Artykuł metodologiczny

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

DOI:

10.3791/54346

⸱

20 sierpnia 2016

 ,  , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym wyzwaniem w neurobiologii jest zrozumienie, jak funkcjonują obwody neuronalne, które kierują odpowiednimi zachowaniami zwierząt. Drosophila melanogaster jest doskonałym systemem modelowym do takich badań ze względu na swoje złożone zachowania, potężne techniki genetyczne i zwarty układ nerwowy. Laboratoryjne testy behawioralne są od dawna stosowane w przypadku Drosophila do symulacji właściwości środowiska naturalnego i badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw odpowiednich zachowań (np. fototaksja, chemotaksja, uczenie się sensoryczne i pamięć)1-3. Wraz z niedawną dostępnością dużych zbiorów transgenicznych linii Drosophila, które oznaczają określone podzbiory neuronalne, testy behawioralne nabrały znaczącej roli w łączeniu neuronów z zachowaniami4-11. Wszechstronne i powtarzalne paradygmaty, wraz z leżącymi u ich podstaw procedurami obliczeniowymi do analizy danych, są niezbędne do szybkich testów kandydujących linii muchowych o różnych genotypach. Szczególnie przydatne są setupy, które są elastyczne pod względem liczby badanych zwierząt, czasu trwania eksperymentów i charakteru prezentowanych bodźców. Wybrany test powinien również generować powtarzalne dane, które są łatwe do pozyskania i analizy. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis systemu i protokołu do oznaczania reakcji behawioralnych much Drosophila na dużej czteropolowej arenie. Konfiguracja służy tutaj do oznaczania reakcji much na pojedynczy bodziec węchowy; Jednak ta sama konfiguracja może być modyfikowana w celu przetestowania wielu bodźców węchowych, wzrokowych lub optogenetycznych lub ich kombinacji. Konfiguracja olfaktometryczna rejestruje aktywność populacji much reagujących na zapachy, a do ilościowego określenia zachowań much stosuje się obliczeniowe metody analityczne. Zebrane dane są analizowane w celu uzyskania szybkiego odczytu przebiegu eksperymentalnego, co jest niezbędne do efektywnego zbierania danych i optymalizacji warunków eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do adaptacji i reagowania na środowisko zewnętrzne jest kluczowa dla przetrwania wszystkich zwierząt. Zwierzę musi unikać niebezpieczeństw, szukać pożywienia i partnerów, a także uczyć się na podstawie wcześniejszych doświadczeń. Systemy sensoryczne funkcjonują w celu odbierania różnych bodźców, takich jak wzrokowe, chemiczne i mechanosensoryczne, i wysyłają te sygnały do ośrodkowego układu nerwowego w celu ich interpretacji i dekodowania. Następnie mózg kieruje odpowiednimi zachowaniami motorycznymi w oparciu o postrzegane środowisko, takie jak poszukiwanie pożywienia lub ucieczka przed drapieżnikiem. Zrozumienie, w jaki sposób systemy sensoryczne wykrywają świat zewnętrzny oraz w jaki sposób mózg dekoduje i kieruje decyzjami, jest głównym wyzwaniem w neurobiologii.

Drosophila melanogaster to potężny system modelowy do badania, w jaki sposób obwody neuronowe kierują zachowaniami. Oprócz tego, że jest prosta i niedroga w utrzymaniu, Drosophila wykazuje wiele różnorodnych i złożonych stereotypowych zachowań, a jednocześnie robi to za pomocą zwartego układu nerwowego składającego się z około 100 000 neuronów. Istnieją potężne techniki genetyczne do manipulowania genomem Drosophila i wygenerowano tysiące linii transgenicznych, które selektywnie i powtarzalnie znakują te same podzbiory neuronów10-13. Te transgeniczne linie mogą być używane do selektywnego manipulowania aktywnością znakowanych neuronów (aktywacji lub hamowania), a te manipulacje mogą być wykorzystywane do badania, w jaki sposób funkcje neuronalne kierują zachowaniami.

Opracowano wiele testów behawioralnych do badania różnych zachowań Drosophila. Drosophila, podobnie jak wiele zwierząt, wykorzystuje swój zmysł węchu do kierowania wieloma wyborami behawioralnymi, takimi jak znajdowanie pożywienia, znajdowanie partnerów i unikanie niebezpieczeństw. Węch jest zatem dobrym systemem sensorycznym do badania, w jaki sposób bodźce zewnętrzne są wykrywane i interpretowane przez układ nerwowy zwierzęcia w celu kierowania odpowiednimi wyborami. W związku z tym opracowano szereg testów do badania zachowań węchowych larw i dorosłych. Tradycyjnie, zachowania węchowe u Drosophila były badane za pomocą paradygmatu labiryntu T-labiryntu dwóch wyborów, który można wykorzystać do oznaczania wrodzonych i wyuczonych zachowań węchowych3. W tym teście około 50 much ma do wyboru dwie rurki: jedna rurka zawiera dany zapach, a druga zawiera kontrolny środek zapachowy (zwykle rozpuszczalnik zapachowy). Muchy mają określony czas na dokonanie wyboru, a następnie zliczana jest liczba much znajdujących się w różnych komorach. Chociaż labirynt T jest prostym testem dla wielu eksperymentów, istnieje kilka ograniczeń. Na przykład zachowania węchowe są mierzone tylko w jednym punkcie czasowym, a różne wybory dokonane przed tym punktem czasowym są odrzucane. Podobnie zaniedbywane są indywidualne zachowania much w populacji. Ponadto labirynt w kształcie litery T wymaga ręcznego liczenia much, co może powodować błędy. Wreszcie, ponieważ istnieją tylko dwie mierzone opcje, zmniejsza to moc statystyczną często wymaganą do wykrycia subtelnych zmian w zachowaniu. Alternatywą dla labiryntu dwustopniowego wyboru jest olfaktometr czterokwadrantowy (czteropolowy)14-18. W tym teście zwierzęta eksplorują arenę, w której każdy z czterech rogów areny jest wypełniony potencjalnym źródłem nawanianego powietrza. Arena ma pomarszczony kształt gwiazdy, aby zmaksymalizować tworzenie się czterech eksperymentalnie zdefiniowanych kwadrantów zapachowych. Jeśli zapach jest dostarczany w jednym z rogów, to jest on zawarty tylko w tym jednym kwadrancie. Zachowania zwierząt można śledzić, gdy wchodzą i wychodzą z kwadrantu zapachu, i łatwo porównywać je z ich zachowaniem w trzech kwadrantach kontrolnych. Czterokwadrantowy test olfaktometryczny rejestruje zatem przestrzenną i czasową reakcję behawioralną na bodźce zapachowe na dużej arenie eksperymentalnej.

Czterokwadrantowy olfaktometr został po raz pierwszy opracowany przez Petterssona i wsp.15 oraz Vet i wsp.17 w celu zbadania węchowych reakcji behawioralnych poszczególnych pasożytniczych błonkoskrzydłych. Faucher i wsp.18 oraz Semmelhack i Wang16 dostosowali konfigurację do monitorowania reakcji węchowych poszczególnych Drosophila. Czterokwadrantowy olfaktometr jest równie czuły na reakcje przyciągające i odpychające, co pozwala na szeroki zakres testowych substancji zapachowych i warunków. Specjalnie napisane oprogramowanie do śledzenia much, opracowane przez Alexa Katsova19 i obecnie utrzymywane przez Juliana Browna (szczegółowo opisane w Materiałach), wprowadziło dodatkowe zalety do nowszych implementacji czterokwadrantowego olfaktometru14,20-23. Obecnie możliwe jest jednoczesne oznaczanie do 100 much w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (27,5 pikseli/cm) i czasowej (30 klatek na sekundę), co pozwala na wyodrębnienie różnych parametrów, takich jak pozycja, prędkość i przyspieszenie much w dowolnym punkcie czasowym. Umożliwia to badanie dynamiki reakcji behawioralnych much na zapachy20. Należy jednak zauważyć, że tożsamość poszczególnych much w populacji przez cały okres obserwacji nie jest zachowana. Zamiast tego każdy ślad lotu jest rejestrowany tak długo, jak długo dwie ścieżki lotu się nie przecinają. W tym momencie po rozejściu się much przypisywane są nowe ślady. Dzięki zastosowaniu innego oprogramowania do przechwytywania wideo (szczegółowo opisanego w tabeli materiałów), ta sama konfiguracja umożliwia elastyczne okresy śledzenia i może być używana do śledzenia much przez maksymalnie 24 godziny, robiąc zdjęcia z niższą liczbą klatek na sekundę. Opcja ta została wykorzystana do zbadania zachowań muszek związanych ze składaniem jaj i porównania ich pozycji ciała z preferencjami składania jaj14. Czteropolowy olfaktometr może być również wykorzystywany do badania reakcji na bodźce multimodalne (np. węchowe i wzrokowe) lub do łączenia stymulacji optogenetycznej9 lub termogenetycznej21 z prezentacją bodźców sensorycznych. Co więcej, wysoka rozdzielczość czasowa pozwala na wyodrębnienie trajektorii dla każdej pojedynczej muchy w zbiorze danych zespołowych. W związku z tym metoda ta pozwala na badanie zachowań populacji sterowanych węchem, a także indywidualnych interakcji społecznych. Dane wygenerowane przez ten test są solidne i wysoce powtarzalne, co pozwala na wykorzystanie olfaktometru czteropolowego do badań behawioralnych.

Opisujemy tutaj zestaw ustawień dla czterokwadrantowego olfaktometru. Ponadto wykazujemy jego zastosowanie w oznaczaniu przyciągania węchowego w odpowiedzi na ocet jabłkowy i odpychania w odpowiedzi na wysoko skoncentrowany propionian etylu. Na koniec opisujemy i udostępniamy przykładowy kod do analizy zarejestrowanych danych śledzenia much.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja zespołu

  1. Wykonać arenę w kształcie gwiazdy (19.5 cm na 19.5 cm na 0.7 cm) z politetrafluoroetylenu (PTFE) zgodnie z dostarczonym rysunkiem (Materiały uzupełniające, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Arena może być wyprodukowana przez obiekt komercyjny lub niestandardowy.
  2. Zaopatrz się w dwie szklane płytki (20,25 cm na 20,25 cm o grubości 2 mm) i wywierć otwór (o średnicy ~0,7 cm) dokładnie na środku jednej ze szklanych płytek za pomocą wiertła z powłoką diamentową.
  3. Wyprodukuj światłoszczelne pudełko behawioralne dla areny behawioralnej. Należy również wyprodukować światłoszczelną obudowę kamery do kamery wideo CCD na podczerwień zgodnie z dostarczonymi rysunkami (materiały dodatkowe, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Pudełka mogą być produkowane przez zakład komercyjny lub niestandardowy.
  4. Zamontuj klimatyzator na tylnej ścianie, a tablice LED na bocznych ścianach skrzynki behawioralnej. Umieść sondę temperatury w skrzynce behawioralnej przez boczny otwór, aby uzyskać informacje zwrotne i regulację temperatury w czasie rzeczywistym (szczegółowe informacje znajdują się na rysunkach 1 i 2).
  5. Podłącz filtr podczerwieni i polaryzator kołowy do kamery i zamontuj zespół w pudełku z kamerą. Skrzynka zachowania i skrzynka kamery są oddzielone szklanym oknem dla lepszej kontroli temperatury pudełka zachowania (szczegóły patrz rysunki 1 i 2).
  6. Podłącz kamerę CCD na podczerwień do adaptera kamery. Podłącz adapter aparatu do konwertera USB. Podłącz konwerter USB do portu USB w komputerze w celu uzyskania danych.
  7. Zainstaluj sterownik konwertera wideo na komputerze zgodnie z instrukcjami producenta. Opcjonalnie zainstaluj oprogramowanie do przetwarzania obrazu dostarczone przez producenta konwertera wideo USB, aby uzyskać dostęp do szerszego zakresu ustawień kamery i parametrów akwizycji.
  8. Podłącz klimatyzator (przez "wyjście" z tyłu regulatora temperatury) i sondę temperatury (przez "termoparę" z tyłu regulatora temperatury) do regulatora temperatury. Umieść sondę w polu zachowania.
    Uwaga: System kontroli temperatury w naszym układzie jest w stanie utrzymać temperaturę pudełka w zakresie od 18 °C do 30 °C. Wyższe lub niższe temperatury otoczenia mogą być przydatne w eksperymentach termogenetycznych (dTrpA1, TrpM8 lub shibirets) w celu manipulowania aktywnością neuronalną lub hamowania transmisji synaptycznej. W przypadku większości eksperymentów temperatura jest utrzymywana na poziomie 25 °C.
  9. Zamontuj system dostarczania zapachów w następujących krokach (patrz rysunek 1B, aby zapoznać się ze szczegółowymi schematami i armaturą łączącą):
    1. Użyj regulatora ciśnienia powietrza, aby kontrolować dopływ powietrza z centralnego systemu pneumatycznego. Podłącz węglowy filtr powietrza (wypełniony węglem drzewnym) do regulatora ciśnienia, aby oczyścić powietrze z centralnego układu powietrza.
    2. Zmontuj system kontroli przepływu składający się z wielu kanałów regulowanych rurkami przepływomierza o wysokiej rozdzielczości.
    3. Podłączyć wyjście z węglowego filtra powietrza do rurek przepływomierza za pomocą kolektora, jak pokazano na rysunkach 1B i 2F. Skieruj wyjście rurek przepływomierza przez elektronicznie sterowane 3-drogowe zawory elektromagnetyczne, aby regulować, czy czyste powietrze opuszczające przepływomierze jest wyrzucane do pomieszczenia lub wprowadzane do specjalnie wykonanych komór zapachowych24.
    4. Zamontuj sterownik zaworu elektromagnetycznego zgodnie z instrukcją producenta.
  10. Elektroniczny przepływomierz powietrza należy zamontować, podłączając go do urządzenia do akwizycji danych (DAQ) i zasilacza zgodnie z instrukcją producenta. Zainstaluj oprogramowanie interfejsu DAQ, aby sprawdzić równe natężenia przepływu w każdym kwadrancie areny przed każdym eksperymentem.

2. Przygotowanie bodźców węchowych

  1. Przygotuj 5 komór nawaniania24, które składają się z plastikowego pojemnika zewnętrznego, szklanego pojemnika wewnętrznego, wykonanej na zamówienie wkładki pokrywy z PTFE, oryginalnej pokrywy pojemnika ze zdjętą częścią środkową i dwóch zaworów jednokierunkowych.
    Uwaga: O-ring wokół pokrywy z PTFE może być użyty, aby zapobiec wyciekowi powietrza z komory zapachowej podczas perfuzji zapachu. Patrz rysunek 1 dla schematu i rysunek 2 dla zdjęć komór.
  2. Użyj czterech komór nawaniania do kontroli rozpuszczalnika i jednej komory do testowego środka zapachowego. Napełnij szklane pojemniki 1 000 μl rozpuszczalnika lub rozcieńczenia środka zapachowego (przetestuj substancje zapachowe + odpowiednie rozpuszczalniki, dokładnie wymieszaj przed eksperymentami), umieść szklany pojemnik w odpowiedniej plastikowej komorze (nie wylewaj płynu do plastikowej komory) i dokręć pokrywkę. Upewnij się, że zawsze używasz czystej komory do testowania kontroli nawaniacza i rozpuszczalnika.
    Uwaga: Przyciąganie węchowe może być wywołane przez rozcieńczenie octu jabłkowego (kwasowość 5%) w wodzie w stosunku 1/16. W przeciwieństwie do tego, zachowanie odpychania węchowego można badać przy użyciu 10% rozcieńczenia propionianu etylu w oleju mineralnym. Bodźcami kontrolnymi w takich przypadkach są komory zapachowe z czystym olejem mineralnym.

3. Przygotowanie do lotu

  1. Tył leci na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej. Umieść 30 samców i 30 samic much rodzicielskich w standardowej butelce i pozwól im składać jaja przez 5 dni w temperaturze 25 °C lub pokojowej.
  2. Do każdego eksperymentu należy zebrać nowo zamknięte (<1 dnia) 25 samców i 25 samic much w krótkim znieczuleniu CO2 .
  3. Muchy należy przechowywać w fiolce ze standardowym podłożem muchowym przez 2-4 dni.
  4. 40-42 godziny przed eksperymentem przenieś muszki bez znieczulenia CO2 do fiolki z ~10 ml 1% żelu agarozowego. Dzięki temu muchy będą nawilżone bez jedzenia, co pomoże zwiększyć ich aktywność lokomotoryczną.
    Uwaga: Ponad 90% much powinno przeżyć głód. Niektóre genotypy są mniej zdrowe i mogą nie przetrwać 40-godzinnej głodówki. W takich przypadkach dopuszczalne są krótsze okresy, takie jak 24-28 godzin, ale powinny być takie same dla wszystkich warunków doświadczalnych i powtórzeń.

4. Reakcje behawioralne na atrakcyjne i odstraszające zapachy

  1. Włączyć regulator temperatury i ustawić go na 25 °C.
  2. Podłącz komory nawaniania (kontrolne i testowe środki zapachowe), wkładając rurkę do wylotu komory nawaniacza i do złączki wciskanej w skrzynce behawioralnej.
  3. Sprawdź natężenie przepływu w każdym kwadrancie za pomocą miernika przepływu powietrza, aby upewnić się, że strumienie powietrza sterującego i zapachowego są równe 100 ml/min.
  4. Wyczyść arenę do muchowania z PTFE i szklane płytki 70% etanolem 2-3 razy i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (~3-4 min).
  5. Przymocuj szklane płytki do areny za pomocą zacisków.
  6. Przenieś muchy bez znieczulenia CO2 na arenę przez otwór w jednej ze szklanych płytek. Po przeniesieniu umieść okrągłą siatkę na otworze, aby zapobiec ucieczce much.
    Uwaga: Wykazano, że znieczulenie CO2 wpływa na zachowanie Drosophila 25 i nie powinno być stosowane w ciągu 24 godzin od eksperymentu behawioralnego.
  7. Umieść arenę z muchami w światłoszczelnej komorze, podłącz cztery sterujące strumienie powietrza, łącząc rurkę dołączoną do złączki push-to-connect na skrzynce behawioralnej do rogów areny, zamknij drzwi komory i odczekaj 10-15 minut, aby muchy zaaklimatyzowały się w nowym środowisku. Jeśli to możliwe, wyłącz światła w pomieszczeniu, w którym przeprowadzane są eksperymenty, aby uniknąć możliwego minimalnego wycieku światła, który może zniekształcić wynik eksperymentu.
  8. Przeprowadź 5-10 minutowy eksperyment kontrolny, w którym muchy są wystawione na działanie 4 kontrolnych strumieni powietrza.
  9. Natychmiast przeanalizuj dane (patrz sekcja Analiza danych poniżej), aby upewnić się, że muchy są równomiernie rozmieszczone na arenie, a wskaźnik przyciągania jest bliski 0. Ten krok jest niezbędny, ponieważ weryfikuje, czy na arenie nie ma niekontrolowanych źródeł preferencji lub unikania (np. światło wyciekające z zewnątrz, nierównomierny rozkład temperatury, nierówna arena, zanieczyszczenie zapachami itp.). Jeśli muchy są rozmieszczone nierównomiernie lub ich aktywność lokomotoryczna jest niska, wyrzuć muchy, ponownie oczyść arenę (Krok 4.4) i użyj nowej partii much, aby powtórzyć eksperyment.
  10. Podłącz testową komorę nawaniacza do konfiguracji, włączając zawory 3-drogowe lub ponownie podłączając rurki łączące.
  11. Uruchom eksperyment testowy przez 5-10 minut i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w sekcji 5 poniżej (patrz również odniesienie 14 i rysunek 3). Nagrania dłuższe niż 20 minut mogą skutkować plikami danych, które mogą być trudne do przetworzenia obliczeniowego. Jeśli pożądane są dłuższe nagrania eksperymentalne, szybko zatrzymaj i ponownie uruchom program śledzący. Powoduje to ~10 sekundową przerwę między nagraniami eksperymentalnymi.
  12. Odrzuć muchy.
  13. Oczyść arenę i szklane płyty 70% etanolem (krok 4.4) i wymień rurki łączące w światłoszczelnej obudowie. Aby przyspieszyć eksperymenty, można użyć nowej czystej areny, a brudna arena jest czyszczona podczas wykonywania eksperymentalnych przebiegów.
  14. W razie potrzeby przeprowadź kolejny eksperyment z nową partią much. Jeśli tego samego dnia przeprowadzanych jest kilka eksperymentów, należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że w systemie nie pozostał żaden nawaniacz z poprzedniego uruchomienia testowego. Zwykle nie stanowi to problemu w przypadku niskich stężeń substancji zapachowych lub CO2 , ale w przypadku wysoce skoncentrowanych bodźców może być potrzebna przerwa do 24 godzin między seriami doświadczalnymi. Ponadto wszystkie rurki za rurkami przepływowymi mogą być wymienione, jeśli podczas eksperymentów kontrolnych podejrzewa się zanieczyszczenie odorantem. Zawsze pozostawiaj suche powietrze włączone między eksperymentami, aby stale przepłukiwać system

5. Analiza danych

Uwaga: Sugerowane oprogramowanie do śledzenia much (szczegółowo opisane w Materiałach), śledzi muchy w czasie rzeczywistym podczas akwizycji i zapisuje znacznik czasu oraz współrzędne wszystkich wykrytych much w formacie *.dat. Opracowaliśmy niestandardową procedurę Matlab do konwersji danych do formatu Matlab i analizowania danych. Przykłady kodu znajdują się w materiałach uzupełniających, ale szczegóły implementacji będą zależeć od oprogramowania używanego do pozyskiwania danych.

  1. Załaduj nieprzetworzone dane. Utwórz maskę przestrzenną, która podąża za konturami areny, i zastosuj maskę do nieprzetworzonych danych, aby usunąć wszystkie punkty danych, które znajdują się poza areną, ponieważ reprezentują szum (Rysunek 4A, kod uzupełniający MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
  2. Usuń wszystkie punkty danych, które poruszają się z prędkością poniżej 0,163 cm/s przez okres dłuższy niż 3 s, ponieważ dane te mogą być szumem lub generowane przez nieporuszające się muchy (Rysunek 4B, kod uzupełniający TemporalFiltering.m).
  3. Wizualizuj pozostałe punkty danych, wykreślając je wszystkie naraz lub jako pojedyncze trajektorie (Rysunek 3, kod uzupełniający SingleTrajectoryViewer.m).
    Uwaga: Lokalizacja granic zapachowych w czterech polach prawdopodobnie zależy od wielu czynników, takich jak charakterystyka każdego nawaniacza i stosowane natężenia przepływu powietrza. Na przykład wysoce lotne substancje zapachowe prawdopodobnie wypełnią kwadrant zapachu w pełniejszy sposób niż mniej lotne substancje zapachowe. W związku z tym jest prawdopodobne, że każdy środek zapachowy może wykazywać nieco inne granice zapachowe. Zastosowanie detektora fotojonizacyjnego do pomiaru granic zapachu może być problematyczne, ponieważ wykorzystuje on próżnię do pobierania próbek powietrza z określonego miejsca, a tym samym zakłóca stężenie substancji zapachowej w tym miejscu. Niemniej jednak granice zapachów można szybko oszacować na podstawie danych behawioralnych much. Na przykład na rysunkach 3C i 3D wyraźnie można zaobserwować granicę zapachu opartą na skumulowanych śladach much w odpowiedzi na różne zapachy.
  4. Oblicz wskaźnik przyciągania, aby określić, czy eksperymenty kontrolne nie generują żadnej reakcji preferencyjnej, a także aby uzyskać dostęp do odpowiedzi na bodziec zapachowy (lub optogenetyczny9). Aby obliczyć wskaźnik przyciągania (AI), użyj ostatnich 5 minut nagrania kontrolnego lub testowego. Aby uzyskać miarę przyciągania, która mieści się w przedziale od +1 (przyciąganie bezwzględne) do -1 (odpychanie bezwzględne), do obliczenia AI stosuje się następujący wzór:
    figure-protocol-1
    gdzie test N to liczba punktów danych w kwadrancie testowym, kontrola N to średnia liczba punktów danych w trzech kwadrantach kontrolnych. Ta miara jest intuicyjna, ponieważ żadna preferencja nie byłaby wskazywana przez wartości bliskie zeru. Jednak nie wskazuje prawidłowo proporcji całkowitej liczby much, które znajdują się w kwadrancie odorantu. Aby uzyskać tę miarę, można użyć wskaźnika procentowego (PI):
    figure-protocol-2
    gdzie Ntest to liczba punktów danych w kwadrancie testu, a Nłącznie to całkowita liczba punktów danych we wszystkich czterech kwadrantach. Ta formuła zapewnia miarę, która mieści się w przedziale od 0 do 1, gdzie 0,25 odpowiada brakowi preferencji behawioralnych (Rysunek 3E i 4C, Kod uzupełniający AttractionIndex.m).
  5. Uruchom 5-10 powtórzeń każdego warunku eksperymentalnego, używając nowej grupy much dla każdego powtórzenia. Porównaj indeksy przyciągania między warunkami lub względem kontroli, używając testu nieparametrycznego Kołmogorowa-Smirnowa (Rysunek 3F, funkcja kstest2 w Matlabie).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czterokwadrantowy test olfaktometryczny rejestruje i analizuje aktywność chodzenia wielu much na dużej przestrzeni behawioralnej. Substancje zapachowe mogą być wprowadzane do strumieni powietrza, które wchodzą do jednego, dwóch, trzech lub wszystkich czterech kwadrantów. W przypadku braku zapachów muchy będą swobodnie poruszać się między wszystkimi czterema kwadrantami. To zachowanie jest kluczowe do zaobserwowania, ponieważ wskazuje, że niezamierzone błędy systematyczne nie zostały wprow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj olfaktometr czteropolowy jest wszechstronnym systemem behawioralnym do badania reakcji węchowych dużych populacji dzikich i zmutowanych much Drosophila . Każdy eksperyment trwa ~1 godzinę (w tym konfiguracja, przebiegi eksperymentalne i czyszczenie), a każdego dnia można rutynowo przeprowadzać 4-6 eksperymentów. Typowy test wykorzystujący 40-50 much przez 5 minut generuje około 450 000 śledzonych punktów danych do analizy. Opisana konfiguracja może być również używana, z niewielkimi modyfikacjami, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Terry'emu Shelleyowi za wykonanie hali do much, Liz Marr za pomoc w utrzymaniu much, oraz Xiaojing Gao i Junjie Luo za pomoc przy kodzie Matlab używanym do analizy danych. Dziękujemy Johanowi Lundströmowi z Monell Chemical Senses Center za zademonstrowanie jego konfiguracji dostarczania zapachów. Prace te były wspierane przez granty z Whitehall Foundation (CJP) i NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System dostarczania powietrza  (Potrzebna ilość)
Rurki i łączniki
Termoplastyczne kolektory NPT(F)Cole-Parmer, IL, USAR-31522-311
Złączka redukcyjna sześciokątna (1/4MNPT->1/8MNPT)McMaster-Carr, IL, USA5232T3141
Rurka ( ID:1/8)McMaster-Carr, IL, USA5108K4350 Ft
Rurka (ID:1/16)McMaster-Carr, IL, Stany Zjednoczone52355K41100 Ft
Łączniki rurowe kolczasteMcMaster-Carr, IL, USA5117K711 opakowanie
Złączki rurowe wciskane do pęczkówMcMaster-Carr, IL, USA5779K1024
Złączki rurowe z zadziorami (1/4MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, Stany Zjednoczone5463K4391 opakowanie (10)
Złączki rurowe kolczaste (1/8MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K4382 paczki (10) 
Złączki do rur kolczastych (1/8MNPT->1/16BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K42 opakowania (10) 
Złączki do rur kolczastych (1/4MNPT->1/4BF)McMaster-Carr, IL, USA&nbsp; 5670K841
wtyczka z sześciokątnymMcMaster-Carr, IL, USA48335K1521
regulator ciśnienia powietrza, filtr powietrza i przepływomierze(Potrzebna ilość)
Urządzenie do suszenia gazu labatoryjnegoW A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, Stany ZjednoczoneModel: L68-NP-303; nr urządzenia #268401
Ramki wielorurowe do rur przepływowych 150 mmCole-Parmer, IL, USAR03215-301
Ramki wielorurowe do rur przepływowych 150 mmCole-Parmer, IL, USAR03215-761
Rurki przepływowe 150 mmCole-Parmer, IL, USAR-03217-159
Wkład zaworuCole-Parmer, IL, USAR-03218-729
Precyzyjny regulator powietrzaMcMaster-Carr, IL, USA6162K131
Zawory elektromagnetyczneAutomate Scientific, Berkeley, CA02-10i4
Sterownik zaworu elektromagnetycznegoValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA01-181
Elektroniczny przepływomierzHoneywellAWM3100V1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) i National InstrumentsNI USB-60091
ZasilaczExtech Instruments3822001
Komory zapachowe
Polipropylen Słoik z szerokimi ustami 2 uncje; 60 mlNalgene562118-0002Wymagane jest co najmniej 5 na eksperyment, ale dla każdego rozcieńczenia każdego środka zapachowego wymagana jest osobna komora. Dostępne w Container Store, część #635114)
Szklana komora zapachowa, 0.25 uncjiButelka SunburstLB4BWymagane jest co najmniej 5 na eksperyment 
Zawór "wewnętrzny" do komory zapachowejSmart Products, Inc., CA, USA214224PB-0011S000-40741 z tych części jest używany w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
Zawór "wyjściowy" do komory zapachowejSmart Products, Inc., CA, USA224214PB-0011S000-40741 z tych części jest używany w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
O-ringRT Dygert International, MN, USAAS568-029 Buna-N O-R1 opakowanie (100)
Fly arena, kamery i pudełka behawioralne(Potrzebna ilość)
Zachowanie i materiał pudełka na kameręTworzywa sztuczne międzystanowe, CA, USAABS wytłaczany (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 cale
kwadratoweTeflon do areny muchowej i wkładów komory zapachowej, grubość 3/8", 12" x 12"McMaster-Carr, IL, USA8545K27 1
Płyty szklane, grubość 1/8", 9" x 9"McMaster-Carr, IL, USA8476K191 cyfra arabska
Sterownik termoelektryczny dwustronnego działaniaWAtronix Inc, CA, USADA12V-K-01
tablica diod LED IRZaawansowane oświetlenie, Rochester, VT, USAAL4554-88024, PS24-TL2 tablice LED i jeden zasilacz
KlimatyzatorMelcor Store  MAA280T-121
System obrazowania(Potrzebna ilość)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) Obiektyw z mocowaniem CB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USAKP1
połączeniowy CCXC-12P05NB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASOCCXC12P05N1
DC-700 Adapter do aparatuB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASODC700 1
B+W 40,5 093 Filtr podczerwieniB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA65-0724421
TiFFEN 40.5 mm Polaryzator kołowyAmazon1
Kamera wideo na podczerwieńPrzemysłowe źródło wizji, FL, USASony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
Konwerter wideo USBThe Imagingsource, NC, USADFG/USB2-It1
iFlySpy2 (oprogramowanie do śledzenia much)Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
IC Capture oprogramowanie 2.2The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous(Potrzebna ilość)
Dremel narzędzie obrotoweDremel, Racine, WI, USADremel 8000-03 1
Wiertła z powłoką diamentową do cięcia szkłaDostępne u różnych dostawców; MSC Industrial Supply Co, Melville, Nowy Jork906063281
PEC21211

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580(2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986(2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361(2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Olfactory Behavior AssayDrosophila TrackingFour quadrant OlfactometerOdorant Chamber SetupFly Population AnalysisAirflow Rate VerificationData Analysis ScriptAttraction Index CalculationOlfactory Stimulus ResponseBehavioral Data Quantification

Powiązane artykuły