Artykuł metodologiczny

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

DOI:

10.3791/54346

⸱

20 sierpnia 2016

 ,  , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym wyzwaniem w neurobiologii jest zrozumienie, jak funkcjonują obwody neuronalne, które kierują odpowiednimi zachowaniami zwierząt. Drosophila melanogaster jest doskonałym systemem modelowym do takich badań ze względu na swoje złożone zachowania, potężne techniki genetyczne i zwarty układ nerwowy. Laboratoryjne testy behawioralne są od dawna stosowane w przypadku Drosophila do symulacji właściwości środowiska naturalnego i badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw odpowiednich zachowań (np. fototaksja, chemotaksja, uczenie się sensoryczne i pamięć)1-3. Wraz z niedawną dostępnością dużych zbiorów transgenicznych linii Drosophila, które oznaczają określone podzbiory neuronalne, testy behawioralne nabrały znaczącej roli w łączeniu neuronów z zachowaniami4-11. Wszechstronne i powtarzalne paradygmaty, wraz z leżącymi u ich podstaw procedurami obliczeniowymi do analizy danych, są niezbędne do szybkich testów kandydujących linii muchowych o różnych genotypach. Szczególnie przydatne są setupy, które są elastyczne pod względem liczby badanych zwierząt, czasu trwania eksperymentów i charakteru prezentowanych bodźców. Wybrany test powinien również generować powtarzalne dane, które są łatwe do pozyskania i analizy. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis systemu i protokołu do oznaczania reakcji behawioralnych much Drosophila na dużej czteropolowej arenie. Konfiguracja służy tutaj do oznaczania reakcji much na pojedynczy bodziec węchowy; Jednak ta sama konfiguracja może być modyfikowana w celu przetestowania wielu bodźców węchowych, wzrokowych lub optogenetycznych lub ich kombinacji. Konfiguracja olfaktometryczna rejestruje aktywność populacji much reagujących na zapachy, a do ilościowego określenia zachowań much stosuje się obliczeniowe metody analityczne. Zebrane dane są analizowane w celu uzyskania szybkiego odczytu przebiegu eksperymentalnego, co jest niezbędne do efektywnego zbierania danych i optymalizacji warunków eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do adaptacji i reagowania na środowisko zewnętrzne jest kluczowa dla przetrwania wszystkich zwierząt. Zwierzę musi unikać niebezpieczeństw, szukać pożywienia i partnerów, a także uczyć się na podstawie wcześniejszych doświadczeń. Systemy sensoryczne funkcjonują w celu odbierania różnych bodźców, takich jak wzrokowe, chemiczne i mechanosensoryczne, i wysyłają te sygnały do ośrodkowego układu nerwowego w celu ich interpretacji i dekodowania. Następnie mózg kieruje odpowiednimi zachowaniami motorycznymi w oparciu o postrzegane środowisko, takie jak poszukiwanie pożywienia lub ucieczka przed drapieżnikiem. Zrozumienie, w jaki sposób systemy sensoryczne wykrywają ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja zespołu

  1. Wykonać arenę w kształcie gwiazdy (19.5 cm na 19.5 cm na 0.7 cm) z politetrafluoroetylenu (PTFE) zgodnie z dostarczonym rysunkiem (Materiały uzupełniające, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Arena może być wyprodukowana przez obiekt komercyjny lub niestandardowy.
  2. Zaopatrz się w dwie szklane płytki (20,25 cm na 20,25 cm o grubości 2 mm) i wywierć otwór (o średnicy ~0,7 cm) dokładnie na środku jednej ze szklanych płytek za pomocą wiertła z powłoką diamentową.
  3. Wyprodukuj światłoszczelne pudełko behawioralne dla areny behawioralnej. Należy również wyprodukować światłoszczelną obudowę kamery do kamery wideo CCD ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czterokwadrantowy test olfaktometryczny rejestruje i analizuje aktywność chodzenia wielu much na dużej przestrzeni behawioralnej. Substancje zapachowe mogą być wprowadzane do strumieni powietrza, które wchodzą do jednego, dwóch, trzech lub wszystkich czterech kwadrantów. W przypadku braku zapachów muchy będą swobodnie poruszać się między wszystkimi czterema kwadrantami. To zachowanie jest kluczowe do zaobserwowania, ponieważ wskazuje, że niezamierzone błędy systematyczne nie zostały wprow.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj olfaktometr czteropolowy jest wszechstronnym systemem behawioralnym do badania reakcji węchowych dużych populacji dzikich i zmutowanych much Drosophila . Każdy eksperyment trwa ~1 godzinę (w tym konfiguracja, przebiegi eksperymentalne i czyszczenie), a każdego dnia można rutynowo przeprowadzać 4-6 eksperymentów. Typowy test wykorzystujący 40-50 much przez 5 minut generuje około 450 000 śledzonych punktów danych do analizy. Opisana konfiguracja może być również używana, z niewielkimi modyfikacjami, .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Terry'emu Shelleyowi za wykonanie hali do much, Liz Marr za pomoc w utrzymaniu much, oraz Xiaojing Gao i Junjie Luo za pomoc przy kodzie Matlab używanym do analizy danych. Dziękujemy Johanowi Lundströmowi z Monell Chemical Senses Center za zademonstrowanie jego konfiguracji dostarczania zapachów. Prace te były wspierane przez granty z Whitehall Foundation (CJP) i NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System dostarczania powietrza  (Potrzebna ilość)
Rurki i łączniki
Termoplastyczne kolektory NPT(F)Cole-Parmer, IL, USAR-31522-311
Złączka redukcyjna sześciokątna (1/4MNPT->1/8MNPT)McMaster-Carr, IL, USA5232T3141
Rurka ( ID:1/8)McMaster-Carr, IL, USA5108K4350 Ft
Rurka (ID:1/16)McMaster-Carr, IL, Stany Zjednoczone52355K41100 Ft
Łączniki rurowe kolczasteMcMaster-Carr, IL, USA5117K711 opakowanie
Złączki rurowe wciskane do pęczkówMcMaster-Carr, IL, USA5779K1024
Złączki rurowe z zadziorami (1/4MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, Stany Zjednoczone5463K4391 opakowanie (10)
Złączki rurowe kolczaste (1/8MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K4382 paczki (10) 
Złączki do rur kolczastych (1/8MNPT->1/16BF)McMaster-Carr, IL, USA5463K42 opakowania (10) 
Złączki do rur kolczastych (1/4MNPT->1/4BF)McMaster-Carr, IL, USA  5670K841
wtyczka z sześciokątnymMcMaster-Carr, IL, USA48335K1521
regulator ciśnienia powietrza, filtr powietrza i przepływomierze(Potrzebna ilość)
Urządzenie do suszenia gazu labatoryjnegoW A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, Stany ZjednoczoneModel: L68-NP-303; nr urządzenia #268401
Ramki wielorurowe do rur przepływowych 150 mmCole-Parmer, IL, USAR03215-301
Ramki wielorurowe do rur przepływowych 150 mmCole-Parmer, IL, USAR03215-761
Rurki przepływowe 150 mmCole-Parmer, IL, USAR-03217-159
Wkład zaworuCole-Parmer, IL, USAR-03218-729
Precyzyjny regulator powietrzaMcMaster-Carr, IL, USA6162K131
Zawory elektromagnetyczneAutomate Scientific, Berkeley, CA02-10i4
Sterownik zaworu elektromagnetycznegoValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA01-181
Elektroniczny przepływomierzHoneywellAWM3100V1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) i National InstrumentsNI USB-60091
ZasilaczExtech Instruments3822001
Komory zapachowe
Polipropylen Słoik z szerokimi ustami 2 uncje; 60 mlNalgene562118-0002Wymagane jest co najmniej 5 na eksperyment, ale dla każdego rozcieńczenia każdego środka zapachowego wymagana jest osobna komora. Dostępne w Container Store, część #635114)
Szklana komora zapachowa, 0.25 uncjiButelka SunburstLB4BWymagane jest co najmniej 5 na eksperyment 
Zawór "wewnętrzny" do komory zapachowejSmart Products, Inc., CA, USA214224PB-0011S000-40741 z tych części jest używany w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
Zawór "wyjściowy" do komory zapachowejSmart Products, Inc., CA, USA224214PB-0011S000-40741 z tych części jest używany w komorze zapachowej, ale należy je często wymieniać
O-ringRT Dygert International, MN, USAAS568-029 Buna-N O-R1 opakowanie (100)
Fly arena, kamery i pudełka behawioralne(Potrzebna ilość)
Zachowanie i materiał pudełka na kameręTworzywa sztuczne międzystanowe, CA, USAABS wytłaczany (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 cale
kwadratoweTeflon do areny muchowej i wkładów komory zapachowej, grubość 3/8", 12" x 12"McMaster-Carr, IL, USA8545K27 1
Płyty szklane, grubość 1/8", 9" x 9"McMaster-Carr, IL, USA8476K191 cyfra arabska
Sterownik termoelektryczny dwustronnego działaniaWAtronix Inc, CA, USADA12V-K-01
tablica diod LED IRZaawansowane oświetlenie, Rochester, VT, USAAL4554-88024, PS24-TL2 tablice LED i jeden zasilacz
KlimatyzatorMelcor Store  MAA280T-121
System obrazowania(Potrzebna ilość)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) Obiektyw z mocowaniem CB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USAKP1
połączeniowy CCXC-12P05NB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASOCCXC12P05N1
DC-700 Adapter do aparatuB I H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USASODC700 1
B+W 40,5 093 Filtr podczerwieniB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA65-0724421
TiFFEN 40.5 mm Polaryzator kołowyAmazon1
Kamera wideo na podczerwieńPrzemysłowe źródło wizji, FL, USASony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
Konwerter wideo USBThe Imagingsource, NC, USADFG/USB2-It1
iFlySpy2 (oprogramowanie do śledzenia much)Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
IC Capture oprogramowanie 2.2The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous(Potrzebna ilość)
Dremel narzędzie obrotoweDremel, Racine, WI, USADremel 8000-03 1
Wiertła z powłoką diamentową do cięcia szkłaDostępne u różnych dostawców; MSC Industrial Supply Co, Melville, Nowy Jork906063281
PEC21211

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (8....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Olfactory Behavior AssayDrosophila TrackingFour quadrant OlfactometerOdorant Chamber SetupFly Population AnalysisAirflow Rate VerificationData Analysis ScriptAttraction Index CalculationOlfactory Stimulus ResponseBehavioral Data Quantification

Powiązane artykuły