Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek

Podsumowanie

Inżynieria i analiza tkanek nośnych z heterogenicznymi populacjami komórek nadal stanowią wyzwanie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelu alginianowego jako platformy do wspólnej hodowli różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu.

Streszczenie

Wiele tkanek nośnych posiada strukturalnie i funkcjonalnie odrębne regiony, zazwyczaj towarzyszą im różne fenotypy komórek o zróżnicowanych cechach mechanosensorycznych. Inżynieria i analiza tych typów tkanek pozostają wyzwaniem. Warstwowe konstrukty hydrożelowe dają możliwość badania interakcji między wieloma populacjami komórek w obrębie pojedynczych konstruktów. Hydrożele alginianowe są zarówno biokompatybilne, jak i pozwalają na łatwą izolację komórek po eksperymentach. W tym miejscu opisujemy metodę opracowywania dwuwarstwowych krążków hydrożelowych z alginianu o małych rozmiarach. Proces ten utrzymuje wysoką żywotność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych podczas procesu tworzenia, a te warstwowe dyski mogą wytrzymać nieograniczoną cykliczną kompresję, powszechnie stosowaną do stymulacji hMSC przechodzących chondrogenezę. Te warstwowe konstrukty mogą być potencjalnie skalowane w górę, aby zawierały dodatkowe poziomy, a także mogą być używane do segregacji populacji komórek początkowo po nałożeniu warstw. Ta dwuwarstwowa platforma do hodowli hydrożelu alginianowego może być wykorzystywana do wielu różnych zastosowań, w tym do inżynierii i analizy komórek tkanek nośnych i kokultur innych typów komórek.

Wprowadzenie

Kompresyjne tkanki nośne, takie jak chrząstka stawowa lub krążki międzykręgowe, składają się z niejednorodnych obszarów tkanki, które są kluczowe zarówno dla funkcji biomechanicznej, jak i odpowiedniej mechano-transdukcji w tkance. Nie tylko organizacja i funkcja komórkowa jest odrębna w różnych regionach, ale matryce zewnątrzkomórkowe (ECM) są również zróżnicowane pod względem składu i organizacji. Na przykład chrząstka stawowa składa się z trzech podstawowych stref o różnej morfologii komórek, funkcji mechanicznych i ECM. Różnice w ich ECM prowadzą do różnicowej odpowiedzialności za nośność; Warstwa powierzchowna bierze przede wszystkim udział w reakcji na rozciąganie na obciążenie, podczas gdy strefy środkowa i głęboka są głównie odpowiedzialne za reakcję na ściskanie ¹. Podobnie w krążku międzykręgowym żelowe jądro miażdżyste jest otoczone blaszkowatym zwłóknieniem pierścienia, a komórki w tych dwóch odrębnych obszarach doświadczają różnych rodzajów bodźców biofizycznych ². W tego typu tkankach komórki i macierze zewnątrzkomórkowe w warstwach tkanek oddziałują ze sobą, gdy tkanka ulega siłom mechanicznym i reaguje na nie.

Rekapitulacja takich heterogenicznych struktur tkankowych pozostaje wyzwaniem w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej, a nasze zrozumienie ich biologicznego znaczenia jest ograniczone. Istnieje zapotrzebowanie na platformy hodowlane do analizy tkanek warstwowych, a także kokultur różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu. W inżynierii tkankowej chrząstki stawowej skonstruowano bezrusztkowe konstrukty warstwowe poprzez wykorzystanie zdolności strefowych chondrocytów do odkładania różnych ECM w celu naśladowania różnych warstw tej tkanki ^3,4. Jednak warstwowe konstrukty hydrożelowe dają możliwość zbadania interakcji różnych typów populacji komórek, które nie są w stanie samodzielnie utworzyć solidnej tkanki. Na przykład różne populacje mezenchymalnych komórek macierzystych mogą być hodowane wspólnie w ramach warstwowych konstruktów. Takie warstwowe rusztowania były używane zarówno z chondrocytami, jak i różnicującymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi w celu poprawy inżynierii tkankowej ⁵. Nie tylko różne populacje komórek mogą być hodowane w podobnych warstwach hydrożelu, ale pojedynczy typ komórek może być również hodowany w warstwach, które zostały zmodyfikowane tak, aby miały różną sztywność lub zawartość biochemiczną, aby wywołać różne reakcje z komórek ^6,7.

Wiele różnych hydrożeli biomateriałowych zostało użytych do warstwowania populacji komórek do inżynierii tkanki chrzęstnej, takich jak te wykorzystujące glikol polietylenowy lub bazie alkoholu poliwinylowego ^7-9. Jednak hydrożele alginianowe są jednym z najprostszych biomateriałów, z których można tworzyć warstwowe rusztowania do badania heterogenicznych populacji komórek w kokulturze. Podczas gdy hydrożele agarozowe są również łatwo tworzone, hydrożele alginianowe mają dodatkową zaletę, umożliwiając łatwą izolację komórek z konstruktu 3D w celu analizy pojedynczych komórek, jak opisano wcześniej ¹⁰. W poprzednich badaniach dwuwarstwowe hydrożele alginianowe zostały uformowane w cienkich arkuszach, a z tych arkuszy wycięto skrawki (np. za pomocą stempla do biopsji) do określonych zastosowań, takich jak analiza zawartości biochemicznej lub właściwości ścinania międzyfazowego ^11,12. Opisano inną metodę formowania cienkich arkuszy alginianowych z możliwością rozwarstwienia na wiele warstw, ale nadal wymagałaby zmiany w hydrożelu do stosowania w testach mechanicznych ¹³.

Tutaj prezentujemy metodę powtarzalnego tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelowych alginianowych do wykorzystania we wspólnej hodowli różnych populacji komórek. Ta platforma z dyskiem alginianowym ma kilka zalet. Przede wszystkim powtarzalny kształt i mały rozmiar sprzyjają mechanicznej stymulacji osadzonych komórek bez konieczności wykonywania biopsji lub innych fizycznych zmian w hydrożelu w wielu zastosowaniach. Dodatkowo, żywotność komórek pozostaje wysoka podczas procesu nakładania warstw, a po utworzeniu żelu widoczne jest wyraźne oddzielenie dwóch populacji komórek w żelu bez początkowego nakładania się obszaru.

Protokół

1. Przygotowanie do tworzenia krążków alginianowych

1. Przygotować 4% (w/v) roztwór alginianu w 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco bez dodatku chlorku wapnia lub chlorku magnezu i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Stężenia roztworu alginianu mogą się różnić, ale zalecane są 1 - 4% (w/v) roztwory alginianu.
2. Wymieszać roztwór alginianu w stosunku 1:1 z ciepłym podłożem do hodowli komórkowych (np. Zmodyfikowanym Eagle Medium firmy Dulbecco) dla żądanego typu komórek. Stężenie alginianów wynosi obecnie połowę pierwotnego stężenia, tj. 2% (w/v). Sterylizuj roztwór alginianu/pożywki za pomocą sterylnych nylonowych filtrów strzykawkowych 0,2 μm.
3. Przygotować kąpiel ze sterylnego 102 mM dwuwodnego chlorku wapnia w sterylnej wodzie z roztworem wystarczającym do zanurzenia pleśni (~ 200 - 300 ml).
4. Zebrać sterylną "formę do tworzenia żelu" (cylindryczne studzienki o średnicy 6 mm x wysokości 3 mm w płycie aluminiowej o wymiarach 3 cale x 3 cale, patrz rysunek 1) i płytki końcowe (na dole: jedna płyta aluminiowa o wymiarach 3 cale x 3 cale, na górze: jedna o wymiarach 1,5 cala x 3 cale) i przygotować formy w następujący sposób:
   1. Przyciąć grubą bibułę filtracyjną (bibułę filtracyjną) i membranę mikrosita komórkowego (wielkość porów 10 μm) do rozmiarów górnej i dolnej płytki końcowej i umieścić je w kąpieli chlorku wapnia do momentu nasycenia, około 1 min. W razie potrzeby wysterylizuj grubą bibułę filtracyjną i membranę mikrosita w autoklawie lub świetle ultrafioletowym przez 30 minut przed użyciem.
   2. Ustaw jedną połowę (dolną połowę) konstrukcji formy.
      1. Ułóż następujące elementy jeden na drugim w następującej kolejności i wygładź za pomocą sterylnej szpatułki: duża płytka końcowa (3 cale x 3 cale), gruba bibuła filtracyjna, a następnie membrana mikrositowa.
      2. Odwróć i dociśnij formę do stosu ręczników papierowych, aby zapewnić utratę nadmiaru roztworu chlorku wapnia.
      3. Umieść "formę do tworzenia żelu" z cylindrycznymi dołkami na górze membrany mikrosita komórkowego i delikatnie przymocuj formę z dwóch stron za pomocą klipsów do segregatorów po lewej i prawej stronie. Upewnij się, że zostawiłeś wystarczająco dużo miejsca na górną płytę końcową (1.5 cala x 3 cale), aby całkowicie zakryć dołki później.
   3. Ustaw drugą połowę (górną połowę) konstrukcji formy.
      1. Ułóż następujące elementy jeden na drugim w następującej kolejności i wygładź go: małą płytkę końcową, grubą bibułę filtracyjną, membranę mikrositową.
      2. Odwróć i dociśnij tę połowę formy do stosu ręczników papierowych, aby zapewnić utratę nadmiaru roztworu chlorku wapnia. Nie mocuj w tym momencie tej połowy formy za pomocą spinaczy do segregatorów.
5. Komórki hodowlane zgodnie z zaleceniami producenta. Zbierz pożądane komórki, aby osadzić je w warstwowych hydrożelach alginianowych. Zalecana gęstość komórek to 1 - 2 x 10⁶ komórek/ml, ale może się ona zmieniać w zależności od pożądanych eksperymentów.
   Uwaga: Korzystając z tej metody do tworzenia warstw z różnymi typami komórek, upewnij się, że hodujesz dwa typy komórek równolegle w celu nakładania warstw. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wysiane w gęstości komórek 1 x 10⁶ komórek/ml zostaną użyte jako przykład dla poniższego protokołu. Numer komórki i numer dysku można skalować na potrzeby eksperymentów w razie potrzeby.
   1. Na jeden do dwóch tygodni przed osadzeniem należy wysiać mezenchymalne komórki macierzyste o gęstości komórek 3,000 - 5,000 komórek/^cm2 w 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 1% penicyliny/streptomycyny) w kolbach T-75.
   2. Usuwaj zużytą pożywkę co 2-3 dni i zastąp 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej, aż komórki będą zlewać się w 80-90%.
   3. Aby zebrać komórki, usuń zużyte podłoże i odpipetuj 3 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco bez dodatku chlorku wapnia lub chlorku magnezu w celu wypłukania komórek. Usunąć ten roztwór, odpipetować 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA na komórki rosnące w kolbach T-75 i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Po oderwaniu komórek od przylegającej powierzchni dodać 6 - 9 ml podstawowej pożywki wzrostowej.
   4. Odwirować MSCs przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 - 5 ml podstawowej pożywki wzrostowej. Policz komórki za pomocą hemocytometru, korzystając z instrukcji urządzenia.
   5. Usunąć 1 x 10⁶ komórek z całkowitego zawieszenia komórek, odwirować w tych samych warunkach i odessać supernatant.

2. Tworzenie krążków alginianowych z nasionami komórek

1. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml sterylnego roztworu alginianu/pożywki, aby uzyskać gęstość komórek 1 x 10⁶ komórek/ml. Mieszanina komórkowo-alginianowa będzie miała jednorodny mętny wygląd, gdy komórki zostaną odpowiednio wymieszane.
2. Odpipetować 130 μl mieszaniny komórek i alginianów do sześciu studzienek o średnicy 6 mm x wysokości 3 mm w dolnej połowie formy, kroplami, tak aby nie tworzyć pęcherzyków. Nad krawędzią każdej studzienki powinna być widoczna lekko wypukła łąkotka.
3. Ostrożnie wygładź górną połowę konstrukcji formy za pomocą sterylnej szpatułki i odwróć ją tak, aby membrana mikrosita komórkowego znalazła się na górze studzienek. Umieść konstrukcję formy na wierzchu studzienek, upewniając się, że studzienki zawierające komórkę i mieszaninę alginianów są całkowicie zakryte.
4. Podnieś załadowaną konstrukcję formy i, mocno dociskając środek, przypnij pozostałe dwie strony (górną i dolną), aby przymocować górną i dolną połowę konstrukcji formy. W tym czasie roztwory alginianu komórkowego powinny być bezpiecznie osadzone w studzienkach.
5. Zanurz mocowaną konstrukcję formy w kąpieli chlorku wapnia o pojemności 102 mM, upewniając się, że cała konstrukcja jest zanurzona. Inkubować w okapie do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej przez 90 minut.
6. Pod koniec 90 minut wyjąć konstrukcję formy z kąpieli chlorku wapnia o pojemności 102 mM i umieścić na stosie ręczników papierowych w kapturze do hodowli komórkowych. Usuń wszystkie cztery spinki do segregatora i oddziel dwie połówki konstrukcji formy. Hydrożele powstające w studniach nie powinny mieć żadnych pęcherzyków i powinny całkowicie wypełnić studzienki.
7. Za pomocą szpatułki ostrożnie obrysuj krawędź studzienek zawierających hydrożele, aby ostrożnie poluzować i wyciąć hydrożele. Po usunięciu hydrożeli z konstrukcji formy, wrzuć hydrożele bezpośrednio do kąpieli 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu. Całkowicie przykryj żele, aby zmyć nadmiar roztworu chlorku wapnia przez 1 - 5 minut.
8. Przenieś hydrożele do podstawowego roztworu pożywki wzrostowej w żądanym naczyniu (np. 6-dołkowych płytkach), które całkowicie zakrywa hydrożele. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przed przejściem do etapu warstwowania.
   Uwaga: Hydrożele zawierające komórki mogą być w tym czasie przechowywane w inkubatorze do hodowli komórkowych przez czas nieokreślony, dopóki nie będzie pożądane nałożenie warstw żeli na inną populację komórek, pod warunkiem, że zmiany pożywki są wykonywane co 2-3 dni.

3. Nakładanie warstw krążków alginianowych

1. W ciągu ostatnich pół godziny 1-godzinnej inkubacji zebrać i przygotować sterylne formy i roztwór do wyżarzania żeli.
   1. Przygotuj "formę do cięcia", mocując formę, która ma dołki o wysokości połowy wysokości "formy do tworzenia żelu" (dołki o średnicy 6 mm x 1,5 mm w płycie aluminiowej o wymiarach 3 cale x 3 cale) do płyty końcowej (3 cale x 3 cale) za pomocą klipsów do segregatora po lewej i prawej stronie.
   2. Przygotuj "formę do wyżarzania", mocując formę o średnicy o 3 mm większą niż "forma do formowania żelu" (dołki o średnicy 9 mm x 3 mm w płycie aluminiowej o wymiarach 3 cale x 3 cale) do płyty końcowej (3 cale x 3 cale) za pomocą klipsów do segregatorów po lewej i prawej stronie.
   3. Przygotować roztwór 100 mM cytrynianu sodu/30 mM EDTA (dwuwodny cytrynian sodu, dwuwodna sól tetrasodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) w sterylnej wodzie.
2. Usuń żele z pożądanymi populacjami komórek (w tym przykładzie dwa krążki z hMSC) z pożywki w naczyniu i umieść w dołkach "formy do cięcia". Każdy żel powinien ściśle przylegać do studzienek, tak aby połowa żelu wystawała ponad formę.
3. Za pomocą skalpela pokrój żel wzdłuż powierzchni formy (spowoduje to przecięcie hydrożelu na pół). Odwróć górną połowę żelu i umieść go w otwartej formie. Połowa żelu powinna również dobrze przylegać do formy, ale teraz obie połówki żeli powinny mieć wysokość formy z widoczną wyciętą powierzchnią wewnętrzną. Powtórzyć z drugim żelem.
   Uwaga: Ostrzeżenie: Tylko wewnętrzne powierzchnie cięcia będą tworzyć warstwowe tarcze. Użycie zewnętrznych powierzchni spowoduje rozdzielenie połówek. Podejrzewa się, że tekstura z membrany mikrosita przeniesiona na powierzchnię żelu uniemożliwia powodzenie procesu wyżarzania.
4. Umieść kawałek suchej membrany mikrositowej na wierzchu studzienek, upewniając się, że membrana mikrosita styka się ze wszystkimi połówkami żelu do wyżarzania i całkowicie je przykryj. Umieść grubą bibułę filtracyjną na membranie mikrosita, upewniając się, że żele są całkowicie pokryte.
5. Odpipetować roztwór 100 mM cytrynianu sodu/30 mM EDTA (dwuwodny cytrynian sodu, dwuwodna sól tetrasodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) na grubą bibułę filtracyjną aż do jej nasycenia. Około 750 μl wystarcza na cztery dołki.
6. Inkubować żele przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń membranę mikrosita komórkowego i grubą bibułę filtracyjną i wyrzuć je. Wyjmij spinki do segregatora i otwórz formę.
7. Dla każdego wyżarzonego żelu przenieś jedną połowę hydrożelu poddanego działaniu cytrynianu sodu/EDTA do przygotowanej "formy do wyżarzania" z powierzchnią cięcia skierowaną do góry. Będzie to połowa wyżarzonej konstrukcji.
8. Za pomocą szpatułki podnieś i umieść drugi półżel poddany działaniu cytrynianu sodu/EDTA (może zawierać inny typ komórek) na żelu już w "formie do wyżarzania", odwracając tę drugą półżel tak, aby powierzchnia cięcia stykała się z powierzchnią cięcia żelu już w "formie do wyżarzania".
9. Delikatnie dociśnij dwa żele za pomocą szpatułki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki między dwoma żelami. W razie potrzeby zmień położenie żeli, aby upewnić się, że znajdują się bezpośrednio jeden na drugim.
10. Delikatnie podnieś "formę do wyżarzania" i zanurz ją w kąpieli chlorkowo-wapniowej o pojemności 102 mM na 30 minut. Nie zakrywaj studzienek płytą końcową.
11. Po 30 minutach inkubacji usuń "formę do wyżarzania" i umieść ją na ręcznikach papierowych. Usuń spinki do segregatora i oddziel formę od płyty końcowej.
12. Za pomocą szpatułki zbierz wyżarzone żele i umieść je w 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Sol z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu w kąpieli w celu umycia żeli. Następnie przenieś wyżarzone hydrożele na pożywkę do hodowli komórkowych w żądanym naczyniu (np. Płytce 6-dołkowej) w celu hodowli.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia proces tworzenia i warstwowania hydrożeli alginianowych. Gotowe żele dwuwarstwowe wykazują całkowitą pierwotną separację populacji komórek, co pokazano na Rysunku 2. Żywotność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych osadzonych w tych hydrożelach i ułożonych warstwowo pozostaje wysoka i jest porównywalna z żywotnością w hydrożelach jednolitych, co przedstawiono na Rysunku 3. Żywotność oceniono po procesie wygrz...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół tworzenia warstwowych krążków hydrożelu alginianowego do badania kokultur wielu populacji komórek, takich jak te w fizjologicznie warstwowych tkankach, np . chrząstce. Struktury warstwowe, takie jak opisana platforma hodowlana, mogą być wykorzystywane do badania wzajemnych oddziaływań między dwiema odrębnymi populacjami komórek poddanymi temu samemu środowisku hodowlanemu lub pod obciążeniem.

Alginian jest anionowym liniowym polisacharydem, który okaza...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól sodowa kwasu alginowego	Sigma Aldrich	A1112	Roztwór wykonany w % wagowym przy użyciu DPBS (-/-)
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco Technologie	życia Gibco	z 11965	roku. Użyj żądanych
filtrów strzykawkowych typu medium (0.02 i #956; m Nylon)	FisherBrand	0979C
Chlorek wapnia Dihydrat	Bioreagents	Fisher BP510	Przygotuj roztwór w sterylnej wodzie
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Przytnij na wymiar płyty końcowe do tworzenia pleśni
Membrana mikrositowa komórkowa (10 μ m rozmiar porów)	Biodesign Inc z Nowego Jorku	N10R	Przycięte na wymiar płyt końcowych do tworzenia pleśni
Cytrynian sodu dwuwodny	FisherScience	S93364
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól tetrasodowa dwuwodna (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Surowica bydlęca płodu	Technologie Gibco Life	26140	Użyty w przykładzie mezenchymalnej pożywki dla podstawowych komórek macierzystych
Penicilina/Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Używany w przykładzie mezenchymalnej pożywki do podstawowego wzrostu komórek macierzystych
L-Glutamina (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Wykorzystany w przykładzie mezenchymalne podłoże do podstawowego wzrostu komórek macierzystych
Aminokwasy endogenne (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Stosowany w przykładzie pożywki dla podstawowych komórek macierzystych