Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Podsumowanie

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Streszczenie

Rak trzustki pozostaje jednym z nowotworów, dla których przeżywalność nie poprawiła się znacząco w ciągu ostatnich kilku dekad. Tylko 7% zdiagnozowanych pacjentów przeżyje dłużej niż pięć lat. Aby zrozumieć i naśladować mikrośrodowisko guzów trzustki, wykorzystaliśmy mysi ortotopowy model raka trzustki, który umożliwia nieinwazyjne obrazowanie progresji guza w czasie rzeczywistym. Komórki raka trzustki wykazujące ekspresję białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) zawieszono w macierzy błony podstawnej o wysokim stężeniu (np. Matrigel HC) z pożywką wolną od surowicy, a następnie wstrzyknięto do ogona trzustki za pomocą laparotomii. Zawiesina komórkowa w macierzy błony podstawnej o wysokim stężeniu staje się substancją żelową po osiągnięciu temperatury pokojowej; Dlatego żeluje się w kontakcie z trzustką, tworząc uszczelnienie w miejscu wstrzyknięcia i zapobiegając wyciekom komórek. Wzrost guza i przerzuty do innych narządów są monitorowane u żywych zwierząt za pomocą fluorescencji. Bardzo ważne jest stosowanie odpowiednich filtrów do wzbudzenia i emisji GFP. Etapy implantacji ortotopowej są szczegółowo opisane w tym artykule, dzięki czemu naukowcy mogą łatwo odtworzyć procedurę na nagich myszach. Głównymi etapami tego protokołu są przygotowanie zawiesiny komórek, implantacja chirurgiczna i obrazowanie fluorescencyjne całego ciała in vivo. Ten model ortotopowy ma na celu zbadanie skuteczności nowych terapii w przypadku guzów pierwotnych i przerzutowych.

Wprowadzenie

Rak trzustki jest diagnozowany częściej w porównaniu z innymi nowotworami i jest^{czwartą najczęstszą} przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Od momentu postawienia diagnozy ponad 90% pacjentów umiera w ciągu pięciu lat ^1,2. Obecnie chirurgiczne usunięcie guza jest jedynym lekarstwem na raka trzustki, ale mniej niż 20% pacjentów kwalifikuje się do poddania się operacji, głównie dlatego, że w momencie rozpoznania choroba jest w zaawansowanym stadium i ma przerzuty ^3,4. Brak specyficznych objawów sprawia, że rak trzustki jest cichą chorobą; Niektóre z objawów to ból brzucha, ból pleców, utrata apetytu, żółtaczka i nudności; które można łatwo zinterpretować jako powszechne choroby układu pokarmowego ⁴. Z tego powodu ważne jest opracowanie nowych narzędzi farmakologicznych, które pomogą w diagnozowaniu i leczeniu raka trzustki.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych pozwala nam zrozumieć biologię raka trzustki i daje wgląd w zastosowanie tej wiedzy u ludzi. Ortotopowe modele ksenoprzeszczepu raka trzustki są realistyczne, ponieważ guzy rosną w narządzie pochodzenia ⁵. W przeciwieństwie do modeli heterotopowych, w których linie komórkowe lub fragmenty guza są wszczepiane podskórnie, modelowanie ortotopowe pozwala na odtworzenie mikrośrodowiska guza i naśladuje interakcję komórek nowotworowych z otoczeniem ⁶. Opisany tutaj model ksenoprzeszczepu wywodzi guzy z ludzkiej linii komórkowej raka trzustki PANC-1 GFP, która jest genetycznie modyfikowana do ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP). Wykrywanie GFP umożliwia nieinwazyjne obrazowanie i monitorowanie wzrostu guza i przerzutów ⁷. Rozwój guza następuje szybko, spontanicznie i bardzo przypomina rozwój guzów pierwotnych u pacjentów z rakiem trzustki ⁸. Modele ortotopowe zapewniają dokładniejsze przewidywanie skuteczności leku w odpowiedzi na środki terapeutyczne, naśladując jednocześnie mikrośrodowisko guza.

Jak wspomniano powyżej, ten model zwierzęcy umożliwia fluorescencyjne wykrywanie wzrostu guza i przerzutów w czasie rzeczywistym. Detekcja fluorescencyjna pozwala na bardziej bezpośrednie/żywe obrazowanie w porównaniu z luminescencją. W przypadku fluorescencji emitowane światło jest wynikiem wzbudzenia przez inne światło o krótszej długości fali; Natomiast w przypadku luminescencji emitowane światło jest wynikiem reakcji chemicznej i może nie mieć silnej emisji⁹. Co więcej, obrazowanie fluorescencyjne całego ciała in vivo nie jest szkodliwe dla zwierzęcia i pozwala naukowcom monitorować wzrost guza w czasie w odpowiedzi na leczenie terapeutyczne.

Protokół

Protokół opisany poniżej jest realizowany pod nadzorem i aprobatą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zachodniego. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi.

1. Hodowla komórkowa

1. Przygotowanie kompletnego podłoża
   1. Korzystając z komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II, przygotuj kompletną pożywkę, aseptycznie dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) i streptomycynę penicylinową (P/S) do 500 ml butelki pożywki RPMI. Delikatnie wymieszaj, mieszając. Końcowe stężenie każdego suplementu wynosi 10% FBS i 1% P/S (v/v). Na przykład uzupełnij 500 ml pożywki 56 ml FBS i 6 ml P/S.
   2. Umieścić kompletną pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Komórki rozmrażające i rozmnażające
   1. Pobierz ogniwa PANC-1 GFP z ciekłego azotu. Rozmrozić fiolkę przez delikatne mieszanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Rozmrażanie powinno być szybkie (około 2 - 3 minuty).
   2. Kolby T-75 należy oznaczyć (a) nazwą linii komórkowej, (b) numerem przejścia, (c) datą i (d) inicjałami badacza.
   3. Przetrzeć fiolkę 70% etanolem i przenieść fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
   4. Aby rozmnożyć komórki, dodać 9,0 ml kompletnej pożywki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Za pomocą pipety o pojemności 1,0 ml ostrożnie przenieść zawiesinę komórek i zawiesić ją w 9 ml kompletnego podłoża.
   5. Wirować przy 125 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść stożkową fiolkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i zassać supernatant bez naruszania osadu.
   6. Zawiesić osad w 10 ml świeżej, kompletnej pożywki, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół.
   7. Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść je w kolbach T-75 o gęstości 2,1 x 10⁶ komórek/kolbę. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   8. Monitoruj komórki codziennie wzrokiem i pod mikroskopem. Jeśli konieczne jest odnowienie płynu, należy w asepcie odessać całą pożywkę wzrostową z kolby i wyrzucić. Dodać równą objętość świeżego, kompletnego podłoża.
3. Rozmnażanie komórek
   1. Usunąć pożywkę z kolby w sposób aseptywny. Dodać 5 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (DPBS) firmy Dulbecco, aby wypłukać komórki i wyrzucić.
   2. Oderwać komórki od kolby, dodając 3 ml 0,25% trypsyny. Inkubować kolbę zawierającą trypsynę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 5–10 minut.
   3. Obserwuj komórki pod mikroskopem (10-krotne powiększenie) i upewnij się, że są okrągłe i przemieszczone.
   4. Zneutralizuj trypsynę, dodając równą objętość kompletnego podłoża i rozbij grudki, delikatnie pipetując w górę iw dół.
   5. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przenieść odpowiednią objętość zawiesiny komórek do nowych kolb o gęstości komórek podanej w ppkt 1.2.7; dodać tyle świeżej pożywki, aby końcowa objętość wynosiła 10 ml na kolbę.
4. Preparat zawiesiny komórek do wstrzykiwań
   Uwaga: Ponieważ matryca błony podstawnej, o wysokim stężeniu, krzepnie w temperaturze pokojowej, wszystkie materiały należy utrzymywać na lodzie. Wszystkie sterylne końcówki i fiolki do pipet należy umieścić na noc w zamrażarce i przechowywać na lodzie podczas pracy z zawiesiną.
   1. Trzymaj butelkę z pożywką RPMI bez żadnych dodatków na lodzie. Rozmrozić matrycę błony podstawnej o wysokim stężeniu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Najlepiej porcjować do mniejszych fiolek, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania ¹⁰.
   2. Odessać pożywkę ze wszystkich kolb i przepłukać 5 ml DPBS. Powtórz wszystkie kroki opisane w poprzedniej sekcji, aż do kroku 1.3.4.
   3. Przenieść zawartość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 125 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść stożkową fiolkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i ponownie zawiesić osad przy użyciu 10 ml DPBS.
   4. Delikatnie odpipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić granulki. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
   5. Ponownie odwirować zgodnie z opisem w kroku 1.4.3. Odessać supernatant i w zależności od liczby komórek dodać odpowiedni rozcieńczalnik, aby uzyskać 3 x 10⁶ komórek w objętości 50 μl. Rozcieńczalnik będzie mieszaniną pożywki wolnej od surowicy i membrany macierzystej o wysokim stężeniu w stosunku 1:1 (v/v).
   6. Delikatnie wymieszaj zawieszenie i utrzymuj je na lodzie przez cały czas. Zawiesina jest teraz gotowa do wstrzyknięcia.
5. Implantacja chirurgiczna
   Uwaga: Upewnij się, że wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne są sterylne. Przez cały czas stosuj techniki aseptyki.
   1. Połóż poduszkę grzewczą na stole i przykryj sterylną zasłoną. Ustaw aparat do znieczulenia i upewnij się, że wszystkie materiały są w zasięgu ręki.
   2. Umieść pysk zwierzęcia w masce anestezjologicznej i ustaw znieczulenie na 1 l/min tlenu i 2,5% izofluranu.
   3. Delikatnie wyszoruj bok zwierzęcia jodem i spłucz 70% etanolem. Powtórz trzy razy.
   4. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, szczypiąc tylną łapę. Zwierzę jest w pełni znieczulone i gotowe do operacji, jeśli nie zaobserwuje się żadnej odpowiedzi. Jeśli jednak zwierzę się wzdrygnie, upewnij się, że w waporyzatorze jest wystarczająca ilość znieczulenia i daj zwierzęciu więcej czasu na całkowite znieczulenie.
   5. Załadować około 200 μl zawiesiny komórek do strzykawki o pojemności 1,0 ml z igłą 18 G (uprzednio schłodzoną). Zastąp igłę igłą 27 G i wróć do lodu, aż będzie gotowa do użycia.
   6. Zlokalizuj ogólny obszar śledziony (lewy górny kwadrant brzucha) i za pomocą kleszczy uszczypnij skórę na szczycie tego obszaru. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości około 1,0 cm, aby utworzyć kieszonkę. Podobnie uszczypnij mięśnie gładkie na szczycie śledziony i przetnij, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.
   7. Delikatnie chwyć ogonowy koniec śledziony i wyciągnij go z ciała. Trzustka zostanie przyczepiona do śledziony. Rozłóż trzustkę za pomocą mokrej, sterylnej końcówki higienicznej i zlokalizuj ogon trzustki.
   8. Wstrzyknąć 50 μl do końcówki trzustki, pozostawić igłę w środku na 10 sekund i powoli obrócić igłę z trzustki. Udana implantacja będzie wyglądała jak powierzchowna bańka bez żadnych przecieków.
   9. Wróć trzustkę i śledzionę do jamy otrzewnej. Najpierw obejmij mięsień, a następnie osobno obejmij skórę. Użyj szwu lub zszywki 6-0, aby zamknąć nacięcie. Aby uniknąć bólu u zwierzęcia, podawaj ketoprofen podskórnie (SC) (5 mg/kg) przez 24 godziny. Alternatywnie, buprenorfinę podskórnie (0,05 - 0,1 mg/kg) należy podawać co 12 godzin przez okres 36 godzin.
   10. Odzyskaj zwierzę ze znieczulenia i włóż je z powrotem do klatki. Monitoruj również ból. Zwierzęta muszą mieć zapewnioną ulgę w bólu w czasie (lub nawet przed – prewencyjnym) zabiegiem chirurgicznym. Zwierzętom, które odczuwają ból, należy zapewnić dodatkową ulgę w bólu zgodnie z protokołem IACCUC lub zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii lub osoby wyznaczonej.
6. Obrazowanie in vivo
   Uwaga: Przechwytywanie obrazu zostało wykonane przy użyciu komercyjnego systemu obrazowania wyposażonego w ciemną komorę i odpowiednie filtry do obrazowania GFP. Akwizycja obrazu została zrealizowana za pomocą kamery CCD oraz układu optycznego składającego się z wymiennych soczewek wzbudzających/emisyjnych (wzbudzenie: 455 - 495 nm; emisja: 513 - 557 nm). Obrazy w jasnym polu zostały wykonane bez filtra przy binningu 1 x 1 dla każdego punktu czasowego. Wzbudzenie GFP wykorzystało ksenonowe wielospektralne źródło światła. Zwierzęta utrzymywano w znieczuleniu przez cały proces obrazowania poprzez podłączenie aparatu do znieczulenia gazowego kolektora zintegrowanego z ciemną komorą systemu obrazowania.
   1. Znieczulić zwierzę w sposób opisany w ppkt 1.5.2. Maska anestezjologiczna znajduje się we wnętrzu ciemnej komory komercyjnego systemu obrazowania, aby utrzymać zwierzę pod narkozą podczas procesu obrazowania.
   2. Ustaw odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji.
   3. Zacznij od uzyskania początkowego obrazu przy użyciu samego światła białego. Utrzymuj tę samą pozycję zwierzęcia przez całą sesję obrazowania i przełącz się na filtry GFP, aby wykonać drugie zdjęcie.
   4. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nałóż na siebie oba obrazy. Przeanalizuj obraz pod kątem obszaru i intensywności fluorescencji.

Wyniki

Metoda ta opisuje chirurgiczną implantację ortotopową fluorescencyjnych ludzkich komórek raka trzustki, koncentrując się na przygotowaniu zawiesiny komórkowej do iniekcji, odpowiedniej anestezji gryzoni, podaniu zawiesiny komórkowej poprzez laparotomię oraz zastosowaniu fluorescencyjnego obrazowania in vivo małych zwierząt. Wykrycie sygnału zielonej fluorescencji (sygnału GFP) od dwóch do trzech tygodni po implantacji dostarcza badaczom wizualnej wskazówki potwierdzającej obecnoś...

Dyskusja

Opisujemy ortotopowy mysi model raka trzustki, który wyraża GFP, umożliwiając w ten sposób nieinwazyjne monitorowanie wzrostu guza za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo całego ciała (ryc. 1). Ta technika pozwala nam monitorować rozwój guza w czasie rzeczywistym (ryc. 3); Może to być ważne narzędzie dla naukowców do badania skuteczności terapeutycznej nowych środków przeciwko rakowi trzustki. Innym ważnym aspektem tego modelu jest to, że fluorescencja GFP zapewnia wizua...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Surowica bydlęca płodu	Gibco	10437-077
Penicylina Streptomycyna	Thermo Ficher Sci	15140-122
Membrana podstawna Matrigel HC, wysokie stężenie	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare lub spieniony antyseptyczny żel do dezynfekcji rąk	Steris	639680
DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dubelcco)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB 27 G 1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Nożyczki chirurgiczne, 5,5" prosty majonez	Henry Schein	22-1600
Linia komórkowa PANC-1 GFP	Anticancer, Inc
System obrazowania małych zwierząt: iBox Scientia	UVP, LLC. Upland, Kalifornia.		System obrazowania małych zwierząt do obserwacji guza fluorescencyjnego u żywych zwierząt

Strzykawka