Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54357

⸱

7 maja 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

Kultury neuronów są dobrym modelem do badania nowych technik stymulacji mózgu poprzez ich wpływ na pojedyncze neurony lub populację neuronów. Przedstawiono różne metody stymulacji wzorcowych kultur neuronalnych za pomocą pola elektrycznego wytwarzanego bezpośrednio przez elektrody kąpielowe lub indukowanego przez zmienne w czasie pole magnetyczne.

Streszczenie

Neuron uruchomi potencjał czynnościowy, gdy jego potencjał błonowy przekroczy pewien próg. W typowej aktywności mózgu dzieje się to w wyniku chemicznych danych wejściowych do jego synaps. Jednak neurony mogą być również pobudzane przez narzucone pole elektryczne. W szczególności ostatnie zastosowania kliniczne aktywują neurony poprzez zewnętrzne wytwarzanie pola elektrycznego. Dlatego interesujące jest zbadanie, w jaki sposób neuron reaguje na pole zewnętrzne i co powoduje potencjał czynnościowy. Na szczęście precyzyjne i kontrolowane zastosowanie zewnętrznego pola elektrycznego jest możliwe w przypadku embrionalnych komórek neuronalnych, które są wycinane, dysocjowane i hodowane w kulturach. Pozwala to na badanie tych pytań w wysoce powtarzalnym systemie.

W tym artykule omówiono niektóre techniki stosowane do kontrolowanego stosowania zewnętrznego pola elektrycznego na hodowlach neuronów. Sieci mogą być albo jednowymiarowe, czyli wzorzyste w formy linearne, albo mogą rosnąć na całej płaszczyźnie podłoża, a więc dwuwymiarowe. Ponadto wzbudzenie może być wytworzone przez bezpośrednie przyłożenie pola elektrycznego za pomocą elektrod zanurzonych w płynie (elektrody kąpielowe) lub przez indukcję pola elektrycznego za pomocą zdalnego wytwarzania impulsów magnetycznych.

Wprowadzenie

Interakcja między neuronami a zewnętrznymi polami elektrycznymi ma zarówno fundamentalne, jak i praktyczne implikacje. Chociaż od czasów Volty wiadomo, że zewnętrznie przyłożone pole elektryczne może pobudzać tkankę, mechanizmy odpowiedzialne za wytwarzanie wynikowego potencjału czynnościowego w neuronach dopiero niedawno zaczynają być odkrywane 1,2,3,4. Obejmuje to znalezienie odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmu powodującego depolaryzację potencjału błonowego, roli właściwości błony i kanałów jonowych, a nawet regionu neuronu, który reaguje na pole elektryczne 2,5. Neurostymulacja terapeutyczna 6,7,8,9,10 metodologie są szczególnie zależne od tych informacji, które mogą być kluczowe dla ukierunkowania na dotknięte obszary i zrozumienia wyniku terapii. Takie zrozumienie może również pomóc w opracowaniu protokołów leczenia i nowych podejść do stymulacji różnych obszarów mózgu.

Pomiar interakcji w mózgu in vivo dodaje ważny element do tego zrozumienia, ale jest utrudniony przez nieprecyzyjność i niską kontrolowalność pomiarów wewnątrz czaszki. W przeciwieństwie do tego, pomiary w kulturach mogą być łatwo wykonywane w dużych ilościach z dużą precyzją, doskonałą wydajnością sygnału do szumu oraz wysokim stopniem odtwarzalności i kontroli. Korzystając z kultur, można wyjaśnić wiele różnych właściwości neuronalnych zachowania sieci zbiorowej 11,12,13,14,15,16. Podobnie, oczekuje się, że ten dobrze kontrolowany system będzie bardzo skuteczny w wyjaśnianiu mechanizmu, za pomocą którego działają inne metody stymulacji, na przykład, w jaki sposób otwieranie kanałów podczas stymulacji optycznej w optogenetycznie aktywnych neuronach 17,18,19 jest odpowiedzialne za tworzenie potencjału czynnościowego.

Tutaj nacisk kładziony jest na opisanie rozwoju i zrozumienia narzędzi, które mogą skutecznie pobudzać neuron za pomocą zewnętrznego pola elektrycznego. W artykule opisano przygotowanie dwuwymiarowych i jednowymiarowych wzorcowych kultur hipokampa, stymulację przy użyciu różnych konfiguracji i orientacji bezpośrednio przyłożonego pola elektrycznego przez elektrody do kąpieli, a na koniec stymulację dwuwymiarowych i wzorzystych kultur jednowymiarowych przez zmienne w czasie pole magnetyczne, które indukuje pole elektryczne 5,20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Procedury obejmujące pracę ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Instytutu Nauki Weizmanna oraz odpowiednimi przepisami prawa izraelskiego. Instytut Weizmanna posiada akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytutu Weizmanna zatwierdził niniejsze badanie przeprowadzone na neuronach hipokampa.

1. Przygotowanie dwuwymiarowych (2D) i jednowymiarowych (1D) kultur hipokampa

  1. Przygotowanie szkiełek podstawkowych do hodowli 2D.
    1. Przygotować pożywkę do wysiewu (PM) składającą się z: 0,9 mL minimalnej pożywki niezbędnej (MEM)+3G, 0,05 mL płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,05 mL inaktywowanej termicznie surowicy konia (HI HS) oraz 1 µL suplementu B27. Uwaga: MEM+3G zawiera na każde 500 mL MEM x 1: 1 mL gentamycyny, 5 mL stabilizowanej L-glutaminy 100x (patrz Tabela materiałów/odczynników) i 5 mL 60% D-(+)-glukozy.
    2. Przygotować bufor boranowy składający się z: 1,9 g boraksu (dekahydratu tetraboranu sodu) w 200 mL wody dwukrotnie destylowanej (DDW) (mieszać w 60 °C) oraz 1,24 g kwasu borowego w 200 mL DDW. Przetytrować końcowy roztwór do pH 8,5 przy użyciu 1 M HCl. Uwaga: Roztwór końcowy to 400 mL 0,1 M buforu boranowego.
    3. Zanurzyć szkiełka podstawkowe w 65% kwasie azotowym na 2 h. Płukać trzykrotnie w DDW, a następnie trzykrotnie w bezwodnym etanolu czystym do analiz (ABS AR).
    4. Przenieść każde szkiełko krótko przez płomień palnika Bunsena dwa lub trzy razy przez 1–2 s, a następnie pozostawić do inkubacji przez noc w płytkach 24-dołkowych z 1 mL 0,01% roztworu poli-L-lizyny rozcieńczonego 1:5 w buforze boranowym (0,1 M, pH 8,4). Następnie opłukać szkiełka w DDW trzy razy i pozostawić z 1 mL PM na dołek w standardowym inkubatorze w 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  2. Przygotowanie szkiełek podstawkowych do hodowli 1D.
    1. Oczyścić szkiełka podstawkowe poprzez zanurzenie w podstawowym roztworze piranhy składającym się z 75 mL DDW, 25 mL 25% roztworu amoniaku i 25 mL 30% nadtlenku wodoru. Umieścić roztwór ze szkiełkami na płycie grzewczej w temp. ~ 50 °C na 30 min, a następnie osuszyć szkiełka azotem.
    2. Pokryć szkiełka najpierw cienką warstwą chromu (99,999%) o grubości 6 Å, a następnie warstwą złota (99,999%) o grubości 30 Å, stosując osadzanie z fazy gazowej lub rozpylanie magnetronowe.
      1. Aby uzyskać szybkość rozpylania 0,05–1 Å/s, należy użyć urządzenia do rozpylania z dwiema wiązkami elektronowymi i systemem próżniowym 260 l/s z tarczami o rozmiarach 2" i 4". Użyć stołu obrotowego z prędkością od 0 do 100 obrotów na minutę (RPM). Zastosować moc rozpylania prądem stałym (DC) w zakresie 0–750 W.
      2. Użyć obrotów 30 rpm i argonu 99,999%, aby uzyskać plazmę przy ciśnieniu 10 mTorr w komorze.
      3. Ustawić zasilanie pistoletów do rozpylania na moc 40 W DC dla chromu, co daje szybkość pokrycia ~ 0,12 Å/s, oraz na moc 10 W DC dla złota, co daje ~ 0,28 Å/s.
    3. Rozpuścić 0,1 g 1-oktadekanotiolu w 100 mL etanolu ABS AR przy użyciu ultradźwięków przez 30 min. Umieścić szkiełka pokryte Cr-Au w tym roztworze na 2 h, a następnie przemyć etanolem ABS AR i osuszyć azotem.
    4. Przygotować roztwór z 100 mL fosforanowego buforu solnego Dulbecco (D-PBS) i 3,5 g kopolimeru triblokowego (patrz Tabela materiałów/odczynników), mieszając przez 1–2 h przy prędkości 600–700 rpm. Umieścić szkiełka w roztworze na 1 h. Osuszyć szkiełka azotem.
    5. Mechanicznie wytrawić pożądany wzór poprzez zarysowanie warstwy bio-odpychającej22. Wykonać to za pomocą plotera pisaka, w którym pisak zastąpiono igłą trawiącą. Zarysować wzór przez warstwy metalu, aby dotrzeć do znajdującego się pod nimi szkła. Kontrolować ten proces komputerowo, aby uzyskać powielony, pożądany wzór. Wzory utworzone tym procesem przedstawiono na Rysunku 2 oraz Rysunku 3.
    6. Przygotować warstwę biokompatybilną składającą się z 100 mL D-PBS, 3,5 g kopolimeru triblokowego, 35,7 µL/mL fibronektyny i 29 µl/mL lamininy.
      1. Zsterylizować szkiełka w świetle ultrafioletowym przez co najmniej 10 min. Inkubować szkiełka w przygotowanym roztworze biokompatybilnym przez noc.
        UWAGA: Warstwa biokompatybilna utworzy się tylko tam, gdzie warstwa bio-odpychająca została wytrawiona w poprzednim kroku.
      2. Następnego dnia przemyć szkiełka dwukrotnie P-DBS. Inkubować szkiełka w PM przez noc. Szkiełka są teraz gotowe do wysiewu komórek.
  3. Przeprowadzić sekcję zgodnie ze standardowymi procedurami, które zostały wcześniej szeroko opublikowane23,24.
    1. W skrócie: wyizolować hipokamp lub korę z embrionów szczura, zazwyczaj w dniu E19, lub myszy, zazwyczaj w dniu E1723,24.
    2. Dysocjować komórki najpierw w roztworze papainy przez 20–30 min, a następnie przeprowadzić tryturację mechaniczną24 za pomocą pipet szklanych o końcówkach wypalanych w ogniu.
      UWAGA: Jeśli komórki pochodzą z myszy modyfikowanych genetycznie, tkanka z każdego embrionu powinna być utrzymywana w oddzielnej plastikowej probówce 1,5 mL przez cały proces.
    3. Policzyć komórki przy użyciu błękitu trypanu przed wysiewem.
      UWAGA: W przypadku zwierząt modyfikowanych genetycznie liczenie należy przeprowadzić oddzielnie dla każdego embrionu.
    4. W przypadku hodowli 2D wysiać neurony mysie w liczbie 750 000 i neurony szczurze w liczbie 850 000 komórek na dołek. Dla hodowli 1D wysiać 650 000 komórek na dołek. Delikatnie potrząsnąć płytką natychmiast po wysiewie, aby zapewnić jednorodne pokrycie szkiełka.
  4. Utrzymanie hodowli neuronalnych.
    1. Przygotować pożywkę do wymiany (CM) składającą się z (na mL): 0,9 mL MEM+3G, 0,1 mL HI HS, 10 µL 5-fluoro-2′-deoksyurydyny (FUDR) z urydyną 100x.
    2. Przygotować pożywkę końcową (FM) składającą się z (na mL): 0,9 mL MEM+3G i 0,1 mL HI HS.
    3. Zastąpić PM 1–1,5 mL CM po 4 dniach in vitro (DIV). W 6 DIV zastąpić 50% CM świeżą pożywką CM. W 8 DIV zmienić pożywkę na 1,5 mL FM, a następnie wymieniać 50% FM co 2 dni. Po około jednym tygodniu pojawia się spontaniczna aktywność synchroniczna.
  5. Obrazowanie spontanicznej lub wywołanej aktywności w hodowlach neuronalnych z użyciem barwników fluorescencyjnych.
    1. Przygotować roztwór 50 µg fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na wapń (patrz Tabela materiałów/odczynników) w 50 µL DMSO (dimetylosulfoksyd).
    2. Przygotować zewnątrzkomórkowy roztwór rejestracyjny (EM) zawierający (w mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glukozy, 45 sacharozy (pH 7,4).
    3. Inkubować hodowlę neuronalną w 2 mL EM z 8 µL roztworu fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na wapń przez 1 h. Chronić przed światłem i delikatnie obracać, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie barwnika do komórek.
    4. Przed obrazowaniem zastąpić roztwór świeżym EM. Obrazowanie fluorescencyjne przedstawiono na Rysunku 4.
    5. Wykonać obrazowanie w mikroskopie fluorescencyjnym z filtrami optycznymi do obrazowania fluorescencji wapnia (szczyt pobudzenia przy 488 nm, szczyt emisji przy 520 nm), używając kamery i oprogramowania zdolnego do kwantyfikacji intensywności dowolnego obszaru zainteresowania (ROI) w polu widzenia mikroskopu.

2. Stymulacja elektryczna kultur

UWAGA: Podstawowy układ do stymulacji elektrycznej przedstawiono na Rysunku 1. Szkiełko podstawowe, na którym hodowla neuronalna rosła przez około 14 dni, umieszcza się w szalce Petriego pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aktywność elektryczną neuronów obrazuje się przy użyciu barwników wrażliwych na jony wapnia, podczas gdy napięcie jest przyłożone za pomocą dwóch par elektrod kąpielowych rozmieszczonych na zewnątrz hodowli. Elektrody są sterowane przez generator sygnałowy, którego wyjście jest wzmacniane przez wzmacniacz dwukanałowy. Sterowanie napięciem w stymulacji jest preferowane nad bardziej standardowym sterowaniem prądowym25,26, ponieważ wektory pola elektrycznego są wyznaczane bezpośrednio, co umożliwia proste sumowanie i kombinowanie wektorów. Wymaga to jednak dokładnej kontroli jednorodności pola elektrycznego, którą w przypadku sterowania napięciem można przeprowadzić w obrębie całej próbki. Podczas stosowania sterowania napięciem należy zadbać o uniknięcie pętli masy i zweryfikować homogeniczność pola elektrycznego (patrz punkt 2.2 poniżej).

  1. Do stymulacji elektrycznej za pomocą jednorodnego pola elektrycznego należy użyć pary równoległych przewodów elektrod.
    1. Należy zastosować elektrody platynowe o grubości rzędu 0,005'' (127 µm). W przypadku stosowania szkiełek nakrywkowych o rozmiarze 13 mm należy upewnić się, że odległość między dwiema elektrodami wynosi około 11 mm, a elektrody są umieszczone 1 mm nad kulturą.
      UWAGA: Do wykonania uchwytu elektrod (ryc. 5A i 6A) należy użyć politetrafluoroetylenu (PTFE). W PTFE należy wywiercić wąskie otwory do włożenia elektrod. Urządzenie powinno być wyższe niż roztwór zewnątrzkomórkowy, aby górna część, w której elektrody są odsłonięte, nigdy nie miała kontaktu z roztworem. W celu izolacji należy użyć kleju epoksydowego na wszystkich częściach przewodów elektrod, które mogą być odsłonięte.
    2. Należy zastosować impuls prostokątny z cyklem pracy 50%, bez składowej stałej (DC), aby uniknąć elektrolizy. Czas trwania impulsu należy zmieniać w zakresie od 10 µs do 4 ms, aby zapewnić skuteczną stymulację bez wypalenia kultury. Należy upewnić się, że amplituda wynosi około ± 22 V (patrz ryc. 5). Impuls prostokątny można obserwować na oscyloskopie podłączonym równolegle do elektrod.
      UWAGA: W celu łatwego zaprogramowania dowolnego kształtu fali należy użyć komercyjnego oprogramowania do edycji przebiegów (patrz Lista materiałów). Należy graficznie wprowadzić pożądany przebieg i przesłać go do generatora funkcji.
  2. Aby sprawdzić jednorodność pola, należy użyć elektrody sondy. Należy zastosować siatkę o rozmiarze co najmniej 1 mm x 1 mm, aby umożliwić przesuwanie sondy w obszarze między elektrodami i pomiar potencjału elektrycznego.
    1. Należy zmierzyć potencjał elektryczny. Do obliczenia pola elektrycznego należy użyć Wzór na gradient pola elektrycznego; pochodna cząstkowa; równanie do badań i fizyki.. Jedną z elektrod należy wykorzystać jako elektrodę odniesienia. Pole elektryczne należy mierzyć przy różnych czasach trwania impulsu w zakresie od 100 µs do 4 ms (patrz ryc. 5B dla przykładu impulsu o czasie trwania 100 µs), aby zweryfikować, czy pole jest jednorodne w zakresie stosowanych czasów stymulacji.
      UWAGA: Przykład zmierzonej jednorodności pola elektrycznego przy czasie trwania impulsu 1 ms przedstawiono na ryc. 5D.
  3. Aby wytworzyć bardziej złożone kształty pola elektrycznego oraz móc orientować pole w różnych kierunkach, należy użyć 2 prostopadłych par elektrod kąpielowych (patrz ryc. 6B). Wykorzystywane będzie urządzenie z 2 parami elektrod, a sygnał na każdej parze elektrod będzie obserwowany na dwóch osobnych oscyloskopach.
    1. Elektrody należy umieścić 1 mm nad kulturą, w odległości 10 - 11 mm od siebie. Należy upewnić się, że obie pary elektrod są „pływające” (nie mają połączenia z masą) i nie posiadają wspólnej masy, mierząc rezystancję między dowolnym zestawem elektrod i weryfikując brak zwarć między elektrodami. Należy sprawdzić, czy cały sprzęt podłączony do elektrod (taki jak oscyloskopy, wzmacniacze, generatory sygnałowe, itp.) jest pływający względem masy, upewniając się, że urządzenia nie są uziemione, a żadna z elektrod odniesienia nie dotyka uziemionego sprzętu.
    2. Aby zmienić orientację pola, należy zmieniać amplitudę napięcia podawanego do dwóch par elektrod względem siebie (patrz ryc. 7A). Na przykład dla 0° należy zastosować ± 22 V na parze elektrod prostopadłych do wzoru i 0 V dla drugiej elektrody. Dla 45° należy zastosować ± 15,6 V na obu parach elektrod bez przesunięcia fazowego, aby suma wektorowa amplitud wynosiła 15,62+15,62=222.
    3. Aby zastosować pole obracające, należy podać jedną pojedynczą falę impulsu napięcia sinusoidalnego i jedną pojedynczą falę impulsu napięcia cosinusoidalnego do dwóch par elektrod, co wytworzy obracające się pole elektryczne o stałej amplitudzie (patrz ryc. 6B).
      UWAGA: Jak widać na ryc. 6B, przy zastosowaniu jednego cyklu sinusoidy z napięciem ± 22 V w jednej elektrodzie i jednego cyklu cosinusoidy z napięciem ± 22 V w drugiej elektrodzie, suma wektorowa stanowi obracające się pole elektryczne o czasie trwania cyklu takim samym jak fal sinus i cosinus, z amplitudą ± 22 V.
  4. Aby zmierzyć i obliczyć chronaksję oraz reobazę aksonów w kulturze neuronalnej w porównaniu z dendrytami w tej samej kulturze, należy wykonać następujące kroki.
    1. Do obrazowania wapnia należy użyć fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na wapń, opisanego w Tabeli materiałów/odczynników oraz w punkcie 1.5), stosując kulturę 1D ukształtowaną w cienkich (170 µm), długich (10 mm) liniach. Barwnik wrażliwy na wapń należy nanieść na kulturę i inkubować przez 45 minut. Barwnik należy wypłukać, zastępując go świeżym roztworem pomiarowym.
    2. Należy odciąć połączenia sieciowe, aby uzyskać statystyki populacyjne bezpośredniej odpowiedzi na stymulację elektryczną, bez wpływu transmisji synaptycznej. W tym celu należy zastosować kombinację 40 µM bikukuliny, która blokuje działanie hamujące receptorów kwasu gamma-aminomasłowego typu A (GABAA), 10 µM 6-cyjanu-7-nitrochinoksalin-2,3-dionu (CNQX), aby zablokować receptory α-amino-3-hydroksy-5-metylu-4-izoksazolopropionowe (AMPA) i kainianowe oraz 20 µM kwasu (2R)-amino-5-fosfonowalerianowego (APV), który blokuje receptory N-metylo-D-asparaginianowe (NMDA). Blokery należy dodać do roztworu pomiarowego.
    3. Należy zastosować impuls prostokątny, jak opisano w punktach 2.1 i 2.3, ze zmiennym czasem trwania od 100 µs do 4 ms. Sygnał można obserwować na oscyloskopie.
    4. Należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z programem do akwizycji obrazu (patrz 1.5), aby monitorować intensywność przejściowych zmian poziomu wapnia w kilku obszarach ROI, z których każdy zawiera kilkaset neuronów. Obrazy należy rejestrować za pomocą czułej kamery EMCCD (patrz Lista materiałów), zdolnej do akwizycji obrazu z prędkością co najmniej 20 klatek na sekundę. Zmiana natężenia światła jest proporcjonalna do liczby stymulowanych neuronów. Ułamek stymulowanych neuronów należy oszacować na podstawie względnej zmiany intensywności.
    5. Dla każdego czasu trwania impulsu (od 100 µs do 4 ms) należy zmieniać amplitudę napięcia przyłożonego do elektrod, zaczynając od napięcia, przy którym nie obserwuje się zmiany intensywności (kilka woltów), aż do napięcia, przy którym zmiany intensywności wywołane przyłożonym napięciem uległy nasyceniu (do ± 22 V).
      UWAGA: Zmiana intensywności będzie rozkładem skumulowanym Gaussa5 w stosunku do napięcia stymulującego dla każdego czasu trwania impulsu napięcia.
    6. Dla każdego czasu trwania impulsu należy dopasować skumulowany rozkład Gaussa dla zależności intensywności od przyłożonego napięcia i wyznaczyć z tego dopasowania średnią wartość Gaussa.
      UWAGA: Średnia ta jest reprezentatywnym napięciem, na które zareagowały neurony.
    7. Po zakończeniu tego procesu należy uzyskać dla każdego czasu stymulacji średnie napięcie, na które zareagowały neurony. Należy użyć tych par czasu i natężenia do wykreślenia krzywych zależność natężenia od czasu trwania stymulacji (patrz ryc. 7).

3. Stymulacja magnetyczna kultur

Uwaga: Podstawowy układ do stymulacji magnetycznej przedstawiono na Rysunku 2. W prawym górnym rogu widoczny jest odwrócony mikroskop fluorescencyjny, służący do obrazowania barwników wrażliwych na wapń w neuronach. Cewka magnetyczna (niebieskie okręgi) jest umieszczona koncentrycznie około 5 mm powyżej pierścieniowej hodowli neuronalnej (niebieski obrys). Cewka odbiorcza (czerwony okrąg) na obwodzie szalki Petriego monitoruje napięcie indukowane przez impuls magnetyczny. W lewym górnym rogu przedstawiono zmierzoną dynamikę cewki stymulatora magnetycznego (MS) przy obciążeniu napięciowym kondensatora 5,000 kV, zintegrowaną z cewki odbiorczej. Indukowane pole elektryczne (obliczone dla promienia pierścienia 14 mm) przedstawiono na zielono, natomiast pole magnetyczne na niebiesko. Na dole znajdują się obrazy hodowli neuronalnej. W lewym dolnym rogu widoczny jest obraz w polu jasnym z wzorcowanego szkiełka podstawowego o średnicy 24 mm. Białe obszary to neurony. Sfotografowany wzór składa się z koncentrycznych hodowli pierścieniowych o różnych promieniach. W prawym dolnym rogu znajduje się powiększenie krótkiego segmentu pierścieni, pokazujące pojedyncze neurony. Dla skali, szerokość pierścieni wynosi około 200 µm.

  1. W celu stymulacji kultur 1D hoduj neurony w pierścieniu (trawionym zgodnie z opisem w punkcie 1.2.5). Do obrazowania wapnia (opisanego w sekcji 1.5) użyj fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na wapń, przy kulturze 1D uformowanej w cienkich (170 µm) i długich (10 mm) liniach.
    1. Użyj okrągłej cewki magnetycznej i umieść szalkę Petriego około 5 mm poniżej cewki, współśrodkowo z nią. Użyj niestandardowej cewki o średnicy około 30 mm (średnica wewnętrzna, średnica zewnętrzna 46 mm) o indukcyjności L = 90 mH, zasilanej przez własnoręcznie wykonany lub komercyjny stymulator magnetyczny (MS) z maksymalnym napięciem 5 kV.
    2. Aby stymulować magnetycznie kultury neuronalne, rozładuj wysokie napięcie i prąd przez cewkę przewodzącą, używając przełącznika wysokoprądowego i wysokonapięciowego. Stymulator magnetyczny (MS) można zbudować zgodnie z opisem w21, używając dużych kondensatorów, rzędu 100 mF, aby uzyskać wysokie napięcie 1 - 5 kV. Alternatywnie można użyć dostępnego komercyjnie urządzenia MS (patrz Tabela materiałów/odczynników).
      UWAGA: Do wykonania własnej cewki21 użyj prostokątnego miedzianego drutu w powłoce poliestrowej o grubości 0,254 mm i szerokości 6,35 mm. Nawijaj druty na niestandardowych ramach, izolując je włóknem szklanym i odlewając w żywicy epoksydowej (patrz Tabela materiałów/odczynników). Alternatywnie można użyć dostępnych komercyjnie cewek (patrz Tabela materiałów/odczynników).
  2. Użyj wirujących pól magnetycznych do stymulacji kultur 2D.
  3. Teraz użyj wirujących pól magnetycznych do stymulacji kultur 2D. Uruchom TMS bez kultury w szalce, przy różnych intensywnościach, aby wykazać liniową korelację odczytów cewki z intensywnością.
  4. Następnie, rejestrując przejściowe zmiany stężenia wapnia w kulturze neuronalnej, zacznij uruchamiać TMS przy zwiększaniu intensywności, rejestrując jednocześnie zmiany wapnia oraz sygnał z cewki. Początkowo wyładowania sieciowe, obserwowane jako duże przejściowe zmiany wapnia, nie powinny być zsynchronizowane z impulsami TMS cewki odbiorczej. Po dalszym zwiększaniu intensywności w pewnym momencie zmiany wapnia zaczną synchronizować się z impulsami TMS. Alternatywnie lub dodatkowo, po uzyskaniu zsynchronizowanej odpowiedzi, zacznij zmniejszać intensywność aż do zniesienia synchronizacji, aby określić próg TMS.
    UWAGA: Warunki powinny być utrzymane ściśle stałe dla każdej z konfiguracji, przy każdym razie stosując dokładnie taką samą objętość, te same naczynia oraz identyczne pozycje i orientacje cewki.
    1. Zamontuj cewkę odbiorczą u podstawy szalki do rejestracji w taki sposób, aby znajdowała się w płaszczyźnie równoległej do kultury neuronalnej i w stałej pozycji względem niej.
      UWAGA: Zapewnia to, że zależność pozycjonowania cewki odbiorczej względem magnesu jest zgodna z pozycją kultury, a wszelkie rozbieżności w pozycjonowaniu będą pomijalne w odczytach cewki odbiorczej.
      1. Użyj dwóch niezależnych cewek ustawionych prostopadle do siebie (Rycina 8B), aby wygenerować wirujące pole magnetyczne i indukowane pole elektryczne. Podłącz każdą cewkę do osobnego urządzenia MS. Upewnij się, że stymulatory rozładowują podobne prądy z przesunięciem fazowym o 90 stopni (Rycina 10A), co skutkuje wirującym polem magnetycznym, które skanuje 270 stopni przestrzeni rzeczywistej przy maksymalnym polu ~ 270 V/m (Rycina 10B).
      2. Umieść kulturę neuronalną wewnątrz szklanego naczynia sferycznego wypełnionego zewnętrznym roztworem do rejestracji (EM).
      3. Monitoruj stymulację (zmianę intensywności fluorescencji neuronów) za pomocą kamery, zgodnie z opisem w kroku 2.4.4.
      4. W przypadku cewek krzyżowych (Rycina 8B), umieść cewkę odbiorczą równolegle i w określonej odległości poniżej kultury neuronalnej. Starannie utrzymuj tę konfigurację przez cały czas trwania eksperymentów.
  5. Oblicz analitycznie pole elektryczne dla konfiguracji 1D za pomocą wzoru Emax=k1Br, gdzie Emax jest maksymalną amplitudą indukowanego pola elektrycznego skierowaną wzdłuż stycznej do pierścieni o promieniu r. B to amplituda impulsu magnetycznego, a k1 to wymiarowa stała proporcjonalności, którą można zmierzyć za pomocą cewki odbiorczej (Rycina 8A).
  6. Użyj pakietu do symulacji numerycznych (patrz lista materiałów), aby numerycznie zasymulować pole elektryczne21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół umożliwia łatwe tworzenie wzorów w kulturach neuronalnych. W połączeniu z opracowanymi przez nas metodami stymulacji pozwala on na pomiar niektórych wewnętrznych właściwości neuronów, takich jak chronaksja i reobaza5, porównanie właściwości neuronów zdrowych i chorych27, znalezienie optymalnych sposobów stymulacji kultur w zależności od ich struktury oraz zastosowanie wielu innych nowatorskich podejść. Niektóre przykła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tworzenie wzorów 1D jest ważnym narzędziem, które można wykorzystać do różnych zastosowań. Na przykład użyliśmy wzorców 1D do tworzenia bramek logicznych z kultur neuronalnych 29 , a ostatnio do pomiaru Chronaxie i Rheobase neuronów hipokampa szczura 5 oraz spowolnienia prędkości propagacji sygnału aktywności wypalania w neuronach hipokampa zespołu Downa w porównaniu z neuronami hipokampa typu dzikiego (WT) 27. Sugerowany protokół tworzenia wzorów 1D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Oferowi Feinermanowi, Fredowi Wolfowi, Menahemowi Segalowi, Andreasowi Neefowi i Eitanowi Reuveny'emu za bardzo pomocne dyskusje. Autorzy dziękują Ilanowi Breskinowi i Jordiemu Soriano za opracowanie wczesnych wersji technologii. Autorzy dziękują Cwi Tlusty'emu i Jean-Pierre'owi Eckmannowi za pomoc w opracowaniu koncepcji teoretycznych. Badania te były wspierane przez Fundację Minerva, Ministerstwo Nauki i Technologii Izraela oraz przez grant 1320/09 Izraelskiej Fundacji Nauki i grant Bi-National Science Foundation 2008331.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
APVSigma-AldrichA8054Odłącz sieć. Wymienione w sekcji 2.4.2
B27 suppGibco17504-044Podłoże galwaniczne. Wspomniano w Sekcja 1.1.1
bicucullineSigma-Aldrich14343Odłącz sieć. Wymieniony w sekcji 2.4.2
Boraks (dekahydrat tetraboranu sodu)Sigma-AldrichS9640Bufor boranowy. Wymieniony w sekcji 1.1.2
Kwas borowyFrutarom LTD5550710Bufor boranowy. Wymienione w sekcji 1.1.2
CaCl2 , 1 MFluka 21098Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego. Wspomniano w sekcji 1.5.2
CNQXSigma-AldrichC239Odłącz sieć. Wspomniano w Sekcja 2.4.2
COMSOLCOMSOL IncMultiphysics 3.5Symulacja numeryczna. Wymienione w sekcji 3.5.2
D-(+)-glukoza, 1 MSigma-Aldrich65146Pożywka galwaniczna, Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wymienione w sekcjach 1.1.1 i 1.5.2 Hodowle
D-PBSSigma-AldrichD8537. Wymienione w sekcjach 1.2.4 i 1.2.6
FCS (FBS)Gibco12657-029Podłoże galwaniczne. Wspomniany w sekcji 1.1.1
FibronectinSigma-AldrichF1141Bio Coating. Wspomniano w sekcji 1.2.6
Fluo4AMLife technologiesF14201Obrazowanie spontanicznej lub wywołanej aktywności. Wymienione w sekcjach 1.5.1, 1.5.3 i 1.5.5
FUDRSigma-AldrichF0503Zmienianie podłoża. Wspomniano w sekcji 1.4.1
GentamycynaSigma-AldrichG1272Pożywka galwaniczna, Pożywka zmieniająca, Pożywka końcowa. Wymienione w sekcji 1.1.1
GlutaMAX 100xGibco35050-038Podłoże galwaniczne, Podłoże do wymiany, Podłoże końcowe. Wspomniany w sekcji 1.1.1
Hepes, 1 MSigma-AldrichH0887Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wspomniano w sekcji 1.5.2
HI HSBI04-124-1APodłoże galwaniczne, Medium zmieniające, Medium końcowe. Wymieniony w sekcjach 1.1.1, 1.4.1 i 1.4.2
KCl,  3 MMerck1049361000Zewnątrzkomórkowe rozwiązanie do nagrywania. Wymienione w sekcji 1.5.2
Laminin Powłoka biologiczna Sigma-AldrichL2020. Wymienione w sekcji 1.2.6
MEM x 1Gibco21090-022Podłoże galwaniczne, Podłoże zmieniające, Pożywka końcowa. Wymienione w sekcji 1.4.1      1.4.2
MgCl2 , 1 MSigma-AldrichM1028Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wymieniony w sekcji 1.5.2
NaCl, 4 MBio-Lab19030591Zewnątrzkomórkowy roztwór do zapisu. Wymienione w sekcji 1.5.2
OctadecanethiolSigma-Aldrich01858Czyszczenie szkiełek nakrywkowych pokrytych Cr-Au (kultury 1D). Wymienione w sekcji 1.2.3
Pluracare F108 NF PrillBASF Corparation 50475278Powłoka bio-odrzucająca, powłoka biologiczna. Wymienione w sekcjach 1.2.4 i 1.2.6
0,01% roztwór poli-L-lizyny Sigma-Aldrich  P47075Promuj podział komórek. Wymieniony w sekcji 1.1.4
Sacharoza, 1 MSigma-AldrichS1888Zewnątrzkomórkowy roztwór do nagrywania. Wymienione w sekcji 1.5.2
Tiol Powłoka bio-odrzucająca Sigma-Aldrich1858. Wymienione w sekcji 1.2.3
URIDINESigma-AldrichU3750Zmienianie podłoża. Wymienione w sekcji 1.4.1
NapylarkaAJA International, IncATC Orion-5Series powlekanie szkła cienkimi warstwami metalu. Wymienione w sekcji 1.2.2
Ploter pisakowy Hewlett Packard HP 7475AWytrawianie wzoru na powlekanym szkiełku nakrywkowym. Wymienione w sekcji 1.2.5
Przewody elektrod A-M Systems, Carlsborg WA767000Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych. Wymienione w sekcjach 2.1, 2.2, 2.3 i 2.4.5
Generator sygnałuBKPrecision4079Kształtowanie sygnału elektrycznego. Wspomniany w Rozdziale 2.3
Wzmacniaczdomowej robotyWzmocnienie napięcia sygnału z generatora sygnału do elektrod. Wymienione w rozdziale 2.3
Matryca zasilania MPS-3005 LK-3 Zasilanie maszyny do napylania. Wspomniano w sekcji 1.2.2.3
Przezczaszkowa stymulacja magnetycznaMagstim, Spring Gardens, UKRapid 2Magnetyczna stymulacja hodowli neuronalnej. Wymienione w sekcjach 3.1, 3.3 i 3.4
Żywica epoksydowaCognisVersamid 140Odlewanie cewek domowej roboty. Wymienione w sekcji 3.4
Powłoka epoksydowaEPON 815 Odlewanie cewek domowej roboty. Wymienione w sekcji 3.4
Druty platynowe o grubości 0,005 ''; Systemy AM,   Carlsborg WA  767000Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych. Wspomniano w sekcji 2.1
Okrągła cewka magnetycznaDomowastymulacja magnetyczna kultur neuronalnych. Wymienione w sekcji 3.3
WaveXpress SWB& K Precyzja Oprogramowanie do edycji przebiegów. Wspomniana w sekcji 2.1.32
Kamera Xion Ultra 897AndorSensitive EMCCD. Wymienione w sekcji 2.4.4
komórkowe

Bibliografia

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577(2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287(2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794(2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680(2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultury neuronalnestymulacja elektrycznastymulacja magnetycznakultury jednowymiaroweustrukturyzowane sieci neuronalnezewnętrzne pole elektrycznekonfiguracja elektrodgenerowanie impulsu magnetycznegokrzywa zależność natężenie-czas
Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.