Artykuł metodologiczny

Określanie supresji układu odpornościowego w porównaniu z ochroną OUN dla interwencji farmakologicznych w demielinizacji autoimmunologicznej

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54348

⸱

12 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham, 4Center for Glial Biology and Medicine, University of Alabama at Birmingham

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak określić, czy farmakologiczne leczenie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wykazuje ochronę OUN w wyniku tłumienia infiltracji komórek odpornościowych, czy też są neuroprotekcyjne podczas ataku infiltracji komórek odpornościowych.

Streszczenie

Główną cechą charakterystyczną autoimmunologicznej choroby demielinizacyjnej stwardnienia rozsianego (MS) jest infiltracja komórek immunologicznych do mózgu i rdzenia kręgowego, skutkująca zniszczeniem mieliny, co nie tylko spowalnia przewodzenie impulsów nerwowych, ale powoduje uszkodzenie aksonów powodujące pogorszenie motoryczne i poznawcze. Obecne metody leczenia stwardnienia rozsianego koncentrują się na osłabieniu infiltracji komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Zabiegi te zmniejszają liczbę nawrotów, poprawiając jakość życia, ale nie eliminują całkowicie nawrotów, więc długotrwała niepełnosprawność nie ulega poprawie. Dlatego uzasadnione są środki terapeutyczne chroniące OUN. Zarówno w modelach zwierzęcych, jak i u ludzi ze stwardnieniem rozsianym, wejście limfocytów T do OUN jest ogólnie uważane za inicjujące zdarzenie zapalne. Aby ocenić, czy lek chroni OUN, należy wykluczyć jakikolwiek potencjalny wpływ na infiltrację lub proliferację komórek odpornościowych na obrzeżach. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić, czy ochrona OUN obserwowana po interwencji lekowej jest konsekwencją osłabienia komórek odpornościowych naciekających OUN, czy też blokowania śmierci komórek OUN podczas uszkodzeń zapalnych. Możliwość zbadania metod leczenia stwardnienia rozsianego, które chronią OUN podczas uszkodzeń zapalnych, jest bardzo ważna dla postępu strategii terapeutycznych, ponieważ obecne metody leczenia zmniejszają, ale nie eliminują całkowicie nawrotów (tj. infiltracji komórek odpornościowych), pozostawiając OUN podatny na zwyrodnienie.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane (MS) charakteryzuje się zmianami zapalnymi, głównie w obszarach istoty białej mózgu we wczesnym stadium choroby. Po długotrwałej progresji atrofia istoty szarej jest wykrywana za pomocą obrazowania MRI i wyznacza neurodegeneracyjną fazę choroby. Reaktywne glejozy, demienizacja i uszkodzenie aksonów w istocie białej przypisuje się komórkom odpornościowym naciekającym OUN. Żadna z metod leczenia stosowanych obecnie w stwardnieniu rozsianym nie odwraca ani nie zapobiega bezpośrednio neurodegeneracji w OUN - zamiast tego zmniejszają stan zapalny poprzez osłabienie aktywacji limfocytów T i/lub infiltracji do OUN. Ponieważ nie ma lekarstwa na stwardnienie rozsiane, a pacjenci stosujący obecne metody leczenia nadal doświadczają progresji choroby, odkrycia leków, które zapobiegają demielinizacji i utracie neuronów, są niezwykle ważne. Jednak rozróżnienie między wpływem na komórki odpornościowe a wpływem na OUN może być trudne eksperymentalnie, ponieważ wynik - tj. zmniejszone uszkodzenie OUN - wygląda tak samo niezależnie od mechanizmów, przez które zachodzi. Dlatego ocena ochrony OUN musi być połączona z oceną komórek odpornościowych naciekających OUN i proliferacji komórek odpornościowych na obrzeżach, aby określić, w jaki sposób czynniki farmakologiczne wpływają na mechanizmy choroby.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to dobrze znany zwierzęcy model autoimmunologicznych zaburzeń zapalnych, który był bezpośrednio odpowiedzialny za odkrycie leków stosowanych obecnie w leczeniu SM 1-4. Myszy są często używane do EAE, przy czym myszy C57BL/6 są popularnym szczepem opartym na dostępności wariantów genetycznych. Myszy C57BL/6 indukowane EAE wykazują postęp choroby przewlekłej z początkiem około 10 dnia po indukcji. Naciekanie miąższu rdzenia kręgowego i móżdżku jest charakterystyczne dla histopatologii tych zwierząt, przy braku nacieku w miąższu korowym 5. Dodatkowo, uszkodzenia korowe i demienizacja w mózgu są cechami charakterystycznymi choroby 6-9, które są stosunkowo nieobecne u myszy C57BL / 6. Dlatego może być lepiej, jeśli to możliwe, użyć myszy SJL, które mają chorobę rzutowo-remisyjną i zmiany znalezione zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym, które wyglądają podobnie do tych w SM 10.

Leczenie nie może być sklasyfikowane jako neuroprotekcyjne, jeśli komórki odpornościowe nigdy nie dotrą do OUN. Dlatego protokół ten wykorzystuje analizę cytometrii przepływowej mózgów, rdzenia kręgowego i śledziony myszy EAE w celu określenia wpływu leczenia na infiltrację komórek odpornościowych do OUN i proliferację komórek odpornościowych na obrzeżach, jak wykazano wcześniej 11. Opisano również analizy immunohistochemiczne tkanki OUN w celu określenia zakresu i charakteru neuroprotekcji. Połączenie tych metod pozwala na określenie, czy komórki odpornościowe były aktywowane i proliferowane na obrzeżach, czy komórki odpornościowe dostały się do OUN i czy OUN był chroniony przed stanem zapalnym lub uszkodzeniem. Jeśli podejrzewa się działanie neuroprotekcyjne pomimo wpływu na układ odpornościowy, eksperymentatorzy mogą zmienić czas rozpoczęcia leczenia po wystąpieniu infiltracji komórek odpornościowych do OUN.

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący dwa różne modele aktywnego EAE, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego za pośrednictwem limfocytów T oraz analizę cytometrii przepływowej w połączeniu z immunohistochemią w różnych punktach czasowych choroby, aby określić skuteczność eksperymentalnych terapii na różnych aspektach patogenezy SM. Metoda ta pomoże naukowcom w różnicowaniu między wpływem na proliferację i infiltrację komórek odpornościowych a ochroną OUN, co ułatwi zawężenie wpływu leków na patogenezę choroby.

Protokół

Procedury eksperymentalne na myszach muszą być zgodne z odpowiednimi przepisami instytucjonalnymi i rządowymi. W niniejszym badaniu myszy były trzymane i leczone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i University of Alabama at Birmingham Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Wprowadzenie i punktacja EAE

  1. Indukuj EAE u myszy C57BL / 6 11-13 lub myszy SJL 10,11, jak opisano wcześniej 13.
    UWAGA: Eksperymentatorzy powinni wybrać model idealny dla swojego pytania badawczego (więcej szczegółów można znaleźć w dyskusji).
  2. Zapisuj wyniki codziennie, jak opisano wcześniej, 11 dla każdej myszy, począwszy od 7 dnia po indukcji. Porównaj średnie dzienne wyniki w czasie między grupami leczenia.

2. Leczenie

  1. Leczyć myszy EAE przed wystąpieniem choroby, aby ustalić, czy leczenie wpływa na infiltrację lub proliferację komórek odpornościowych.
    1. Wybierz leczenie, metodę dostarczania i częstotliwość leczenia, biorąc pod uwagę przepuszczalność bariery krew-mózg leku, okres półtrwania i dawkowanie.
      UWAGA: EAE zwiększa przepuszczalność bariery krew-mózg i może pozwolić lekom dotrzeć do OUN, co w innym przypadku nie byłoby możliwe u zdrowych zwierząt. Przeprowadzenie eksperymentów dotyczących krzywych dawka-odpowiedź z uwzględnieniem wyników klinicznych EAE może pomóc w doborze odpowiedniej dawki leku. Kontrole pojazdu powinny być przeprowadzane równolegle z leczeniem farmakologicznym. Alternatywnie, myszy z warunkowym nokautem mogą być używane z rodzeństwem z miotu jako kontrola.
    2. W tym eksperymencie użyj myszy SJL lub C57BL/6. Leczyć myszy wcześnie po indukcji EAE (dzień 7), przed wystąpieniem objawów, stosując wybraną metodę porodu.
    3. Uśmierc i poddaj myszy sekcji w szczycie choroby (około 15 dnia), jak w kroku 3.1 i jego podetapach, w oparciu o najwyższy średni wynik kliniczny w czasie.
    4. Przeprowadź cytometrię przepływową na rdzeniu kręgowym myszy (jak w kroku 3.2), aby określić infiltrację komórek odpornościowych w OUN, oraz na śledzionie (jak w kroku 3.3), aby określić proliferację komórek odpornościowych na obrzeżach. Na oddzielnych myszach przeprowadź immunohistochemię (jak w kroku 4) w celu ilościowego określenia astrocytów i mikrogleju oraz zachowania mieliny.
  2. Leczyć myszy EAE po wystąpieniu choroby, aby ustalić, czy leczenie chroni OUN po wystąpieniu infiltracji komórek odpornościowych.
    1. Powtórz krok 2.1.1.
    2. Do tego eksperymentu użyj myszy SJL, ponieważ myszy te mają mierzalne remisji choroby. Leczenie myszy podczas pierwszego szczytu choroby (lub, w razie potrzeby, w szczycie następnego nawrotu), mierzonego średnimi wynikami klinicznymi.
    3. Poświęć myszy w pożądanym czasie po indukcji EAE. Ponieważ infiltracja już nastąpiła, mierzenie infiltracji za pomocą analizy FACS może nie być przydatne. Weźmy jednak rdzeń kręgowy, aby określić ilościowo reaktywną glejozę i mielinę, aby określić, czy istnieje ochrona OUN pomimo infiltracji komórek odpornościowych.

3. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Rozwarstwienie
    1. Oznaczyć trzy stożkowe probówki o pojemności 15 ml (jedną dla mózgu, jedną dla rdzenia kręgowego i jedną dla śledziony) dla każdego zwierzęcia identyfikatorem zwierzęcia i rodzajem zawartej w nich tkanki. Przechowuj wszystkie tkanki w osobnych probówkach przez cały zabieg na lodzie.
    2. Do analizy FACS śledziony należy poświęcić myszy w szczycie choroby (~ dzień 15 po indukcji EAE) przy użyciu dwutlenku węgla o natężeniu przepływu około 15% objętości pojemnika na minutę przez 2 - 3 min. Potwierdź eutanazję przez brak oddychania. Po uśmierceniu każdej myszy należy usunąć śledzionę 14 i umieścić w indywidualnej, oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml (z kroku 3.1.1) zawierającej lodowaty RPMI uzupełniony 2% FCS, 100 j.m. penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (określanej w całym protokole jako "pożywka").
    3. W celu analizy FACS mózgu i rdzenia kręgowego należy wykonać perfuzję serca, przecinając prawy przedsionek myszy nożyczkami chirurgicznymi w celu uwolnienia krążącej krwi i przekłuwając lewą komorę igłą podłączoną do strzykawki wypełnionej 10 ml lodowatego PBS. Powoli wstrzyknąć 10 ml PBS.
    4. Odetnij głowę myszy i naciąć linię środkową skóry głowy nożyczkami chirurgicznymi. Oderwij skórę ręcznie lub kleszczami i wykonaj cięcie linii środkowej czaszki nożyczkami chirurgicznymi, używając punktu wejścia rdzenia kręgowego jako punktu wyjścia.
    5. Oderwij czaszkę za pomocą mikrokleszczy i użyj miarki, aby uwolnić mózg. Umieścić mózgi w oznakowanych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml (z kroku 3.1.1) zawierających pożywkę.
    6. Usuń skórę myszy za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych i wypatrosz mysz za pomocą nożyczek chirurgicznych. Odetnij kończyny, ogon, żebra i otaczające mięśnie nożyczkami chirurgicznymi, aby uwolnić kręgosłup.
    7. Przetnij kręgosłup na około 5 mniej więcej równych kawałków nożyczkami chirurgicznymi i ściśnij jeden koniec jednego kawałka hemostatem, a następnie użyj innego hemostatu, aby kontynuować ściskanie, przesuwając się wzdłuż kawałka, aż rdzeń kręgowy wyciśnie się z góry. Powtórzyć tę czynność dla każdego kawałka kręgosłupa i umieścić sznury w osobnych, oznaczonych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml (z kroku 3.1.1) zawierających pożywkę.
  2. Ocena naciekania komórek odpornościowych w mózgu i rdzeniu kręgowym
    1. Pokrój mózgi i rdzeń kręgowy na mniejsze kawałki za pomocą sterylnych nożyczek. Rozdrobnić tłokiem ze strzykawki o pojemności 3 ml nad sitkiem o średnicy komórek 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml, jednocześnie przepłukując sitko pożywką. Doprowadzić każdą probówkę do objętości 50 ml z pożywką. Wirować przy 453 x g przez 5 minut do osadzania komórek.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 4 ml podłoża o gradiencie gęstości 40%. Ostrożnie bardzo powoli nałożyć komórki zawierające gradient o gęstości 40% na 2 ml gradientu gęstości o gęstości 70% w nowej stożkowej pipecie rurkowej o pojemności 15 ml na ściankę stożkowej probówki, aby zapewnić prawidłowe ułożenie gradientu. Wiruj z prędkością 796 x g przez 20 minut przy RT bez hamulca.
    3. Ostrożnie usunąć górną warstwę mieliny z gradientu za pomocą pipety transferowej o pojemności 1 ml, a następnie usunąć żywe komórki na granicy faz za pomocą pipety transferowej o pojemności 1 ml i przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić probówkę do 15 ml z pożywką i odwirować przy 448 x g przez 10 minut.
    4. Zawiesić osad w podłożu o objętości 200 μl i umieścić w jednym dołku na 96-dołkowej płycie okrągłodennej (każda próbka od każdego zwierzęcia trafi do osobnej studzienki). Odwirować płytkę o sile 410 x g przez 5 minut.
    5. Strząśnij sklarat i ponownie zawieś osad w 200 μl pożywki restymulacyjnej (RPMI uzupełnione 10% FCS, 100 IU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 1x aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronianu sodu i 55 μM β-merkaptoetanolu, plus 50 ng/ml octanu mirystynianu forbolu (PMA), 750 ng/ml jonomycyny, i inhibitor transportu białek Brefeldin A). Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 oC przez 4 godziny.
      UWAGA: Restymulacja PMA i jonomycyny powoduje aktywację wszystkich limfocytów T - niezależnie od ich swoistości antygenowej w celu oceny całkowitej liczby każdego podzbioru limfocytów T w danej tkance. Jednak odpowiedzi efektorowych limfocytów T specyficznych dla antygenu można oceniać na różne sposoby, w tym restymulację komórek peptydem MOG w obecności Brefeldyny A 15,16.
    6. Ocena fenotypów limfocytów T CD4 + OUN
      1. Po inkubacji odwirować 96-dołkową płytkę okrągłodenną (od etapu 3.2.5) przy 410 x g przez 5 minut i strzepnąć supernatant. Wszystkie poniższe etapy barwienia są wykonywane na tej płycie.
      2. Przemyć komórki w 200 μl PBS z 2% FCS i wirować przy 410 x g przez 5 minut. Strząśnąć supernatant i inkubować komórki z 200 μl PBS zawierającego 2% FCS z blokiem Fc (klon 2,4G2) przez 10 - 15 minut na lodzie.
      3. Aby rozpocząć barwienie zewnątrzkomórkowe, odwirować komórki przy 410 x g przez 5 minut, strzepnąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl koktajlu barwienia powierzchniowego zawierającego przeciwciała znakowane fluoroforem przeciwko CD4 (1:200, 1 μg/ml), TCRβ (1:200, 1 μg/ml) i barwnikowi żywotności (1:500) rozcieńczony w PBS przez 15 minut na lodzie. Odwirować komórki o masie 410 x g przez 5 minut i strzepnąć supernatant. Umyj komórki 2x w 200 μl PBS, a następnie odwiruj przy 410 x g przez 5 min.
      4. Po usunięciu przebarwienia zewnątrzkomórkowego rozpocznij procedurę barwienia wewnątrzkomórkowego poprzez utrwalenie/przepuszczalność, a następnie barwienie wewnątrzkomórkowe.
        1. Na początek strzepnij supernatant i utrwal / przepuszczalność komórek za pomocą odczynników barwiących czynnik transkrypcyjny Foxp3 17 (zgodnie z instrukcjami producenta; patrz Lista materiałów) przez 30 minut do nocy w temperaturze 4 oC.
        2. Przemyć komórki w 150 μl buforu permeabilizacyjnego z zestawu i odwirować płytkę przy 410 x g przez 5 minut. Strzep komórki supernatantu i barwnika w 50 μl buforu permeabilizacji z przeciwciałami znakowanymi fluoroforem przeciwko IL-17A (1:200, 1 μg/ml), IFN-γ (1:200, 1 μg/ml) i Foxp3 (1:200, 2,5 μg/ml) rozcieńczone w PBS przez 30 minut na lodzie.
        3. Odwirować komórki o masie 410 x g przez 5 minut i strzepnąć supernatant. W celu usunięcia nadmiaru przeciwciał przemyć 3x w 200 μl buforu permeabilizacyjnego, a następnie odwirować przy 410 x g przez 5 minut. Strząsnąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl PBS.
        4. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, bramkując na żywych komórkach TCRβ + CD4 +, jak opisano wcześniej 11, aby ocenić procent komórek wyrażających każdą cząsteczkę. Policz komórki za pomocą hemocytometru 18 lub innej zwalidowanej metody, aby określić liczbę komórek na mysz z każdym z fenotypów limfocytów T CD4 +.
        5. Korzystając z uzyskanych danych, oblicz procent i liczbę limfocytów T CD4+ infiltrujących mózg i rdzeń kręgowy od każdej myszy, ze szczególnym uwzględnieniem tych populacji, które odgrywają kluczową rolę w patogenezie i ochronie EAE 19: IL-17A+ IFN-γ-, IL-17A+ IFN-γ+, IL-17A- IFN-γ+, Foxp3+.
  3. Ocena proliferacji i aktywacji obwodowych limfocytów T
    1. Zmiażdż śledzionę za pomocą szkiełek z matowego szkła w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 15 mm. Umieścić zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, używając pożywki do zawieszenia komórek. Napełnić probówkę do 15 ml pożywką i komórkami wirówkowymi o stężeniu 448 x g przez 5 min.
    2. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 2 ml buforu lizującego ACK w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek przez około 3 minuty.
    3. Doprowadzić probówkę do objętości 15 ml z pożywką i przecedzić sitko o wielkości 70 μm do nowej probówki. Odwirować komórki przy 448 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić w pożywce o objętości 2 ml.
    4. Ocena proliferacji obwodowych limfocytów T CD4 + przez barwienie Ki-67
      1. Umieścić małą podwielokrotność (zwykle 200 μl) równoważnej liczby splenocytów z ppkt 3.3.3 w pojedynczych studzienkach (po jednej na próbkę) w 96-dołkowej płytce okrągłodennej.
      2. Wirować przy 410 x g przez 5 minut i strzepnąć supernatant. Zawiesić w 200 μl PBS zawierającym 2% FCS i powtórzyć wirowanie. Odstrzepnąć supernatant i ponownie zawiesić komórki z PBS zawierającym 2% FCS z blokiem Fc (klon 2,4G2) i inkubować przez 10 - 15 minut na lodzie. W przypadku barwienia zewnątrzkomórkowego powtórzyć krok 3.2.6.3.
      3. Po usunięciu przebarwienia zewnątrzkomórkowego rozpocznij procedurę barwienia wewnątrzkomórkowego poprzez utrwalenie/przepuszczalność, a następnie barwienie wewnątrzkomórkowe.
        1. Powtórz krok 3.2.6.4.1.
        2. Odwirować komórki o masie 410 x g przez 5 minut i strzepnąć supernatant. Umyć komórki 1x w 200 μl buforu przepuszczalnego z zestawu i odwirować przy 410 x g przez 5 min. Strzepnąć supernatant i komórki barwiące w 50 μl buforze przepuszczalnym z przeciwciałem anty-Ki-67 (1:200, 1 μg/ml) przez 30 min.
        3. Odwirować komórki o masie 410 x g przez 5 minut i strzepnąć supernatant. Przemyć komórki 2x w 200 μl buforu permeabilizacyjnego z zestawu i odwirować przy 410 x g przez 5 min.
        4. Strząśnij supernatant i umyj komórki 1x w 200 μl PBS i odwiruj przy 410 x g przez 5 minut. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, bramkując na żywych komórkach TCRβ+ CD4+, jak opisano wcześniej 11, a następnie oceń procent komórek Ki-67+.
    5. Ocena fenotypów obwodowych limfocytów T CD4 +
      1. Umieścić 200 μl komórek (od etapu 3.3.3) na 96-dołkowej płytce okrągłodennej (jedna studzienka na próbkę) i odwirować przy 410 x g przez 5 minut i ponownie stymulować, jak w ppkt 3.2.5.
      2. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 oC na 4 godziny. Wykonać tę samą procedurę barwienia, co w kroku 3.2.6 i jego podetapach. Analizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, jak w 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5.

4. Immunohistochemia i kwantyfikacja

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Uśmierc myszy EAE w oddzielnym eksperymencie od tych użytych w kroku 3 i jego podkrokach w dowolnym momencie po indukcji EAE (często ~ 30 dnia, podczas przewlekłej fazy choroby dla myszy C57Bl / 6 lub podczas szczytu średnich wyników klinicznych dla myszy SJL), wykonując poniższe czynności, aby określić zakres reaktywnej glejozy i demielinizacji.
    2. Znieczulij myszy 2,5% izofluranem i 97,5% tlenem i potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia delikatnym szczypnięciem palca u nogi za pomocą kleszczy, szukając braku odpowiedzi. Wykonać perfuzję przezsercową zgodnie z opisem w kroku 3.1.3. Po wstrzyknięciu PBS do lewej komory, za pomocą nowej strzykawki wstrzyknąć 10 ml 4% paraformaldehydu w PBS. ostrożność: Paraformaldehyd działa drażniąco na skórę i płuca, może powodować poważne uszkodzenia oczu i podejrzewa się, że powoduje raka. Unikać wdychania, spożywania i kontaktu ze skórą i oczami. Perfuzja powinna być wykonywana w dygestorium.
    3. Usuń mózg i kręgosłupy zgodnie z opisem w krokach 3.1.4 - 3.1.6. Przywiąż kręgosłupy do patyczków sznurkiem, aby zapewnić proste wyrównanie rdzenia kręgowego.
    4. Umieść mózgi w fiolkach scyntylacyjnych oznaczonych identyfikatorem zwierzęcia z około 20 ml 4% paraformaldehydu w PBS, a rdzenie kręgowe w 50 ml stożkowych probówkach oznaczonych identyfikatorem zwierzęcia z około 50 ml 4% paraformaldehydu w PBS do późniejszego utrwalenia przez noc.
    5. Aby kriochronić mózgi, spłucz 3 razy w 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 oC w 30% sacharozie w 1x PBS. Pozwól mózgom opaść na dno pojemników (około 3 dni).
    6. Usuń wapń z kręgosłupa, płucząc go 3 razy w 1x PBS i umieszczając go w dużej objętości (około 50 ml dla rdzenia kręgowego myszy) 0,5 M EDTA w 1x PBS (początkowe pH wyniesie ~10; pH do ~ 7,8 przy 6 N HCl) przez 2 - 3 tygodnie, aż kość przestanie być sztywna. Kriochroń kręgosłup, wykonując krok 4.1.5.
    7. Osadź mózgi i kręgosłupy w OCT, wykonując poniższe czynności, gdy tylko opadną na dno swoich pojemników.
      1. Przygotuj mieszaninę 1 części 30% sacharozy w 1x PBS i 2 częściach OCT (na przykład dodaj 15 ml 30% sacharozy w 1x PBS do 30 ml OCT).
      2. Dodaj mieszaninę OCT / sacharozy do formy do zatapiania (22 x 22 x 20 mm dla mózgów i 22 x 30 x 20 mm dla rdzenia kręgowego), aż będzie wypełniona w około 1/2.
      3. Pokrój kręgosłupy na 6 równych kawałków za pomocą żyletki i umieść w formie do osadzania o wymiarach 22 x 30 x 20 mm skierowanej do przodu w przypadku odcinków rdzenia kręgowego. Umieść całe mózgi w foremkach o wymiarach 22 x 22 x 20 mm skierowanych do przodu.
      4. Dodaj mieszaninę OCT / sacharozy, aby przykryć tkankę i pozostaw na 1 godzinę, aby pęcherzyki mogły się wydostać. W ciągu tej godziny dodaj 2-metylobutan do naczynia, które może pomieścić formy do zatapiania w celu błyskawicznego zamrażania. Umieść naczynie na suchym lodzie i przykryj do wstępnego ostygnięcia.
      5. Błyskawicznie zamrozić formę w 2-metylobutanie na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 oC wewnątrz pojemnika, aby zapobiec odwodnieniu.
    8. Gdy będzie gotowy, przeciąć tkankę pod kątem 16 μm za pomocą kriostatu i zamontować na szkiełkach naładowanych elektrostatycznie. Umieść co 10sekcję na slajdzie dla mózgu i rdzenia kręgowego (na przykład slajd 1 będzie zawierał sekcje 1, 11 i 21, a slajd 2 będzie zawierał sekcje 2, 12 i 22 i tak dalej). Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 oC lub od razu użyć do barwienia.
  2. Barwienie glejozy reaktywnej i mieliny
    1. Gdy będziesz gotowy do barwienia, wybierz po jednym szkiełku dla mózgu i rdzenia kręgowego na plamę dla każdego zwierzęcia w tym samym (lub tak podobnym, jak to możliwe) regionie. W przypadku mózgu wybierz slajdy przedstawiające pęczek ciała modzelowatego i cingulum.
    2. Umieść szkiełka z chusteczką na bloku grzewczym w temperaturze 70 oC na 7 minut. Po 7 minutach wyłącz blok grzewczy i pozwól szkiełkom ostygnąć na bloku grzewczym przez kolejne 10 - 15 minut. Zapobiegnie to wypadaniu skrawków tkanek z szkiełek podczas procedury barwienia.
    3. Myć szkiełka 3 razy w 1x PBS z 0,1% niejonowym detergentem (dla antygenów wewnątrzkomórkowych) lub 1x PBS (dla przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom powierzchniowym) przez 5 min.
      UWAGA: Ponieważ przeciwciała użyte w tym protokole są wewnątrzkomórkowe, w kolejnych krokach zostaną użyte detergenty niejonowe. Nigdy nie pozwól, aby szkiełka całkowicie wyschły po tym kroku.
    4. Umieść szkiełka w pojemniku i przykryj buforem cytrynianowym o pH 3,0. Aby przygotować bufor cytrynianowy, dodaj 0,192 g bezwodnego kwasu cytrynowego do końcowej objętości 100 ml w wodzie. Dostosuj pH kwasem octowym, jeśli jest powyżej pH 3,0 lub NaOH, jeśli jest poniżej niego.
    5. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 oC przez 30 min i myć 3 razy w 1x PBS z 0,1% niejonowym detergentem przez 5 minut.
    6. Zakreśl obszar wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego i umieść szkiełka w wilgotnej komorze (na przykład pudełku ze szkiełkami zawierającym mokre ręczniki papierowe). Dodaj bufor blokujący do tkanki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Bufor blokujący składa się z 1x PBS plus 0,3% niejonowego detergentu i odpowiedniej surowicy (5%) opartej na gospodarzu przeciwciała drugorzędowego, tj. surowicy końskiej dla zasadowego białka mielinowego (MBP) i kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) oraz surowicy koziej dla Iba1.
    7. Zetrzep bufor blokujący ze szkiełek i dodaj pierwszorzędowe przeciwciało (1:1 000 lub 0,2 μg/ml koziego białka zasadowego anty-mieliny dla oligodendrocytów, 1:1 000 lub 1 μg/ml do 3 μg/ml mysiego anty-GFAP dla astrocytów lub 1:750 lub 0,67 μg/ml króliczego anty-Iba1 dla mikrogleju) rozcieńczone w odpowiednim buforze blokującym (patrz krok 4.2.6) do zakreślonego obszaru. Pozostawić w temperaturze 4 oC na noc w nawilżonej komorze.
    8. Strzepnąć przeciwciało w buforze blokującym ze szkiełek i umyć szkiełka 3 razy w 1x PBS z 0,1% niejonowym detergentem przez 5 minut.
    9. Dodać przeciwciało drugorzędowe (1:200 lub 7,5 μg/ml biotynylowanego przeciwciała przeciwko koniom dla MBP i GFAP lub biotynylowanego koziego przeciwciała anty-króliczego dla Iba1) rozcieńczone w odpowiednim buforze blokującym (patrz krok 4.2.6) do zakreślonego obszaru i pozostawić szkiełka do inkubacji w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    10. Strzepnąć przeciwciało w buforze blokującym ze szkiełek i umyć szkiełka 3 razy w 1x PBS z 0,1% niejonowym detergentem przez 5 minut.
    11. Przygotować kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC) w immunoperoksydazie (patrz wykaz materiałów) 30 minut przed użyciem i mieszać na wytrząsarce do momentu, gdy będzie to potrzebne w 4.2.12. Dodaj 0,3% H2O2 w metanolu do zakreślonego obszaru przez 10 minut, aby ugasić aktywność endogennej peroksydazy.
    12. Strzepnij roztwór ze szkiełek i umyj 2 razy w 1x PBS lub 1x PBS z 0,1% niejonowym detergentem przez 5 minut, a następnie 1 raz w 1x PBS. Dodaj odczynnik ABC do zakreślonego obszaru na 30 minut.
    13. Strzepnąć roztwór ze szkiełek i przemyć 3 razy w 1x PBS przez 5 minut, a następnie 2 razy w wodzie przez 5 minut. Przygotować roztwór 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) (patrz Lista Materiałów) i dodać go do pokrycia sekcji.
      UWAGA: Ten krok wymaga mikroskopu, aby zaobserwować optymalny czas wykrywania barwienia i musi być wykonywany przez ten sam czas, aby można było porównać szkiełka.
    14. Umyj szkiełka 3 razy w wodzie po 5 minut każda. Odwodnić tkankę, umieszczając w następujących roztworach na 2 minuty każde: 70% etanolu w wodzie, 95% etanolu w wodzie, 100% etanolu w wodzie, 50% ksylenów i 50% etanolu, 100% ksylenów. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą żywicznego medium montażowego.
    15. Alternatywnie, należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne, jak opisano wcześniej 11, aby ocenić reaktywną glejozę przy użyciu przeciwciał przeciwko Iba-1 i GFAP.
    16. Zrób zdjęcia każdego odcinka rdzenia kręgowego (wybarwionego odpowiednimi przeciwciałami za pomocą DAB) za pomocą obiektywu 4X, 0,13 NA i zapisz obrazy jako .tiff. Alternatywnie, zrób zdjęcia ciała modzelowatego i wiązki cingulum w lewej lub prawej półkuli mózgu za pomocą obiektywu 20X, 0,50 NA i zapisz obrazy w .tiff. W celu bardziej kompleksowego określenia obciążenia zmian chorobowych w mózgu korzystne jest uwzględnienie w analizach obu półkul.
  3. Pomiar średniej powierzchni frakcji dla glejozy reaktywnej (barwienie Iba1 i GFAP)
    1. Pobierz NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) i otwórz na komputerze. W oprogramowaniu ImageJ użyj ciągu menu Plik > Otwórz i wybierz obraz z kroku 4.2.16. Narysuj obszar za pomocą narzędzia "Wybory wielokątów" na pasku menu. W przypadku rdzenia kręgowego prześledź cały odcinek; W przypadku mózgów pęczek ciała modzelowatego i cingulum. Przekonwertuj obraz na 16-bitowy, przechodząc do Image > Type i klikając "16-bitowy".
    2. Usuń szum z obrazu, przechodząc do opcji Przetwarzaj > odejmuj tło i ustaw "Promień toczącej się kuli" na co najmniej rozmiar największego obiektu, który nie jest częścią tła (patrz podręcznik użytkownika ImageJ pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html).
      UWAGA: W przypadku 4-krotnego obrazu barwienia Iba-1 używamy 4.0, a w przypadku GFAP używamy 50,0, ale liczby te mogą się różnić w zależności od powiększenia obrazu i intensywności barwienia.
    3. Zaznacz "Przesuwany parabloid" i kliknij "OK". Przejdź do opcji Image > Adjust > Threshold (Dopasuj próg) i ustaw dolny poziom progu (górny pasek) za pomocą przesuwanych pasków. Uwzględnij tylko barwienie, które jest komórkowe i zachowaj spójność na wszystkich obrazach. W przypadku obrazów z ciemnym tłem (dotyczy tylko barwienia fluorescencyjnego) upewnij się, że pole "Ciemne tło" jest zaznaczone.
    4. Przejdź do opcji Analizuj > ustaw pomiary... i wybierz "Ułamek powierzchni" (podaje procent obszaru progowego w obszarze zainteresowania). Upewnij się, że opcja "Ogranicz do progu" nie jest zaznaczona, a opcja "Wyświetl etykietę" jest zaznaczona. Kliknij "OK" po zakończeniu.
    5. Aby uzyskać pomiary, przejdź do sekcji Analizowanie > mierzenie. Pojawi się wyskakujące okienko "Wyniki", a dane te można zapisać w niezmienionej postaci lub skopiować do innego programu. W celu analizy porównaj wartości "Frakcji powierzchniowej" między grupami leczenia.
  4. Kwantyfikacja barwienia MBP za pomocą gęstości optycznej
    1. Otwórz obraz i narysuj obszar zainteresowania zgodnie z opisem w kroku 4.3.1. Przejdź do opcji Analizuj > ustaw pomiary... i wybierz opcję "Średnia wartość szarości" (suma wartości szarości w zaznaczeniu podzielona przez liczbę pikseli). Upewnij się, że opcja "Ogranicz do progu" nie jest zaznaczona, a opcja "Wyświetl etykietę" jest zaznaczona. Kliknij "OK" po zakończeniu.
    2. Aby uzyskać pomiary, przejdź do sekcji Analizowanie > mierzenie. Zwróć uwagę na wyskakujące okienko "Wyniki". Skopiuj te dane i zapisz je bez zmian lub skopiuj do innego programu.
    3. Na potrzeby analizy skopiuj i wklej wartości do innego programu. Przelicz średnią wartość szarości na gęstość optyczną (OD) za pomocą wzoru: OD = log10 (255 / średnia wartość szarości).

Wyniki

W niniejszej pracy wykorzystano dwa modele EAE, aby zbadać, czy dany agent farmakologiczny zapewnia ochronę OUN poprzez osłabienie nacieku limfocytów T do OUN lub zapobieganie uszkodzeniom mieliny i aksonów podczas nasilonej infiltracji zapalnych komórek odpornościowych. Aby określić, czy środek terapeutyczny zapobiega infiltracji komórek odpornościowych do rdzenia kręgowego, zastosowano model chronicznej EAE u myszy C57BL/6, w którym infiltracja komórek odpornościowych i patologia choroby lokalizują się głównie w rdzeniu kręgowym (Rycina 1A). Aby natomiast ustalić, czy lek terapeutyczny zapewnia ochronę OUN podczas wnikania komórek odpornościowych do OUN, wykorzystano model zwierzęcy EAE o przebiegu rzutowo-remisyjnym u myszy SJL, w którym patologia choroby występuje zarówno w mózgu, jak i w rdzeniu kręgowym (Rycina 1B).

Oceny kliniczne

Odpowiednie oceny kliniczne przeprowadza się zgodnie z poniższą rubryką dla typowego (Ryc. 1C) lub nietypowego (Ryc. 1D) EAE. W przypadku typowego obrazu klinicznego choroby, wynik 0 oznacza brak nieprawidłowych zachowań. Po podniesieniu za nasadę ogona, ogon może szybko rotować (podobnie jak łopatka helikoptera), a tylne kończyny będą rozstawione na boki. Wynik kliniczny 1 oznacza częściowy wiotkość ogona, co można stwierdzić, podnosząc mysz za nasadę ogona. Normalna rotacja przypominająca helikopter może być osłabiona lub nieobecna, a część ogona może być całkowicie wiotka. Pomocnym sposobem określenia zakresu paraliżu ogona jest przesunięcie palcem wzdłuż jego długości; niesparaliżowany ogon zazwyczaj owinie się wokół palca, podczas gdy ogon częściowo sparaliżowany nie będzie w stanie tego zrobić. Wynik kliniczny 2 oznacza całkowity paraliż ogona. Podczas podnoszenia myszy za nasadę ogona nie występuje żaden ruch ogona. Wynik kliniczny 3 oznacza częściowy paraliż kończyn tylnych. Określenie tego wyniku wymaga, aby mysz mogła swobodnie poruszać się po płaskiej powierzchni. Jeśli jedna kończyna tylna jest ciągnięta podczas ruchu myszy do przodu lub jeśli jedna bądź obie kończyny tylne wydają się częściowo sparaliżowane, można przyznać wynik 3. Wynik kliniczny 4 oznacza całkowity paraliż kończyn tylnych. Przy tym wyniku mysz nie jest w stanie poruszać kończynami tylnymi i przesuwa się do przodu, używając kończyn przednich. Wynik kliniczny 5 oznacza mysz w stanie przedśmiertelnym lub mysz z trudnościami w poruszaniu się po klatce lub w oddychaniu. Jeśli mysz nie może przeciągać się po dnie klatki lub jeśli jej oddech jest przyspieszony i ciężki, należy poddać mysz humanitarnej eutanazji. Wynik kliniczny 6 oznacza mysz znalezioną martwą w klatce. Wynik 6 jest rzadki i należy zbadać przyczyny śmierci inne niż EAE.

Nietypowy obraz kliniczny choroby może lub nie może być któremu towarzyszyć paraliż. W przypadku, gdy u myszy występuje choroba nietypowa wraz z typowymi objawami, konieczne może być zastosowanie dwóch oddzielnych systemów punktacji. Wynik 0 oznacza brak nieprawidłowych zachowań, podobnie jak w typowym systemie punktacji. Kliniczny wynik 1 oznacza lekki skręt lub nachylenie głowy podczas chodzenia myszy. Można to ustalić, pozwalając myszy na ruch do przodu i obserwując stałą kierunkowość jej ruchu w lewo lub w prawo. Kliniczny wynik 2 oznacza bardziej wyraźny skręt głowy i upośledzoną zdolność do przyjmowania pozycji wyprostowanej. Podobnie jak przy nietypowym wyniku 1, mysz wykazuje kierunkowość ruchu i może mieć lekkie trudności z utrzymaniem równowagi. Kliniczny wynik 3 oznacza niezdolność do chodzenia w linii prostej. Mysz będzie miała trudności z utrzymaniem równowagi i może wykorzystywać ściankę klatki, aby pomóc sobie w wyprostowaniu się podczas chodzenia. Kliniczny wynik 4 oznacza mysz leżącą na boku, niezdolną do chodzenia z powodu problemów z równowagą. Mysz może być w stanie przeciągać się po dnie klatki, ale może wykazywać kierunkowość ruchu. Kliniczny wynik 5 oznacza ciągłe toczenie się, chyba że zwierzę jest podtrzymywane. Mysz, która osiągnie taki wynik, powinna zostać w sposób humanitarny uśpiona. Kliniczny wynik 6 oznacza znalezienie martwej myszy w klatce. Wynik 6 jest rzadki i należy zbadać przyczyny śmierci inne niż EAE.

Można zastosować wyniki „pośrednie”, np. dodając 0,5 punktu do oceny, jeśli stan myszy ulegnie niewielkiej zmianie lub gdy wybór między dwiema ocenami jest trudny. Na przykład mysz, która zaczyna poruszać się wolniej niż zdrowe osobniki, ale nie wykazuje niedowładu, lub mysz, która po podniesieniu za ogon chwyta tylne łapy przednimi zamiast rozstawiać nogi, może otrzymać ocenę 0,5. Mysz, która potrafi jedynie pełzać po dnie klatki i wykazuje okresowe drgnięcia kończyn tylnych lub drga w odpowiedzi na dotyk, może otrzymać ocenę 3,5.

Ocena redukcji nacieku komórek odpornościowych

Po indukcji EAE w modelu mysim C57BL/6 (Rysunek 1A, dzień 0), w dniach 1–5 następuje prezentacja antygenu i proliferacja limfocytów T w śledzionie, a następnie, około 7. dnia, infiltracja komórek odpornościowych do OUN. Około 3 do 5 dni po początkowej infiltracji komórek odpornościowych u myszy pojawiają się objawy kliniczne. Aby ocenić, czy środek terapeutyczny blokuje infiltrację komórek odpornościowych do rdzenia kręgowego, leki lub nośnik podaje się w 7. dniu po prezentacji antygenu i proliferacji w śledzionach, ale przed rozpoczęciem infiltracji komórek odpornościowych do rdzenia kręgowego. Jeśli infiltracja komórek odpornościowych została osłabiona, przebieg kliniczny choroby powinien odzwierciedlać poprawę wyników klinicznych podczas fazy wzrostowej choroby od 10. do 15. dnia (Rysunek 2).

Zmniejszenie infiltracji komórek odpornościowych doprowadziłoby również do ograniczenia stanu zapalnego w obrębie układu nerwowego. Reaktywna astrocytoza i mikroglioza są uważane za główne cechy charakterystyczne neurozapalenia. Barwienie astrocytów za pomocą GFAP oraz mikrogleju za pomocą Iba-1 może następnie posłużyć do oceny zmian w średniej frakcji powierzchni barwienia w celu ilościowego określenia stopnia neurozapalenia (Rycina 3).

Aby określić, czy infiltracja komórek odpornościowych uległa zmniejszeniu, rdzenie kręgowe są usuwane i poddawane analizie cytometrią przepływową w szczycie choroby (Rysunek 1A, około 18. dnia). Zapewnia to, że do rdzenia kręgowego przeniknęła największa liczba komórek odpornościowych. Przenikanie limfocytów T do OUN jest uważane za inicjujące zdarzenie zapalne, a komórki Th1 i Th17 występują zarówno w modelach zwierzęcych EAE, jak i u pacjentów z SM. Biorąc to pod uwagę, analiza cytometryczna powinna obejmować ocenę obu typów patogennych limfocytów T. Ponadto Treg są dobrze scharakteryzowanymi supresoryjnymi limfocytami T, które łagodzą przebieg choroby. Dlatego należy ocenić odsetek limfocytów Treg w całkowitej populacji CD4+ w porównaniu z odsetkiem populacji efektorowych limfocytów T. Pozwoli to ustalić, czy nastąpiła ogólna redukcja infiltracji limfocytów T, czy też doszło do przesunięcia fenotypów limfocytów T w OUN. Reprezentatywne wykresy kropkowe (Rysunek 4A) wykazują zmniejszenie całkowitej liczby infiltrujących limfocytów T CD4+ w rdzeniach kręgowych myszy leczonych lekiem w porównaniu z rdzeniami kręgowymi myszy leczonych nośnikiem (liczby w prawych górnych kwadrantach). W celu oceny komórek Th1, Th17 i Treg analizuje się następujące białka sygnaturowe: odpowiednio IFN-γ+, IL-17+ i Foxp3+, których poziom powinien być obniżony (Rysunek 4A). Analizę statystyczną należy przeprowadzić dla liczby komórek CD4+, IFN-γ+, IL-17+ i Foxp3+, aby wykazać istotną redukcję (Rysunek 4B). Aby wykluczyć przesunięcie w podzbiorach limfocytów T, przeprowadzono ocenę statystyczną proporcji komórek IFN-γ+ IL-17+, IFN-γ+ IL-17-, IL-17+ IFN-γ- oraz Foxp3+ (Rysunek 4C).

Aby wykluczyć możliwość, że zmniejszenie liczby limfocytów T infiltrujących OUN jest konsekwencją hamowania proliferacji, aktywacji i różnicowania w obwodzie, należy ocenić liczbę aktywnie proliferujących limfocytów T oraz proporcje podtypów limfocytów T. Jeśli aktywacja i różnicowanie nie uległy zmianie, nie powinno być stwierdzonych zmian w procencie komórek CD4+, IFN-γ+, IL-17+ lub Foxp3+ (Rycina 5A). Ponadto, jeśli proliferacja nie została zaburzona, nie powinno być stwierdzonych zmian w liczbie komórek Ki67+ CD4+ (Rycina 5B). Leczenie farmakologiczne wdraża się w 7. dniu lub później, aby uniknąć zmiany początkowej prezentacji antygenu i aktywacji limfocytów T w obwodzie. Jednak w modelach genetycznych białka są często usuwane konstytutywnie podczas embriogenezy lub indukowane przed wywołaniem EAE, co sprawia, że ocena splenocytów jest niezwykle istotna.

Ocena ochrony ośrodkowego układu nerwowego

Aby wykazać, czy dany środek terapeutyczny moduluje patologię choroby w OUN po infiltracji komórek odpornościowych, interwencje lekowe powinny być podawane podczas pierwszego szczytu w ocenie klinicznej choroby. Model EAE u myszy szczepu SJL jest korzystny dla tych eksperymentów, ponieważ myszy te wykazują fenotyp rzutowy-remisyjny. Jeśli leczenie zapobiega degeneracji mieliny i aksonów, zaobserwowana zostanie poprawa w punktacji klinicznej (Rycina 6). Patologiczna ocena mieliny musi potwierdzić zmniejszenie uszkodzeń mieliny zgodnie z poprawą wyników klinicznych. W celu ilościowej oceny integralności mieliny wykonuje się barwienie MBP (białka zasadowego mieliny) metodą DAB, a następnie analizę statystyczną gęstości optycznej tego barwienia (Rycina 7). Aby dodatkowo potwierdzić, czy neurostan zapalny jest podtrzymywany lub zmniejszany przez interwencje terapeutyczne, można ocenić reaktywną gliozę, mierząc średnią frakcję powierzchni gliozy reaktywnej, zgodnie z opisem powyżej (Rycina 3). Aby potwierdzić, że interwencja terapeutyczna bezpośrednio chroni OUN bez efektów immunomodulujących, należy wykluczyć osłabienie infiltracji komórek odpornościowych do OUN oraz proliferację w śledzionach. W tym celu należy przeprowadzić opisane powyżej metody oceny infiltracji komórek odpornościowych w mózgu i rdzeniu kręgowym oraz oceny proliferacji i aktywacji obwodowych limfocytów T (Ryciny 4 i 5). Podsumowując, środki terapeutyczne, które blokują uszkodzenia komórek w OUN bez dowodów na redukcję limfocytów T infiltrujących OUN lub proliferację limfocytów T w obwodzie, są lekami o działaniu neuroprotekcyjnym w obrębie OUN.

figure-results-1
Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki oceny klinicznej EAE u myszy C57BL/6 i SJL. (A) Wyniki kliniczne (średnia ± SEM) myszy C57BL/6 (n = 10) z indukowanym MOG35-55 w celu wywołania EAE z przebiegiem chronicznym. (B) Wyniki kliniczne (średnia ± SEM) myszy szczepu SJL (n = 3) z indukowanym PLP139-151 w celu wywołania EAE o przebiegu rzutowo-remisyjnym. (C) Rubryka oceny klinicznej stosowana do monitorowania typowego postępu choroby u myszy z EAE. (D) Rubryka oceny klinicznej stosowana do monitorowania nietypowej progresji choroby u myszy z EAE. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2. Leczenie farmakologiczne przed infiltracją komórek odpornościowych u myszy C57BL/6 z EAE. Wyniki kliniczne (średnia ± SEM) myszy C57BL/6 leczonych PBS (n = 20) lub SAS (n = 19) od 7. dnia po immunizacji MOG35-55. Dane pochodzą z trzech połączonych niezależnych eksperymentów. Różnicę statystyczną określono za pomocą nieparametrycznego dwustronnego testu U Manna-Whitneya, *p < 0,05. Przedruk za zgodą z (11).

figure-results-3
Rysunek 3. Barwienie immunofluorescencyjne i kwantyfikacja reaktywnej gliozy w rdzeniach kręgosłupowych myszy C57BL/6 z grupy kontrolnej, EAE oraz grupy leczonej. (A) Marker fluorescencyjny dla GFAP (astrocytów) i Iba-1 (mikroglii) w rdzeniach kręgosłupowych myszy kontrolnych (nieimmunizowanych) (panele lewe) oraz myszy z EAE leczonych PBS (panele środkowe) lub SAS (panele prawe). Pasek skali = 100 µm. Kwantyfikację barwienia określono za pomocą techniki ułamka powierzchni w celu pomiaru procentowej powierzchni immunopozytywnej dla GFAP (B) oraz Iba-1 (C). Średnia ± SEM, n = 3 myszy kontrolne, n = 3 myszy leczone SAS lub n = 4 myszy leczone PBS, 6 przekrojów na mysz. Różnice statystyczne określono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Przedruk za zgodą z (11). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4. Analiza FACS rdzeni kręgowych myszy C57BL/6 z EAE wykazująca zmniejszoną infiltrację limfocytów T u myszy leczonych. Myszy C57BL/6 były leczone SAS lub PBS, począwszy od 7 dnia po indukcji EAE. Rdzenie kręgowe pobrano w 15 dniu. (A) Reprezentatywne wykresy kropkowe pokazują komórki Th1 (IFN-γ+/IL-17-) i Th17 (IFN-γ-/IL-17+) w bramce CD4+ (panele górne) oraz limfocyty T regulatorowe (Foxp3+) (panele dolne). Wykresy kropkowe przedstawiają wartości procentowe w prawym górnym kwadrancie. (B) Poddano analizie statystycznej bezwzględne liczby komórek CD4+ oraz komórek IFN-γ+, IL-17A+ i Foxp3+. (C) Zbadano również zmianę procentowego udziału populacji limfocytów T pomiędzy myszami z EAE leczonymi SAS a myszami leczonymi PBS. Średnia ± SEM, n = 10 dla grupy leczonej PBS i n = 9 dla grupy leczonej SAS z dwóch niezależnych eksperymentów. Do wszystkich wykresów słupkowych zastosowano obustronny test t. **p < 0.01. Przedruk za zgodą (11). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5. Analiza FACS śledzion myszy C57BL/6 z EAE wykazująca równoważne profile ekspresji i proliferację limfocytów T u myszy leczonych i nieleczonych. Śledziony myszy leczonych PBS oraz SAS analizowano 15 dni po indukcji EAE. (A) Procent limfocytów T CD4+, Th1 (IFN-γ+/IL-17-), Th17 (IFN-γ-/IL-17+) oraz limfocytów T regulatorowych (Foxp3+) w śledzionach myszy leczonych PBS (n = 10) i SAS (n = 9) z dwóch niezależnych eksperymentów. (B, panel lewy) Procent komórek Ki-67+ w populacji CD4+ ze śledzion naiwnych (n = 4) oraz z myszy z indukowanym EAE leczonych PBS (n = 5) i SAS (n = 5). Jednoczynnikowy test ANOVA wykazał istotność statystyczną między proporcją komórek Ki-67+ ze śledzion naiwnych a śledzionami z EAE leczonymi PBS lub SAS. Nie stwierdzono istotności między śledzionami z EAE leczonymi PBS a SAS. (B, panel prawy) Reprezentatywne wykresy kropkowe; liczby wskazują proporcję proliferacji. Wykresy kropkowe pokazują wartości procentowe. Wykresy słupkowe przedstawiają dwustronny test t, ***p < 0.001. Przedrukowano za zgodą (11). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Leczenie farmakologiczne po infiltracji komórek odpornościowych u myszy SJL z EAE. Wyniki kliniczne (średnia ± SEM) myszy SJL leczonych PBS (n = 8) lub SAS (n = 8) od 24. dnia po immunizacji (linia przerywana) PLP139-151. Dane przedstawiają średnią ± SEM wyników klinicznych. Różnicę statystyczną określono za pomocą nieparametrycznego dwustronnego testu U Mann-Whitneya, ***p < 0,001. Górna linia reprezentuje wartości wykorzystane do analizy statystycznej. Przedruk za zgodą z (11).

figure-results-7
Rysunek 7. Ilościowe oznaczenie barwienia MBP z wykorzystaniem gęstości optycznej. (A) Reprezentatywne barwienie MBP w rdzeniu kręgowym odcinka piersiowego u nieokreślonej myszy z knockoutem genetycznym w porównaniu do myszy kontrolnej C57BL/6 z tego samego miotu, u których wywołano EAE. Nawias wskazuje reprezentatywny obszar zmniejszonego barwienia MBP, co świadczy o demielinizacji. (B) Barwienie MBP w rdzeniu kręgowym odcinka piersiowego u nieokreślonej myszy C57BL/6 z knockoutem genetycznym. (C) Nieokreślone myszy z knockoutem genetycznym, u których wywołano EAE (KO; n = 6 myszy, 2–4 przekroje lędźwiowe i piersiowe na zwierzę), wykazują wyższą gęstość optyczną (OD) barwienia MBP w rdzeniu kręgowym niż myszy typu dzikiego (WT; n = 3 myszy, 2–4 przekroje lędźwiowe i piersiowe na zwierzę), u których wywołano EAE. Analiza statystyczna przeprowadzona za pomocą obustronnego testu t, *p < 0.05. Słupki błędu reprezentują SEM. Pasek skali 100 µm.

Dyskusja

Pacjenci ze stwardnieniem rozsianym nadal doświadczają nawrotów choroby podczas przyjmowania leków, które osłabiają aktywację limfocytów T i/lub infiltrację do OUN, co uzasadnia opracowanie opcji leczenia, które bezpośrednio chronią OUN. EAE jest klasycznie stosowany do modelowania objawów stwardnienia rozsianego i może być potężnym narzędziem podczas badania charakteru interakcji między układem odpornościowym a OUN in vivo. Korzystając z rozważań dotyczących czasu leczenia w EAE, np. przed lub po rozpoczęciu choroby, w połączeniu z badaniem infiltracji komórek odpornościowych w OUN oraz proliferacji i aktywacji na obrzeżach, możliwe jest określenie wpływu leczenia zarówno na układ odpornościowy, jak i na OUN.

Podczas gdy EAE u myszy C57BL / 6 jest szerzej stosowany, EAE u myszy SJL może być bardziej reprezentatywny dla większości przypadków stwardnienia rozsianego, ponieważ myszy te mają fenotyp rzutowo-remisyjny i infiltrację komórek odpornościowych w miąższu mózgu 10. Myszy SJL mają wyraźną regenerację również podczas remisji, co umożliwia rozpoczęcie leczenia po wystąpieniu choroby, ale w okresach zmniejszonego stanu zapalnego. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że myszy SJL nie zawsze nawracają i zsynchronizowują się, co powoduje potencjalnie dużą zmienność, gdy wyniki są łączone. Dlatego niektórzy badacze mogą zdecydować się na pokazanie reprezentatywnych wyników klinicznych dla wyników klinicznych od jednego zwierzęcia podczas pobierania myszy do analizy FACS i histologii w zindywidualizowanych punktach progresji choroby.

Rozważenie, kiedy dokonywane są manipulacje na myszach EAE, może pomóc w ustaleniu, w jaki sposób leczenie wpływa na układ odpornościowy lub OUN. Istnieje wiele opcji rozpoczęcia leczenia, z których każda ma swoje własne konotacje dotyczące tego, czy komórki odpornościowe dostały się do OUN i jak mogą wchodzić w interakcje z OUN. Leczenie przed wystąpieniem objawów oznacza, że komórki odpornościowe nie dostały się jeszcze do OUN ani nie spowodowały jego uszkodzenia. Leczenie po wystąpieniu objawów oznacza, że komórki odpornościowe dostały się do OUN i spowodowały pewne uszkodzenia. Używając myszy SJL, leczenie można również rozpocząć podczas nawrotu, gdy komórki odpornościowe aktywnie infiltrują i powodują stan zapalny, lub podczas remisji, gdy komórki odpornościowe mogą być mniej rozpowszechnione w OUN z mniejszym stanem zapalnym. Wstępne hipotezy dotyczące wpływu leczenia na OUN i układ odpornościowy można postawić, rozważając, gdzie znajdują się komórki odpornościowe w procesie patologicznym podczas leczenia.

Istnieje wiele sposobów, w jakie leczenie może wpływać na komórki odpornościowe i OUN, a każdy z nich ma na celu zmniejszenie nasilenia objawów EAE. Dlatego konieczne jest zastosowanie analizy cytometrii przepływowej i immunohistochemii, aby sprawdzić, w jaki sposób komórki odpornościowe są dotknięte na obwodzie i OUN, czy komórki odpornościowe dostały się do OUN i jak OUN reaguje na leczenie. Podczas gdy analiza cytometrii przepływowej rdzenia kręgowego może określić, ile komórek dostało się do OUN w danym momencie, nie można stwierdzić, że efekt ten jest spowodowany zmniejszonym transportem komórek odpornościowych, chyba że proliferacja komórek odpornościowych w śledzionie nie jest zakłócona. Dlatego konieczne jest przeanalizowanie zarówno tkanki obwodowej, jak i OUN i określenie, co wyniki oznaczają mechanicznie, gdy porównuje się obie tkanki. Możliwe jest również, że profile aktywności komórek odpornościowych zostaną zmienione przez leczenie, na przykład przełączając się w profilu ciężkim komórek T patogennych limfocytów T pomocniczych na profil regulatorowy ciężkich limfocytów T. Przyjrzenie się markerom dla różnych typów komórek i porównanie procentowej ekspresji między zwierzętami poddanymi i nieleczonymi jest zatem również ważnym czynnikiem. Pojawiająca się koncepcja w badaniach nad stwardnieniem rozsianym sugeruje, że limfocyty B odgrywają ważną rolę w demielinizacji autoimmunologicznej. Opiera się to na badaniach wykazujących, że limfocyty B są niezbędne do reaktywacji limfocytów T 20. Koncepcja ta jest wspierana przez sukces terapii, takich jak rytuksymab, przeciwciało przeciwko CD20 ulegające ekspresji na powierzchni limfocytów B 21,22. Jak wykazano sukcesem przeciwciała monoklonalnego okrelizumabu w badaniach klinicznych, leki ukierunkowane na różne epitopy CD20 mogą poprawić skuteczność terapii ukierunkowanych na limfocyty B 23.

Jednym z ograniczeń przedstawionych tutaj technik jest to, że komórki odpornościowe mogą dostać się do OUN, ale nie są w stanie przemieszczać się w miąższu. Immunohistochemia może być wykorzystana do wykrycia okołonaczyniowego mankietowania komórek odpornościowych i oceny drogi przebytej w miąższu między zwierzętami leczonymi i nieleczonymi. Kolejnym potencjalnym ograniczeniem jest wpływ mikrobiomu na patogenezę EAE. Komensalna mikrobiota jelitowa może w dużym stopniu wpływać na patogenezę choroby 24; Dlatego myszy trzymane w różnych koloniach, a nawet w różnych klatkach, mogą mieć ogromne różnice w nasileniu choroby. W związku z tym, w miarę możliwości, zawsze zaleca się stosowanie kontroli rodzeństwa z miotu hodowanego w tej samej klatce do eksperymentów z udziałem EAE. Ostatnia uwaga jest taka, że jeśli eksperymentalnie pożądane jest wyeliminowanie skutków zmian proliferacyjnych komórek odpornościowych na peryferiach, może być możliwe zrobienie tego za pomocą pasywnej indukcji transferu, a nie aktywnej indukcji opisanej w tym protokole.

Dalsze potwierdzenie neuroprotekcji można uzyskać za pomocą systemu kohodowli 11 w celu przetestowania określonych mechanizmów śmierci komórki lub poprzez użycie myszy z warunkowym nokautem, który pozwala na selektywną delecję białek w typie komórki. Ponadto, aby rozszerzyć badania nad środkami farmakologicznymi, które są neuroprotekcyjne, należy uwzględnić markery przecięcia aksonów i śmierci neuronów. Kolejnym ważnym obszarem jest remielinizacja. Uszkodzone aksony nie są w stanie remielinizować, co dodatkowo potwierdza, że terapie neuroprotekcyjne powinny być ważną częścią terapii remielinizacyjnych. Ponadto aksony niezmielinizowane są bardziej podatne na uszkodzenia niż aksony zmielinizowane. Sugeruje to, że gdy akson ulega demielinizacji, interwencje terapeutyczne, które promują szybką remielinizację, zapobiegną uszkodzeniu aksonów. Aby zbadać te możliwości, można wykorzystać inne modele demielinizacji i remielinizacji in vivo (tj. cuprizone i lizolecytyna). Opisana w niniejszym dokumencie metoda koncentrowała się na ocenie neuroprotekcji poprzez ilościowe określenie utraty mieliny. Dla oceny remielinizacji ważna byłaby również liczba komórek progenitorowych, a także ich zdolność do proliferacji i dojrzewania. Wspominając o tych alternatywnych modelach, należy również wziąć pod uwagę różne modele zapalenia mózgu, które są zależne od wirusa. Istnieją dwa dobrze scharakteryzowane modele wirusa RNA, które powodują utratę mieliny: jeden to mysie zapalenie mózgu i rdzenia Theilera, bezotoczkowy wirus Picornaviridae, a drugi to wirus zapalenia wątroby myszy należący do rodziny wirusów Coronaviridae 25,26.

EAE jest cennym narzędziem do badań nad tym, jak manipulacje lub terapie wpływają na układ odpornościowy i OUN in vivo. Opisany tutaj protokół może pomóc w ustaleniu, gdzie leczenie wpływa na proces chorobowy, czy to na obrzeżach, na barierze krew-mózg, czy w OUN. Żadne obecne metody leczenia stwardnienia rozsianego nie leczą choroby, a pacjenci często doświadczają pogorszenia z czasem. Podobnie inne choroby związane z infiltracją komórek odpornościowych do OUN i degradacją mieliny, w tym ostre rozsiane zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego, poprzeczne zapalenie rdzenia kręgowego i zapalenie nerwu wzrokowego, nie mają leczenia chroniącego OUN, ponieważ jest on bezpośrednio atakowany przez naciekające komórki odpornościowe. Uwzględnienie czasu leczenia i zastosowanie analizy cytometrii przepływowej śledziony i rdzenia kręgowego w połączeniu z immunohistochemią OUN w celu oceny stanu zapalnego i uszkodzeń pozwoli na dokonanie mechanistycznych ustaleń dotyczących leczenia.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, The Civitan International Research Foundation, The Mike L. Jezdimir Transverse Myelitis Foundation, The University of Alabama Health Services Foundation - General Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, oraz T32 AI007051 z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Forma do zatapiania 22 x 22 x 20 mmFisher Scientific NC9719245
Forma do zatapiania 22 x 30 x 20 mmFisher ScientificNC9531194
2-merkaptoetanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-metylobutanFisher ScientificO3551-4
Forma do zatapiania 30 x 22 x 20 mmFisher Scientific18-30
ACK LysingBuffer Quality Biological118-156-101
anty-CD4 PE-Cy7BD Biosciences5527750,2 mg / ml stężenie
zapasowe anty-Foxp3-FITCeBioscience11-5773-820,5 mg / ml stężenie podstawowe
anty-GFAP (koktajl)Biolegend8353011 - 3 mg / ml stężenie zapasowe
przeciwciało poliklonalne anty-Iba-1 (50 i # 181; g)Wako019-197410,5 mg/ml stężenie zapasowe
anty-IFN-γ APCeBioscience17-7311-820,2 mg/ml stężenie
zapasowe anty-IL-17A PerCP-Cy5.5eBioscience45-7177-820,2 mg/ml stężenie zapasu
anty-Ki-67 PEeBioscience12-5698-820,2 mg/ml stężenie zapasu
anty-MBP (D-18)Santa Cruz Biotechnologysc-139120,2 mg/ml stężenie zapasu
anty-TCRβ FITCeBioscience11-5961-850,5 mg/ml stężenie zapasowe
anty-TCRβ PEeBioscience12-5961-830,2 mg/ml stężenie podstawowe
Biotynylowane kozie przeciwciało IgGIgG VectorLabs BA-10001,5 mg/ml stężenie zapasowe
Biotynylowane konie Przeciw mysim IgGVectorLabs BA-2000 1,5 mg/ml stężenie podstawowe
Kwas cytrynowy, bezwodny, 99,5%Fisher ScientificAC42356-5000
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sól tetrasodowa dwuwodna, 99%Fisher ScientificAC446085000
Hyklon płodowej surowicy bydlęcejSH30071.03
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus, opakowanie 10 sztukFisher Scientific12-550-15
Golgi WtyczkaBD Biosciences555029inhibitor transportu białek
Immedge Hydrofobowy długopisbarierowy Fisher ScientificNC9545623
JonomycynaEMD Millipore407952-5mg
L-glutamina, 100xCorning25-005-Cl
MEM Aminokwasy endogenneCorning25-025-Cl
Near IR Żywy/Martwy Zestaw do barwieniaLife TechnologiesL10119barwnik żywotności
Normalna surowica koziaVector LabsS-1000
Normalna surowica końskaVector LabsS-2000
Paraformaldehyd, 96%Fisher ScientificAC416785000
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100xCorning30-002-Cl
PercollGE Opieka zdrowotna17-0891-01gradient gęstości
PermountFisher ScientificSP15-500żywiczne podłoże montażowe
12-mirystynian 13-octanu (PMA) PhorbolP1585-1mg
Oczyszczone przeciwciało przeciwko mielinie Podstawowe białkoBioLegend808401
RPMI 1640Corning10-040-CM
Pirogronian soduCorning25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCTZwiązek Fisher Scientific14-373-65
Triton X-100Sigma-AldrichT9284niejonowy
detergent Vectastain Elite ABC Kit (standardowy)Fisher ScientificNC9206402peroksydaza awidyno-biotyny  kompleks (ABC) w immunoperoksydazie 
Vector Laboratories Zestaw substratu peroksydazy (DAB)Fisher ScientificNC9276270Roztwór DAB

Bibliografia

  1. Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide. Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).
  2. Yednock, T. A., et al. Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature. 356, 63-66 (1992).
  3. Ridge, S. C., et al. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone. Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).
  4. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).
  5. Kuerten, S., et al. MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum. J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).
  6. Brownell, B., Hughes, J. T. The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).
  7. Kidd, D., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis. Brain. 122 (Pt 1), 17-26 (1999).
  8. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).
  9. Geurts, J. J., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology. AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).
  10. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130, 2816-2829 (2007).
  11. Evonuk, K. S., et al. Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination. J Immunol. 195, 450-463 (2015).
  12. Rowse, A. L., et al. Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling. PloS one. 7, e52658(2012).
  13. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. , (2014).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. , (2015).
  15. McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE. J Neuroinflammation. 12, 128(2015).
  16. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. , (2012).
  17. Law, J. P., et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).
  18. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A(2001).
  19. Korn, T., et al. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature medicine. 13, 423-431 (2007).
  20. Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system. Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).
  21. Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).
  22. Bar-Or, A., et al. Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial. Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).
  23. Kappos, L., et al. Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial. Lancet. 378, 1779-1787 (2011).
  24. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  25. Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
  26. Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis. The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Infiltracja komórek odpornościowychcytometria przepływowamodel EAEprzetwarzanie tkanekwirowanie w gradiencie gęstościanaliza w programie ImageJpodstawowe białko mielinyglioza reaktywna
Określanie supresji układu odpornościowego w porównaniu z ochroną OUN dla interwencji farmakologicznych w demielinizacji autoimmunologicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.