Artykuł metodologiczny

Porównanie metod usuwania białek komórek gospodarza tytoniu poprzez blanszowanie nienaruszonych roślin lub obróbkę cieplną ekstraktów

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54343

⸱

8 sierpnia 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono trzy metody wytrącania ciepła, które skutecznie usuwają ponad 90% białek komórek gospodarza (HCP) z ekstraktów tytoniowych przed jakimkolwiek innym etapem oczyszczania. HCP roślin nieodwracalnie agregują się w temperaturach powyżej 60 °C.

Streszczenie

Rośliny nie tylko dostarczają ludziom żywności, paszy i surowców, ale zostały również opracowane jako ekonomiczny system produkcji białek biofarmaceutycznych, takich jak przeciwciała, kandydaci na szczepionki i enzymy. Muszą one zostać oczyszczone z biomasy roślinnej, ale etapy chromatografii są utrudnione przez wysokie stężenia białek komórek gospodarza (HCP) w ekstraktach roślinnych. Jednak większość HCP nieodwracalnie agreguje się w temperaturach powyżej 60 °C, ułatwiając późniejsze oczyszczanie białka docelowego. W tym miejscu przedstawiono trzy metody uzyskiwania wytrącania ciepła HCP tytoniu w nienaruszonych liściach lub ekstraktach. Blanszowanie nienaruszonych liści można łatwo włączyć do istniejących procesów, ale może mieć negatywny wpływ na kolejne etapy filtracji. Odwrotna sytuacja ma miejsce w przypadku wytrącania ciepła ekstraktów z liści w naczyniu z mieszadłem, co może poprawić wydajność dalszych operacji, choć przy poważnych zmianach w konstrukcji urządzeń procesowych, takich jak geometria homogenizatora. Wreszcie, konfiguracja wymiennika ciepła jest dobrze scharakteryzowana pod względem warunków wymiany ciepła i łatwa do skalowania, ale czyszczenie może być trudne i może mieć negatywny wpływ na wydajność filtra. Podejście oparte na projektowaniu eksperymentów może być wykorzystane do zidentyfikowania najistotniejszych parametrów procesu wpływających na usuwanie HCP i odzysk produktu. Ułatwia to zastosowanie każdej metody na innych platformach ekspresji i określenie najbardziej odpowiedniej metody dla danej strategii oczyszczania.

Wprowadzenie

Współczesne systemy opieki zdrowotnej w coraz większym stopniu opierają się na białkach biofarmaceutycznych 1. Produkcja tych białek w roślinach jest korzystna ze względu na niskie obciążenie patogenami i większą skalowalność w porównaniu z konwencjonalnymi systemami ekspresyjnymi 2-4. Jednakże przetwarzanie końcowe (DSP) farmaceutyków pochodzenia roślinnego może być trudne, ponieważ niszczące procedury ekstrakcji prowadzą do wysokiego obciążenia cząsteczkowego, z mętnością przekraczającą 5,000 NTUs oraz stężeniem białek komórek gospodarza (HCP) często przekraczającym 95% [m/m] 5,6.

Wymagane są rozbudowane procedury klarowania w celu usunięcia cząstek rozproszonych 7-9, jednak sprzęt chromatograficzny jest tańszy w eksploatacji w trybie wiązania i elucji podczas wstępnego odzyskiwania produktu, jeśli istnieje wcześniejszy etap efektywnego usuwania białek gospodarza (HCPs) 10,11. Można to osiągnąć poprzez wytrącanie białka docelowego za pomocą flokulantów 12 lub niskiego pH 13,14, a także poprzez wywoływanie agregacji HCPs. Selektywną agregację rybulozo-1,5-bisfosforanu karboksylazy/oksygenazy (RuBisCO), najliczniejszego białka HCP w zielonych roślinach, takich jak tytoń (Nicotiana tabacum), można promować poprzez dodanie glikolu polietylenowego 15, ale jest to kosztowne i niekompatybilne z produkcją na dużą skalę. Wykazano, że obróbka termiczna denaturuje i wytrąca ponad 95% białek HCP tytoniu, podczas gdy kandydaci na białkową szczepionkę przeciw malarii, takie jak Vax8, pozostają stabilne w roztworze 16-18.

W celu wywołania precypitacji białek gospodarza (HCP) tytoniu pod wpływem ciepła zastosowano trzy różne podejścia: (i) blanszowanie, tj. zanurzanie nienaruszonych liści w gorącym płynie, (ii) mieszadłowy zbiornik z kontrolą temperatury oraz (iii) wymiennik ciepła (Rycina 1) 16. W przypadku nienaruszonych liści blanszowanie pozwoliło na szybką i efektywną precypitację HCP, było łatwe do przeskalowania i kompatybilne z istniejącymi procesami produkcyjnymi na dużą skalę, które obejmują wstępny etap mycia biomasy roślinnej 19. Z kolei zbiorniki z kontrolą temperatury są już dostępne w niektórych procesach i mogą być wykorzystywane do obróbki termicznej ekstraktów roślinnych 20, jednak ich skalowalność i szybkość przekazywania energii są ograniczone, ponieważ stosunek powierzchni do objętości zbiorników ulega stopniowemu zmniejszeniu, co czyni je nieodpowiednimi w skali procesowej. Wymiennik ciepła stanowi technicznie dobrze zdefiniowaną alternatywę dla podgrzewanych zbiorników z mieszadłem, ale wymaga obfitego dopływu mediów grzewczych i chłodzących, np. pary wodnej i zimnej wody, a także ściśle kontrolowanego natężenia przepływu objętościowego dostosowanego do geometrii wymiennika ciepła i właściwości mediów, np. właściwej pojemności cieplnej. Niniejszy artykuł pokazuje, w jaki sposób wszystkie trzy metody mogą być wykorzystywane do precypitacji HCP tytoniu pod wpływem ciepła, a w ogóle HCP roślinnych. Wprowadzenie i obsługa każdej z metod w warunkach laboratoryjnych może służyć do oceny ich przydatności do procesów na większą skalę. Głównym wyzwaniem jest zidentyfikowanie odpowiednich modeli skalowania w dół (scale-down) oraz warunków pracy dla każdej operacji, które odzwierciedlają urządzenia i warunki stosowane podczas produkcji w skali procesowej. Przedstawione tutaj dane odnoszą się do eksperymentów przeprowadzonych na transgenicznych roślinach tytoniu wykazujących ekspresję kandydata na szczepionkę przeciw malarii Vax8 oraz białka fluorescencyjnego DsRed 16, jednak metodę tę z sukcesem zastosowano również u roślin N. benthamiana przejściowo wykazujących ekspresję innych białek biofarmaceutycznych 21.

Podejście oparte na planowaniu eksperymentów (DoE) 22 może ułatwić rozwój procesu, a flokulanty 23 mogą być również korzystne w tym kontekście, jak opisano wcześniej 8. Główną różnicą między blanszowaniem, podgrzewaniem w naczyniach a wymiennikami ciepła jest to, że blanszowanie stosuje się do nienaruszonych liści na wczesnym etapie procesu, podczas gdy pozostałe metody stosuje się do ekstraktów roślinnych (Rysunek 1).

Schemat przetwarzania tytoniu transgenicznego; homogenizator, grzałka, układ chromatograficzny do ekstrakcji białek.
Rysunek 1: Schemat procesu ilustrujący wdrożenie trzech różnych metod precypitacji termicznej HCP tytoniu. Materiał roślinny jest płukany i homogenizowany przed klarowaniem i oczyszczaniem. Urządzenia do etapu blanszowania (kolor czerwony) można łatwo dodać do istniejącego parku maszynowego. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie naczynia z mieszadłem (kolor pomarańczowy), a zwłaszcza wymiennika ciepła (kolor niebieski), wymaga jednego lub kilku dodatkowych urządzeń oraz rurociągów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uprawiaj rośliny tytoniu

  1. Przepłukać każdy blok wełny mineralnej 1 do 2 litrów wody dejonizowanej, a następnie 1 litrem 0,1% roztworu nawozu [w/v]. Umieść po jednym ziarnie tytoniu w każdym bloku wełny mineralnej i delikatnie przepłucz 0,25 l roztworu nawozu, nie zmywając nasion 16.
  2. Uprawiaj rośliny tytoniu przez 7 tygodni w szklarni o wilgotności względnej 70%, fotoperiod 16 godzin (180 μmol s−1 m−2; λ = 400 - 700 nm) i reżim temperatury 25/22 °C światło/ciemność.
  3. Zbierz wszystkie liście z wyjątkiem czterech liści liścienia, które znajdują się u podstawy łodygi rośliny.

2. Opcjonalnie: Upust ciepła przez blanszowanie

UWAGA: Wykonaj kroki opisane w krokach od 2.1 do 2.12 w celu wytrącenia HCP tytoniu poprzez blanszowanie. Pomiń całą sekcję 2, jeśli HCP będą wytrącane w ogrzewanym naczyniu (sekcja 4) lub przy użyciu wymiennika ciepła (sekcja 5).

  1. Odłóż na bok 50 g materiału roślinnego i przeprowadź ekstrakcję bez blanszowania (sekcja 3). Pobrać próbkę tego ekstraktu w celu kontroli wewnętrznej podczas późniejszej analizy (sekcja 7).
  2. Ustaw kąpiel wodną o pojemności roboczej 8 l, np. 50 x 40 x 40 cm, w izolowanym termicznie wiadrze z pianki polistyrenowej lub podobnym. Zamontuj regulowany termostat na łaźni wodnej w celu późniejszej kontroli temperatury (krok 2.7).
  3. Przenieś cały zespół na magnetyczną płytkę mieszającą i umieść mieszadło magnetyczne w łaźni wodnej. Upewnij się, że pole magnetyczne jest wystarczająco silne, aby obrócić mieszadło.
  4. Otocz mieszadło co najmniej czterema płytkami wsporczymi, na których zostanie umieszczony kosz polipropylenowy (krok 2.6) później podczas procedury blanszowania. Upewnij się, że płytki nośne są wykonane z materiału niemagnetycznego (np. stopu stali nierdzewnej zawierającego nikiel) i że są wyższe niż mieszadło (Rysunek 2).
  5. Do łaźni wodnej dodać 8 l wody dejonizowanej.
    UWAGA: Użycie buforu, np. 50 mM fosforanu sodu (pH 7,5), może poprawić docelową wydajność białka, jeśli problemem jest wytrącanie się przy niskim pH.
  6. Umieść kosz polipropylenowy o wymiarach 23 x 23 x 23 cm na płytkach nośnych i upewnij się, że kosz nie przeszkadza w obracaniu się mieszadła i że jest całkowicie zanurzony w płynie. W razie potrzeby dodaj dodatkową wodę/bufor, aż kosz zostanie całkowicie zanurzony, a następnie ponownie wyjmij kosz.
    ostrożność: Wszystkie kolejne kroki do 2.12 obejmują obchodzenie się z gorącą cieczą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice izolowane termicznie.
  7. Użyj regulowanego termostatu, aby doprowadzić łaźnię wodną do 70 °C (lub temperatury wymaganej do eksperymentów). Odczekaj co najmniej 15 minut po osiągnięciu żądanej temperatury, aby upewnić się, że cały zespół osiągnął równowagę termiczną.
  8. Przygotuj 150 g porcji z zebranych liści tytoniu. Umieść jedną porcję w koszu, unikając nieodwracalnego ściskania i uszkodzenia liści, np. przez rozdarcie. Unikaj przepełniania kosza materiałem roślinnym lub gęstego pakowania tego ostatniego.
  9. Ostrożnie, ale szybko zanurz kosz w gorącym płynie i umieść go na płytkach wsporczych. Umieść blok ze stali nierdzewnej na górze kosza, aby zapobiec unoszeniu się na wodzie.
  10. Inkubuj liście przez 5 minut w płynie do blanszowania lub wybierz czas odpowiadający projektowi eksperymentalnemu. Monitoruj temperaturę cieczy przez cały okres inkubacji.
  11. Ostrożnie wyjmij kosz z płynu do blanszowania i pozwól, aby pozostały płyn spłynął z liści przez 30 sekund. Następnie wyjmij liście rośliny z kosza, przenieś je do blendera i natychmiast rozpocznij ekstrakcję (rozdział 3).
    UWAGA: Rośliny mogą być przechowywane przez dłuższy czas po blanszowaniu i przed rozpoczęciem ekstrakcji, np. dłużej niż 30 minut na lodzie lub zamrożone w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni zostały pomyślnie przetestowane. Jednak stabilność produktu może się zmniejszać wraz z wydłużaniem się czasu przechowywania, dlatego zaleca się natychmiastowe przetworzenie.
  12. Powtórzyć kroki od 2.8 do 2.11 ze świeżym materiałem liściowym, aż cała zebrana biomasa zostanie przetworzona.

3. Ekstrakcja białka z liści tytoniu

UWAGA: Następne kroki obejmują blender z obracającymi się ostrzami. Nie pracuj w wiadrze blendera, gdy jest ono zamontowane na silniku blendera.

  1. Umieścić 150 g (mokra masa) zebranych (etap 1.3) lub blanszowanych (etap 2.11) liści w mieszaczu i dodać 450 ml buforu ekstrakcyjnego (50 mM fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu, 10 mM dwusiarczynu sodu, pH 8,0).
    UWAGA: Skład buforu ekstrakcyjnego zależy od białka, które ma być ekstrahowane i dlatego może wymagać dostosowania, np. użycia innego pH lub składnika buforowego, takiego jak Tris.
  2. Homogenizuj liście przez 3 impulsy po 30 sekund z 30-sekundowymi przerwami. Upewnij się, że liście są homogenizowane i nie zatykają wiadra blendera. Zatrzymaj blender i podnieś liście, aby w razie potrzeby zapobiec zatkaniu, a następnie kontynuuj homogenizację.
  3. Pobrać 1 ml próbki z każdego ekstraktu, która jest wytwarzana do dalszej analizy (sekcja 7). Jeśli materiał roślinny jest zblanszowany, przejdź do sekcji 6. W przeciwnym razie należy kontynuować wytrącanie ciepła w naczyniu (sekcja 4) lub wymienniku ciepła (sekcja 5), w zależności od wybranego podejścia doświadczalnego.

4. Opcjonalnie: Wytrącanie ciepła w naczyniu z mieszadłem

UWAGA: Wykonaj kroki opisane w sekcjach od 4.2 do 4.11 w celu wytrącenia HCP tytoniu w naczyniu z mieszadłem. Pomiń całą sekcję 4, jeśli HCP zostały wytrącone przez blanszowanie (sekcja 2) lub zostaną wytrącone za pomocą wymiennika ciepła (sekcja 5).

  1. Ustaw dwie kąpiele wodne o pojemności roboczej 8 l, np. 50 x 40 x 40 cm, z izolowanej termicznie pianki polistyrenowej lub podobnej. W pierwszej kąpieli zamontuj regulowany termostat w celu późniejszej kontroli temperatury (krok 4.6). W drugim dodaj 5 l wody dejonizowanej i 2 kg lodu w celu późniejszego schłodzenia (krok 4.9).
  2. Przenieś pierwszą kąpiel wodną na magnetyczną płytkę mieszającą i umieść 2-litrowe naczynie ze stali nierdzewnej w łaźni wodnej tak, aby środek naczynia był wyrównany ze środkiem płytki mieszającej.
  3. Umieść mieszadło magnetyczne w naczyniu ze stali nierdzewnej. Upewnij się, że pole magnetyczne jest wystarczająco silne, aby obrócić mieszadło.
  4. Napełnij łaźnię wodną wodą dejonizowaną do 5 cm poniżej górnej krawędzi naczynia ze stali nierdzewnej. Następnie napełnij naczynie buforem ekstrakcyjnym. Umieść pokrywkę z pianki polistyrenowej na naczyniu.
    ostrożność: Wszystkie kolejne kroki do 4,9 obejmują obchodzenie się z gorącą cieczą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice izolowane termicznie.
  5. Włóż termometr do naczynia ze stali nierdzewnej przez odpowiedni otwór w pokrywie z pianki polistyrenowej. Ustawić temperaturę łaźni wodnej na 78 °C i inkubować cały zestaw przez 15 minut, aby osiągnąć równowagę termiczną. Upewnij się, że temperatura w naczyniu wynosi 70 °C, około 8 °C poniżej wartości zadanej łaźni wodnej.
  6. Jeśli temperatura w naczyniu ze stali nierdzewnej różni się od 70 °C, należy odpowiednio wyregulować temperaturę łaźni wodnej i pozostawić system do równowagi przez kolejne 15 minut. Powtarzaj ten krok, aż temperatura w naczyniu osiągnie 70 °C lub zgodnie z wymaganiami eksperymentu, a następnie opróżnij naczynie ze stali nierdzewnej.
  7. Wlać 300 ml ekstraktu (krok 3.2) do naczynia ze stali nierdzewnej, gdy jest ono jeszcze w łaźni wodnej i uruchomić minutnik. Wymieszaj ekstrakt przy 150 obr./min i inkubuj przez 5 minut. Upewnij się, że ekstrakt osiąga temperaturę 70 °C przez co najmniej 2 minuty podczas tego okresu inkubacji.
  8. Wyjmij gorącą kąpiel wodną z mieszadła magnetycznego, wyjmij naczynie ze stali nierdzewnej i umieść je w lodowatym wiadrze. Umieść ten ostatni na mieszadle magnetycznym i zdejmij pokrywkę z pianki polistyrenowej.
  9. Upewnić się, że homogenat roślinny jest dobrze wymieszany przy 150 obr./min, umieścić termometr w ekstrakcie i inkubować do momentu, gdy osiągnie temperaturę 20 °C lub temperaturę określoną w schemacie doświadczalnym.
  10. Powtórz kroki od 4.7 do 4.9 dla wszystkich podwielokrotności. Pobrać 1 ml próbki z każdego ekstraktu wytrąconego na gorąco, gdy osiągnie on temperaturę końcową, a następnie przejść do sekcji 6.

5. Opcjonalnie: Wytrącanie ciepła w wymienniku ciepła

UWAGA: Wykonaj kroki opisane w sekcjach od 5.2 do 5.12 w celu wytrącenia HCP tytoniu za pomocą wymiennika ciepła. Pominąć całą sekcję 5, jeśli HCP zostały wytrącone przez blanszowanie (sekcja 2) lub w podgrzewanym naczyniu (sekcja 4).

  1. Ustaw dwie kąpiele wodne o pojemności roboczej 8 l, np. 50 x 40 x 40 cm, w izolowanych termicznie wiadrach z pianki polistyrenowej lub podobnych. W pierwszej kąpieli zamontuj regulowany termostat w celu późniejszej regulacji temperatury (krok 5.3). W drugim dodaj 5 l wody dejonizowanej i 2 kg lodu w celu późniejszego schłodzenia (krok 5.10).
    ostrożność: Wszystkie kolejne kroki do 5.9 obejmują obchodzenie się z gorącą cieczą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice izolowane termicznie.
  2. Napełnij pierwszą łaźnię wodną 8 litrami wody dejonizowanej. Ustaw temperaturę na 74.5 °C za pomocą termostatu. Inkubować zespół przez 15 minut, aby osiągnąć równowagę termiczną.
  3. Przygotuj izolowane naczynie do przechowywania, umieszczając plastikową zlewkę o pojemności 0,5 l w plastikowej zlewce o pojemności 1 litra i wypełnij szczeliny watą. Alternatywnie można skorzystać z dedykowanego naczynia izolowanego termicznie o pojemności roboczej 0,5 l.
  4. Podłączyć wymiennik ciepła do pompy perystaltycznej na jednym końcu i do węża wylotowego na drugim końcu za pomocą rurki L/S 24. Umieść oba końce rurki wraz z termometrem w izolowanym naczyniu do przechowywania i napełnij je 300 ml buforu ekstrakcyjnego (rysunek 2).
  5. Umieścić wymiennik ciepła w łaźni gorącej wody i uruchomić pompę perystaltyczną z szybkością 300 ml min-1. Upewnij się, że uzyskana temperatura w naczyniu wynosi 70 °C, około 4.5 °C poniżej wartości zadanej łaźni wodnej, po 3 minutach.
  6. Jeżeli temperatura w izolowanym naczyniu różni się od 70 °C, należy odpowiednio dostosować temperaturę łaźni wodnej i pozostawić system do wyrównania przez kolejne 15 minut. Powtarzać ten krok do momentu, gdy temperatura buforu ekstrakcyjnego wzrośnie z temperatury otoczenia do 70 °C w czasie krótszym niż 3 minuty lub zrówna się z temperaturą wymaganą dla doświadczenia, i opróżnij naczynie ze stali nierdzewnej.
  7. Wylać bufor ekstrakcyjny z izolowanego naczynia i przygotować 300 ml porcji ekstraktu roślinnego. Napełnij izolowane naczynie jedną porcją.
  8. Pompować ekstrakt roślinny (sekcja 3.3) przez wymiennik ciepła o stężeniu 300 ml min-1 przez 5 minut. Upewnić się, że temperatura ekstraktu wynosi 70 °C po 3 minutach lub jest równa temperaturze określonej w projekcie doświadczalnym.
  9. Po 5 minutach umieść wymiennik ciepła w lodowatej łaźni wodnej, podczas gdy ekstrakt jest nadal pompowany. Inkubować w tych warunkach do momentu, gdy temperatura osiągnie dokładnie 20 °C lub temperaturę określoną w schemacie doświadczalnym.
  10. Wyjmij wąż dopływowy podłączony do pompy perystaltycznej z izolowanego naczynia i kontynuuj pompowanie w celu zebrania resztkowego ekstraktu roślinnego wytrąconego ciepłem z wnętrza wymiennika ciepła. Następnie zatrzymaj pompę.
  11. Powtórz kroki od 5.7 do 5.10 dla wszystkich podwielokrotności. Pobrać 1 ml próbki z każdego ekstraktu wytrąconego termicznie, gdy osiągnie on temperaturę końcową, a następnie przekazać ekstrakty do filtracji workowej (sekcja 6).
    UWAGA: Po pierwszym cyklu przez kroki od 5.7 do 5.10 nie będzie bufora do wyrzucenia w kroku 5.7.

6. Filtracja workowa ekstraktu roślinnego

  1. Zamontuj filtr workowy w odpowiednim koszu nośnym, który jest zamontowany w obudowie filtra i zapewnia mechaniczne podparcie dla elastycznego materiału filtracyjnego. Umieścić 1-litrowe naczynie pod koszem i nanieść podwielokrotności ekstraktu (sekcja 3.3, 4.10 lub 5.11 w zależności od wybranej obróbki cieplnej) do worka w ilości 150 ml min-1.
  2. Po filtracji zmierzyć zmętnienie filtratu w stosunku 1:10 w buforze ekstrakcyjnym za pomocą mętnościomierza.
  3. Pobrać próbkę o objętości 1 ml i przetworzyć filtrat workowy zgodnie z opisem w projekcie doświadczalnym, np. filtracja wgłębna i chromatografia 7,10.

7. Przykładowa analiza

  1. Zmierzyć ilość całkowitego rozpuszczalnego białka (TSP) przy użyciu metody Bradforda 24,25.
    1. W trzech powtórzeniach odpipetować 2,5 μl każdej próbki do pojedynczych dołków na płytce 96-dołkowej. Włączyć osiem wzorców albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w trzech egzemplarzach w zakresie 0 - 2 000 μg ml-1.
    2. Dodaj 200 μl odczynnika Bradford do każdego dołka i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, ale na tyle delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
    3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 22 °C i zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm w spektrofotometrze. Obliczyć stężenie TSP w próbkach w oparciu o krzywą wzorcową przechodzącą przez punkty odniesienia BSA.
  2. Określ ilościowo Vax8 za pomocą powierzchniowej spektroskopii rezonansu plazmonów 26.
    1. Ustawić przyrząd do powierzchniowego rezonansu plazmonowego z buforem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) (10 mM HEPES, 3 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1,500 mM chlorku sodu, polisorbatu 0,05% v/v 20, pH 7,4) i zamontować w urządzeniu karboksymetylowalowany chip powierzchniowy dekstranu. Użyj funkcji zależności, aby przepłukać system i rozpocząć pracę ręczną z natężeniem przepływu 30 μl min-1 nad komorami przepływowymi 1 i 2. Wstrzyknąć 30 mM chlorowodór dwukrotnie przez 60 sekund z 60-sekundowym wstrzyknięciem przeplatanym 25 mM wodorotlenku sodu.
    2. Przygotować 200 μl 500 μg ml-1 mAb 5,2 roztworu w 10 mM octanie sodu (pH 4,0). Rozmrozić fiolki z chlorowodorkiem 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidem (NHS) i odwirować je w temperaturze 16 000 x g przez 1 min. Wymieszać 70 μl EDC z 70 μl NHS i przenieść do plastikowej fiolki o średnicy 7 mm.
    3. Aktywować powierzchnię wióra karboksymetylowanego dekstranu poprzez wstrzyknięcie mieszaniny EDC/NHS do komórek przepływowych 1 i 2 przez 10 minut z natężeniem przepływu 10 μl min-1.
    4. Ustaw ścieżkę przepływu tylko na komórkę przepływu 2. Połącz mAb 5,2, wstrzykując go przez 15 minut z szybkością 10 μl min-1.
    5. Przełącz ścieżkę przepływu na komory przepływowe 1 i 2 i wstrzyknij etanoloaminę przez 7 minut z szybkością 5 μl min-1, aby dezaktywować powierzchnię. Następnie wstrzyknąć 30 mM chlorowodór dwukrotnie przez 60 sekund z 60-sekundowym wstrzyknięciem przeplatanym 25 mM wodorotlenku sodu.
    6. Wstrzykiwać próbki i wzorce MSP1 - 19 z szybkością 30 μl min-1 przez 180 sek. Upewnij się, że stężenie Vax8 wynosi 50 - 1 000 ng ml-1. W razie potrzeby przygotować wstępne rozcieńczenia w buforowanym roztworze soli fizjologicznej HEPES zawierającym EDTA i polisorbat 20 (HBSEP).
    7. Odejmij sygnał szczytowy komórki przepływowej 1 od sygnału komórki przepływowej 2 i wykorzystaj różnicę do obliczenia stężenia Vax8 w próbkach na podstawie sygnału wstrzyknięcia MSP 1 - 19 o znanym stężeniu białka 500 ng ml-1.
    8. Zregeneruj powierzchnię wióra po każdej próbce lub wstrzyknięciu MSP 1 - 19 poprzez wystawienie na działanie 30 mM chlorowodoru przez 60 sekund przy natężeniu przepływu 30 μl min-1.
  3. Oznaczanie ilościowe DsRed za pomocą spektrometrii fluorescencyjnej
    1. W trzech egzemplarzach odpipetować 50 μl każdej próbki do pojedynczych dołków czarnej płytki 96-dołkowej o połowie powierzchni. Zawiera sześć wzorców DsRed obejmujących zakres 0 - 225 μg ml-1.
    2. Zmierzyć fluorescencję w dwóch egzemplarzach za pomocą filtra wzbudzającego 530 ± 30 nm i filtra emisyjnego 590 ± 35 nm w spektrofotometrze. Obliczyć stężenie DsRed w próbkach na podstawie krzywej wzorcowej przechodzącej przez punkty odniesienia DsRed.
  4. Wyznaczanie rozkładu wielkości cząstek
    1. Umyj kuwetę 1 ml izopropanolu, a następnie 2 ml wody dejonizowanej, aby usunąć cząsteczki kurzu. Pobrać pipetą 850 μl próbki do kuwety.
    2. Umieść kuwetę w analizatorze potencjału zeta i wielkości cząstek. Otwórz "Oprogramowanie" i rozpocznij ręczny pomiar z "Białkom" jako materiałem i "PBS" jako dyspergatorem. Wybierz temperaturę 25 °C i czas równowagi 180 sekund.
    3. Wybierz komórkę "DTS0012" i zmierz pod kątem 173° rozproszenia wstecznego. Sprawdź funkcję "auto" dla czasu trwania pomiaru i wybierz trzy pomiary bez przeplatanego opóźnienia.
    4. Zbadaj profil piku rozkładu wielkości cząstek po zakończeniu pomiaru, wybierając trzy pomiary próbki w widoku eksperymentu. Wybierz zakładkę "Wolumin PSD".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wytrącanie białek komórek gospodarza tytoniu poprzez obróbkę termiczną (blanszowanie)
Procedura blanszowania opisana w sekcji 2. została z sukcesem zastosowana do wytrącania HCP z liści tytoniu za pomocą 70 °Credukując TSP o 96 ± 1% (n = 3), przy jednoczesnym odzyskaniu do 51% białka docelowego Vax8, co zwiększyło jego czystość z 0,1% do 1,2% przed rozdziałem chromatograficznym 16Możliwe było również odzyskanie 83 ± 1% (n = 3) fluorescencyjnego białka DsRed, przy j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Trzy opisane powyżej metody wytrącania ciepła mogą skutecznie usunąć HCP tytoniu przed jakimkolwiek etapem oczyszczania chromatograficznego 16,17. Uzupełniają one inne strategie, które mają na celu zwiększenie początkowej czystości produktu, np. gutacja 29, ryzowydzielanie 30 lub ekstrakcja odśrodkowa 31,32, z których wszystkie ograniczają się do wydzielanych białek. Jednak metody oparte na cieple mogą być stosowane w sensowny sposób tylko wtedy, gdy docelowe białko, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Thomasowi Rademacherowi, Alexandrowi Boesowi i Veronique Beiß za dostarczenie transgenicznych nasion tytoniu oraz Ibrahimowi Al Amedi za uprawę roślin tytoniu. Autorzy pragną podziękować dr Richardowi M. Twymanowi za pomoc redakcyjną, a także Güvenowi Edgü za udostępnienie odniesienia do MSP1-19. Praca ta została częściowo sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach Advanced Grant "Future-Pharma", nr wniosku 269110, Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fundację Fraunhofera Przyszłości) oraz Fraunhofer-Gesellschaft w ramach grantu nr 269110. Przyciągaj 125-600164.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przenośny mętnościomierz 2100PHach4650000aminy mętnościomierza
GE HealthcareBR100050 Zestaw sprzęgający wióry SPR
Kosz do autoklawowaniaNalgene6917-0230Kosz do blanszowania liści
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01Urządzenie SPR
Analizator komórek biologicznych BCA 003 R& D z 3D ORMSequipn.a.Analizatorwielkości cząstek
BlenderWaring800EGBlender
BP-410Furh2632410001Filtr workowy
Wirówka 5415DEppendorf5424 000.410Wirówka
Probówka wirówkowa 15 mlLabomedic2017106Probówka reakcyjna
Probówka wirówkowa 50 ml wolnostojącaRurkareakcyjna
1110504 chip CM5GE HealthcareBR100012 Chip do pomiarów SPR
Kuweta 10 x 10 x 45Sarsted67.754Kuweta do Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEsoftware
Fosforan disodowyCarl Roth GmbH  4984.3 Komponent Media
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Nawóz
Forma -86C Zamrażarka ULTThermoFisher88400Zamrażarka
Szklarnian.a.n.a.Douprawy roślin
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cmGrodan102446Rockwool
Blok Wymiennik ciepła z dwupętlową pętlą (długość 4,8 m)n.d. (projekt niestandardowy)n.d.Heat wymiennik
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Komponent medialny
K200P 60DPall5302303Warstwa filtra wgłębnego
KS50P 60DPallB12486Warstwa filtra wgłębnego
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Termostat kąpieli wodnej
L/S 24MasterflexSN-06508-24Rurka
mAb 5,2Kolekcja kultur typu amerykańskiegoHB-9148Przeciwciało specyficzne dla Vax8
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Pompa perystaltyczna
MiraclothLabomedic475855-1RTkanina filtracyjna
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-metr / miernik przewodności
Osram zimna biel 36 WOsram4930440Źródło światła
PhytotronIlka Zelln.a.Douprawy roślin
Dwusiarczyn soduCarl Roth GmbH8554.1Składnik medialny
Chlorek soduCarl Roth GmbHP029.2Składnik medialny
Naczynie ze stali nierdzewnej; 0,7 kg 2,0 L; wysokość 180 mm; średnica 120 mmn.d. (projekt niestandardowy)n.d.Pojemnikdo wytrącania ciepła
Synergy HTBioTekSIAFRTCzytnik płytek fluorescencyjnych i spektrometrycznych
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Obudowa
filtra Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600Pomiar rozkładu wielkości cząstek
DLS Oprogramowanie Zetasizer v7.11Malvernn.a.Oprogramowaniedo obsługi urządzenia Zetasizer Nano ZS
Zestaw sprzęgający Labomedic

Bibliografia

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940(2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Blanszowanie ro liny tytoniuekstrakty z obr bki termicznejwytr canie w naczyniu z mieszad emkonfiguracja wymiennika ciep aplanowanie eksperyment woczyszczanie chromatograficznefiltracja ko cowaanaliza czysto ci bia ekoptymalizacja procesu

Powiązane artykuły