Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

DOI:

10.3791/54342

⸱

12 sierpnia 2016

 ,  , 
1Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dodanie znacznika do białka to potężny sposób na uzyskanie wglądu w jego funkcję. W tym miejscu opisujemy protokół endogennego znakowania setek białek Trypanosoma brucei równolegle, tak aby możliwe było znakowanie skali genomu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulepszenia w spektrometrii mas, sekwencjonowaniu i bioinformatyce wygenerowały duże zbiory danych potencjalnie interesujących genów. Znakowanie tych białek może dać wgląd w ich funkcję, określając ich lokalizację w komórce i umożliwiając identyfikację partnera interakcji. Niedawno opublikowaliśmy szybką i skalowalną metodę generowania linii komórkowych Trypanosoma brucei, które wyrażają znakowane białko z endogennego locus. Metoda opierała się na wygenerowanym przez nas plazmidzie, który w połączeniu z PCR z długimi starterami może być wykorzystany do modyfikacji genu w celu zakodowania białka znakowanego na obu końcach. Pozwala to na równoległe znakowanie dziesiątek białek trypanosomów, co ułatwia walidację na dużą skalę genów kandydujących. System ten może być używany do znakowania białek w celu lokalizacji (przy użyciu białka fluorescencyjnego, znacznika epitopu lub znacznika mikroskopii elektronowej) lub biochemii (przy użyciu znaczników do oczyszczania, takich jak znacznik TAP (tandemowe oczyszczanie powinowactwa). W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania długiego startera PCR i elektroporacji na płytkach 96-dołkowych, z odzyskiem i selekcją transgenicznych trypanosomów zachodzących na płytkach 24-dołkowych. Dzięki takiemu przepływowi pracy setki białek mogą być znakowane równolegle; Jest to ulepszenie o rząd wielkości w stosunku do naszego poprzedniego protokołu, a znakowanie w skali genomu jest teraz możliwe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trypanosoma brucei to pasożyt pierwotniak, który powoduje u bydła ludzką afrykańską trypanosomasis i nagana. T. brucei jest idealnym organizmem do analizy funkcji białek ze względu na połączenie wysokiej jakości genomu, licznych zbiorów danych proteomicznych i transkryptomicznych oraz dobrze rozwiniętych narzędzi molekularnych 1-3. Postępy w proteomice i sekwencjonowaniu zaowocowały powstaniem dużych zbiorów danych, które podkreślają potencjalnie interesujące geny 4-6; Jednak wiele genów ma minimalną ilość informacji związanych z nimi w istniejących bazach danych. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania metody wysokoprzepustowej, która wspomoże charakterystykę funkcjonalną białek.

Wyrażenie oznaczonego białka może dostarczyć wielu informacji na temat funkcji białka. Na przykład białko oznaczone białkiem fluorescencyjnym lub epitopem można zlokalizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, która dostarcza informacji o tym, gdzie białko może wywierać swój efekt biologiczny. Alternatywnie, białko oznaczone znacznikiem TAP 7, HaloTag 8 lub His może zostać oczyszczone w celu przeprowadzenia testów biochemicznych i identyfikacji jego partnerów w interakcji.

Niedawno opracowaliśmy solidną metodologię tagowania dla T. brucei 9. W ten sposób wykorzystano PCR z długimi starterami do wygenerowania DNA do transfekcji i umożliwiono równoległe znakowanie dziesiątek białek – co stanowi znaczne ulepszenie istniejących protokołów. Poprawiliśmy teraz skalowalność tego protokołu w formach procyklicznych o rząd wielkości. Tutaj przedstawiamy naszą metodę, w której przeprowadzamy PCR i transfekcję na płytki 96-dołkowe, przy czym odzysk i selekcja zachodzą na płytkach 24-dołkowych. Ponieważ setki białek mogą być teraz znakowane równolegle, metoda ta zapewnia opłacalną i wykonalną metodę znakowania całego genomu trypanosomu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 96-dołkowy Long Primer PCR

  1. Wstępnie zamrozić 96-dołkową chłodziarkę PCR w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  2. W probówce o pojemności 10 ml przygotuj Master Mix A: 2 100 μl ddH2O, 105 μl DMSO klasy PCR, 105 μl 10 mM dNTP, 105 μl szablonu pPOT (25 ng/μl) 9, co daje całkowitą objętość 2 415 μl na płytkę.
  3. Podwielokrotność 23 μl do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR.
  4. Dodać 2 μl 100 μM zbiorczych starterów do każdego załadowanego dołka za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P20. Uszczelnić folią, umieścić płytkę na wstępnie schłodzonej chłodziarce do PCR i pozostawić do zamrożenia na co najmniej 20 minut w temperaturze -80 °C.
  5. W probówce o pojemności 10 ml przygotować Master Mix B: 2,048 μl ddH2O, 525 μl 10x buforu, 52,5 μl polimerazy o całkowitej objętości 2,626 μl na płytkę.
  6. Wyjmij płytkę i chłodziarkę do PCR z zamrażarki w temperaturze -80 °C.
  7. Trzymając płytkę nadal w chłodnicy PCR, dodaj 25 μl Master Mix B na wierzch zamrożonej Master Mix A, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 50 μl. Ma to kluczowe znaczenie czasowe i powinno zostać zakończone, zanim mieszanka A będzie mogła się rozmrozić. Płyta uszczelniająca z folią.
  8. Ustaw termocykler w następujący sposób: 94 °C na 10 minut, następnie 30 cykli 94 °C przez 15 sekund, 65 °C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty, a następnie końcowy okres przedłużenia 72 °C przez 7 minut.
  9. Załadować płytkę PCR po osiągnięciu przez blok temperatury 94 °C.

2. Walidacja 96-dołkowego długiego PCR startera

  1. Odlej duży 1% (w/v) żel agarozowy w buforze biegowym Tris Acetate EDTA (TAE) z 4 x 28-dołkowymi grzebieniami, aby uzyskać żel z 4 rzędami dołków. Dopasuj naprzemienne zęby grzebienia do końcówek 12-kanałowej pipety wielokanałowej. Ostrożnie zanurz żel w buforze do pracy TAE po załadowaniu pasów.
  2. Załaduj drabinkę DNA o pojemności 1 kb do 1. i 28. dołka w każdym rzędzie.
  3. Za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P20 przenieś 2 μl produktu PCR bezpośrednio na każdą linię żelu (rysunek 1A). Zrób to szybko, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia amplikonów.
    1. Załadować produkty PCR z rzędu A płytki PCR na nieparzyste ponumerowane pasy 1. rzędu żelu (A1 - tor 3, A2 - tor 5 ...... A11 - tor 23, A12 - tor 25) i załadować produkty PCR z rzędu B płytki PCR na parzyste pasy 1. rzędu żelu (B1 - tor 4, A2 - pas 6 ...... B11 - pas 24, B12 - pas 26).
    2. Załadować produkty PCR z rzędów C i D płytki PCR, stosując ten sam wzór, jak opisano powyżej, z rzędem C na tory o numerach nieparzystych, a rzędem D na tory o numerach parzystych. Kontynuuj ten schemat ładowania, aż każdy dołek płytki PCR zostanie załadowany na żel. Bufor ładujący DNA nie jest wymagany do załadowania tego żelu.
  4. Umieść żel w zbiorniku do pracy i napełnij zbiornik buforem do pracy TAE, aż żel zostanie zanurzony. Uruchom przy napięciu 100 V przez 30 minut i wizualizuj za pomocą transiluminatora UV. Na rysunku 1B przedstawiono przykładowy gel.
    Uwaga: Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni przed transfekcją

3. Transfekcja 96-dołkowa

  1. Do tej procedury należy użyć procyklicznej linii komórkowej SMOXP9 10 w postaci procyklicznej T. brucei i hodować w pożywkach SDM-79 zawierających 10% FCS 10.
  2. Użyj 1 x 107 komórek na transfekcję (łącznie 1,1 x 109 komórek) podczas znakowania na końcu N białka i 2 x 107 komórek na transfekcję (łącznie 2,2 x 109 komórek) podczas znakowania na końcu C białka. Utrzymuj komórki w połowie log (1,2 x 106-1 x 107 komórek/ml) przez kilka dni przed transfekcją i zbierz komórki do transfekcji w gęstości 5-8 x 106 komórek/ml.
  3. Pozwól, aby zamrożone produkty PCR do transfekcji rozmroziły się w temperaturze pokojowej.
  4. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  5. Granulka wymagana liczba komórek w wielu probówkach o pojemności 50 ml po 800 x g przez 10 min.
  6. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml zmodyfikowanego cytomiksu (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM bufor fosforanu potasu pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH7,6, 2,6 mM MgCl2, 0,5% (w/v) glukozy, 100 μg/ml BSA, 1 mM hipoksantyna, 144 mM sacharoza) na probówkę. Przenieść wszystkie roztwory komórek do jednej probówki i ponownie wirować z prędkością 800 x g przez 10 minut.
  7. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 23 ml zmodyfikowanego cytomiksu do uzyskania końcowego stężenia 5 x 107 komórek/ml.
  8. Podczas wirowania komórek dodaj 1 ml pożywki SDM-79 do każdej studzienki 4 x 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Oznacz tabliczki A-D i narysuj pierścień wokół dołka A1 na każdej płytce trwałym markerem, aby ułatwić orientację płytki.
  9. Podłączyć uchwyt do płytek do elektroporatora. Na elektroporatorze ustaw napięcie na 1 500 V, długość impulsu na 100 μs, liczbę impulsów na 12, a interwał impulsów na 500 ms. Na uchwycie płytek ustaw liczbę impulsów na 1. Gwarantuje to, że elektroporator zastosuje pojedynczy impuls do każdej z 12 kolumn płytki elektroporacyjnej.
  10. Za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 przenieś reakcje PCR z płytki PCR na 96-dołkowe jednorazowe płytki do elektroporacji w odstępie 4 mm.
  11. Gdy komórki zostaną odwirowane i ponownie zawieszone do końcowego stężenia 5 x 107 komórek/ml (etap 3.7), przenieść do zbiornika odczynnika. Odpipetować 200 μl roztworu ogniw do każdego dołka płytki elektroporacyjnej za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200, wymieszać z produktem PCR przez pipetowanie.
  12. Za pomocą chusteczki usuń wszelkie kropelki z górnej części płytki, aby uniknąć zwarć.
  13. Nałóż folię uszczelniającą dostarczoną w opakowaniu płyty na górną część płytki do elektroporacji, ustawiając ją tak, aby pozostawić otwarte otwory na elektrody na górze i na dole każdej kolumny. Unikaj zakrywania podniesionych punktów używanych do prowadzenia folii.
  14. Załaduj płytkę elektroporacyjną do uchwytu do płytek i zamknij pokrywę. Naciśnij przycisk "Pulse" na elektroporatorze.
  15. Po elektroporacji szybko przenieś komórki z 96-dołkowej płytki do elektroporacji na 4 x 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych. Aby przenieść komórki, użyj 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 z brakującą co drugą końcówką, tak aby pozostałe 6 końcówek pokrywało się z 6 rzędami na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Przenieś elektroporowane komórki z 96-dołkowych płytek do elektroporacji według wstępnie zdefiniowanego wzoru na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych (ryc. 2A).
  16. Przygotuj końcówki do pipet P200 - dla każdej transfekcji 96-dołkowej przygotuj 2 pudełka po 96 końcówek z usuniętą co drugą kolumną.
    1. Przenieść studzienki A1/A3/A5/A7/A9/A11 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na płytkę A rzędu A 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, B1/B3/B5/B7/B9/B11 do rzędu B, C1/C3/C5/C7/C9/C11 do rzędu C i D1/D3/D5/D7/D9/D11 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.
    2. Przenieś studzienki E1/E3/E5/E7/E9/E11 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na 24-dołkową płytkę B, rząd A, F1/F3/F5/F7/F9/F11 do rzędu B, G1/G3/G5/G7/G9/G11 do rzędu C i H1/H3/H5/H7/H9/H11 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.
    3. Przenieś studzienki A2/A4/A6/A8/A10/A12 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na 24-dołkową płytkę C, rząd A, B2/B4/B6/B8/B10/B12 do rzędu B, C2/C4/C6/C8/C10/C12 do rzędu C i D2/D4/D6/D8/D10/D12 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.
    4. Przenieś studzienki E2/E4/E6/E8/E10/E12 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na 24-dołkową płytkę D, rząd A, F2/F4/F6/F8/F10/F12 do rzędu B, G2/G4/G6/G8/G10/G12 do rzędu C i H2/H4/H6/H8/H10/H12 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.
  17. Używając mikroskopu z kontrastem z odwróconymi fazami, zbadaj 1 studzienkę z każdej kolumny, aby sprawdzić komórki. Pojawi się mieszanina żywych i martwych komórek ze znaczną ilością szczątków komórkowych. Żywe komórki można odróżnić od martwych, ponieważ będą jasne pod mikroskopią kontrastu fazowego i będą się poruszać.
  18. Umieść 24-dołkowe płytki w czystym, plastikowym pudełku z pokrywką, która tworzy szczelne zamknięcie. Umieścić pudełko w inkubatorze o temperaturze 28 °C.
  19. Między 6-8 godzinami później dodaj 1 ml SDM-79 z 10% FCS zawierającym 2x selektywny antybiotyk do każdej studzienki. Z naszego doświadczenia wynika, że linie komórkowe, w których geny są znakowane na końcu N, są odporne na wyższe stężenia selektywnego leku. Dlatego, używając blasticydyny jako przykładu, znakowanie na końcu N wymaga końcowego stężenia 20 μg/ml blasticydyny, a znakowanie na końcu C wymaga końcowego stężenia 10 μg/ml blasticydyny.
    Uwaga: Transgeniczne linie komórkowe staną się widoczne 9-10 dni po transfekcji.
  20. Pasaż co najmniej dwa razy w świeżym leku i pożywce przed analizą. Rysunek 2B przedstawia wyniki typowej 96-dołkowej transfekcji do znakowania 96 różnych białek na końcu N. Oceń każdą studzienkę za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby określić, czy zawiera zdrowe, oporne na leki komórki. Zdrowa studzienka zawiera głównie (<95%) wysoce aktywne komórki, które są jasne w mikroskopii skurczowej fazowej. Późniejsza analiza za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub western blot jest wymagana w celu ustalenia, czy białko zostało pomyślnie oznakowane.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej reprezentatywnej transfekcji startery zostały zaprojektowane za pomocą skryptu TagIt perl 9 i zsyntetyzowane komercyjnie. Reakcja PCR w płytce 96-dołkowej została przeprowadzona i zwalidowana zgodnie z opisem (Rysunek 1A); w tym przykładzie 95/96 reakcji PCR przebiegło pomyślnie (Rysunek 1B). Z naszego doświadczenia wynika, że powtarzanie nieudanych reakcji, zarówno z oryginalnymi, jak i ponownie zsyntetyzowanymi starterami, nie prowadzi do uzyskania pomyślnej reakcji PCR.

Amplikony przeniesiono do 96-dołkowych płytek do elektroporacji w celu przeprowadzenia elektroporacji (Rycyna 2A), a następnie przeniesiono do 24-dołkowych płytek hodowlanych w celu regeneracji i selekcji. Po upływie czasu wystarczającego do zajścia selekcji, oceniono przeżywalność w poszczególnych dołkach przed dalszą analizą. W tym przykładzie po 15 dniach selekcji 88/96 dołków (92%) okazało się pozytywnych.

figure-results-1
Rycina 1: Walidacja PCR z użyciem długich starterów. (A) Schemat przenoszenia produktów PCR z 96-dołkowej płytki PCR na żel agarozowy w celu walidacji PCR. (B) Reprezentatywny żel walidacyjny PCR z 96 dołkami dla tagowania 95 genów na N-końcu oraz 1 amplikonu bez homologii celującej do końca 5', służącego jako kontrola negatywna w transfekcji. Próbki naniesiono na 1% (w/v) żel agarozowy i rozdzielono przy napięciu 100 V przez 30 min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Elektroporacja i selekcja w płytkach 96-dołkowych. (A) Schemat przenoszenia elektroporowanych komórek z 96-dołkowej płytki do elektroporacji do 24-dołkowych płytek hodowlanych. (B) Schemat przedstawiający typową ocenę żywotności (live/dead scoring) po 15 dniach selekcji w płytkach 24-dołkowych. Kolor zielony oznacza udaną transfekcję, kolor szary oznacza dołek zawierający wyłącznie martwe komórki. W tym przykładzie 88/96 (92%) dołków zawierało pomyślnie przetransfekowane pasożyty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radykalna poprawa czułości metod proteomiki i transkryptomiki w ciągu ostatnich 5-10 lat dostarczyła cennych danych na temat tysięcy genów i ich produktów. Jednak narzędzia do badania funkcji tych białek nie nadążają za zmianami.

Znakowanie białka ułatwia przeprowadzenie licznych eksperymentów w celu określenia jego funkcji. Na przykład białko może być połączone z białkiem fluorescencyjnym w różnych kolorach, aby ułatwić badania nad lokalizacją i kolokalizacją. Znaczniki opracowane dla mikroskopii elektronowej, takie jak APEX2 lub miniSOG 11,12, umożliwiają ultrastrukturalną lokalizację znakowanego białka. Znaczniki biochemiczne, takie jak znacznik TAP i znacznik ProtC-TEV-ProtA (PTP) 7,13 , umożliwiają oczyszczanie kompleksów związanych z białkiem w celu identyfikacji partnerów wiążących lub testów biochemicznych in vitro .

Konkretne kroki, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu, to: włączenie DMSO do PCR Master Mix 1, zamrożenie PCR Master Mix 1 przed dodaniem Master Mix 2, zastosowanie komercyjnej polimerazy w Master Mix 2 oraz modyfikacja buforu do elektroporacji cytomixu. Z naszego doświadczenia wynika, że konieczne jest użycie podwójnej liczby komórek do transfekcji znakowania końcówek C niż do transfekcji znakowania końcówek N, aby osiągnąć podobny odsetek dołków dodatnich. Dlatego wszystkie kroki należy wykonać zgodnie z opisem.

Technika ta może być skuteczna tylko w przypadku transfekcji trypanosomu w postaci procyklicznej owada. Formy krwi mają niższą skuteczność transfekcji 14, ponadto istnieje prawdopodobieństwo, że umrą podczas selekcji z powodu toksyczności zależnej od gęstości, która nie jest związana z selektywnym lekiem. Dlatego nasz poprzedni protokół reprezentuje obecnie najlepszą technologię znakowania trypanosomów z krwioobiegu 9. Jest również prawdopodobne, że skuteczność transfekcji będzie się różnić w zależności od konkretnego izolatu trypanosomu. Protokół ten został zoptymalizowany przy użyciu 927 form procyklicznych SMOX – inne szczepy mogą wymagać dodatkowej optymalizacji. Środki, które mogą zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu, obejmują: zwiększenie ilości amplikonu PCR, zwiększenie liczby komórek wchodzących w skład transfekcji.

Przedstawiamy metodę, w której setki białek mogą być znakowane równolegle. Ułatwi to zakrojone na szeroką skalę badania nad lokalizacją i interakcją, uzupełniając istniejące duże zbiory danych i dostarczając bezcennych informacji społeczności. Szablony podkładów są dostępne na życzenie, a lista szablonów plazmidów jest dostępna pod adresem: http://www.sdeanresearch.com/

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SD było wspierane przez Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. Praca ta została sfinansowana z grantów Wellcome Trust [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] dla profesora Keitha Gull. Chcielibyśmy podziękować profesorowi Keithowi Gullowi za pomocne rozmowy i spostrzeżenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
OligonukleotydyTechnologie życiatylko doodsalania (nie stosować dodatkowego oczyszczania)
DMSORocheW zestawie z pakietem Expand HiFiMusi być dNTP klasy PCR
, dowolny renomowany
polimeraza Expand HiFiRoche11759078001
BTX ECM830AparaturaElectroporator
Uchwyt do płytek HT-200Aparat HarvardaHT-200Obsługuje 96-dołkowe elektropłytki
MOS 96 GALWANIZACJA 4 mmAparat Harvard45-0452Galwanizacja do elektroporacji 96-dołkowej
Chlorowodorek blastycydyny SMelford3513-03-9
Higromycyna b ZłotoInvivogenant-hg-1
FleomycynaMelfordP0187
Kolba TC 225 cm, szyjka skośna, kapelusz fenolowyAppletonwoodsBC006
24-dołkowe płytkihodowlane AppletonwoodsBC017
Eppendorf® PCR Cooler, bezlodowy system przechowywania w chłodni na 96-dołkowe płytki i probówki do PCRSigma AldrichZ606634-1EA
96-well Multiply® Płytka PCR z fartuchem bocznymSarstedt72.1979.203
Harvard

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
  2. Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
  3. Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
  4. Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
  5. Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
  6. Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
  7. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  9. Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197(2015).
  10. Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037(2012).
  11. Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
  12. Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
  13. Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
  14. Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PCR z d ugim starteremelektroporacja w p ytkach 96 do kowychtagowanie bia ekmodyfikacja locus endogennegooczyszczanie tagiem TAPtagowanie bia kami fluorescencyjnymiregeneracja po elektroporacjitransgeniczne linie kom rkowe

Powiązane artykuły