Pomiar aktywności enzymatycznej laktazy w laboratorium dydaktycznym

Podsumowanie

Aktywność enzymatyczna laktazy jest niezbędna do katabolicznego przetwarzania disacharydu laktozy. W tym przypadku aktywność laktazy znajdującej się w suplementach diety jest oznaczana za pomocą testu kolorymetrycznego. Daje to studentom eksperymentalną platformę do zrozumienia aktywności laktazy i kinetyki enzymów.

Streszczenie

Zrozumienie, jak działają enzymy, i odniesienie tego do przykładów z życia wziętych, jest kluczowe dla szerokiego zakresu studiów licencjackich w naukach biologicznych i biomedycznych. Ten łatwy do naśladowania protokół został opracowany dla studentów pierwszego roku studiów licencjackich farmacji i stanowi wprowadzenie na poziomie podstawowym do reakcji enzymatycznych i procedur analitycznych do analizy enzymów. Enzymem z wyboru jest laktaza, ponieważ stanowi ona przykład dostępnego na rynku enzymu istotnego dla chorób u ludzi/praktyki farmaceutycznej. Laktaza jest ekstrahowana z tabletek suplementu diety i oceniana za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na hydrolizie sztucznego substratu dla laktazy (orto-nitrofenol-beta-D-galaktopyranozyd, ONPG). Uwalnianie ortonitrofenolu po hydrolitycznym rozszczepieniu ONPG przez laktazę mierzy się poprzez zmianę absorbancji przy 420 nm, a wpływ temperatury na reakcję enzymatyczną ocenia się, przeprowadzając reakcję na lodzie, w temperaturze pokojowej i w temperaturze 37 °C. Bardziej zaawansowana analiza może być realizowana przy użyciu tego protokołu, oceniając aktywność enzymu w różnych warunkach i przy użyciu różnych odczynników.

Wprowadzenie

Enzymy to wyspecjalizowany rodzaj białka, które działają jako biologiczne katalizatory reakcji chemicznych w organizmach żywych¹. Działanie enzymów ma kluczowe znaczenie dla życia, dostarczając energii, usuwając odpady i umożliwiając funkcjonowanie organizmów. Zrozumienie enzymów ma zatem kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia życia. Taka wiedza jest niezbędna w szerokiej gamie programów studiów uniwersyteckich, od nauk medycznych po biologię. Podczas gdy szczegółowe tło, począwszy od zasad katalizy, a skończywszy na teoretycznych modelach aktywności enzymów, można zapewnić studentom za pomocą wykładów i materiałów do czytania, właściwości reakcji enzymatycznych są najlepiej zrozumiane przez praktyczne doświadczenie enzymów w działaniu, jak pokazano wcześniej². Protokół ten zapewnia prosty do naśladowania paradygmat eksperymentalny do pomiaru aktywności enzymu w warunkach laboratoryjnych, wykorzystując laktazę jako przykład enzymu o aktywności istotnej dla żywienia i zdrowia człowieka.

Laktaza hydrolazy glikozydowej (EC 3.2.1.23/26) jest enzymem o kluczowym znaczeniu żywieniowym dla ssaków³. Aktywność laktazy jest wysoce konserwatywna w procesie ewolucji i wywodzi się z rodziny enzymów beta-galaktozydazy - rodziny obecnej od Escherichia coli do Homo sapiens (ryc. 1, PDB 1JZ8)⁴. Krytyczne znaczenie laktazy w żywieniu człowieka wynika z jej roli w umożliwianiu rozkładu laktozy na składniki monosacharydowe, które mogą być następnie wykorzystane do wytwarzania energii w organizmie. Laktaza katalizuje hydrolizę wiązania glikozydowego w dwucucharydzie laktozie, uwalniając galaktozę i glukozę (ryc. 2)⁵. Te monosacharydy są następnie wykorzystywane głównie do wytwarzania trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez cykl kwasu cytrynowego i fosforylację oksydacyjną⁶. Podczas rozwoju noworodków i niemowląt laktaza ulega silnej ekspresji w ludzkim układzie pokarmowym, rozkładając laktozę otrzymywaną z mleka matki, którego laktoza jest głównym składnikiem węglowodanów i jednym z kluczowych źródeł pożywienia we wczesnych latach życia⁷. Medyczne znaczenie laktazy podkreśla wrodzony niedobór laktazy (CLD), rzadki autosomalny recesywny stan spowodowany mutacjami w genie laktazy (LCT) kodującym enzym laktazę⁸. Noworodki z CLD wykazują bardzo małą aktywność laktazy, dlatego nie mogą być karmione mlekiem matki, żadnym innym rodzajem mleka ani mlekiem modyfikowanym zawierającym laktozę.

Podczas dzieciństwa ekspresja laktazy jest zwykle zmniejszona; jednak ta redukcja po odsadzeniu różni się geograficznie, przy czym około 35% dorosłych na całym świecie kontynuuje ekspresję enzymu⁹. Utrzymująca się ekspresja laktazy, znana jako trwałość laktazy, pozwala pacjentom na dalsze trawienie mleka i produktów mlecznych z różnych źródeł. I odwrotnie, utrata ekspresji laktazy może prowadzić do nietolerancji laktozy, znanej również jako hipolaktazja typu dorosłego (ATH), wynikającej z niezdolności do rozkładu laktozy w jelitach. ATH charakteryzuje się nagromadzeniem laktozy w okrężnicy po spożyciu produktów spożywczych zawierających laktozę. W okrężnicy nagromadzona laktoza jest fermentowana przez faunę mikrobiologiczną jelit, uwalniając gazy, w tym wodór, metan i dwutlenek węgla. Produkcja tych gazów u osób z niedoborem enzymu laktazy sprzyja wzdęciom brzucha, zwiększonym wzdęciom, bólowi, nudnościom i borborygmi (burczeniu w brzuchu)⁷. Zwiększony poziom laktozy w przewodzie pokarmowym może również prowadzić do luźnych stolców.

Kontrola ekspresji genu LCT jest modulowana przez polimorfizmy zlokalizowane w intronach pobliskiego genu MCM6. Osoby z utrzymującą się ekspresją laktazy są nosicielami polimorfizmów, które działają jako silne dystalne wzmacniacze ekspresji genu LCT, kompensując w ten sposób normalną regulację transkrypcji LCT w dół podczas odsadzania, a w konsekwencji utrzymując ekspresję laktazy w wieku dorosłym³. Sugeruje się, że polimorfizmy wzmacniaczy zostały pozytywnie wyselekcjonowane po udomowieniu bydła i wielbłądów na Bliskim Wschodzie ponad pięć tysięcy lat temu^9,10.

Objawy wynikające z ATH można opanować poprzez zmniejszenie spożycia laktozy, na przykład poprzez usunięcie produktów mlecznych z diety. Alternatywnym podejściem do ATH, a także podejściem z wyboru w przypadku CLD, jest stosowanie suplementów laktazy, powszechnie dostępnych w aptekach. Suplementy te dostarczają laktazę wyizolowaną z różnych źródeł, w tym drożdży i bakterii, w postaci płynnej lub na bazie tabletek, którą można przyjmować z jedzeniem zawierającym laktozę lub dodawać do niej. Suplement będzie hydrolizował część laktozy obecnej w żywności do produktów glukozy i galaktozy, umożliwiając w ten sposób ich wchłanianie i zapobiegając gromadzeniu się niestrawionego substratu laktozy w jelitach.

Opierając się na zastosowaniu suplementów laktazy jako pomocy dietetycznej, opracowaliśmy prosty eksperyment laboratoryjny enzymologiczny odpowiedni dla studentów pierwszego roku nauk biomedycznych lub farmacji. Ten eksperyment laboratoryjny wykorzystuje dostępne na rynku suplementy laktazy i wykorzystuje orto-nitrofenol-beta-D-galaktopyranozyd (ONPG) w celu zapewnienia kolorymetrycznego punktu końcowego do pomiaru rozszczepienia wiązań glikozydowych przez laktazę (ryc. 3)¹¹. ONPG działa jak sztuczny substrat dla laktazy, która poddana hydrolizie przez ten enzym wytwarza D-galaktozę i ortonitrofenol. Ten ostatni produkt ma żółty kolor, pochłaniając światło o długości fali 420 nm. Określając ilościowo wszelkie zmiany absorbancji przy 420 nm po ekspozycji ONPG na laktazę, możliwe jest oszacowanie aktywności tego enzymu. Ten eksperyment laboratoryjny zapewnia demonstrację aktywności hydrolazy enzymatycznej. Dzięki wbudowaniu dodatkowych powtórzeń i przeprowadzeniu testów w różnych warunkach, możliwe jest włączenie bardziej zaawansowanych analiz kinetyki enzymów, dostarczając cennego przykładu działania enzymów w praktyce, istotnych dla zdrowia ludzkiego.

Protokół

UWAGA: Poniższy protokół został opracowany tak, aby odbywał się w ciągu dwóch godzin (wliczając w to wypełnianie arkuszy w klasie) w specjalnie zbudowanym laboratorium dydaktycznym. Etapy eksperymentalne zostały celowo zestawione razem, aby wykluczyć bardziej szczegółową analizę kinetyki enzymów (przeprowadzoną w kontekście tego kursu przy użyciu danych modelowych); Jednak – jak zauważono w dyskusji – protokół zapewnia szablon dla bardziej zaawansowanych analiz w zależności od czasu, obiektów i poziomu osiągnięć uczniów.

BEZPIECZEŃSTWO: To ćwiczenie powinno być przeprowadzone zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratorium Chemicznego (GCLP) — środki ochrony osobistej, w tym zapinany fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne powinny być noszone przez cały czas w laboratorium.

1. Ekstrakcja enzymu

1. Rozdrobnić jedną tabletkę laktazy, zawierającą 200 mg enzymu, na równy proszek za pomocą moździerza i tłuczka.
2. Umieść otrzymany proszek w 15 ml probówce oznaczonej jako "zawiesina" i ponownie zawieś w 10 ml 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
3. Wiruj przez 1 minutę, aby zmaksymalizować ekstrakcję enzymatyczną.
4. Przenieść 1 ml z zawiesiny do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g do osadzających się cząstek stałych.
5. Przenieść 500 μl supernatantu do czystej probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej jako "Ekstrakt laktazy".

2. Obserwacja reakcji kolorymetrycznej

1. Umieścić 390 μl 100 mM PBS w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "Reakcja A".
2. Dodać 100 μl 5 mM roztworu ONPG i dobrze wymieszać przez wirowanie.
   UWAGA: W tym praktycznym zastosowaniu orto-nitrofenolu-beta-D-galaktopyranozydu (ONPG) jako substytutu laktozy. Ponieważ ONPG jest związkiem fenolowym, należy obchodzić się z nim ostrożnie. W przypadku kontaktu skóry z ONPG, odsłoniętą skórę należy natychmiast umyć. Wszelkie rozlane płyny należy natychmiast wytrzeć ręcznikami papierowymi i wyrzucić do odpowiedniego strumienia odpadów.
3. Dodać 10 μl ekstraktu do probówki A i dobrze wymieszać przez wirowanie.
4. Obserwuj mieszaninę reakcyjną przez 5 minut i zwróć uwagę na wszelkie zmiany kolorymetryczne w roztworze.

3. Pomiar aktywności enzymu

1. Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml: jedną oznaczoną "Reakcja B", drugą oznaczoną "Kontrola".
2. Dodać 390 μl 100 mM PBS do probówki reakcyjnej B, 400 μL 100 mM PBS do probówki kontrolnej, a następnie dodać 100 μL 5 mM ONPG do każdej probówki.
3. Wymieszaj zawartość przez wirowanie.
4. Dodać 10 μl ekstraktu laktazy do probówki B do reakcji, wymieszać przez wirowanie i pozostawić reakcję do przebiegu przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
5. Po upływie 1 minuty dodać 500 μl 1 M węglanu sodu do obu probówek, aby zahamować enzym laktazę poprzez zwiększenie pH, kończąc w ten sposób reakcję.
6. Przenieść 500 μl z każdej probówki do czystych kuwet spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 420 nm za pomocą spektrofotometru.
7. Zanotować absorbancję dla reakcji B i próbek kontrolnych, a następnie odjąć wartość kontrolną od wartości reakcji, aby uzyskać zmianę absorbancji spowodowaną hydrolizą ONPG w obecności aktywnego enzymu.

4. Wpływ temperatury na aktywność enzymu

1. Ustawić trzy probówki kontrolne i trzy probówki reakcyjne zgodnie z opisem w rozdziale 3 i oznaczyć je jako "4 °C", "Temperatura pokojowa" i "37 °C".
2. Po dodaniu ekstraktu enzymatycznego inkubować jedną probówkę na lodzie, jedną w temperaturze pokojowej i jedną w temperaturze 37 °C (w podgrzanej łaźni wodnej).
3. Pozostawić reakcje do zatoczenia przez 1 minutę, a następnie zakończyć reakcję, dodając 500 μl 1 M węglanu sodu do każdej probówki.
4. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 420 nm dla każdej probówki, jak opisano w sekcji 3. Zapisz wartości, odejmując wartość kontrolną od wartości reakcji w każdym przypadku.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki dla sekcji 2 protokołu przedstawiono na Rysunku 4A. Reakcja kontrolna, wykonana bez enzymu laktazy, pozostaje klarowna, podczas gdy roztwór reakcyjny zawierający ekstrakt z tabletki laktazy zmienia kolor na żółty w wyniku hydrolizy ONPG i uwalniania ortho-nitrofenolu. Rysunek 4B przedstawia ilościowe zestawienie w jednostkach arbitralnych z sekcji 4 protokołu, opracowane po analizie próbek za pomocą spektrofotometru. Produkcja ortho-nitrofenolu jest najniższa, gdy reakcja jest inkubowana w lodzie, a najwyższa, gdy reakcja prowadzona jest w temperaturze 37 °C.

Rysunek 1: *E. coli* beta-galaktozydaza (A) Struktura krystaliczna beta-galaktozydazy z Escherichia coli, przedstawiające tetrameryczną strukturę aktywnego kompleksu. (B) Allolaktoza (zaznaczona na czerwono) związana z centrum aktywnym beta-galaktozydazy. Obrazy wygenerowane na podstawie PDB 1JZ8⁴. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Działanie enzymatyczne laktazy. Hydroliza laktozy przez laktazę prowadząca do powstania beta-D-galaktozy i beta-D-glukozy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Hydroliza orto-nitrofenylo-beta-D-galaktopyranosydy. Hydroliza ONPG przez laktazę w celu wytworzenia beta-D-galaktozy i orto-nitrofenolu (który ma żółty kolor), co pozwala na oszacowanie aktywności laktazy poprzez pomiar absorbancji przy 420 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Hydroliza ONPG. Reprezentatywne wyniki hydrolizy ONPG, przedstawiające próbki kontrolne i reakcyjne (A) oraz reprezentatywne dane z sekcji 4 protokołu zapisane w arkuszach roboczych podczas zajęć, przedstawiające surową absorbancję w jednostkach arbitralnych przy 420 nm, skorygowaną o tło i w trzech różnych temperaturach (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Warunki eksperymentalne	Zmienne eksperymentalne
Temperatura	0 °C, 10 °C, 20 °C, 30 °C, 50 °C
Stężenie substratu	0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Hamowanie konkurencyjne	5 mM ONPG oraz 0 mM, 1 mM, 5 mM lub 10 mM laktozy
Zależność od czasu	0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min
Denaturacja termiczna	Ekstrakt laktazy podgrzany do 100 °C przez 10 min przed analizą

Tabela 1: Potencjalne rozszerzone warunki eksperymentalne. Sugerowane rozszerzone eksperymenty, do przeprowadzenia w trzech powtórzeniach, badające konkretne aspekty biologii laktazy.

Materiały uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Szczegółowa wiedza i zrozumienie enzymów, reakcji enzymatycznych i kinetyki enzymów jest wymagana w szerokim zakresie tematów obejmujących biologię, biomedycynę i farmakologię. Opisany powyżej protokół wykorzystuje laktazę jako przykład enzymu istotnego dla zdrowia ludzkiego do demonstrowania reakcji enzymatycznych, zapewniając kluczowe umiejętności, które można wykorzystać w bardziej zaawansowanych eksperymentach laboratoryjnych.

Protokół ten został celowo zaprojektowany tak, aby był jak najbardziej solidny, umożliwiając studentom z niewielkim lub zerowym doświadczeniem w mokrych laboratoriach uzyskanie możliwych do zinterpretowania wyników w krótkim czasie. W roku akademickim 2014/2015 w Szkole Farmacji Uniwersytetu w Reading łącznie 144 studentów, podzielonych na 3-osobowe grupy, przeprowadziło eksperyment "pomiaru laktazy", przy czym wszystkie grupy były w stanie wykryć pewien poziom aktywności enzymatycznej ekstraktów z tabletek laktazy.

W protokole tym składa się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, ważne jest, aby początkowa ekstrakcja była wydajna, co pozwala na rozpuszczenie wystarczającej ilości aktywnego enzymu do późniejszych analiz. Z naszego doświadczenia wynika, że studenci pierwszego roku studiów licencjackich mogą to osiągnąć, postępując zgodnie z opisanym protokołem; Jednak w tym momencie potrzebne były pewne wskazówki ze strony demonstratorów laboratoryjnych. Chociaż wydawałoby się to oczywiste, kluczowym czynnikiem sukcesu tego protokołu jest możliwość dokładnego odmierzania objętości, prawidłowego etykietowania probówek i postępowania zgodnie z instrukcjami. Podczas gdy w przypadku wielu uczniów można założyć pewien poziom biegłości, uważne monitorowanie i wyraźna prośba do uczniów, aby poprosili o pomoc w przypadku, gdy nie są pewni, co robić dalej, zapewnia największe prawdopodobieństwo pomyślnego testu.

Ocena ucznia może być przeprowadzona za pomocą arkusza roboczego w klasie (dostępnego jako materiał uzupełniający), w którym prosi się uczniów o zanotowanie danych z eksperymentów, skomentowanie ich wyników i zamieszczenie linku do informacji ogólnych/lektur z materiału wykładowego lub poprzez bardziej szczegółową ocenę poza klasą z dostarczonymi danymi modelowymi umożliwiającymi podjęcie i ocenę analiz kinetycznych.

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół jest prostym przykładem testu aktywności laktazy w warunkach laboratoryjnych i istnieje wiele możliwości zwiększenia złożoności eksperymentu, aby umożliwić bardziej zaawansowane analizy. W szczególności przedstawiony protokół stanowi wprowadzenie do koncepcji kinetyki enzymów, ale nie pozwala na analizę kinetyczną danych doświadczalnych. W związku z tym zalecamy zapoznanie się z opisanym protokołem jako wstępnym szablonem dla zajęć, z dokładnymi szczegółami dostosowanymi do konkretnych celów i talentów kohorty studentów podejmujących eksperymenty. Przykłady rozszerzonych eksperymentów mogą obejmować: powtarzające się pomiary w różnych temperaturach, przy użyciu różnych stężeń substratów w celu umożliwienia analizy statystycznej, analizę kinetyczną danych (odpowiednią dla studentów/kierunków biochemii), zaczynając od kilku różnych tabletek i pozwalając studentom ocenić różną aktywność enzymu w każdej z nich (z dodatkiem tabletek kontrolnych, odpowiednich dla studentów/kierunków kryminalistycznych), ocena wpływu denaturacji cieplnej lub przeprowadzenie eksperymentów konkursowych przez dodanie laktozy lub inhibitorów laktazy (tab. 1). Szczegółowy protokół analizy kinetycznej laktazy został wcześniej opublikowany¹².

Ważną zaletą tego protokołu jest to, że łączy on podstawowe wprowadzenie do enzymologii i kinetyki enzymów z rzeczywistym studium przypadku enzymologii w medycynie. To sprawia, że ten eksperyment laboratoryjny ma szczególne znaczenie dla studentów medycyny, farmacji, nauk biomedycznych i kierunków pokrewnych. Co ważne, fakt, że istnieje zarówno poważny stan chorobowy, jak i bardziej powszechny problem dietetyczny związany z katabolizmem laktozy, daje możliwość poruszenia ze studentami szerokiego zakresu kwestii medycznych i etycznych. Może to obejmować kwestie związane z badaniami genetycznymi w kierunku schorzeń oraz związane z nimi dyskusje związane z terapią genową i poradnictwem genetycznym, a także stosowaniem i sprzedażą suplementów leczniczych. Jednym z głównych ograniczeń jest to, że protokół nie pozwala na precyzyjne oszacowanie stężenia enzymu, ze względu na materiał wyjściowy użyty do ekstrakcji. Modyfikacja mająca na celu uwzględnienie tego faktu polegałaby jednak na użyciu enzymu klasy odczynnikowej do testu. Co ważne, pozwoliłoby to również na dokładniejsze obliczenia kinetyki enzymu laktazy.

Podsumowując, badanie aktywności laktazy w środowisku laboratoryjnym stanowi solidne, wciągające i interesujące wprowadzenie do dziedziny biologii enzymów dla początkujących studentów uniwersytetów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabletka laktazy	Lamberts	8511-60
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (sproszkowana)	Sigma	P3813	Rozpuszczona w wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia 100 mM
ONPG	Sigma	N1127	Rozpuszczona w wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia 5 mM
Węglan sodu	Sigma	451614	Rozpuszczona w wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia 1 M
Woda dejonizowana	NA	NA
Tłuczek i moździerz	VWR
Spektrofotometr	Jenway 6315
Pipety	Probówki Gilson
15 ml Probówki	VWR
1,5 ml	Eppendorf
Spektrofotometr Kuwety	Jenway
Vortex	Wirówka Vortex genie 2
Beckman
Wiadro na lód	VWR
Łaźnia wodna	Thermo-Scientific Wagi Thermo-Scientific