Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54346

⸱

20 sierpnia 2016

 ,  , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Streszczenie

Kluczowym wyzwaniem w neurobiologii jest zrozumienie, jak funkcjonują obwody neuronalne, które kierują odpowiednimi zachowaniami zwierząt. Drosophila melanogaster jest doskonałym systemem modelowym do takich badań ze względu na swoje złożone zachowania, potężne techniki genetyczne i zwarty układ nerwowy. Laboratoryjne testy behawioralne są od dawna stosowane w przypadku Drosophila do symulacji właściwości środowiska naturalnego i badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw odpowiednich zachowań (np. fototaksja, chemotaksja, uczenie się sensoryczne i pamięć)1-3. Wraz z niedawną dostępnością dużych zbiorów transgenicznych linii Drosophila, które oznaczają określone podzbiory neuronalne, testy behawioralne nabrały znaczącej roli w łączeniu neuronów z zachowaniami4-11. Wszechstronne i powtarzalne paradygmaty, wraz z leżącymi u ich podstaw procedurami obliczeniowymi do analizy danych, są niezbędne do szybkich testów kandydujących linii muchowych o różnych genotypach. Szczególnie przydatne są setupy, które są elastyczne pod względem liczby badanych zwierząt, czasu trwania eksperymentów i charakteru prezentowanych bodźców. Wybrany test powinien również generować powtarzalne dane, które są łatwe do pozyskania i analizy. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis systemu i protokołu do oznaczania reakcji behawioralnych much Drosophila na dużej czteropolowej arenie. Konfiguracja służy tutaj do oznaczania reakcji much na pojedynczy bodziec węchowy; Jednak ta sama konfiguracja może być modyfikowana w celu przetestowania wielu bodźców węchowych, wzrokowych lub optogenetycznych lub ich kombinacji. Konfiguracja olfaktometryczna rejestruje aktywność populacji much reagujących na zapachy, a do ilościowego określenia zachowań much stosuje się obliczeniowe metody analityczne. Zebrane dane są analizowane w celu uzyskania szybkiego odczytu przebiegu eksperymentalnego, co jest niezbędne do efektywnego zbierania danych i optymalizacji warunków eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Zdolność do adaptacji i reagowania na środowisko zewnętrzne jest kluczowa dla przetrwania wszystkich zwierząt. Zwierzę musi unikać niebezpieczeństw, szukać pożywienia i partnerów, a także uczyć się na podstawie wcześniejszych doświadczeń. Systemy sensoryczne funkcjonują w celu odbierania różnych bodźców, takich jak wzrokowe, chemiczne i mechanosensoryczne, i wysyłają te sygnały do ośrodkowego układu nerwowego w celu ich interpretacji i dekodowania. Następnie mózg kieruje odpowiednimi zachowaniami motorycznymi w oparciu o postrzegane środowisko, takie jak poszukiwanie pożywienia lub ucieczka przed drapieżnikiem. Zrozumienie, w jaki sposób systemy sensoryczne wykrywają świat zewnętrzny oraz w jaki sposób mózg dekoduje i kieruje decyzjami, jest głównym wyzwaniem w neurobiologii.

Drosophila melanogaster to potężny system modelowy do badania, w jaki sposób obwody neuronowe kierują zachowaniami. Oprócz tego, że jest prosta i niedroga w utrzymaniu, Drosophila wykazuje wiele różnorodnych i złożonych stereotypowych zachowań, a jednocześnie robi to za pomocą zwartego układu nerwowego składającego się z około 100 000 neuronów. Istnieją potężne techniki genetyczne do manipulowania genomem Drosophila i wygenerowano tysiące linii transgenicznych, które selektywnie i powtarzalnie znakują te same podzbiory neuronów10-13. Te transgeniczne linie mogą być używane do selektywnego manipulowania aktywnością znakowanych neuronów (aktywacji lub hamowania), a te manipulacje mogą być wykorzystywane do badania, w jaki sposób funkcje neuronalne kierują zachowaniami.

Opracowano wiele testów behawioralnych do badania różnych zachowań Drosophila. Drosophila, podobnie jak wiele zwierząt, wykorzystuje swój zmysł węchu do kierowania wieloma wyborami behawioralnymi, takimi jak znajdowanie pożywienia, znajdowanie partnerów i unikanie niebezpieczeństw. Węch jest zatem dobrym systemem sensorycznym do badania, w jaki sposób bodźce zewnętrzne są wykrywane i interpretowane przez układ nerwowy zwierzęcia w celu kierowania odpowiednimi wyborami. W związku z tym opracowano szereg testów do badania zachowań węchowych larw i dorosłych. Tradycyjnie, zachowania węchowe u Drosophila były badane za pomocą paradygmatu labiryntu T-labiryntu dwóch wyborów, który można wykorzystać do oznaczania wrodzonych i wyuczonych zachowań węchowych3. W tym teście około 50 much ma do wyboru dwie rurki: jedna rurka zawiera dany zapach, a druga zawiera kontrolny środek zapachowy (zwykle rozpuszczalnik zapachowy). Muchy mają określony czas na dokonanie wyboru, a następnie zliczana jest liczba much znajdujących się w różnych komorach. Chociaż labirynt T jest prostym testem dla wielu eksperymentów, istnieje kilka ograniczeń. Na przykład zachowania węchowe są mierzone tylko w jednym punkcie czasowym, a różne wybory dokonane przed tym punktem czasowym są odrzucane. Podobnie zaniedbywane są indywidualne zachowania much w populacji. Ponadto labirynt w kształcie litery T wymaga ręcznego liczenia much, co może powodować błędy. Wreszcie, ponieważ istnieją tylko dwie mierzone opcje, zmniejsza to moc statystyczną często wymaganą do wykrycia subtelnych zmian w zachowaniu. Alternatywą dla labiryntu dwustopniowego wyboru jest olfaktometr czterokwadrantowy (czteropolowy)14-18. W tym teście zwierzęta eksplorują arenę, w której każdy z czterech rogów areny jest wypełniony potencjalnym źródłem nawanianego powietrza. Arena ma pomarszczony kształt gwiazdy, aby zmaksymalizować tworzenie się czterech eksperymentalnie zdefiniowanych kwadrantów zapachowych. Jeśli zapach jest dostarczany w jednym z rogów, to jest on zawarty tylko w tym jednym kwadrancie. Zachowania zwierząt można śledzić, gdy wchodzą i wychodzą z kwadrantu zapachu, i łatwo porównywać je z ich zachowaniem w trzech kwadrantach kontrolnych. Czterokwadrantowy test olfaktometryczny rejestruje zatem przestrzenną i czasową reakcję behawioralną na bodźce zapachowe na dużej arenie eksperymentalnej.

Czterokwadrantowy olfaktometr został po raz pierwszy opracowany przez Petterssona i wsp.15 oraz Vet i wsp.17 w celu zbadania węchowych reakcji behawioralnych poszczególnych pasożytniczych błonkoskrzydłych. Faucher i wsp.18 oraz Semmelhack i Wang16 dostosowali konfigurację do monitorowania reakcji węchowych poszczególnych Drosophila. Czterokwadrantowy olfaktometr jest równie czuły na reakcje przyciągające i odpychające, co pozwala na szeroki zakres testowych substancji zapachowych i warunków. Specjalnie napisane oprogramowanie do śledzenia much, opracowane przez Alexa Katsova19 i obecnie utrzymywane przez Juliana Browna (szczegółowo opisane w Materiałach), wprowadziło dodatkowe zalety do nowszych implementacji czterokwadrantowego olfaktometru14,20-23. Obecnie możliwe jest jednoczesne oznaczanie do 100 much w wysokiej rozdzielczości przestrzennej (27,5 pikseli/cm) i czasowej (30 klatek na sekundę), co pozwala na wyodrębnienie różnych parametrów, takich jak pozycja, prędkość i przyspieszenie much w dowolnym punkcie czasowym. Umożliwia to badanie dynamiki reakcji behawioralnych much na zapachy20. Należy jednak zauważyć, że tożsamość poszczególnych much w populacji przez cały okres obserwacji nie jest zachowana. Zamiast tego każdy ślad lotu jest rejestrowany tak długo, jak długo dwie ścieżki lotu się nie przecinają. W tym momencie po rozejściu się much przypisywane są nowe ślady. Dzięki zastosowaniu innego oprogramowania do przechwytywania wideo (szczegółowo opisanego w tabeli materiałów), ta sama konfiguracja umożliwia elastyczne okresy śledzenia i może być używana do śledzenia much przez maksymalnie 24 godziny, robiąc zdjęcia z niższą liczbą klatek na sekundę. Opcja ta została wykorzystana do zbadania zachowań muszek związanych ze składaniem jaj i porównania ich pozycji ciała z preferencjami składania jaj14. Czteropolowy olfaktometr może być również wykorzystywany do badania reakcji na bodźce multimodalne (np. węchowe i wzrokowe) lub do łączenia stymulacji optogenetycznej9 lub termogenetycznej21 z prezentacją bodźców sensorycznych. Co więcej, wysoka rozdzielczość czasowa pozwala na wyodrębnienie trajektorii dla każdej pojedynczej muchy w zbiorze danych zespołowych. W związku z tym metoda ta pozwala na badanie zachowań populacji sterowanych węchem, a także indywidualnych interakcji społecznych. Dane wygenerowane przez ten test są solidne i wysoce powtarzalne, co pozwala na wykorzystanie olfaktometru czteropolowego do badań behawioralnych.

Opisujemy tutaj zestaw ustawień dla czterokwadrantowego olfaktometru. Ponadto wykazujemy jego zastosowanie w oznaczaniu przyciągania węchowego w odpowiedzi na ocet jabłkowy i odpychania w odpowiedzi na wysoko skoncentrowany propionian etylu. Na koniec opisujemy i udostępniamy przykładowy kod do analizy zarejestrowanych danych śledzenia much.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Montaż zestawu

  1. Wykonaj arenę w kształcie gwiazdy (19,5 cm na 19,5 cm na 0,7 cm) z politetrafluoroetylenu (PTFE) zgodnie z załączonym rysunkiem (Supplementary Materials, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Arena może zostać wykonana w zakładzie komercyjnym lub specjalistycznym.
  2. Przygotuj dwie płyty szklane (20,25 cm na 20,25 cm o grubości 2 mm) i wywierć otwór (o średnicy ok. 0,7 cm) dokładnie w centrum jednej z płyt szklanych, używając wiertła diamentowego.
  3. Wykonaj szczelną pod względem światła komorę behawioralną dla areny. Wykonaj również szczelną pod względem światła obudowę dla podczerwienianej kamery CCD zgodnie z załączonymi rysunkami (Supplementary Materials, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Obudowy mogą zostać wykonane w zakładzie komercyjnym lub specjalistycznym.
  4. Zamontuj jednostkę klimatyzacyjną na tylnej ścianie, a matryce LED na ścianach bocznych komory behawioralnej. Umieść sondę temperatury w komorze behawioralnej przez otwór boczny w celu monitorowania i regulacji temperatury w czasie rzeczywistym (szczegóły znajdują się na Rysunkach 1 i 2).
  5. Zamocuj filtr IR oraz polaryzator kołowy do kamery, a następnie zamontuj cały zestaw w obudowie kamery. Komora behawioralna i obudowa kamery są oddzielone szklanym oknem, co zapewnia lepszą kontrolę temperatury w komorze behawioralnej (szczegóły znajdują się na Rysunkach 1 i 2).
  6. Podłącz podczerwoną kamerę CCD do adaptera kamery. Podłącz adapter kamery do konwertera USB. Podłącz konwerter USB do portu USB w komputerze służącym do akwizycji danych.
  7. Zainstaluj sterownik konwertera wideo w komputerze zgodnie z instrukcją producenta. Opcjonalnie zainstaluj oprogramowanie do przetwarzania obrazu dostarczone przez producenta konwertera wideo USB, aby uzyskać dostęp do szerszego zakresu ustawień kamery i parametrów akwizycji.
  8. Podłącz jednostkę klimatyzacyjną (przez wyjście „output” z tyłu kontrolera temperatury) oraz sondę temperatury (przez wejście „thermocouple” z tyłu kontrolera temperatury) do kontrolera temperatury. Umieść sondę w komorze behawioralnej.
    Uwaga: System kontroli temperatury w naszej konfiguracji jest w stanie utrzymać temperaturę w komorze w zakresie od 18 °C do 30 °C. Wyższe lub niższe temperatury otoczenia mogą być przydatne w eksperymentach termogenetycznych (dTrpA1, TrpM8 lub shibirets) w celu manipulacji aktywnością neuronalną lub hamowania przekaźnictwa synaptycznego. W większości eksperymentów temperatura jest utrzymywana na poziomie 25 °C.
  9. Zmontuj system podawania zapachów w następujących krokach (szczegółowe schematy i złączki znajdują się na Rysunku 1B):
    1. Użyj regulatora ciśnienia powietrza, aby kontrolować dopływ powietrza z centralnego systemu powietrznego. Podłącz węglowy filtr powietrza (wypełniony węglem aktywnym) do regulatora ciśnienia, aby oczyścić powietrze z centralnego systemu.
    2. Zmontuj system kontroli przepływu składający się z wielu kanałów regulowanych przez wysokorozdzielcze rurki przepływomierza.
    3. Podłącz wyjście z węglowego filtra powietrza do rurek przepływomierza za pomocą kolektora, jak pokazano na Rysunku 1B i 2F. Skieruj wyjście z rurek przepływomierza przez elektronicznie sterowane trójdrożne zawory elektromagnetyczne, aby regulować, czy czyste powietrze opuszczające przepływomierze jest wydmuchiwane do pomieszczenia, czy wprowadzane do specjalnie wykonanych komór zapachowych24.
    4. Zainstaluj sterownik zaworów elektromagnetycznych zgodnie z instrukcją producenta.
  10. Zainstaluj elektroniczny przepływomierz powietrza, podłączając go do urządzenia akwizycji danych (DAQ) i zasilacza zgodnie z instrukcją producenta. Zainstaluj oprogramowanie interfejsu DAQ, aby przed każdym eksperymentem zweryfikować równość przepływów w każdym kwadrancie areny.

2. Przygotowanie bodźców węchowych

  1. Przygotować 5 komór zapachowych24, które składają się z plastikowego zewnętrznego pojemnika, szklanego wewnętrznego pojemnika, wykonanej na zamówienie wkładki do pokrywy z PTFE, oryginalnej pokrywy pojemnika z usuniętą częścią środkową oraz dwóch zaworów jednokierunkowych.
    Uwaga: Aby zapobiec wyciekom powietrza z komory zapachowej podczas perfuzji zapachu, można zastosować uszczelkę typu O-ring wokół pokrywy z PTFE. Schemat przedstawiono na Rysunku 1, a zdjęcia komór na Rysunku 2.
  2. Cztery komory zapachowe wykorzystać jako kontrole rozpuszczalnika, a jedną dla testowanego zapachu. Napełnić szklane pojemniki 1 000 µl rozpuszczalnika lub rozcieńczenia zapachu (zapachy testowe + odpowiednie rozpuszczalniki, dokładnie wymieszać przed eksperymentami), umieścić szklany pojemnik w odpowiadającej mu plastikowej komorze (uważając, aby nie wylać cieczy do plastikowej komory) i mocno dokręcić pokrywę. Należy zawsze używać czystej komory dla zapachu testowego oraz kontroli rozpuszczalnika.
    Uwaga: Przyciąganie węchowe można wywołać za pomocą 1/16 rozcieńczenia octu jabłkowego (kwasowość 5%) w wodzie. Z kolei zachowanie odpychania węchowego można badać, stosując 10% rozcieńczenie propionianu etylu w oleju mineralnym. Bodźcami kontrolnymi w tych przypadkach są komory zapachowe z czystym olejem mineralnym.

3. Przygotowanie much

  1. Hoduj muchy na standardowym podłożu kukurydzianym. Umieść 30 samców i 30 samic much rodzicielskich w standardowej butelce i pozwól im składać jaja przez 5 dni w temperaturze 25 °C lub w temperaturze pokojowej.
  2. Dla każdego eksperymentu należy zebrać nowo wyklute (<(1. dnia życia) 25 samców i 25 samic much pod wpływem krótkotrwałego działania CO22 znieczulenie
  3. Przechowywać muchy w fiolce ze standardową pożywką dla much przez 2–4 dni.
  4. Na 40–42 godziny przed eksperymentem przenieść muchy bez użycia CO2 znieczulenie do probówki zawierającej ok. 10 ml 1% żelu agarozowego. Pozwoli to utrzymać wilgotność otoczenia much przy jednoczesnym braku pożywienia, co sprzyja zwiększeniu ich aktywności lokomotorycznej.
    Uwaga: Głodówka powinna zakończyć się przeżyciem ponad 90% much. Niektóre genotypy charakteryzują się gorszym stanem zdrowia i mogą nie przetrwać 40-godzinnej głodówki. W takich przypadkach dopuszczalne jest skrócenie tego czasu do 24–28 godzin, jednak okres ten musi być jednakowy dla wszystkich warunków doświadczalnych i powtórzeń.

4. Reakcje behawioralne na zapachy atrakcyjne i repelentne

  1. Włącz kontroler temperatury i ustaw go na 25 °C.
  2. Połącz komory zapachowe (kontrolną i testową), wkładając rurkę do wylotu komory zapachowej oraz do szybkozłączki w pudełku behawioralnym.
  3. Sprawdź przepływ w każdym kwadrancie za pomocą miernika przepływu powietrza, aby upewnić się, że strumienie powietrza kontrolnego i substancji zapachowej wynoszą 100 ml/min.
  4. Przeczyść arenę dla muszek z PTFE oraz szklane płytki 70-procentowym etanolem 2–3 razy i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu (~3–4 min).
  5. Przymocuj szklane płytki do areny za pomocą zacisków.
  6. Przenoszenie much bez CO2 znieczulenie do areny przez otwór w jednej z szklanych płytek. Po przeniesieniu należy umieścić nad otworem okrągłą siatkę, aby zapobiec ucieczce much.
    Uwaga: CO2 wykazano, że znieczulenie wpływa na Muszka owocówka zachowanie25 i nie powinno być stosowane na 24 godziny przed eksperymentem behawioralnym.
  7. Umieść arenę z muchami w światłoszczelnej komorze, podłącz cztery strumienie powietrza sterującego, łącząc rurki przymocowane do szybkozłączek w skrzynce behawioralnej z narożnikami areny, zamknij drzwi komory i odczekaj 10–15 min, aby muchy zaaklimatyzowały się w nowym środowisku. Jeśli to możliwe, wyłącz światła w pomieszczeniu, w którym prowadzone są eksperymenty, aby uniknąć ewentualnych minimalnych przecieków światła, które mogłyby wpłynąć na wynik eksperymentu.
  8. Przeprowadź 5–10 minutowy eksperyment kontrolny, w którym muchy zostaną poddane działaniu 4 kontrolnych strumieni powietrza.
  9. Należy niezwłocznie przeanalizować dane (patrz sekcja Analiza danych poniżej), aby upewnić się, że muchy są rozmieszczone w arenie równomiernie, a indeks atrakcyjności (Attraction Index) jest bliski 0. Krok ten jest niezbędny, ponieważ pozwala zweryfikować brak niekontrolowanych źródeł preferencji lub unikania w obrębie areny (np. przenikanie światła z zewnątrz, nierównomierny rozkład temperatury, nierówna arena, zanieczyszczenie zapachowe, itd.). Jeśli muchy są rozłożone nierównomiernie lub ich aktywność lokomotoryczna jest niska, należy je usunąć, ponownie oczyścić arenę (krok 4.4) i użyć nowej partii much w celu powtórzenia eksperymentu.
  10. Podłącz komorę z testowym odorantem do układu, przełączając zawory trójdrożne lub przepinając rurki łączące.
  11. Przeprowadź eksperyment testowy przez 5–10 min i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w sekcji 5 poniżej (patrz również Odnośnik 14 i Rysunek 3Nagrania trwające powyżej 20 min mogą generować pliki danych, których przetwarzanie obliczeniowe może być utrudnione. W przypadku potrzeby przeprowadzenia dłuższych nagrań eksperymentalnych należy szybko zatrzymać i ponownie uruchomić program do śledzenia. Powoduje to powstanie około 10-sekundowej przerwy między nagraniami eksperymentalnymi.
  12. Zutylizuj muchy.
  13. Oczyścić arenę oraz szalki szklane 70% etanolem (Krok 4.4) i wymienić rurki łączące wewnątrz szczelnej osłony świetlnej. Aby przyspieszyć przebieg eksperymentów, można użyć nowej, czystej areny, a zabrudzoną arenę wyczyścić w trakcie przeprowadzania serii pomiarowych.
  14. W razie potrzeby przeprowadź kolejny eksperyment z nową partią much. Jeśli tego samego dnia wykonuje się kilka eksperymentów, należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że w układzie nie pozostały substancje zapachowe z poprzedniego testu. Zazwyczaj nie stanowi to problemu przy niskich stężeniach substancji zapachowych lub przy użyciu CO2.2natomiast w przypadku silnie skoncentrowanych bodźców może być wymagana przerwa do 24 h między seriami pomiarowymi. Ponadto, jeśli podczas eksperymentów kontrolnych podejrzewa się zanieczyszczenie substancją zapachową, można wymienić wszystkie rurki znajdujące się za rurkami przepływowymi. Pomiędzy eksperymentami należy zawsze pozostawić włączony przepływ suchego powietrza w celu ciągłego płukania układu.

5. Analiza danych

Uwaga: sugerowane oprogramowanie do śledzenia much (opisane szczegółowo w sekcji Materiały) śledzi muchy w czasie rzeczywistym podczas akwizycji i zapisuje znaczniki czasu oraz współrzędne wszystkich wykrytych much w formacie *.dat. Opracowaliśmy autorską procedurę w programie Matlab, aby przekonwertować dane na format Matlab oraz przeprowadzić ich analizę. Przykłady kodu znajdują się w Materiałach Uzupełniających, jednak szczegóły implementacji będą zależne od oprogramowania wykorzystanego do akwizycji danych.

  1. Wczytaj surowe dane. Utwórz maskę przestrzenną dopasowaną do konturów areny i zastosuj ją do surowych danych, aby usunąć wszystkie punkty danych znajdujące się poza areną, ponieważ reprezentują one szum (Rycina 4A, Kod uzupełniający MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
  2. Usuń wszystkie punkty danych, które poruszają się z prędkością poniżej 0.163 cm/s przez czas dłuższy niż 3s, ponieważ dane te prawdopodobnie są szumem lub zostały wygenerowane przez nieruchome muchy (Rycina 4B, Kod uzupełniający TemporalFiltering.m).
  3. Wizualizuj pozostałe punkty danych, wykreślając je wszystkie jednocześnie lub jako pojedyncze trajektorie (Rycina 3, Kod uzupełniający SingleTrajectoryViewer.m).
    Uwaga: Położenie granic zapachowych w czteropolowym układzie prawdopodobnie zależy od szeregu czynników, takich jak charakterystyka każdego substancji zapachowej i stosowane natężenia przepływu powietrza. Na przykład substancje silnie lotne będą prawdopodobnie wypełniać kwadrant zapachowy bardziej całkowicie niż substancje mniej lotne. Zatem prawdopodobne jest, że każda substancja zapachowa może wykazywać nieco inne granice zapachowe. Stosowanie detektora fotojonizacyjnego do pomiaru granic zapachowych może być problematyczne, ponieważ wykorzystuje on próżnię do pobierania próbek powietrza z konkretnego miejsca, co zaburza stężenie substancji zapachowej w tym punkcie. Niemniej jednak granice zapachowe można szybko oszacować na podstawie danych behawioralnych much. Na przykład granicę zapachową opartą na skumulowanych ścieżkach much w odpowiedzi na różne zapachy można wyraźnie zaobserwować na Ryciniach 3C oraz 3D.
  4. Oblicz indeks atrakcyjności, aby określić, czy eksperymenty kontrolne nie generują odpowiedzi preferencyjnej, a także aby ocenić odpowiedź na bodziec zapachowy (lub optogenetyczny9). Aby obliczyć Indeks Atrakcyjności (AI), wykorzystaj ostatnie 5 min nagrania kontrolnego lub testowego. W celu uzyskania miary atrakcyjności mieszczącej się w przedziale od +1 (absolutna atrakcyjność) do -1 (absolutna repulsja), do obliczenia AI stosuje się następujący wzór:
    Równanie AI dla analizy eksperymentalnej grup testowych względem kontrolnych.
    gdzie Ntest to liczba punktów danych w kwadrancie testowym, a Ncontrol to średnia liczba punktów danych w trzech kwadrantach kontrolnych. Miara ta jest intuicyjna, ponieważ brak preferencji byłby wskazywany przez wartości bliskie zeru. Nie wskazuje ona jednak poprawnie proporcji całkowitej liczby much znajdujących się w kwadrancie zapachowym. Aby uzyskać tę miarę, można zastosować Indeks Procentowy (PI):
    Równanie indeksu wydajności, PI = N_test/N_total, powiązane z obliczeniami badawczymi.
    gdzie Ntest to liczba punktów danych w kwadrancie testowym, a Ntotal to całkowita liczba punktów danych we wszystkich czterech kwadrantach. Formuła ta dostarcza miary mieszczącej się w przedziale od 0 do 1, gdzie 0.25 odpowiada brakowi preferencji behawioralnej (Rycina 3E oraz 4C, Kod uzupełniający AttractionIndex.m).
  5. Wykonaj od 5 do 10 powtórzeń dla każdego warunku eksperymentalnego, używając nowej grupy much dla każdego powtórzenia. Porównaj indeksy atrakcyjności między warunkami lub względem grup kontrolnych, stosując nieparametryczny test Kołmogorowa-Smirnowa (Rycina 3F, funkcja kstest2 w programie Matlab).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test w olfaktometrze czterokwadratowym rejestruje i analizuje aktywność lokomozyjną wielu much w szerokiej przestrzeni behawioralnej. Substancje zapachowe mogą być wprowadzane do strumieni powietrza wlatujących do jednego, dwóch, trzech lub wszystkich czterech kwadrantów. W przypadku braku zapachów muchy będą swobodnie przemieszczać się między wszystkimi czterema kwadrantami. Obserwacja tego zachowania jest kluczowa, ponieważ wskazuje ona, że w teście nie wprowadzono niezamierzonych błędó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj olfaktometr czteropolowy jest wszechstronnym systemem behawioralnym do badania reakcji węchowych dużych populacji dzikich i zmutowanych much Drosophila . Każdy eksperyment trwa ~1 godzinę (w tym konfiguracja, przebiegi eksperymentalne i czyszczenie), a każdego dnia można rutynowo przeprowadzać 4-6 eksperymentów. Typowy test wykorzystujący 40-50 much przez 5 minut generuje około 450 000 śledzonych punktów danych do analizy. Opisana konfiguracja może być również używana, z niewielkimi modyfikacjami, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Terry'emu Shelleyowi za wykonanie hali do much, Liz Marr za pomoc w utrzymaniu much, oraz Xiaojing Gao i Junjie Luo za pomoc przy kodzie Matlab używanym do analizy danych. Dziękujemy Johanowi Lundströmowi z Monell Chemical Senses Center za zademonstrowanie jego konfiguracji dostarczania zapachów. Prace te były wspierane przez granty z Whitehall Foundation (CJP) i NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System dostarczania powietrza  (Potrzebna ilość)
Rurki i łączniki
Termoplastyczne kolektory NPT(F)Cole-Parmer, IL, USAR-31522-311
Złączka redukcyjna sześciokątna (1/4MNPT->1/8MNPT)McMaster-Carr, IL, USA5232T3141
Rurka ( ID:1/8)McMaster-Carr, IL, USA5108K4350 Ft
Rurka (ID:1/16)McMaster-Carr, IL, Stany Zjednoczone52355K41100 Ft
Łączniki rurowe kolczasteMcMaster-Carr, IL, USA5117K711 opakowanie
Złączki rurowe wciskane do pęczkówMcMaster-Carr, IL, USA5779K1024
Złączki rurowe z zadziorami (1/4MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, Stany Zjednoczone5463K4391 opakowanie (10)
Złączki rurowe kolczaste (1/8MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K4382 paczki (10) 
Złączki do rur kolczastych (1/8MNPT->1/16BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K42 opakowania (10) 
Złączki do rur kolczastych (1/4MNPT->1/4BF)McMaster-Carr, IL, USA&nbsp; 5670K841
wtyczka z sześciokątnymMcMaster-Carr, IL, USA48335K1521
regulator ciśnienia powietrza, filtr powietrza i przepływomierze(Potrzebna ilość)
Urządzenie do suszenia gazu labatoryjnegoW A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, Stany ZjednoczoneModel: L68-NP-303; nr urządzenia #268401
Ramki wielorurowe do rur przepływowych 150 mmCole-Parmer, IL, USAR03215-301
Ramki wielorurowe do rur przepływowych 150 mmCole-Parmer, IL, USAR03215-761
Rurki przepływowe 150 mmCole-Parmer, IL, USAR-03217-159
Wkład zaworuCole-Parmer, IL, USAR-03218-729
Precyzyjny regulator powietrzaMcMaster-Carr, IL, USA6162K131
Zawory elektromagnetyczneAutomate Scientific, Berkeley, CA02-10i4
Sterownik zaworu elektromagnetycznegoValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA01-181
Elektroniczny przepływomierzHoneywellAWM3100V1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) i National InstrumentsNI USB-60091
ZasilaczExtech Instruments3822001
Komory zapachowe
Polipropylen Słoik z szerokimi ustami 2 uncje; 60 mlNalgene562118-0002Wymagane jest co najmniej 5 na eksperyment, ale dla każdego rozcieńczenia każdego środka zapachowego wymagana jest osobna komora. Dostępne w Container Store, część #635114)
Szklana komora zapachowa, 0.25 uncjiButelka SunburstLB4BWymagane jest co najmniej 5 na eksperyment 
Zawór "wewnętrzny" do komory zapachowejSmart Products, Inc., CA, USA214224PB-0011S000-40741 z tych części jest używany w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
Zawór "wyjściowy" do komory zapachowejSmart Products, Inc., CA, USA224214PB-0011S000-40741 z tych części jest używany w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
O-ringRT Dygert International, MN, USAAS568-029 Buna-N O-R1 opakowanie (100)
Fly arena, kamery i pudełka behawioralne(Potrzebna ilość)
Zachowanie i materiał pudełka na kameręTworzywa sztuczne międzystanowe, CA, USAABS wytłaczany (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 cale
kwadratoweTeflon do areny muchowej i wkładów komory zapachowej, grubość 3/8", 12" x 12"McMaster-Carr, IL, USA8545K27 1
Płyty szklane, grubość 1/8", 9" x 9"McMaster-Carr, IL, USA8476K191 cyfra arabska
Sterownik termoelektryczny dwustronnego działaniaWAtronix Inc, CA, USADA12V-K-01
tablica diod LED IRZaawansowane oświetlenie, Rochester, VT, USAAL4554-88024, PS24-TL2 tablice LED i jeden zasilacz
KlimatyzatorMelcor Store  MAA280T-121
System obrazowania(Potrzebna ilość)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) Obiektyw z mocowaniem CB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USAKP1
połączeniowy CCXC-12P05NB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASOCCXC12P05N1
DC-700 Adapter do aparatuB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASODC700 1
B+W 40,5 093 Filtr podczerwieniB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA65-0724421
TiFFEN 40.5 mm Polaryzator kołowyAmazon1
Kamera wideo na podczerwieńPrzemysłowe źródło wizji, FL, USASony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
Konwerter wideo USBThe Imagingsource, NC, USADFG/USB2-It1
iFlySpy2 (oprogramowanie do śledzenia much)Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
IC Capture oprogramowanie 2.2The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous(Potrzebna ilość)
Dremel narzędzie obrotoweDremel, Racine, WI, USADremel 8000-03 1
Wiertła z powłoką diamentową do cięcia szkłaDostępne u różnych dostawców; MSC Industrial Supply Co, Melville, Nowy Jork906063281
PEC21211

Bibliografia

  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580(2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986(2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361(2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test zachowania w chowegoledzenie Drosophilakonfiguracja komory zapachowejanaliza populacji muszekweryfikacja szybko ci przep ywu powietrzaskrypt analizy danychobliczanie indeksu atrakcyjno ciodpowied na bodziec w chowykwantyfikacja danych behawioralnych
Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.