Artykuł metodologiczny

Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

DOI:

10.3791/54357

⸱

7 maja 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultury neuronów są dobrym modelem do badania nowych technik stymulacji mózgu poprzez ich wpływ na pojedyncze neurony lub populację neuronów. Przedstawiono różne metody stymulacji wzorcowych kultur neuronalnych za pomocą pola elektrycznego wytwarzanego bezpośrednio przez elektrody kąpielowe lub indukowanego przez zmienne w czasie pole magnetyczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuron uruchomi potencjał czynnościowy, gdy jego potencjał błonowy przekroczy pewien próg. W typowej aktywności mózgu dzieje się to w wyniku chemicznych danych wejściowych do jego synaps. Jednak neurony mogą być również pobudzane przez narzucone pole elektryczne. W szczególności ostatnie zastosowania kliniczne aktywują neurony poprzez zewnętrzne wytwarzanie pola elektrycznego. Dlatego interesujące jest zbadanie, w jaki sposób neuron reaguje na pole zewnętrzne i co powoduje potencjał czynnościowy. Na szczęście precyzyjne i kontrolowane zastosowanie zewnętrznego pola elektrycznego jest możliwe w przypadku embrionalnych komórek neuronalnych, które są wycinane, dysocjowane i hodowane w kulturach. Pozwala to na badanie tych pytań w wysoce powtarzalnym systemie.

W tym artykule omówiono niektóre techniki stosowane do kontrolowanego stosowania zewnętrznego pola elektrycznego na hodowlach neuronów. Sieci mogą być albo jednowymiarowe, czyli wzorzyste w formy linearne, albo mogą rosnąć na całej płaszczyźnie podłoża, a więc dwuwymiarowe. Ponadto wzbudzenie może być wytworzone przez bezpośrednie przyłożenie pola elektrycznego za pomocą elektrod zanurzonych w płynie (elektrody kąpielowe) lub przez indukcję pola elektrycznego za pomocą zdalnego wytwarzania impulsów magnetycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcja między neuronami a zewnętrznymi polami elektrycznymi ma zarówno fundamentalne, jak i praktyczne implikacje. Chociaż od czasów Volty wiadomo, że zewnętrznie przyłożone pole elektryczne może pobudzać tkankę, mechanizmy odpowiedzialne za wytwarzanie wynikowego potencjału czynnościowego w neuronach dopiero niedawno zaczynają być odkrywane 1,2,3,4. Obejmuje to znalezienie odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmu powodującego depolaryzację potencjału błonowego, roli właściwości błony i kanałów jonowych, a nawet regionu neuronu, który reaguje na pole elektryczne 2,5. Neurostymulacja terapeutyczna 6,7,8,9,10 metodologie są szczególnie zależne od tych informacji, które mogą być kluczowe dla ukierunkowania na dotknięte obszary i zrozumienia wyniku terapii. Takie zrozumienie może również pomóc w opracowaniu protokołów leczenia i nowych podejść do stymulacji różnych obszarów mózgu.

Pomiar interakcji w mózgu in vivo dodaje ważny element do tego zrozumienia, ale jest utrudniony przez nieprecyzyjność i niską kontrolowalność pomiarów wewnątrz czaszki. W przeciwieństwie do tego, pomiary w kulturach mogą być łatwo wykonywane w dużych ilościach z dużą precyzją, doskonałą wydajnością sygnału do szumu oraz wysokim stopniem odtwarzalności i kontroli. Korzystając z kultur, można wyjaśnić wiele różnych właściwości neuronalnych zachowania sieci zbiorowej 11,12,13,14,15,16. Podobnie, oczekuje się, że ten dobrze kontrolowany system będzie bardzo skuteczny w wyjaśnianiu mechanizmu, za pomocą którego działają inne metody stymulacji, na przykład, w jaki sposób otwieranie kanałów podczas stymulacji optycznej w optogenetycznie aktywnych neuronach 17,18,19 jest odpowiedzialne za tworzenie potencjału czynnościowego.

Tutaj nacisk kładziony jest na opisanie rozwoju i zrozumienia narzędzi, które mogą skutecznie pobudzać neuron za pomocą zewnętrznego pola elektrycznego. W artykule opisano przygotowanie dwuwymiarowych i jednowymiarowych wzorcowych kultur hipokampa, stymulację przy użyciu różnych konfiguracji i orientacji bezpośrednio przyłożonego pola elektrycznego przez elektrody do kąpieli, a na koniec stymulację dwuwymiarowych i wzorzystych kultur jednowymiarowych przez zmienne w czasie pole magnetyczne, które indukuje pole elektryczne 5,20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Naukowego Weizmanna oraz odpowiednim prawem izraelskim. Instytut Weizmanna jest akredytowany przez Międzynarodowe Stowarzyszenie Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC). Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Weizmann zatwierdził to badanie, przeprowadzone na neuronach hipokampa.

1. Przygotowanie dwuwymiarowych (2D) i jednowymiarowych (1D) kultur hipokampa

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do kultur 2D.
    1. Przygotować pożywkę galwaniczną (PM) składającą się z: 0,9 ml minimum essential media (MEM) + 3G, 0,05 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,05 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej (HI HS) i 1 μl suplementu B27. Uwaga: MEM+3G zawiera na każde 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycyny, 5 ml stabilizowanej L-glutaminy 100x (patrz Tabela materiałów/odczynników) i 5 ml 60% D-(+)-glukozy.
    2. Przygotować bufor boranowy składający się z: 1,9 g boraksu (dekahydrat tetraboranu sodu) w 200 ml podwójnie destylowanej wody (DDW) (mieszać w temperaturze 60 °C) i 1,24 g kwasu borowego w 200 ml DDW. Miareczkować roztwór końcowy do pH 8,5 przy użyciu 1 M HCl. Uwaga: Końcowy roztwór to 400 ml 0,1 M buforu boranowego.
    3. Zanurz szkiełka nakrywkowe w 65% kwasie azotowym na 2 godziny. Spłucz trzykrotnie w DDW, a następnie trzykrotnie przepłucz absolutnym odczynnikiem analitycznym (ABS AR) etanolem.
    4. Przepuść każde szkiełko nakrywkowe krótko przez płomień palnika Bunsena dwa lub trzy razy przez 1 - 2 s, a następnie pozostaw do inkubacji na noc w 24-dołkowych płytkach z 1 ml 0,01% roztworu poli-L-lizyny rozcieńczonego 1:5 w buforze boranowym (0,1 M, pH 8,4). Następnie trzykrotnie spłucz szkiełka nakrywkowe w DDW i pozostaw na noc z 1 ml PM na studzienkę w standardowym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do kultur 1D.
    1. Szkiełka nakrywkowe należy oczyścić przez zanurzenie w roztworze podstawowym piranii składającym się z 75 ml DDW, 25 ml 25% roztworu amoniaku i 25 ml 30% nadtlenku wodoru. Roztwór ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi umieścić na płycie grzewczej w temperaturze ~ 50 °C na 30 minut, a następnie osuszyć szklane szkiełka nakrywkowe azotem.
    2. Szkiełka nakrywkowe należy najpierw pokryć cienką warstwą chromu (99,999%) o grubości 6 A, a następnie warstwą złota o grubości 30 A (99,999%), stosując osadzanie parowe lub napylanie.
      1. Aby osiągnąć szybkość rozpylania 0,05 – 1 A / s, użyj napylarki z 2 wiązkami elektronowymi i systemem próżniowym 260 l/s o docelowych rozmiarach 2" i 4". Użyj etapu rotacji, który może przejść od 0 do 100 rund na minutę (RPM). Użyj prądu stałego (DC) o mocy 0 – 750 watów.
      2. Użyj obrotu 30 obr./min i argonu 99.999%, aby uzyskać plazmę pod ciśnieniem 10 mTorr w komorze.
      3. Zasilanie pistoletów do napylania należy uruchomić przy mocy napylania 40 W DC dla chromu, co prowadzi do szybkości pokrycia ~ 0,12 A/s, oraz przy mocy napylania 10 W DC dla złota, co prowadzi do ~ 0,28 A / s.
    3. Rozpuścić 0,1 g 1-oktadekanetiolu w 100 ml etanolu ABS AR za pomocą ultradźwięków przez 30 min. Umieścić szkiełka nakrywkowe pokryte Cr-Au na 2 godziny w tym roztworze, a następnie przemyć etanolem ABS AR i osuszyć azotem.
    4. Przygotować roztwór 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (D-PBS) i 3,5 g trójblokowego kopolimeru (patrz Tabela materiałów/odczynników), mieszając przez 1 - 2 godziny przy 600 - 700 obr./min. Umieść szkiełka nakrywkowe w roztworze na 1 godzinę. Suche szkiełka nakrywkowe z azotem.
    5. Mechanicznie wytraw żądany wzór, rysując warstwę bio-odrzucenia22. Zrób to za pomocą plotera pisakowego, w którym pióro jest zastąpione igłą do trawienia. Zdrap wzór przez warstwy metalu, aby dotrzeć do szkła znajdującego się pod spodem. Kontroluj ten proces przez komputer, aby uzyskać zreplikowany pożądany wzorzec. Wzorce powstałe w tym procesie pokazano na rysunkach 2 i 3.
    6. Przygotuj biokompatybilną warstwę 100 ml D-PBS, 3,5 g kopolimeru tri-blokowego, 35,7 μl/ml fibronektyny i 29 μl/ml lamininy.
      1. Sterylizować szkiełka nakrywkowe w świetle ultrafioletowym przez co najmniej 10 minut. Szkiełka nakrywkowe inkubować w przygotowanym roztworze biokompatybilnym przez noc.
        UWAGA: Warstwa biokompatybilna utworzy się tylko tam, gdzie warstwa odrzucenia biologicznego została wytrawiona w poprzednim kroku.
      2. Następnego dnia umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy za pomocą P-DBS. Inkubuj szkiełka nakrywkowe w PM przez noc. Szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe do powlekania komórkowego.
  3. Wykonaj sekcję zgodnie ze standardowymi procedurami, które zostały wcześniej szeroko opublikowane23,24.
    1. Krótko mówiąc, wyodrębnij hipokamp lub korę z zarodków szczurów, zwykle w dniu E19, lub od myszy, zwykle w dniu E1723,24.
    2. Najpierw rozdziel komórki w roztworze papainy przez 20 - 30 minut, a następnie wykonaj mechaniczne rozcieranie24 za pomocą szklanych pipet, których końcówki są polerowane ogniowo.
      UWAGA: Jeśli komórki pochodzą od genetycznie zmodyfikowanych myszy, tkanka z każdego zarodka powinna być przechowywana w oddzielnej plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml podczas całego procesu.
    3. Przed wysiewem policzyć komórki za pomocą trypana niebieskiego.
      UWAGA: W przypadku zwierząt zmodyfikowanych genetycznie liczenie powinno być przeprowadzone oddzielnie dla każdego zarodka.
    4. W przypadku kultur 2D wysiewaj neurony myszy w 750 000, a neurony szczurów w 850 000 komórek na studzienkę. W przypadku 1D wysiewaj 650 000 komórek na dołek. Natychmiast po wysianiu lekko wstrząsnąć płytką, aby zapewnić równomierne pokrycie szkiełka nakrywkowego.
  4. Utrzymanie kultur neuronalnych.
    1. Przygotować pożywkę zmieniającą (CM) składającą się z (na ml): 0,9 ml MEM+3G, 0,1 ml HI HS, 10 μl 5-fluoro-2′-deoksyurydyny (FUDR) z urydyną 100x.
    2. Przygotować pożywkę końcową (FM) składającą się z (na ml): 0,9 ml MEM+3G i 0,1 ml hi hs.
    3. Zastąp PM 1-1,5 ml CM po 4 dniach in vitro (DIV). Przy 6 DIV zastąp 50% CM świeżym CM. W DIV 8 zmień pożywkę na 1,5 ml FM, a następnie 50% zmień FM co 2 dni. Po około tygodniu pojawia się spontaniczna aktywność synchroniczna.
  5. Obrazowanie spontanicznej lub wywołanej aktywności w kulturach neuronalnych za pomocą barwników fluorescencyjnych.
    1. Przygotować roztwór 50 μg wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów/odczynników) w 50 μl DMSO (dimetylosulfotlenku).
    2. Przygotować zewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy (EM) zawierający (w mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glukozę, 45 sacharozę (pH 7,4).
    3. Inkubować hodowlę neuronów w 2 ml EM z 8 μl wrażliwego na wapń roztworu barwnika fluorescencyjnego przez 1 godzinę. Chronić przed światłem i delikatnie obracać, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie barwnika do komórek.
    4. Zastąp roztwór świeżym EM przed obrazowaniem. Obrazowanie fluorescencyjne przedstawiono na rysunku 4.
    5. Obraz w mikroskopie fluorescencyjnym z filtrami optycznymi do obrazowania fluorescencji wapnia (pik wzbudzenia przy 488 nm, pik emisji przy 520 nm), przy użyciu kamery i oprogramowania zdolnych do ilościowego określenia intensywności dowolnego obszaru zainteresowania (ROI) w polu widzenia mikroskopu.

2. Elektryczna stymulacja kultur

UWAGA: Podstawowa konfiguracja do stymulacji elektrycznej jest pokazana na rysunku 1. Szkiełko nakrywkowe, na którym hodowla neuronalna była hodowana przez około 14 dni, umieszcza się na szalce Petriego pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aktywność elektryczna neuronów jest obrazowana za pomocą barwników wrażliwych na wapń, podczas gdy napięcie jest podawane przez dwie pary elektrod do kąpieli, które są umieszczone na zewnątrz hodowli. Elektrody są napędzane przez generator sygnału, którego wyjście jest wzmacniane przez wzmacniacz dwukanałowy. Kontrola napięcia do stymulacji jest preferowana w stosunku do bardziej standardowej kontroli prądu25,26, ponieważ wektory pola elektrycznego są określane bezpośrednio, co umożliwia proste dodawanie i kombinację wektorów. Wymaga to dokładnego sprawdzenia jednorodności pola elektrycznego, które można przeprowadzić na całej próbce w przypadku kontroli napięcia. Podczas korzystania z kontroli napięcia należy zachować ostrożność, aby uniknąć pętli uziemienia i sprawdzić jednorodność pola elektrycznego (patrz 2.2 poniżej).

  1. Do stymulacji elektrycznej za pomocą jednorodnego pola elektrycznego należy użyć pary równoległych drutów elektrodowych.
    1. Należy stosować elektrody wykonane z platyny o grubości rzędu 0,005'' (127 μm). W przypadku stosowania ze szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 13 mm należy upewnić się, że odległość między dwiema elektrodami wynosi około 11 mm i umieścić elektrody 1 mm nad hodowlą.
      UWAGA: Aby wykonać uchwyt elektrody (rysunki 5A i 6A), użyj politetrafluoroetylenu (PTFE). Wywierć wąskie otwory w PTFE, aby wprowadzić elektrody. Urządzenie powinno znajdować się wyżej niż roztwór zewnątrzkomórkowy, aby górny koniec, na którym odsłonięte są elektrody, nigdy nie stykał się z roztworem. Do izolacji użyj kleju epoksydowego na dowolnej części przewodów elektrod, która może być odsłonięta.
    2. Użyj kwadratowego kształtu impulsu z 50% cyklem pracy, bez składowej stałej, aby uniknąć elektrolizy. Zmieniaj czas trwania impulsu w zakresie od 10 μs do 4 ms, aby uzyskać skuteczną stymulację bez spalania kultury. Upewnij się, że amplituda jest rzędu ± 22 V (patrz rysunek 5). Impuls kwadratowy można zaobserwować na oscyloskopie podłączonym równolegle do elektrod.
      UWAGA: Aby łatwo zaprogramować dowolny pożądany przebieg, użyj komercyjnego oprogramowania do edycji przebiegów (patrz Lista materiałów). Wprowadź graficznie żądany przebieg i wyślij go do generatora przebiegów.
  2. Aby sprawdzić jednorodność pola, użyj elektrody sondowej. Użyj siatki o wymiarach co najmniej 1 mm x 1 mm, aby umożliwić przesuwanie sondy w obszarze między elektrodami i pomiar potencjału elektrycznego.
    1. Zmierz potencjał elektryczny. Użyj figure-protocol-1, aby obliczyć pole elektryczne. Użyj jednej z elektrod jako elektrody odniesienia. Zmierz pole elektryczne o zmiennym czasie trwania impulsu od 100 μs do 4 ms (patrz rysunek 5B dla przykładu czasu trwania impulsu 100 μs), aby sprawdzić, czy pole jest jednorodne w zakresie czasu trwania stymulacji.
      UWAGA: Patrz rysunek 5D, aby zapoznać się z przykładem zmierzonej jednorodności pola elektrycznego, gdy czas trwania impulsu wynosił 1 ms.
  3. Użyj 2 prostopadłych par elektrod do kąpieli, aby wytworzyć bardziej skomplikowane kształty pola elektrycznego i móc zorientować pole w różnych kierunkach (patrz rys. 6B). Stosowane będzie urządzenie z 2 parami elektrod, a sygnał na każdej parze elektrod będzie obserwowany na dwóch oddzielnych oscyloskopach.
    1. Umieść elektrody 1 mm nad kulturą i w odległości 10 - 11 mm od siebie. Upewnij się, że obie pary elektrod są pływające (nie mają połączenia uziemiającego) i nie mają wspólnego uziemienia, mierząc rezystancję między dowolnymi zestawami elektrod i sprawdzając, czy nie ma zwarć między żadną z elektrod. Sprawdź, czy wszystkie używane urządzenia, które są podłączone do elektrod (takie jak oscyloskopy, amplifiery, generatory sygnału itp.) unoszą się w stosunku do masy, sprawdzając, czy wszystkie urządzenia są pływające i czy żadna z elektrod odniesienia nie dotyka żadnego uziemionego sprzętu.
    2. Aby zmienić orientację pola, zmień amplitudę napięcia podawanego do dwóch par elektrod względem siebie (patrz rysunek 7A). Na przykład dla 0° użyj ± 22 V na parze elektrod, które są prostopadłe do wzoru i 0 V na drugiej elektrodzie. Dla 45° należy użyć ± 15,6 V na obu parach elektrod bez opóźnienia fazowego, dla sumy wektorów amplitudy 15,62+15,62=222.
    3. Aby zastosować pole wirujące, należy użyć jednego przebiegu sinusoidalnego impulsu napięciowego i jednego pojedynczego przebiegu cosinusoidalnego impulsu napięciowego do dwóch par elektrod, aby wytworzyć wirujące pole elektryczne o stałej amplitudzie (patrz rysunek 6B).
      UWAGA: Jak można zobaczyć na rysunku 6B, przy użyciu jednego cyklu fali sinusoidalnej o napięciu ± 22 V w jednej elektrodzie i jednego cyklu fali cosinusoidalnej o napięciu ± 22 V w drugiej elektrodzie, suma wektorowa jest wirującym polem elektrycznym o czasie trwania cyklu takim samym jak dla fal sinusoidalnych i cosinusoidalnych, i o amplitudzie ± 22 V.
  4. Aby zmierzyć i obliczyć chronaksję i reobazę aksonów w kulturze neuronalnej w porównaniu z dendrytami w tej samej kulturze, wykonaj następujące czynności.
    1. Do obrazowania wapnia należy użyć barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na wapń, jak opisano w Tabeli materiałów/odczynników oraz w ppkt 1.5) z kulturą 1D wzorowaną na cienkich (170 μm), długich (10 mm) liniach. Barwnik wrażliwy na wapń zostanie nałożony na kulturę i inkubowany przez 45 minut. Barwnik zostanie umyty poprzez zastąpienie go świeżym roztworem do nagrywania.
    2. Odłącz sieć, aby uzyskać statystyki populacji bezpośredniej odpowiedzi na stymulację elektryczną, bez efektu transmisji synaptycznej. W tym celu należy zastosować kombinację 40 μM bikukuliny, która blokuje hamujące działanie receptorów kwasu gamma-aminomasłowego-A (GABAA), 10 μM 6-cyjano-7-nitrochinoksalino-2,3-dionu (CNQX), w celu zablokowania receptorów α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowych (AMPA) i kainianu oraz 20 μM kwasu (2R)-amino-5-fosfonowalerianu (APV), który blokuje receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Blokery zostaną dodane do rozwiązania do nagrywania.
    3. Zastosować impuls prostokątny, jak opisano w ppkt 2.1 i 2.3, o różnym czasie trwania od 100 μs do 4 ms. Sygnał można zaobserwować na oscyloskopie.
    4. Użyć mikroskopu fluorescencyjnego z programem do akwizycji obrazu (patrz 1.5), aby monitorować intensywność stanów przejściowych wapnia przy kilku ROI, z których każdy zawiera kilkaset neuronów. Rejestruj obrazy za pomocą czułej kamery EMCCD (patrz Lista materiałów), która może rejestrować obrazy z szybkością co najmniej 20 klatek na sekundę. Zmiana natężenia światła jest proporcjonalna do ilości neuronów, które zostały pobudzone. Oszacuj frakcję stymulowanych neuronów za pomocą względnej zmiany intensywności.
    5. Dla każdego czasu trwania impulsu (od 100 μs do 4 ms) zmień amplitudę napięcia przyłożonego do elektrod, zaczynając od napięcia, przy którym nie obserwuje się zmiany intensywności (kilka woltów), na napięcie, w którym zmiany intensywności spowodowane przyłożonym napięciem uległy nasyceniu (do ± 22 V).
      UWAGA: Zmiana intensywności zostanie rozłożona jako skumulowana klasa Gaussa5 w odniesieniu do przyłożonego napięcia do stymulacji dla każdego czasu trwania impulsu napięcia.
    6. Dopasuj skumulowany rozkład Gaussa dla intensywności w funkcji przyłożonego napięcia dla każdego czasu trwania i wyodrębnij średnią Gaussa z tego dopasowania.
      UWAGA: Ta średnia jest reprezentatywnym napięciem, na które zareagowały neurony.
    7. Pod koniec tego procesu należy uzyskać dla każdego czasu trwania stymulacji średnie napięcie, na które zareagowały neurony. Użyj tych par czasów trwania i mocnych stron, aby wykreślić krzywe siły-czasu trwania (patrz rysunek 7).

3. Magnetyczna stymulacja kultur

Uwaga: Podstawowa konfiguracja stymulacji magnetycznej jest pokazana na rysunku 2. W prawym górnym rogu pokazany jest odwrócony mikroskop fluorescencyjny, który służy do obrazowania wrażliwych na wapń barwników w neuronach. Cewka magnetyczna (niebieskie kółka) jest umieszczona około 5 mm koncentrycznie nad kulturą pierścienia neuronalnego (niebieski kontur). Cewka odbiorcza (czerwone kółko) na obwodzie szalki Petriego monitoruje napięcie indukowane przez impuls magnetyczny. W lewym górnym rogu pokazana jest zmierzona dynamika cewki stymulatora magnetycznego (MS) z obciążeniem napięciowym kondensatora 5 000 kV, zintegrowanej z cewką odbiorczą. Indukowane pole elektryczne (obliczone dla promienia pierścienia 14 mm) jest przedstawione na zielono, podczas gdy pole magnetyczne jest przedstawione na niebiesko. Na spodzie pokazane są zdjęcia kultury neuronalnej. W lewym dolnym rogu znajduje się zdjęcie w jasnym polu wzorzystego szkiełka nakrywkowego o średnicy 24 mm. Białe obszary to neurony. Sfotografowany wzór składa się z koncentrycznych kultur pierścieniowych o różnych promieniach. W prawym dolnym rogu znajduje się zbliżenie na krótki fragment pierścieni, pokazujący poszczególne neurony. W przypadku skali szerokość pierścieni wynosi około 200 μm.

  1. Hoduj neurony w okrągłym układzie pierścieniowym (wytrawionym zgodnie z opisem w 1.2.5) w celu stymulacji kultur 1D. Do obrazowania wapnia należy użyć barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na wapń (zgodnie z opisem w punkcie 1.5) z kulturą 1D wzorowaną na cienkich (170 μm), długich (10 mm) liniach.
    1. Użyj okrągłej cewki magnetycznej i umieść szalkę Petriego około 5 mm poniżej i koncentrycznie z cewką. Użyj niestandardowej cewki o średnicy około 30 mm (średnica wewnętrzna, średnica zewnętrzna 46 mm) o indukcyjności L = 90 mH napędzanej domowym lub komercyjnym MS obciążonym maksymalnym napięciem 5 kV.
    2. Rozładuj wysokie napięcie i prąd przez cewkę przewodzącą za pomocą przełącznika wysokiego prądu i wysokiego napięcia, aby magnetycznie stymulować kultury neuronalne. Stymulator magnetyczny (MS) może być zbudowany zgodnie z opisem w 21 przy użyciu dużych kondensatorów, rzędu 100 mF, w celu uzyskania wysokiego napięcia 1 - 5 kV. Alternatywnie można użyć dostępnego w handlu MS (patrz Tabela materiałów/odczynników).
      UWAGA: Użyj prostokątnego drutu miedzianego o grubości 0,254 mm i szerokości 6,35 mm pokrytego poliestrem, aby wyprodukować domowej roboty cewkę21. Tocz przewody na niestandardowych ramach, izolowanych włóknem szklanym i odlewanych w żywicy epoksydowej (patrz Tabela materiałów/odczynników). Alternatywnie można użyć dostępnych w handlu cewek (patrz Tabela materiałów/odczynników).
  2. Użyj wirujących pól magnetycznych, aby stymulować kultury 2D.
  3. Teraz użyj wirujących pól magnetycznych do stymulacji kultur 2D. Wystrzel TMS bez kultury w naczyniu, z różną intensywnością, aby pokazać liniową korelację odczytu cewki z intensywnościami.
  4. Następnie, rejestrując stany przejściowe wapnia za pomocą hodowli neuronalnej, zacznij wystrzeliwać TMS z rosnącą intensywnością, rejestrując zarówno stany przejściowe wapnia, jak i cewkę. Na początku impulsy sieciowe obserwowane jako duże stany przejściowe wapnia nie powinny synchronizować się ze skokami TMS cewki odbiorczej. Kontynuując zwiększanie intensywności, w pewnym momencie stany przejściowe wapnia zaczynają synchronizować się ze skokami TMS. Alternatywnie lub dodatkowo, po osiągnięciu zsynchronizowanej odpowiedzi, zacznij zmniejszać intensywność, aż synchronizacja zostanie zniesiona, aby określić próg TMS.
    UWAGA: Warunki powinny być utrzymywane ściśle ustalone dla każdej z konfiguracji, używając za każdym razem dokładnej objętości, tych samych naczyń oraz dokładnych pozycji i orientacji cewki.
    1. Zamontuj cewkę odbiorczą na podstawie czaszy nagrywającej tak, aby znajdowała się w płaszczyźnie równoległej do kultury neuronalnej i w ustalonej pozycji w stosunku do hodowli.
      UWAGA: Gwarantuje to, że zależność położenia cewki odbiorczej w stosunku do magnesu jest wierna położeniu kultury i że wszelkie rozbieżności w położeniu będą znikome na odczytach cewki odbiorczej.
      1. Użyj dwóch niezależnych cewek, które są ustawione prostopadle do siebie (rysunek 8B), aby wytworzyć wirujące pole magnetyczne i indukowane pole elektryczne. Podłącz każdą cewkę do własnego MS. Upewnij się, że stymulatory rozładowują podobne prądy z opóźnieniem fazowym 90 stopni (rysunek 10A), co powoduje powstanie wirującego pola magnetycznego, które skanuje 270 stopni rzeczywistej przestrzeni przy maksymalnym polu ~ 270 V/m (rysunek 10B).
      2. Umieść kulturę neuronalną w sferycznym szklanym pojemniku wypełnionym zewnętrznym roztworem rejestrującym (EM).
      3. Monitoruj stymulację (zmianę intensywności fluorescencji neuronów) za pomocą kamery, jak opisano w kroku 2.4.4.
      4. W przypadku cewek krzyżowych (ryc. 8B) cewkę odbiorczą należy ustawić równolegle i w określonej odległości poniżej kultury neuronalnej. Ostrożnie utrzymuj tę konfigurację przez cały czas trwania eksperymentów.
  5. Oblicz analitycznie pole elektryczne dla konfiguracji 1D według wzoru Emax=k1Br, gdzie Emax jest maksymalną amplitudą indukowanego pola elektrycznego i jest skierowane wzdłuż stycznej pierścieni o promieniu r. B to amplituda impulsu magnetycznego, a k1 to wymiarowa stała proporcjonalności, którą można zmierzyć za pomocą cewki odbiorczej (rysunek 8A).
  6. Użyj pakietu symulacji numerycznej (patrz Lista materiałów), aby numerycznie zasymulować pole elektryczne21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół pozwala na łatwe tworzenie wzorców kultur neuronalnych. W połączeniu z kilkoma opracowanymi przez nas metodami stymulacji, umożliwia to pomiary niektórych wewnętrznych właściwości neuronów, takich jak Chronaxie i Rheobase5, porównanie właściwości zdrowych i chorych neuronów27, znalezienie optymalnych sposobów stymulowania kultur w funkcji ich struktury i wiele innych nowatorskich podejść. Kilka przykładów przedstawiono...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie wzorów 1D jest ważnym narzędziem, które można wykorzystać do różnych zastosowań. Na przykład użyliśmy wzorców 1D do tworzenia bramek logicznych z kultur neuronalnych 29 , a ostatnio do pomiaru Chronaxie i Rheobase neuronów hipokampa szczura 5 oraz spowolnienia prędkości propagacji sygnału aktywności wypalania w neuronach hipokampa zespołu Downa w porównaniu z neuronami hipokampa typu dzikiego (WT) 27. Sugerowany protokół tworzenia wzorów 1D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Oferowi Feinermanowi, Fredowi Wolfowi, Menahemowi Segalowi, Andreasowi Neefowi i Eitanowi Reuveny'emu za bardzo pomocne dyskusje. Autorzy dziękują Ilanowi Breskinowi i Jordiemu Soriano za opracowanie wczesnych wersji technologii. Autorzy dziękują Cwi Tlusty'emu i Jean-Pierre'owi Eckmannowi za pomoc w opracowaniu koncepcji teoretycznych. Badania te były wspierane przez Fundację Minerva, Ministerstwo Nauki i Technologii Izraela oraz przez grant 1320/09 Izraelskiej Fundacji Nauki i grant Bi-National Science Foundation 2008331.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
APVSigma-AldrichA8054Odłącz sieć. Wymienione w sekcji 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Podłoże galwaniczne. Wspomniano w Sekcja 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343Odłącz sieć. Wymieniony w sekcji 2.4.2
Boraks (dekahydrat tetraboranu sodu)Sigma-AldrichS9640Bufor boranowy. Wymieniony w sekcji 1.1.2
Kwas borowyFrutarom LTD5550710Bufor boranowy. Wymienione w sekcji 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka 21098Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego. Wspomniano w sekcji 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Odłącz sieć. Wspomniano w Sekcja 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5Symulacja numeryczna. Wymienione w sekcji 3.5.2
D-(+)-glukoza, 1 MSigma-Aldrich65146Pożywka galwaniczna, Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wymienione w sekcjach 1.1.1 i 1.5.2 Hodowle
D-PBSSigma-AldrichD8537. Wymienione w sekcjach 1.2.4 i 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Podłoże galwaniczne. Wspomniany w sekcji 1.1.1
FibronectinSigma-AldrichF1141Bio Coating. Wspomniano w sekcji 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Obrazowanie spontanicznej lub wywołanej aktywności. Wymienione w sekcjach 1.5.1, 1.5.3 i 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Zmienianie podłoża. Wspomniano w sekcji 1.4.1
GentamycynaSigma-AldrichG1272Pożywka galwaniczna, Pożywka zmieniająca, Pożywka końcowa. Wymienione w sekcji 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Podłoże galwaniczne, Podłoże do wymiany, Podłoże końcowe. Wspomniany w sekcji 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wspomniano w sekcji 1.5.2
HI HSBI04-124-1APodłoże galwaniczne, Medium zmieniające, Medium końcowe. Wymieniony w sekcjach 1.1.1, 1.4.1 i 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000Zewnątrzkomórkowe rozwiązanie do nagrywania. Wymienione w sekcji 1.5.2
Laminin Powłoka biologiczna Sigma-AldrichL2020. Wymienione w sekcji 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Podłoże galwaniczne, Podłoże zmieniające, Pożywka końcowa. Wymienione w sekcji 1.4.1      1.4.2
MgCl2 , 1 MSigma-AldrichM1028Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wymieniony w sekcji 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591Zewnątrzkomórkowy roztwór do zapisu. Wymienione w sekcji 1.5.2
OctadecanethiolSigma-Aldrich01858Czyszczenie szkiełek nakrywkowych pokrytych Cr-Au (kultury 1D). Wymienione w sekcji 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 50475278Powłoka bio-odrzucająca, powłoka biologiczna. Wymienione w sekcjach 1.2.4 i 1.2.6
0,01% roztwór poli-L-lizyny Sigma-Aldrich  P47075Promuj podział komórek. Wymieniony w sekcji 1.1.4
Sacharoza, 1 MSigma-AldrichS1888Zewnątrzkomórkowy roztwór do nagrywania. Wymienione w sekcji 1.5.2
Tiol Powłoka bio-odrzucająca Sigma-Aldrich1858. Wymienione w sekcji 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Zmienianie podłoża. Wymienione w sekcji 1.4.1
NapylarkaAJA International, IncATC Orion-5Series powlekanie szkła cienkimi warstwami metalu. Wymienione w sekcji 1.2.2
Ploter pisakowy Hewlett Packard HP 7475AWytrawianie wzoru na powlekanym szkiełku nakrywkowym. Wymienione w sekcji 1.2.5
Przewody elektrod A-M Systems, Carlsborg WA767000Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych. Wymienione w sekcjach 2.1, 2.2, 2.3 i 2.4.5
Generator sygnałuBKPrecision4079Kształtowanie sygnału elektrycznego. Wspomniany w Rozdziale 2.3
Wzmacniaczdomowej robotyWzmocnienie napięcia sygnału z generatora sygnału do elektrod. Wymienione w rozdziale 2.3
Matryca zasilania MPS-3005 LK-3 Zasilanie maszyny do napylania. Wspomniano w sekcji 1.2.2.3
Przezczaszkowa stymulacja magnetycznaMagstim, Spring Gardens, UKRapid 2Magnetyczna stymulacja hodowli neuronalnej. Wymienione w sekcjach 3.1, 3.3 i 3.4
Żywica epoksydowaCognisVersamid 140Odlewanie cewek domowej roboty. Wymienione w sekcji 3.4
Powłoka epoksydowaEPON 815 Odlewanie cewek domowej roboty. Wymienione w sekcji 3.4
Druty platynowe o grubości 0,005 ''; Systemy AM,   Carlsborg WA  767000Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych. Wspomniano w sekcji 2.1
Okrągła cewka magnetycznaDomowastymulacja magnetyczna kultur neuronalnych. Wymienione w sekcji 3.3
WaveXpress SWB& K Precyzja Oprogramowanie do edycji przebiegów. Wspomniana w sekcji 2.1.32
Kamera Xion Ultra 897AndorSensitive EMCCD. Wymienione w sekcji 2.4.4
komórkowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577(2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287(2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794(2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680(2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultury neuronalnestymulacja elektrycznastymulacja magnetycznakultury jednowymiaroweustrukturyzowane sieci neuronalnezewn trzne pole elektrycznekonfiguracja elektrodgenerowanie impulsu magnetycznegokrzywa zale no nat enie czas

Powiązane artykuły