Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54375

⸱

11 listopada 2016

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Biochemistry II, Kanazawa Medical University, 3Center for Immunotherapy, Roswell Park Cancer Institute, 4DNAVEC Corporation, 5Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 6Department of Surgical Oncology, Roswell Park Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Streszczenie

Adoptywny transfer ex vivo rozszerzonych autologicznych limfocytów naciekających nowotwór (TILs) może pośredniczyć w trwałych i pełnych odpowiedziach w znacznych podgrupach pacjentów z przerzutowym czerniakiem. Głównymi przeszkodami w tym podejściu są zmniejszona żywotność przenoszonych limfocytów T, spowodowana skróceniem telomerów, oraz ograniczona liczba TIL uzyskanych od pacjentów. Mniej zróżnicowane limfocyty T z długimi telomerami byłyby idealnym podzbiorem limfocytów T do adoptywnej terapii komórkami T; jednak generowanie dużej liczby tych mniej zróżnicowanych limfocytów T jest problematyczne. To ograniczenie adoptywnej terapii limfocytami T można teoretycznie przezwyciężyć za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które samoodnawiają się, utrzymują pluripotencję, mają wydłużone telomery i stanowią nieograniczone źródło autologicznych limfocytów T do immunoterapii. W tym miejscu przedstawiamy protokół do generowania iPSC przy użyciu wektorów wirusa Sendai do transdukcji czynników przeprogramowujących do TIL. Protokół ten generuje w pełni przeprogramowane, wolne od wektorów klony. Te iPSC pochodzące z TIL mogą być w stanie generować mniej zróżnicowane limfocyty T specyficzne dla pacjenta i nowotworu do adoptywnej terapii limfocytami T.

Wprowadzenie

Technologia przeprogramowania komórkowego, która pozwala na generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez nadekspresję określonego zestawu czynników transkrypcyjnych, jest bardzo obiecująca w dziedzinie terapii komórkowych1,2. Te iPSC wykazują cechy transkrypcyjne i epigenetyczne oraz mają zdolność do samoodnawiania się i pluripotencji, podobnie jak embrionalne komórki macierzyste (ESC)3-5. Niezwykły postęp dokonany w technologii przeprogramowania w ciągu ostatniej dekady pozwolił nam na generowanie ludzkich iPSC nawet z terminalnie zróżnicowanych komórek, takich jak limfocyty T6-8. IPSC pochodzące z limfocytów T (TiPSC) zachowują tę samą przegrupowaną konfigurację genów łańcuchowych receptora komórek T (TCR), co oryginalne limfocyty T, co umożliwia regenerację limfocytów T specyficznych dla antygenu z TiPSC9-11.

Prawie 80% limfocytów naciekających czerniaka (TIL) uzyskanych z guza pacjenta rozpoznaje antygeny związane z nowotworem i utrzymuje cytotoksyczność w stosunku do oryginalnych komórek rakowych12. W szczególności stwierdzono, że ekspresja białka programowanej śmierci komórki-1 (PD-1) na TIL identyfikuje autologiczny repertuar reaktywny na nowotwór, w tym zmutowane limfocyty CD8 + specyficzne dla neoantygenu13. Adoptywny transfer ekspandowanych autologicznych TIL ex vivo w połączeniu z preparatywnymi schematami limfodepletingu i ogólnoustrojowym podawaniem interleukiny-2 (IL-2) może powodować znaczną regresję czerniaka z przerzutami w podgrupach pacjentów14. Pomimo zachęcających wyników w modelach przedklinicznych i u pacjentów, słaba przeżywalność limfocytów T podawanych we wstrzyknięciu i istnienie szlaków immunosupresyjnych wydaje się zagrażać pełnemu potencjałowi adoptywnej terapii limfocytami T. Obecne protokoły kliniczne wymagają rozległej manipulacji ex vivo autologicznymi limfocytami T w celu uzyskania dużej liczby. Powoduje to wytwarzanie terminalnie zróżnicowanych limfocytów T, które mają słabą przeżywalność, zmniejszoną zdolność proliferacyjną i wysoki poziom PD-115.

To ograniczenie adoptywnej terapii limfocytami T można teoretycznie przezwyciężyć za pomocą iPSC, które mogą zapewnić nieograniczone źródło autologicznych limfocytów T do immunoterapii. Niedawno informowaliśmy o przeprogramowaniu TIL czerniaka wyrażających wysokie poziomy PD-1 przez transdukcję czterech czynników transkrypcyjnych, w której pośredniczy wirus Sendai (SeV) i OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC16. Podczas gdy wektory retrowirusowe wymagają integracji z chromosomami gospodarza w celu ekspresji genów przeprogramowujących, wektory SeV są nieintegrujące się i ostatecznie są eliminowane z cytoplazmy. Wydajność przeprogramowania jest znacznie wyższa w przypadku systemu SeV w porównaniu z wektorami lentiwirusowymi lub retrowirusowymi6-8. Co więcej, SeV może specyficznie przeprogramowywać limfocyty T w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), podczas gdy niektóre klony iPSC generowane przez wektory lentiwirusowe lub retrowirusowe mogą pochodzić z linii nielimfoidalnych6-8. W tym miejscu szczegółowo opisano procedury stosowane w celu izolacji i aktywacji ludzkich czerniaków TIL oraz generowania iPSC pochodzących z TIL za pomocą systemu przeprogramowania SeV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Pacjenci powinni wyrazić świadomą zgodę na udział w badaniu zatwierdzonym przez Institutional Review Board i Human Pluripotent Stem Cell Committee.

1. Izolacja i kultura TIL

  1. Uzyskaj materiał nowotworowy, który nie jest wymagany do diagnozy histopatologicznej, z usługi patomorfologicznej/rdzenia do pobierania tkanek. Umieść 20-100 g próbek guza w 50-mililitrowej probówce z 30 ml pożywki do zbierania guza (Tabela 1).
  2. Wypreparuj twardą, twardą, normalną tkankę próbki guza z delikatnych i/lub krwawych martwiczych obszarów za pomocą nożyczek. Po usunięciu tkanki martwiczej użyj nożyczek, aby zmielić próbkę tak mało, jak to możliwe.
  3. Zdysocjuj zmieloną próbkę do zawiesiny jednokomórkowej za pomocą dysocjatora i zestawu do dysocjacji guza (człowieka) zgodnie z instrukcjami producenta. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sitka o pojemności 70 μm, które jest umieszczone na probówce o pojemności 50 ml i przemyć sitko 2 razy 2 ml RPMI 1640.
  4. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki z limfocytów T (Tabela 1).
  5. Przygotować dwustopniowy roztwór gradientowy, taki jak Ficoll (roztwór gradientowy) w probówce o pojemności 50 ml, z dolnym krokiem 10 ml 100% roztworu gradientowego i środkowym krokiem 30 ml 75% roztworu gradientowego rozcieńczonego buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu (D-PBS(-)).
  6. Nałożyć zawiesinę komórek (z kroku 1.4) na roztwór gradientowy (z kroku 1.5). Wirować przy 400 x g w temperaturze 20 °C przez 45 min.
  7. Zebrać warstwę zawierającą wzbogacone TIL na granicy faz między roztworem o 100% gradiencie a roztworem o 75% gradiencie w probówce o pojemności 50 ml. Rozcieńczyć warstwę roztworu wzbogaconymi TIL, dodając 20-30 ml D-PBS(-).
  8. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić frakcję wzbogaconą w TIL w 10 ml pożywki z limfocytów T.
  9. Wyhodować frakcję (z kroku 1.8) z 2 ml pożywki z limfocytów T i 6 000 j.m./ml rekombinowanej ludzkiej (rh) IL-2 na 6-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  10. Zmień połowę pożywki w 5 dniu po rozpoczęciu hodowli, a następnie co 2-3 dni.
  11. Podziel komórki w stosunku 1:2 bez trypsynizacji po delikatnym zawieszeniu, podwajając liczbę dołków po osiągnięciu 80-90% zbieżności. Dodać połowę objętości (1 ml) świeżej pożywki z limfocytów T i rhIL-2 w stężeniu 6 000 j.m./ml.

2. Przygotowanie płytki komórkowej SNL traktowanej mitomycyną C

  1. Hodować komórki karmiące SNL w 10 ml pożywki z komórek zasilających SNL (tabela 1) na 0,1% pokrytej żelatyną naczyniu o średnicy 10 cm, aż do osiągnięcia 80-90% konfluencji (3-4 x 106 komórek).
  2. Dodać 310 μl 0,4 mg/ml roztworu mitomycyny C bezpośrednio do naczynia do hodowli komórek SNL i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny i 15 minut. Odessać pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 5 ml D-PBS(-).
  3. Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w celu dysocjacji komórek. Dodać 4,5 ml pożywki z ogniwami zasilającymi SNL, aby zneutralizować i ponownie zawiesić komórki w pojedynczej zawiesinie.
  4. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i policzyć komórki za pomocą hemocytometru po ponownym zawieszeniu w 10 ml pożywki komórkowej SNL.
  5. Płytkę 1,5 x 106 komórek na studzienkę komórek zasilających SNL na 10 cm szalce i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Użyj ogniw podajnika SNL w ciągu 3 dni.

3. Generowanie iPSC za pomocą wektora wirusa Sendai (SeV)

  1. Zebrać TIL (z kroku 1.11) i aktywować 5 x 105 komórek TIL za pomocą związanego z płytką mysiego anty-ludzkiego CD3 (1 μg/ml) i rozpuszczalnego mysiego anty-ludzkiego CD28 (5 μg/ml), z rhIL-2 (6,000 IU/ml) w 2 ml pożywki z komórek T na 6-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 dni.
  2. Zebrać TIL (z kroku 3.1) do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  3. Reaktywuj 1 x 105 komórek TIL za pomocą związanego z płytką mysiego anty-ludzkiego CD3 (1 μg/ml) i rozpuszczalnego mysiego anty-ludzkiego CD28 (5 μg/ml), z rhIL-2 (60 IU/ml) w 500 μl pożywki do przeprogramowania (Tabela 1) na studzienkę w 24-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny. Przygotuj 3 studzienki na infekcję SeV: OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC (1 dołek); Zakażenie SeV (GFP: białko zielonej fluorescencji) (1 dołek); i liczba komórek (1 dołek).
  4. Po 24 godzinach (od kroku 3.3) policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i określ objętość każdego wirusa dla różnych (3-20) wielokrotności infekcji (MOI). Wyjąć jeden zestaw probówek z wektorami wirusa Sendai z magazynu w temperaturze -80 °C. Szybko rozmrozić wektory SeV w łaźni wodnej (37 °C) i umieścić je na lodzie.
    Objętość wirusa (μl) = MOI (CIU/komórka) x liczba komórek/miano wirusa (CIU/ml) × 10-3 (μl/ml)
  5. Dodaj obliczone objętości każdej z czterech probówek wektorów wirusa Sendai, które indywidualnie przenosiły OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC, dodając mieszaninę wektorów SeV o stężeniu 10-20 MOI do pożywki, w tym aktywowane TIL.
  6. Aby określić wydajność transdukcji, dodaj obliczone objętości SeV-GFP do studzienki aktywowanych TIL.
  7. Umieścić naczynie (z kroku 3.5 i kroku 3.6) w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 24 godziny. Po 24 godzinach oszacuj skuteczność infekcji za pomocą TIL zakażonych SeV-GFP pod mikroskopią fluorescencyjną.
  8. Zebrać komórki (z kroku 3.5) do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 0,5 ml pożywki hESC z pożywką dla komórek ES naczelnych i zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng/ml).
  10. Przenieść zawiesinę do 10-centymetrowego naczynia zawierającego komórki SNL poddane działaniu mitomycyny C w 10 ml pożywki hESC. Zmieniaj pożywkę hESC co drugi dzień, aż kolonie będą rosły.
  11. Około 18 do 21 dnia usuń komórki zasilające SNL wokół kolonii pod mikroskopem za pomocą końcówki 10 μl w czystej ławce.
  12. Zeskrobać kolonie za pomocą końcówki o pojemności 10 μl i przenieść je za pomocą końcówki o pojemności 200 μl do 100 μl pożywki iPSC na dołek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Pigazuj w górę i w dół 2-3 razy, aby rozbić kolonie na małe kępy o średniej wielkości 50-100 μm.
  13. Przenieś małe grudki na 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej z komórkami SNL traktowanymi mitomycyną C (z etapu 2) w 2 ml na studzienkę pożywki iPSC z podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng / ml). Zmieniaj nośniki iPSC każdego dnia.
  14. Przenieś iPSC na 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej ze świeżymi komórkami SNL traktowanymi mitomycyną C z 1 mg / ml kolagenazy dożylnej co 5-6 dni. Przygotuj 2 dołki na płytki każdego klonu do barwienia immunologicznego.
  15. Określ pełne przeprogramowanie każdego klonu przez immunohistochemiczne barwienie markerów pluripotencji (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 i OCT3/4)1,
    UWAGA: W celu dalszej oceny potencjału pluripotencji należy potwierdzić, że w pełni przeprogramowane linie iPSC mogą różnicować się w trzy listki zarodkowe za pomocą testu tworzenia i różnicowania ciał zarodkowych lub testu tworzenia potworniaków16.
  16. Potwierdź, że w pełni przeprogramowane linie iPSC wykazują prawidłowy kariotyp za pomocą analizy cytogenetycznej.
  17. W celu utworzenia potworniaka należy wstrzyknąć niezróżnicowaną zawiesinę iPSC pochodzącą z TIL (1 x 106) w 100 μl DMEM zawierającego 10% FCS do tkanki podskórnej 6-8 tygodniowych samic myszy NOD / SCID. Wybarwienie skrawków potworniaka hematoksyliną i eozyną.

4. Barwienie immunofluorescencyjne iPSC dla SSEA3, SSEA4, TRA1-60 i TRA1-81

  1. Przemyć iPSC 1 ml PBS i utrwalić iPSC 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu przez 10 minut. Usunąć 4% roztwór paraformaldehydu i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas stosowania paraformaldehydu, ponieważ jest on toksyczny.
  2. Wstępnie potraktuj iPSC buforem blokującym (tabela 1) przez 30 minut. W międzyczasie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała (szczurzy anty-ludzki SSEA3, mysi anty-ludzki SSEA4, mysi anty-ludzki TRA1-60 i mysi anty-ludzki TRA1-81) 1:50 w 1,5% roztworze surowicy koziej rozcieńczonym PBS i TritonX-100 (całkowita objętość: 1 ml).
  3. Usuń bufor blokujący (tabela 1). Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W międzyczasie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (anty-mysie IgG i IgM lub anty-szczurze IgM) w stosunku 1:50 w 1,5% roztworze surowicy koziej.
  4. Usunąć rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu.
  5. Usunąć rozcieńczony roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. Obserwuj iPSC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

5. Barwienie immunofluorescencyjne iPSC dla Oct3/4

  1. Przemyć iPSC 1 ml PBS i utrwalić iPSC 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu przez 10 minut. Usunąć 4% roztwór paraformaldehydu i przemyć iPSC PBS 3 razy.
  2. Dodać bufor permeabilizacyjny (Tabela 1) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć bufor permeabilizacji i dodać bufor blokujący (Tabela 1).
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W międzyczasie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało (mysie przeciwciało anty-ludzkie Oct3/4) w stosunku 1:50 w buforze blokującym.
  4. Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Usunąć rozcieńczony roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. W międzyczasie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-mysie IgG/IgM) w stosunku 1:100 w buforze blokującym.
  6. Dodać rozcieńczony roztwór przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu przez 45 minut.
  7. Usunąć rozcieńczony roztwór wtórny i przemyć iPSC 1 ml PBS 3 razy, każdy przez 5 minut. Obserwuj iPSC pod mikroskopią immunofluorescencyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat procedury, która obejmuje wstępną ekspansję TIL-ów z czerniaka z użyciem rhIL-2, a następnie aktywację przeciwciałami anty-CD3/CD28 oraz transfer genów OCT3/4, KLF4, SOX2 i c-MYC do TIL-ów w celu generowania iPSC. Zazwyczaj TIL-e w hodowli z rhIL-2 zaczynają tworzyć sfery od 21 do 28 dni po rozpoczęciu hodowli. W tym momencie TIL-e są gotowe do aktywacji anty-CD3/CD28. Rysunek 2A przedstawia TIL-e w hodowli z rhIL-2 w 21. dni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj zademonstrowaliśmy protokół przeprogramowania TIL czerniaka do iPSC poprzez transdukcję czterech czynników transkrypcyjnych OCT3 / 4 za pośrednictwem SeV. Podejście to, wykorzystujące system SeV do przeprogramowania limfocytów T, ma przewagę nad metodą niecałkującą7.

Poprzednie badanie wykazało, że system przeprogramowania SeV był wysoce wydajny i niezawodny w przeprogramowywaniu nie tylko fibroblastów, ale także limfocytów T krwi obwodowej7,17. Ponadto niedawno wyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Pani Deborah Postiff i Pani Jackline Barikdar z Tissue Procurement Core oraz dr Cindy DeLong z Pluripotent Stem Cell Core Laboratory na Uniwersytecie Michigan za jej pomoc techniczną. Badanie to było wspierane przez fundusze start-upów University of Michigan i granty z Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance i NIH/NCI (1K08CA197966-01) dla F. Ito.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
delikatne rurki MACS CMiltenyi Biotec130-093-237
delikatny dysocjator MACSMiltenyi Biotec130-093-235
Zestaw do dysocjacji guza, człowiekMiltenyi Biotec130-095-929
RPMI 1640Technologie życiowe11875-093
Filtr siatkowy do komórek Falcon 70 umBD352350
BD Falcon 50ml Stożkowe probówki do trifużuBD352070
IMDMTechnologie życiowe12440053
ludzkiej surowicy ABTechnologie życia34005100
L-glutamina (200mM)Technologie życia25030-081
2-merkaptoetanol (1000x, 55mM)Technologie życia21985-023
Penicylina-Streptomycyna Technologie życiowe15140-122
gentamycynaTechnologie życiowe15750-060
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-02
D-PBS (-)Technologie życia14040-133
rekombinowany ludzki (rh) IL-2Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD3BD555329
Oczyszczona mysz NA/LE Anti-Human CD28BD555725
X-VIVO 15Lonza04-418Q
FBSGibco26140-079
HEPESLife technologies15630-080
N-acetylocysteinaCumberland Farmaceutyki Inc.NDC 66220-207-30
Płytki do hodowli tkankowych Falcon (6-dołkowe)Płytki
Falcon (24-dołkowe)Corning353047
Wektor wirusa SendaiDNAVEC
SNLCell Biolabs, IncCBA-316
mitomycyna CSIGMAM4287rozpuszczalna w wodzie (0,5 mg / ml)
żelatynaSIGMAG1890
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)Technologie życiaPHG0264
do hodowli tkankowych Corning 353046 Komórki zasilające

Bibliografia

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
  4. Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
  5. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  6. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  7. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  8. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
  9. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
  10. Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
  11. Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
  12. Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
  13. Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
  14. Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
  15. Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
  16. Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11(2016).
  17. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  18. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
  19. Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wektory wirusa Sendairepertuar receptor w limfocyt w Tpo ywka dla ludzkich embrionalnych kom rek macierzystychwarstwa zasilaj ca SNL traktowana mitomycyn Crekombinowana ludzka IL 2mikroskopia fluorescencyjnaanaliza kariotyputworzenie potworniak w
Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.