Artykuł metodologiczny

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

DOI:

10.3791/54391

⸱

16 stycznia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cząsteczki rybonukleoproteiny kierują biogenezą i regulacją potranskrypcyjną wszystkich mRNA poprzez odrębne kombinacje białek wiążących RNA. Składają się one z zależnych od położenia, działających cis elementów RNA i unikalnych kombinacji białek wiążących RNA. Zdefiniowanie składu konkretnego RNP ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia podstawowego zrozumienia regulacji genów. Izolacja wybranego RNP jest podobna do znalezienia igły w stogu siana. Tutaj demonstrujemy podejście do izolowania RNP związanych z nieulegającym translacji regionem 5' wybranego mRNA w asynchronicznych, transfekowanych komórkach. Wykazano, że ten pokrewny RNP jest niezbędny do translacji wybranych wirusów i genów odpowiedzi komórkowej na stres.

Wykazany protokół współstrącania RNA-białko jest odpowiedni do dalszej analizy składników białkowych poprzez analizy proteomiczne, immunobloty lub odpowiednie testy identyfikacji biochemicznej. Ten protokół eksperymentalny pokazuje, że helikaza A DHX9 / RNA jest wzbogacona na końcu 5' pokrewnego retrowirusowego RNA i dostarcza wstępnych informacji do identyfikacji jej związku z pokrewnymi mRNA huR i junD związanymi ze stresem komórkowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja genów po transkrypcji jest precyzyjnie regulowana, począwszy od transkrypcji DNA w jądrze. Kontrolowana przez białka wiążące RNA (RBP), biogeneza i metabolizm mRNA zachodzą w wysoce dynamicznych cząstkach rybonukleoproteiny (RNP), które łączą się i dysocjują z mRNA prekursorem substratu podczas progresji metabolizmu RNA1-3. Dynamiczne zmiany w składnikach RNP wpływają na potranskrypcyjny los mRNA i zapewniają gwarancję jakości podczas przetwarzania pierwotnych transkryptów, ich transportu jądrowego i lokalizacji, ich aktywności jako matryc mRNA do translacji oraz ostatecznego obrotu dojrzałych mRNA.

Wiele białek jest oznaczonych jako RBP ze względu na ich konserwatywne domeny aminokwasowe, w tym motyw rozpoznawania RNA (RRM), dwuniciową domenę wiążącą RNA (RBD) i odcinki podstawowych reszt (np. arginina, lizyna i glicyna)4. RBP są rutynowo izolowane za pomocą strategii immunoprecypitacji i poddawane badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania ich pokrewnych RNA. Niektóre RBP współregulują pre-mRNA, które są funkcjonalnie powiązane, oznaczone jako regulony RNA5-8. Te RBP, ich pokrewne mRNA, a czasem niekodujące RNA, tworzą katalityczne RNP o różnym składzie; Ich wyjątkowość wynika z różnych kombinacji powiązanych czynników, a także z sekwencji czasowej, lokalizacji i czasu trwania ich interakcji9.

Immunoprecypitacja RNA (RIP) to potężna technika izolowania RNP z komórek i identyfikowania powiązanych transkryptów za pomocą analizy sekwencji10-13. Przejście od badania przesiewowego kandydata do badania przesiewowego całego genomu jest możliwedzięki RIP w połączeniu z analizą mikromacierzy14 lub sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (RNAseq)15. Podobnie, białka współwytrącające się można zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas, jeśli są wystarczająco obfite i można je oddzielić od przeciwciała współwytrącającego16,17. W tym miejscu zajmiemy się metodologią izolowania składników RNP określonego pokrewnego RNA z hodowanych komórek ludzkich, chociaż podejście to można zmienić w przypadku rozpuszczalnych lizatów komórek roślinnych, grzybów, wirusów i bakterii. Dalsze analizy materiału obejmują identyfikację i walidację kandydata za pomocą immunoblot, spektrometrii mas, biochemicznego testu enzymatycznego, RT-qPCR, mikromacierzy i RNAseq, jak podsumowano na rysunku 1.

Biorąc pod uwagę fundamentalną rolę RNP w kontrolowaniu ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym, zmiany w ekspresji składników RBP lub ich dostępności dla pokrewnych RNA mogą być szkodliwe dla komórki i są związane z kilkoma rodzajami zaburzeń, w tym z chorobą neurologiczną18. Helikaza A (RHA) DHX9/RNA jest niezbędna do translacji wybranych mRNA pochodzenia komórkowego i retrowirusowego6. Te pokrewne RNA wykazują strukturalnie powiązane elementy cis-działające w ramach ich 5' UTR, który jest oznaczony jako potranskrypcyjny element kontrolny (PCE)19. Aktywność RHA-PCE jest niezbędna do efektywnej translacji zależnej od czapeczki wielu retrowirusów, w tym HIV-1, oraz genów regulatora wzrostu, w tym junD6,20,21. Kodowany przez niezbędny gen (dhx9), RHA jest niezbędny do proliferacji komórek, a jego regulacja w dół eliminuje żywotność komórek22. Analiza molekularna RNP RHA-PCE jest niezbędnym krokiem do zrozumienia, dlaczego aktywność RHA-PCE jest niezbędna do kontrolowania proliferacji komórek.

Dokładna charakterystyka składników RHA-PCE RNP w stanie ustalonym lub po fizjologicznym zaburzeniu komórki wymaga selektywnego wzbogacania i wychwytywania RNP RHA-PCE w wystarczającej ilości do dalszej analizy. W tym przypadku retrowirusowy RNA PCEgag został oznaczony 6 kopiami miejsca wiązania cis-działającego RNA dla białka płaszcza MS2 (CP) w otwartej ramce odczytu. Białko płaszcza MS2 uległo egzogennej koekspresji z RNA PCEgag przez transfekcję plazmidu w celu ułatwienia składania RNP w rosnących komórkach. RNP zawierające białko płaszcza MS2 z pokrewnym RNA PCEgag znakowanym MS2 zostały immunoprecypitowane z ekstraktu komórkowego i wychwycone na kulkach magnetycznych (Figura 2a). Aby selektywnie wychwycić składniki RNP związane z PCE, unieruchomiony RNP inkubowano z oligonukleotydem komplementarnym do sekwencji dystalnych do PCE, tworząc hybrydę RNA-DNA, która jest substratem dla aktywności RNazy H. Ponieważ PCE znajduje się w końcówce 5' regionu 5' nieulegającego translacji, oligonukleotyd był komplementarny do sekwencji RNA sąsiadujących z miejscem rozpoczęcia translacji retrowirusowej (kodon start gag). Rozszczepienie RNazy H w pobliżu kodonu startu wymiotnego uwolniło kompleks 5' UTR z unieruchomionego RNP, który został zebrany jako eluent. Następnie próbkę oceniono za pomocą RT-PCR w celu potwierdzenia wychwytu PCEgag oraz za pomocą SDS PAGE i immunoblot w celu potwierdzenia wychwycenia docelowego białka płaszcza MS2. Następnie przeprowadzono walidację białka wiążącego RNA związanego z PCE, helikazy A DHX9/RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Kompozycje buforowe
Bufor do mycia:
50 mM Tris-HCl, pH 7,4
150 mM NaCl
3 mM MgCl2
Bufor o niskiej zawartości soli:
20 mM Tris-HCl, pH 7,5
10 mM NaCl
3 mM MgCl2
Naziemna telewizja cyfrowa 2 mM
1x koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA
RNaza Out 5 μl/ml (inhibitor RNazy)
Bufor do lizy cytoplazmatycznej:
0,2 mln sacharozy
1,2% Triton X-100
Bufor płuczący NETN-150:
20 mM Tris-HCl, pH 7,4
150 mM NaCl
0,5% NP-40
3 mM MgCl2
10% glicerolu
Bufor wiązania:
10 mM HEPES pH 7,6
40 mM KCl
3 mM MgCl2
Naziemna telewizja cyfrowa 2 mM
5% glicerolu

Tabela 2: Kompozycje buforowe.

1. Przygotowanie komórek i matrycy powinowactwa

  1. Hoduj linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania do subkonfluencji (80%) w 10-centymetrowym naczyniu. Użyj 10 cm płytki do niezależnego immunoprecypitacji (IP) białka płaszcza NLS-MS2 znakowanego FLAG. Wykonaj IP za pomocą surowic odpornościowych do znacznika FLAG-epitope. Podczas ekspresji plazmidu białka płaszcza MS2 znakowanego flagą, komórki transfekowane 24-48 godzin przed zbiorem20,
    UWAGA: Określony RNP może być wzbogacony z lizatów jądrowych lub cytoplazmatycznych lub preparatu frakcjonowanego biochemicznie, takiego jak frakcje gradientu sacharozy. Zaleca się równoległe pobieranie lizatu z komórek nietransfekowanych w celu przeprowadzenia dodatkowej kontroli ujemnej.
  2. Przenieść 60 μl na IP zawiesiny kulek magnetycznych białka G do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  3. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na probówki do mikrowirówek, aby oddzielić kulki od roztworu do przechowywania.
  4. Usunąć roztwór do przechowywania, ostrożnie pobierając go za pomocą mikropipety.
  5. Wyjmij rurkę ze stojaka na magnesy.
  6. Umyj i zrównoważ kulki z 600 μl (10-krotność użytej objętości kulek) 1x buforu do płukania (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 3 mM MgCl2; i 150 mM NaCl) i obracaj od końca do końca przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i wyjmij bufor do mycia.
  8. Dodać 10 objętości (600 μl) 1x buforu płuczącego i immunoprecypitującego przeciwciała FLAG do zrównoważonych kulek magnetycznych białka G (zgodnie z ilością zalecaną przez producenta do immunoprecypitacji) i obracać od końca do końca w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, aby skoniugować przeciwciało immunoprecypitacyjne. Użyć odpowiedniego izotypu IgG jako odpowiedniej kontroli ujemnej przeciwciała.
  9. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aby zebrać kulki i usunąć supernatant.
  10. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i umyj kulki sprzężone z przeciwciałami 10 objętościami (600 μl) 1x buforu do płukania i obracaj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  11. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i wyjmij bufor do mycia.

2. Zbieranie RNP

UWAGA: Przygotuj RNP podczas inkubacji po kroku 1.8.

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek przez aspirację i przemyć komórki dwukrotnie 1-5 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Za pomocą skrobaka do komórek usunąć mokre, przylegające komórki przed pobraniem przez odwirowanie w temperaturze 226 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
  2. Dodaj 375 μl lodowatego buforu o niskiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 3 mM MgCl2; 10 mM NaCl; 2 mM DTT; 1x koktajl inhibitorów proteazy, wolny od EDTA; i 5 μl/ml inhibitora RNazy) do osadu komórkowego i pozwól na pęcznienie, umieszczając go na lodzie przez 5 min.
    UWAGA: Dostosuj objętość buforu o niskiej zawartości soli do wielkości osadu komórkowego. Dla 1,2 x 106 komórek z płytki 10 cm wystarczy 375 μl buforu.
  3. Aby zebrać lizat komórek cytoplazmatycznych, dodaj 125 μl lodowatego buforu do lizy (0,2 M sacharozy/1,2% Triton X-100), a następnie wykonaj 10 uderzeń homogenizatorem Dounce, który został wstępnie schłodzony w wiadrze z lodem.
    UWAGA: Aby zebrać całkowity ekstrakt komórkowy, do solubilizacji nukleoplazmy/chromatyny zaleca się standardowy bufor do lizy RIPA.
  4. Wirować w mikronaczyniu z maksymalną prędkością (16 000 x g) przez 1 minutę; to oczyści supernatant z zanieczyszczeń i jąder.
  5. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml, która znajdowała się na lodzie. Określić całkowite stężenie białka za pomocą standardowej, preferowanej przez laboratorium metody, takiej jak test Bradforda23. Należy zarezerwować podwielokrotność co najmniej 10% dla analizy Western blot, która ma być wykorzystana jako kontrolka wejściowa. Pobrany lizat komórkowy należy natychmiast wykorzystać do immunoprecypitacji lub przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że próbki te mogą być przechowywane i wykorzystywane kilka miesięcy później do analizy immunoprecypitacji bez uszczerbku dla integralności.

3. Immunoprecypitacja

  1. Dodać żądaną objętość pobranego lizatu komórkowego, w oparciu o stężenie białka określone w kroku 2.5, do docelowych kulek sprzężonych z przeciwciałami. Używając 1x bufora do mycia, zwiększ całkowitą objętość do 600 μl i obracaj od końca do końca przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ten okres czasu jest wystarczający do wygenerowania solidnej izolacji kompleksów RNP o wysokim powinowactwie przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego wiązania. Rozcieńczyć alternatywne źródła RNP, takie jak frakcje gradientu sacharozy, co najmniej 1:1 z 1x buforem do płukania, a następnie inkubować je z wcześniej przygotowanymi kompleksami kulka-przeciwciało, jak wspomniano powyżej.
  2. Po 90 minutach inkubacji umieść rurkę IP na stojaku magnetycznym, aby zebrać koraliki. Zachowaj supernatant jako przepływowy.
    UWAGA: Ten pierwszy przepływ jest ważną próbką kontrolną do pomiaru wydajności IP. Test immunoblot dostarczy wskazówek na temat skuteczności IP, a także swoistości badanych interakcji. Zaleca się przechowywanie tego supernatantu do dalszej analizy.
  3. Przemyć związane z RNP, sprzężone z przeciwciałami kulki 10 objętościami (600 μl) lodowatego buforu płuczącego NETN-150 (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3 mM MgCl2; 0,5% NP40; i 10% glicerolu) na obracanie przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz krok 3 razy.
    UWAGA: Ten bufor różni się od buforu do lizy i skutecznie redukuje słabe lub niespecyficzne asocjacje.
  4. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić unieruchomione kompleksy RNP w 60 μl lodowatego buforu wiążącego 1x (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl; 3 mM MgCl2; 5% glicerolu; i 2 mM DTT) i zarezerwować 10% unieruchomionych granulek kompleksu dla Western blot i 20% do izolacji RNA.

4. Elucja

  1. Dostosować pozostałą objętość do 100 μl za pomocą lodowatego buforu wiążącego 1x i podgrzewać probówkę w temperaturze 70 °C przez 3 minuty.
  2. Aby wyizolować pokrewne kompleksy RNA-białko, dodaj oligonukleotyd DNA ~ 30-nt, który jest komplementarny do granicy sekwencji 3' interesującego RNA i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem (wystarczy 100 nM oligonukleotydu).
    UWAGA: Oligonukleotyd jest antysensowny w stosunku do reszt nukleotydowych sąsiadujących z miejscem startowym translacji konstruktu PCE użytego jako przykład w tym protokole. Odpowiednią komplementarność sekwencji zapewnia zawartość ~40% G-C. Zaprojektuj oligonukleotyd antysensowny do wydajnej hybrydyzacji do minimalnego komplementarnego regionu docelowego RNA.
  3. Dodaj 5-10 jednostek RNazy H do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby rozszczepić RNA hybrydy RNA:DNA. Przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml; ta próbka zawiera przechwycone kompleksy RNP będące przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: W zależności od dostępności pokrewnego RNA, dwie lub więcej rund traktowania RNazy H może być przydatne w celu zwiększenia obfitości próbki do dalszych analiz
    4. .
  4. Użyj 20% eluatu w Western blot dla znanych powiązanych białek i 20% eluatu do izolacji RNA, a następnie RT qPCR. Pozostałe 60% można wykorzystać do spektrometrii mas lub do identyfikacji składników białkowych.
  5. Równolegle należy poddać podwielokrotność zarezerwowanego lizatu komórkowego izolacji RNA i analizie RT-PCR. Ocena ta wskazuje na wzbogacenie RNA w kompleksie RNP.
    UWAGA: Użyj wyizolowanego preparatu białkowego w kontrolnym western blot, aby upewnić się, że rozszczepienie RNazy H było skuteczne w uwalnianiu RNP z kompleksu immunuoprecipitowanego.

5. Elektroforeza białek i analiza Western Blot

  1. Poddaj około 10-20% całej próbki analizie SDS-PAGE i immunoblot zgodnie ze standardowym protokołem laboratoryjnym.
    UWAGA: Ten krok służy do walidacji wydajności i swoistości IP przed dalszą analizą RNA. Może być również stosowany do oceny składu białkowego wyizolowanego kompleksu RNP.

6. Pobieranie immunologicznie wytrąconego RNA

UWAGA: Izolację RNA można przeprowadzić metodą Trizol lub zgodnie z opisanym protokołem.

  1. Zawiesić połowę całej próbki w 750 μl kwaśnego odczynnika tiocyjanianu guanidyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed ekstrakcją RNA z wychwyconych kompleksów PCE-RNP.
  2. Do probówki dodać 200 μl chloroformu, energicznie wstrząsać przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  3. Po odwirowaniu w stężeniu 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, zebrać fazę wodną do nowej probówki i dodać równą objętość izopropanolu. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. Dodać 1 μl błękitu glikolowego do próbki i przechowywać ją w temperaturze -20 °C w zamrażarce w celu skutecznego wytrącania lub przetworzenia w przyszłości.
  4. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, aby nie naruszyć osadu RNA; w celu ułatwienia tego procesu zaleca się użycie końcówki do mikropipet P-200.
  5. Dodać 500 μl 75% etanolu do każdej probówki, odwirować i odwirować probówki przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant jak w kroku 6.4. Suszyć granulki na powietrzu przez 2-3 minuty i ponownie zawiesić w 100 μl wody wolnej od RNaz.
    UWAGA: Nie przedłużaj czasu schnięcia pelletu na powietrzu, aby uniknąć problemu z ponownym zawieszeniem.
  6. Nałożyć 100 μl próbki RNA na kolumnę czyszczącą RNA. Przetwarzaj go zgodnie z protokołem producenta. Wypłucz RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz i przechowuj w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy.
    UWAGA: Ten izolowany RNA nadaje się do dalszej analizy za pomocą RT-realtime PCR (qPCR), mikromacierzy i sekwencjonowania RNA. W zależności od obfitości RNP i wydajności, z jaką izoluje się RNP będący przedmiotem zainteresowania, ten sam lizat może zostać poddany dwóm lub więcej rundom IP w celu wygenerowania wystarczającej ilości RNA mającej zastosowanie do dalszych analiz.

7. Odwrotna transkrypcja RNA i amplifikacja cDNA metodą PCR

  1. Poddaj wyizolowany RNA odwrotnej transkrypcji za pomocą losowego startera z wysokiej jakości odwrotną transkryptazą (RT), zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Aby amplifikować interesujący RNA, zaprojektuj specyficzny dla genu starter antysensowny w sekwencji cięcia RNazy H. Użyj podobnych ilości oligonukleotydu antysensownego, startera losowego lub startera oligo-dT (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Starter oligo-dT i poli-adenylowane mRNA zapewniają pozytywne reakcje kontrolne dla reakcji RT-PCR.
  3. Zarezerwować 5% reakcji RT (1 μl) na preparatywny qPCR wykonany w połączeniu z lizatem kontroli ujemnej IP i próbkami DNA z kontroli dodatniej w celu określenia punktu odcięcia i wytworzenia krzywej wzorcowej. Jeżeli wartość CT preparatywnego qPCR wykracza poza zakres krzywej wzorcowej, rozcieńczyć reakcję RT w kolejnych rozcieńczeniach 1:5 i powtórzyć krok 7.2.
    UWAGA: Aby zapoznać się z techniką sekwencjonowania RNA i spektrometrii mas, zobacz plik Metoda uzupełniająca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik Metody Uzupełniającej. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniejsze wyniki RIP zidentyfikowały retrowirusowe RNA gag i wybrane komórkowe RNA, które współstrącają się z DHX9/RHA, w tym HIV-16, junD6 i huR (Fritz i Boris-Lawrie, niepublikowane). Wykazano, że retrowirusowy 5' UTR współwytrąca się z DHX9 / RHA w jądrze i izoluje w cytoplazmie na polirybosomach. Jest jednoznacznie zdefiniowany jako działający cis potranskrypcyjny element kontrolny (PCE)6. W celu wyizolowania kompleksów rybonukleoproteinowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj strategia izolacji RNP i identyfikacji pokrewnych RNA jest selektywnym sposobem badania specyficznej interakcji RNA-białko i odkrywania białek kandydujących współregulujących określony RNP w komórkach.

Zaletą stosowania rozszczepienia RNazy H skierowanej oligonukleotydem do izolacji RNP jest możliwość wychwytywania i specyficznej analizy elementu RNP działającego cis na heterogenicznych RNP związanych poniżej interesującego nas elementu RNA działającego cis. Ponieważ obfitość pok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony NIH P50GM103297, P30CA100730 i Comprehensive Cancer P01CA16058.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dynabeads Białko AInvitrogen10002D
Dynabeads Białko GPrzeciwciało Invitrogen10004D
Przeciwciało anty-FLAGSigmaF3165
Przeciwciało anty-FLAGSigmaF7425
Przeciwciało anty-RHAOdczynnik
LS10296-028
RNaza HAmbionAM2292
ChloroformFisher ScientificBP1145-1
IsopropanolFisher ScientificBP26184
Kolumna czyszcząca RNaeasyQiagen74204
Omniscript odwrotna transkryptazaQiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
Koktajl inhibitorów proteazyRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
GlicerolFisher Scientific17904
Losowe startery heksameroweInvitrogenN8080127
Startery Oligo-dTInvitrogen
startery PCRStartery specyficzne dla genu IDTdla  Amplifikacja PCR
Oligonukleotyd do rozszczepienia za pośrednictwem RNazy HStarter antysensowny IDTdla docelowego RNA
TrypsynaTechnologia Gibco Life25300-054
Pożywka do hodowli tkankowych DMEMTechnologia Gibco Life11965-092
Surowica bydlęcaTechnologia Gibco Life10082-147
Baza TrisFisher ScientificBP152-5
Chlorek soduFisher ScientificS642-212
Chlorek magnezuFisher ScientificBP214
DTTFisher ScientificR0862
SacharozaFisher ScientificBP220-212
Membrana nitrocelulozowaBio-Rad1620112
Stojak magnetycznyProbówka do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml z
laminarnymDo hodowli tkanek zwierzęcych
CO2Do hodowli tkanek zwierzęcych
AparaturaSeparacja próbek białek
Aparatura do przenoszenia białek Przenoszeniepróbek białek
Produkt gotowy Żele białkowe (4-15%)Separacja próbek białkowych
WirówkaOsad w dół próbki
RotatorWymieszaj próbkę od końca do końca
WirWymieszaj próbki
TRizol AM5730G płodu kapturem Inkubator do stosowania żelu białkowego stołowa stołowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18(2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA ImmunoprecipitationRNP IsolationFLAG tagged ProteinMagnetic Bead ConjugationCytoplasmic Lysate PreparationRNase H TreatmentRNA ExtractionWestern Blot AnalysisRT PCR Validation

Powiązane artykuły