację po parametrach progu i szerokości, aż zostanie osiągnięte prawidłowe oszacowanie liczby komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, pokazujemy przechwytywanie komórek (Rysunek 3A) i uwalnianie komórek (Rysunek 3C) komórek MCF7GFP, jak również kontrolę żywych komórek (Rysunek 4). Określiliśmy ilościowo wychwytywanie komórek, gdy 60% i 80% zostało uwolnionych (Figura 3C). Kiedy rozszerzyliśmy to podejście na mieszaninę makrofagów RAW 264.7 i komórek MCF7GFP, 50% makrofagów RAW zostało wychwyconych (Fig. 3D)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulepszenia w technikach izolacji komórek naprzód badania naukowe nad relacjami struktura-funkcja w neurobiologii18, programowaniem komórek macierzystych w biologii regeneracyjnej i sygnalizacją angiogenną w biologii naczyniowej19. Rzeczywiście, pierwotna hodowla komórkowa20 (np. HUVEC) w biologii naczyniowej odbywa się głównie poprzez zastosowanie technik izolacji komórek. Izolacja komórek została również niedawno wykorzystana do analizy cytometrii ilościowej przepływu (qFlow) re...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować American Cancer Society, Illinois Division (282802) oraz National Science Foundation CBET (1512598) za wsparcie finansowe. Chcielibyśmy również podziękować dr Dianwen Zhang z University of Illinois Beckman Institute za szkolenie z mikroskopii. Na koniec chcielibyśmy podziękować Jaredowi Weddellowi, Stacie Chen i Spencerowi Mamerowi za wnikliwe dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTES)Acros Organics919-30-2Służy do wytwarzania 2% roztworu APTES
Środek do czyszczenia plazmowego PicoDienerModel 1Czyści powierzchnie i pozwala na wiązanie PDMS ze szkłem
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Stosowany jako mechanizm uwalniający w powierzchni wychwytu komórkowego. 
dimetylosulfotlenek (DMSO)Brytyjskie domy leków (BDH)BDH1115-1LPRozpuszcza DSB w roztworze
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Aktywuje kwasy karboksylowe i umożliwia wiązanie białek z powierzchnią szkła.
niepowlekane 8-dołkowe szkiełko hodowlaneBD FalconOpakowanie 24 szt.: 354118
Opakowanie 96: 354108		Używany w eksperymentach komórkowych z udziałem mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss, takich jak początkowe eksperymenty ilościowe wychwytywania i uwalniania
Płytki 24-dołkowe ze szklanym dnemMatTekP24G-0-13-FUżywany w eksperymentach komórkowych z udziałem czytnika płytek, takich jak eksperymenty z przeciwciałami i miareczkowaniem komórkowym
MerkaptoetanolScience Lab60-24-2Służy do wygaszania reakcji między EDC a DSB
Hydrat kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego
(Hydrat MES 99%)		Fisher ScientificAC172590250Służy do wytwarzania 0,1 M buforu MES do stosowania w reakcji EDC
Piec precyzyjnyThermo Scientific11-475-153Stosowany do utwardzania warstwy PDMS i APTES.
Wytrząsarka Titramax 1000Heidolph13-889-420Służy do zapewnienia równomiernego rozprowadzania APTES na powierzchniach.
1x Streptawidyna 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Białko wiążące biotynę. Może powodować podrażnienie.
Naczynie szklane 5 cmFisher Scientific08748AUżywane w badaniach HUVEC, a także w przyszłych badaniach profilowania.
14 cm szalka Petriego z pokrywąSigma-AldrichZ717231Służy do przechowywania funkcjonalizowanych próbek i ich transportu.
Komórki MCF7-GFPCell BiolabsAKR211Przechowywane w ciekłym azocie
RAW264.7 makrofagi myszyATCCTIB-71Podarowane nam przez laboratorium Smith na Uniwersytecie Illinois. Przechowywany w ciekłym azocie.
TrypLELife Technologies12605036Przechowywany w 100 ml w temperaturze pokojowej
Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle mediumCell Media Facility w School of Chemical Sciences w UIUC50003PCDostawca: Corning
Nonessential aminoacidsCell Media Facility w School of Chemical Sciences w UIUC25-025-CIJuż dodany do DMEM przez obiekt. Dostawca: Corning.
Skrobak do komórekFisher Scientific12-565-58Mały 23 cm 50 sztuk
Roztwór do dysocjacji komórekCorningMT-25-056CISłuży do nieenzymatycznego podnoszenia komórek do stosowania w eksperymentach komórkowych
HemacytometrHausser02-671-54Służy do liczenia komórek w celu ilościowego oznaczania roztworów komórkowych oraz skuteczności wychwytywania i uwalniania.
BiotynaAmresco58-85-5Służy do uwalniania komórek z powierzchni.
HBSSUtworzony na podstawie recepturyNie dotyczySłuży do utrzymywania komórek przy życiu w zawiesinie, a także do mycia powierzchni o niespecyficznym wiązaniu. Na podstawie protokołów Cold Spring Harbor: In 500  ML, użyj 4  g NaCl, 0,2  g KCl, 0.0402  g Na2PO4• 7H2O, 0.03  g KH2PO4 oraz 0,5  g glukozy. Dodaj wodę DI, aby się dostać do  500 ml, przefiltrować, a następnie wstawić do lodówki.
Przeciwciało HLA-ABCBioLegend311402Przeciwciało używane do wychwytywania komórek MCF7gfp
Przeciwciało hIgGBioLegendHP6017Przeciwciało używane do wychwytywania komórek MCF7gfp
Komórki MCF7 GFPCell BiolabsAKR-211Linia Luminal Breast Cancer, która została transfekowana zielonym białkiem fluorescencyjnym.
Assorted ConicalsThermo-Scientific15mL: 12-565-26850/15 ml plastikowe stożki do przechowywania roztworów i podwielokrotności.
Rotatory mini-rurek (mikser end over end)Fisher Scientific05-450-127Służy do inkubacji przeciwciał i mieszania innych roztworów komórkowych w celu wymieszania
Axiovert 200M (mikroskop fluorescencyjny)ZeissN/AMikroskop odwrócony fluorescencji Zeiss Axiovert 200 M.
Kolumny odsalające ZebaThermo-ScientificPI-87770Służy do oczyszczania nowo biotynylowanych przeciwciał po użyciu zestawu do biotynylacji. Instrukcje znajdują się pod adresem: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo-ScientificSłuży do biotynylacji przeciwciał, aby umożliwić ich integrację z powierzchnią wychwytywania
Czytnik płytekBioTekSynergy HTX Multimode ReaderSłuży do ilościowego pomiaru intensywności fluorescencji w eksperymentach miareczkowych.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791(2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glass Surface FunctionalizationCell Capture ReleaseBiotinylated AntibodiesDesthiobiotin StreptavidinAPTES Surface TreatmentCell Isolation MethodFluorescence Imaging AnalysisFlow Cytometry DownstreamTumor Angiogenesis ScreeningPersonalized Medicine Diagnostics

Powiązane artykuły