Method Article

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

DOI:

10.3791/54394

⸱

April 29th, 2017

 ,  , 
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria masowa wykorzystuje przeciwciała sprzężone z etykietami metali ciężkich, podejście, które znacznie zwiększyło liczbę parametrów i możliwości głębokiej analizy znacznie ponad to, co jest możliwe przy użyciu konwencjonalnej cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji. Podobnie jak w przypadku każdej nowej technologii, istnieją krytyczne kroki, które pomagają zapewnić niezawodne generowanie danych wysokiej jakości. Przedstawiono tutaj zoptymalizowany protokół, który obejmuje wiele technik przetwarzania próbek komórek do analizy cytometrii masowej. Opisane tutaj metody pomogą użytkownikowi uniknąć typowych pułapek i osiągnąć spójne wyniki poprzez zminimalizowanie zmienności, która może prowadzić do niedokładnych danych. Aby uzyskać informacje na temat projektu eksperymentu, omówiono uzasadnienie opcjonalnych lub alternatywnych kroków w protokole oraz ich skuteczność w odkrywaniu nowych odkryć w biologii badanego systemu. Na koniec przedstawiono reprezentatywne dane w celu zilustrowania oczekiwanych wyników przedstawionych tutaj technik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria umożliwia jednoczesny pomiar wielu celów przeciwciał na poziomie pojedynczej komórki w dużych populacjach komórek. W tradycyjnej cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji liczba parametrów, które można określić ilościowo, jest ograniczona przez nakładanie się widma między widmem emisyjnym wielu fluoroforów, co wymaga coraz bardziej złożonych obliczeń kompensacyjnych wraz ze wzrostem liczby parametrów. Ograniczenia te są eliminowane za pomocą cytometrii masowej, w której przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi są wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu (TOF), aby znacznie rozszerzyć liczbę parametrów zbieranych jednocześnie i uzyskać wysokowymiarowy profil obfitości białek dla każdej pojedynczej komórki.

Podstawowe zrozumienie działania przyrządu do cytometrii masowej jest korzystne dla użytkownika i może być niezbędne do rozwiązywania problemów. Bardziej szczegółowy opis strojenia i uruchamiania maszyny do cytometrii masowej można znaleźć w powiązanym manuskrypcie1. Krótko mówiąc, próbka komórki jest znakowana panelem przeciwciał sprzężonych z metalami ukierunkowanych na markery powierzchniowe komórki, białka cytoplazmatyczne, białka jądrowe, białka związane z chromatyną lub inne epitopy będące przedmiotem zainteresowania (Figura 1i). Oznakowane komórki są ładowane do maszyny, pojedynczo przez ręczne wstrzykiwanie lub za pomocą automatycznego podajnika próbek, który pobiera próbki z 96-dołkowej płytki. Załadowane komórki są wstrzykiwane przez nebulizator, który generuje rozpylone kropelki cieczy otaczające komórki (ryc. 1ii). Spray ten jest umieszczony w taki sposób, że komórki są jonizowane przez palnik plazmowy argonowy. Ta jonizacja generuje chmurę cząstek składającą się ze wszystkich atomów składowych każdej komórki (rysunek 1iii). Gdy ta chmura cząstek przemieszcza się do detektora, atomy o niskiej masie atomowej są oddzielane od jonów o dużej masie przez kwadrupolowy filtr masowy. Pozostałe jony o dużej masie są dalej przesyłane do detektora, gdzie określa się ilościowo obfitość każdego izotopu (ryc. 1iv). Surowe dane zebrane przez detektor są analizowane przez oprogramowanie przyrządu do cytometrii masowej w celu identyfikacji zdarzeń komórkowych. Dla każdego zidentyfikowanego zdarzenia komórki sygnał wykryty w każdym kanale jest określany ilościowo i zapisywany w wyjściowym pliku .fcs. Kanały masowe używane do wykrywania przeciwciał sprzężonych z metalami ciężkimi wykazują minimalne nakładanie się widma, które waha się od 0 do 4%, przy czym większość udziałów wynosi poniżej 1%. Ze względu na ten niski przesłuch między kanałami, generalnie nie ma potrzeby przekształcania danych za pomocą macierzy kompensacji przed analizą2. Należy jednak zachować ostrożność podczas projektowania eksperymentalnego panelu przeciwciał w celu zapewnienia, że przeciwciało z epitopem o wysokiej liczebności nie jest przypisywane do kanału masowego, który przekazuje sygnał do kanału przypisanego do przeciwciała o niskiej liczebności, ponieważ może to spowodować sztucznie zawyżoną populację w kanale odbierającym wkład sygnału.

Dokładne przygotowanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej zależy w dużym stopniu od rodzaju pobieranych próbek i testowanej hipotezy eksperymentalnej. Podajemy przykłady dwóch protokołów pobierania różnych typów komórek (ludzkie embrionalne komórki macierzyste) i komórek pierwotnych (izolat komórek nabłonkowych guza piersi myszy). Rozpoczynając badanie cytometrii masowej, zaleca się najpierw przeprowadzenie małego eksperymentu pilotażowego, aby upewnić się, że wszystkie protokoły i przeciwciała, które mają być zastosowane, działają dobrze w rękach badacza. Jest to szczególnie istotne, gdy mają być stosowane niestandardowe przeciwciała sprzężone, ponieważ reakcja częściowej redukcji podczas koniugacji przeciwciał może zakłócić powinowactwo przeciwciał; Dlatego każde niestandardowe przeciwciało musi zostać zweryfikowane empirycznie, aby zapewnić dokładność danych. Inne rozważania obejmują określenie, czy przeciwciała powierzchniowe komórki, które mają być użyte w teście, rozpoznają swoje epitopy po utrwaleniu, czy też należy je zastosować do żywych komórek. Pewne utrwalenie może uniemożliwić prawidłowe barwienie przeciwciałami na powierzchni komórki, jak wiadomo, że występuje w przypadku barwienia peptydowo-MHC3,4. W przypadku niektórych przeciwciał może być konieczne barwienie przeciwciał na powierzchni komórek na żywych komórkach, ale wyklucza to możliwość kodowania kreskowego przed znakowaniem przeciwciał, ponieważ większość metod kodowania kreskowego jest wykonywana po utrwaleniu5, chociaż kod kreskowy oparty na przeciwciałach6,7 jest wyjątkiem.

Przy określaniu liczby komórek do przygotowania, ważne jest, aby wiedzieć, że tylko część komórek załadowanych na maszynę zostanie wykryta i wygeneruje dane. Strata ta wynika przede wszystkim z nieefektywności, gdy nebulizator rozpyla próbkę na palniku. Dokładna strata procentowa zależy od konfiguracji maszyny do cytometrii masowej i typu komórki, ale może wynosić od 50 do 85% i powinna być brana pod uwagę podczas projektowania eksperymentu. Protokół ten został zoptymalizowany dla 2x106 komórek na próbkę, ale może być dostosowany do przetwarzania mniejszych lub większych rozmiarów próbek. Protokół ten może być stosowany z minimalnymi modyfikacjami dla wielkości próbek od 1 x 106 do 4 x 106, jednak bardzo ważne jest, aby wielkość próby była spójna w eksperymencie. Zmiany w liczbie komórek mogą wpływać na intensywność barwienia kodami kreskowymi i przeciwciałami i powinny być mniej więcej spójne we wszystkich próbkach, aby można je było bezpośrednio porównać.

Niektóre procedury, takie jak znakowanie martwych komórek i etykietowanie DNA, powinny być przeprowadzane w zdecydowanej większości, jeśli nie we wszystkich eksperymentalnych projektach. Znakowanie martwych komórek w eksperymentach analizujących tylko markery powierzchniowe można osiągnąć przy użyciu Rh103, ale Rh103 należy unikać w eksperymentach, w których wymagana jest przepuszczalność, ponieważ powoduje to utratę barwienia. W przypadku eksperymentów obejmujących przepuszczalność zaleca się stosowanie cisplatyny8 i, jeśli to możliwe, przeciwciała rozpoznającego rozszczepiony PARP lub rozszczepioną kaspazę w celu wykrycia apoptozy i martwych komórek.

Kody kreskowe próbek mogą zmniejszyć zużycie przeciwciał, skrócić czas pobierania i wyeliminować zmienność między próbkami9. Proces kodowania kreskowego polega na zastosowaniu unikalnego kodu specyficznego dla próbki do wszystkich komórek, który służy do przypisania każdej komórki do próbki pochodzenia. Po zakodowaniu kreskowym próbki można połączyć przed barwieniem przeciwciałami, co zapewnia jednakowe barwienie wszystkich próbek. Aby zminimalizować błąd eksperymentalny, rozsądnie jest oznaczyć kreską i połączyć wszystkie próbki, które mają być bezpośrednio ze sobą porównane. Obecnie istnieje kilka metod oznaczania próbek do kodów kreskowych do analizy cytometrii masowej5,6,7, z których dwie są przedstawione tutaj (patrz poniżej).

Dzięki obecnie dostępnym odczynnikom możliwe jest ilościowe określenie obfitości 38 celów przeciwciał, identyfikacja komórek w fazie S10, rozróżnienie żywych i martwych komórek8 i zmierzenie komórkowego poziomu niedotlenienia11 w multipleksowanym eksperymencie z wieloma próbkami. Ta zdolność do zbierania danych o pojedynczych komórkach o wysokich parametrach dla dużych populacji komórek umożliwia lepsze profilowanie wysoce heterogenicznych populacji komórek i już przyniosła szereg nowatorskich spostrzeżeń biologicznych12,13,14,15,16. Przekształcenie uzyskanych w ten sposób złożonych danych w możliwe do zinterpretowania informacje wymagało użycia algorytmów obliczeniowych, w tym Spanning Tree Progression of Density Normalized Events (SPADE)17 i viSNE18.

Ten artykuł przedstawia przystępny przegląd tego, jak zaprojektować i przeprowadzić eksperyment z cytometrią masową oraz wprowadza podstawową analizę danych cytometrii masowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie komórek

  1. Pobieranie komórek z tkanki pierwotnej
    UWAGA: Proces opisany dla pobierania komórek z tkanki pierwotnej ma szczególne zastosowanie do tkanki guza piersi myszy i może nie mieć zastosowania, tak jak w przypadku tkanek pierwotnych z innych źródeł.
    1. Przygotować bufor do wytrawiania, rozpuszczając 5 mg hialuronidazy i 30 mg kolagenazy w 10 ml pożywki DMEM/F12 na gram tkanki, która ma być przetworzona. Filtruj sterylizuj bufor mineralizacyjny.
    2. Wyizoluj pierwotny guz gruczołu sutkowego od myszy i zarejestruj masę guza.
    3. Miel tkankę skalpelem #10 przez co najmniej 5 minut.
    4. Dodać tkankę mieloną do odpowiedniej objętości buforu wytrawiającego (10 ml buforu na gram tkanki).
    5. Wstrząsać tkanką mieloną w buforze wytrawiającym z prędkością 100 obr./min przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C.
    6. Zawiesinę jednokomórkową uzyskuje się przez przepuszczenie komórek przez filtr 0,4 μm do probówki o pojemności 50 ml.
    7. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    8. Zawiesić osad w 4 ml DMEM/F12 i przenieść do 5 ml probówki z okrągłym dnem.
  2. Pobieranie komórek z hodowli tkankowej
    1. Przemyć płytkę lub kolbę przylegających komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanem wolnego od wapnia i magnezu (PBS) w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Opisana technika pobierania komórek ma szczególne zastosowanie do przylegających do zarodków ludzkich komórek macierzystych (hESC). Jednak pozostała część opisanego protokołu ma szerokie zastosowanie do innych hodowanych linii komórkowych, linii nieprzylegających i komórek pierwotnych.
    2. Dodać podgrzaną (37 °C) trypsynę lub inny odczynnik do trawienia enzymatycznego zoptymalizowany pod kątem uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki z przylegających komórek. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Trypsyna i inne enzymatyczne odczynniki dysocjacyjne mogą potencjalnie wpływać na markery komórkowe.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut w celu odłączenia komórek. W przypadku kultur o wysokiej konfluencji delikatnie postukaj w płytkę, aby ułatwić odłączenie komórek.
    4. Przenieść całkowicie oderwane komórki z płytki do okrągłej probówki o pojemności 5 ml i delikatnie pipetować za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu dysocjacji komórek.
      UWAGA: W przypadku przetwarzania dużej liczby próbek wszystkie etapy można alternatywnie wykonać w 96-dołkowej okrągłej płycie dennej. W przypadku przetwarzania próbek w formacie 96-dołkowym wszystkie płukania można przeprowadzić przy objętości 250 μl. Objętości opisane w innych krokach można regulować tak, aby całkowita objętość nie przekraczała 300 μl.
    5. Odczynnik do mineralizacji enzymatycznej ugasić buforem do przemywania o równej objętości (0,5% BSA i 0,02% azydku sodu w PBS).
      UWAGA: Azydek sodu jest niebezpieczną substancją chemiczną. Podczas jego przygotowania i obchodzenia się z nim należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności.
    6. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    7. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wolnej od surowicy.
    8. Policz komórki, przenosząc 10 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozcieńczyć podwielokrotność w znanym stosunku w błękitu trypanowym i przenieść do hemocytometru lub automatycznego systemu zliczania komórek.
  3. Znakowanie populacji fazy S
    UWAGA: Jeśli znakowanie fazy S nie ma być wykonywane, przejdź do trzpienia 1.4.
    1. Przygotować 1 ml 10 μM 5-jodo-2'-deoksyurydyny (IdU) w surowicy wolnej od DMEM F12 lub innym odpowiednim podłożu dla każdych 2 x 106 komórek do analizy.
    2. Dodać 500 μL 10 μM IdU w pożywce wolnej od surowicy na każde 2 x 106 komórek.
      UWAGA: Podczas gdy znakowanie IdU można przeprowadzić w pożywce zawierającej surowicę, wolne białko będzie reagować z cisplatyną, uniemożliwiając prawidłowe znakowanie martwych komórek. Jeśli podczas znakowania IdU stosuje się pożywkę zawierającą surowicę, dodatkowym etapem przemywania jest konieczność usunięcia białek surowicy w celu usunięcia białek surowicy przed barwieniem cisplatyną żywych/martwych.
    3. Delikatnie zawiesić granulki za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc.
  4. Etykietowanie żywych/martwych
    1. Dla każdej próbki należy przygotować 500 μl 50 μM cisplatyny w surowicy DMEM-F12 lub pożywce odpowiedniej dla typu komórki.
      UWAGA: Jeśli znakowanie populacji w fazie S przez IdU nie ma być wykonywane, należy ponownie zawiesić próbki w stężeniu 4 x 106 komórek/ml. Ponowne zawieszenie komórek przed dodaniem cisplatyny umożliwia szybsze mieszanie roztworów w celu jednolitego etykietowania żywych/martwych.
    2. Dodać 500 μl 50 μM cisplatyny na 2 x 106 komórek do próbek.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 minutę na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem.
    4. Ugasić cisplatynę równą objętością buforu do płukania.
    5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    6. Przepłukać próbki dwukrotnie buforem do przemywania o pojemności 500 μl w celu usunięcia nadmiaru cisplatyny.
    7. Próbki należy przemyć dwukrotnie 500 μl PBS w celu usunięcia nadmiaru białka.
  5. Utrwalanie próbki
    1. Zawiesić próbkę w 500 μl PBS.
    2. Dodać równą objętość 4% PFA do PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 2%; odpipetować do mieszania.
      UWAGA: Przygotuj 4% PFA prosto z proszku, dostosuj pH do 6,9 i przepuść przez filtr 0,44 μm. 4% PFA w PBS można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Unikaj gotowej formaliny dostarczanej w ampułkach, chyba że została ona specjalnie przetestowana, ponieważ często zawiera ona zanieczyszczenia metalowe, które mogą zakłócać kanały mierzonej masy. Niższe stężenie PFA może być wystarczające i pomóc zminimalizować wpływ wiązania na wiązanie przeciwciał, ale powinno być testowane empirycznie.
    3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem.
    4. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    5. Przemyć próbki PBS w celu usunięcia roztworu PFA.
      UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 °C. Długotrwałe przechowywanie w temperaturze 4 °C może spowodować degradację próbki i zmniejszenie jej barwienia.

2. Kody kreskowe

UWAGA: Podczas gdy metodologia wykorzystania monoizotopowego cisplatyny i palladu jest prezentowana równocześnie, może być stosowana niezależnie lub całkowicie unikana, jeśli nie jest to wymagane w eksperymencie.

  1. Monoizotopowe kody kreskowe cisplatyny
    UWAGA: Ponieważ kodowanie kreskowe cisplatyny i barwienie żywych/martwych cisplatyny opierają się na nakładających się kanałach, należy zachować ostrożność, aby zminimalizować barwienie cisplatyną żywym/martwym w żywych komórkach, ponieważ może to zakłócić dokładność kodu kreskowego cisplatyny.
    1. Rozcieńczyć 1 mM monoizotopowe roztwory podstawowe cisplatyny do 200 μM w PBS.
    2. Dla każdego unikalnego kodu kreskowego cisplatyny przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml z 500 μl PBS dla każdych 2 x 106 komórek otrzymujących ten kod kreskowy.
    3. Aby przygotować każdy niepowtarzalny kod kreskowy, należy dodać każdą odpowiednią cisplatynę monoizotopową do końcowego stężenia 200 nM.
    4. Zawieś komórki w 500 μl PBS na 2 x 106 komórek.
    5. Do każdej próbki dodać równą objętość odpowiedniego roztworu kodu kreskowego.
    6. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem.
    7. Cisplatynę należy ugasić równą objętością buforu do płukania.
    8. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    9. Przepłukać próbki dwukrotnie buforem do przemywania o pojemności 500 μl w celu usunięcia nadmiaru cisplatyny.
  2. Palladowy kod kreskowy
    UWAGA: Odczynniki do kodów kreskowych z palladu można przygotować5 lub zakupić komercyjnie.
    1. Przejściowa częściowa przepuszczalność19
      UWAGA: Kodowanie kreskowe chelatacji palladu wymaga częściowej przepuszczalności, aby odczynniki mogły przejść przez błonę komórkową i solidnie oznaczyć komórkę.
      1. Próbki należy przemyć 500 μl PBS.
      2. Próbki należy przepłukać 500 μl PBS plus 0,02% saponiny.
      3. Zawiesić pelet w pozostałej objętości.
    2. Zastosuj palladowe kody kreskowe.
      1. Rozcieńczyć 100x zapas palladowego odczynnika do kodów kreskowych w 1 ml lodowatego PBS z 0,02% saponiną.
      2. Szybko dodać rozcieńczony odczynnik do kodów kreskowych do ponownie zawieszonej próbki.
      3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy ciągłym mieszaniu.
      4. Próbki należy przepłukać dwukrotnie buforem do przemywania o pojemności 500 μl.

3. Barwienie powierzchni komórki

UWAGA: Barwienie powierzchni komórek można przeprowadzić na żywych komórkach przed utrwaleniem. Może to być konieczne w przypadku przeciwciał, które tracą powinowactwo do swojego epitopu po utrwaleniu. Niektóre próbki komórek mogą korzystać z dodatkowego blokowania, takiego jak blokowanie Fc dla leukocytów, przed znakowaniem przeciwciał w celu zmniejszenia tła. Optymalne blokowanie powinno być empirycznie określone dla określonego typu próbki.

  1. Przygotuj panel do barwienia przeciwciał na powierzchni komórki.
    1. Połączyć 0,5 μl lub empirycznie określoną ilość każdego 0,5 mg/ml przeciwciała powierzchniowego komórki na próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml. W razie potrzeby dodać bufor do przemywania w celu uzyskania objętości do 10 μl na próbkę. Mieszać pipetując.
      UWAGA: Określić robocze rozcieńczenie dla każdego przeciwciała przed eksperymentem empirycznie przez eksperyment miareczkowania.
    2. Podziel pulę przeciwciał na powierzchni komórek równomiernie na jedną probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki, która ma być barwiona.
    3. Przygotować 500 μl buforu do przemywania w probówce o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
  2. Zastosuj barwienie powierzchni komórek do próbek w znormalizowanej objętości dla wszystkich próbek.
    UWAGA: Aby zapewnić spójne znakowanie przeciwciał w wielu próbkach, konieczne jest dokładne kontrolowanie objętości próbki i stężenia przeciwciał. Poniższe kroki mają na celu osiągnięcie tej spójności poprzez zapewnienie, że końcowe objętości próbki po dodaniu przeciwciała są jednolite.
    1. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl ustawionej na 50 μl usunąć pozostały roztwór z osadu próbki i przenieść do probówki z puli przeciwciał na powierzchni podzielonej komórki.
    3. Odpipetować wszystkie płyny znajdujące się w podwielokrotnej probówce, nie zasysając powietrza do końcówki pipety.
    4. Przytrzymując tłok pipety, aby uniknąć zasysania powietrza, przesunąć końcówkę do przygotowanej probówki z buforem do płukania o pojemności 500 μl i zwolnić tłok.
    5. Dodać z powrotem zawartość końcówki pipety do próbki i ponownie zawiesić próbkę w cieczy, delikatnie pipetując.
    6. Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze suchej tonacji na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem.
    7. Przepłukać próbki dwukrotnie buforem płuczącym o pojemności 500 μl, aby upewnić się, że wszystkie wolne przeciwciała zostały wypłukane.
    8. Próbki należy przemyć 500 μl PBS.
    9. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PBS.
    10. Dodać równą objętość 4% PFA do PBS; odpipetować do wymieszania.
    11. Inkubować przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej.

4. Permeabilizacja komórek i barwienie wewnątrzkomórkowe

  1. Przenikanie komórek
    1. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    2. Ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości, delikatnie wirując, aż do dysocjacji osadu.
      UWAGA: Brak dysocjacji komórek przed dodaniem MeOH spowoduje, że komórki będą się ze sobą sklejać i wytwarzać cienką warstwę, co spowoduje częściową utratę próbki.
    3. Natychmiast dodać 1 ml 100% MeOH na 2 x 106 komórek i delikatnie pipetować do mieszania.
      UWAGA: MeOH można zastąpić innymi metodami przepuszczalności i mogą być konieczne do osiągnięcia optymalnej przepuszczalności dla niektórych typów komórek. W przypadku niektórych źródeł komórkowych 0,1% Triton X-100, 0,2% Tween-20 lub 0,1% saponiny w roztworze PBS do przepuszczalności może lepiej utrzymać integralność komórki, zapewniając jednocześnie stałą przepuszczalność.
    4. Próbki inkubować przez co najmniej 1 godzinę lub maksymalnie do 24 godzin w temperaturze 4 °C w celu uzyskania przepuszczalności.
      UWAGA: Na tym etapie próbki w MeOH mogą być przechowywane przez okres do 1 miesiąca w temperaturze -80 °C.
    5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    6. Dodać 1 ml buforu płuczącego na każdy ml MeOH użytego do przepuszczalności próbki. Delikatnie zawiesić osad komórkowy.
    7. Przepłukać próbkę dwukrotnie buforem do przemywania o pojemności 500 μl.
  2. Przygotuj wewnątrzkomórkowy panel do barwienia przeciwciał.
    1. Połączyć 0,5 μl lub empirycznie określoną ilość każdego 0,5 mg/ml przeciwciała wewnątrzkomórkowego na próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml. W razie potrzeby dodać bufor do przemywania w celu uzyskania objętości do 10 μl na próbkę. Wymieszać pipetując.
    2. Podziel pulę przeciwciał wewnątrzkomórkowych równo na jedną probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
    3. Przygotować 500 μl buforu do przemywania w probówce o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
  3. Zastosuj barwienie wewnątrzkomórkowe do próbek w znormalizowanej objętości dla wszystkich próbek.
    UWAGA: Aby zapewnić spójne znakowanie przeciwciał w wielu próbkach, konieczne jest dokładne kontrolowanie objętości próbki i stężenia przeciwciał.
    1. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl ustawionej na 50 μl usunąć pozostały roztwór z osadu próbki i przenieść do probówki z pulą przeciwciał na powierzchni podzielonej komórki.
    3. Odpipetować wszystkie płyny znajdujące się w podwielokrotnej probówce, nie zasysając powietrza do końcówki pipety.
    4. Przytrzymując tłok pipety, aby uniknąć zasysania powietrza, przesunąć końcówkę do przygotowanej probówki z buforem do płukania o pojemności 500 μl i zwolnić tłok, tworząc bufor do przemywania dla całkowitej objętości próbki 50 μl.
    5. Dodać z powrotem zawartość końcówki pipety do próbki i ponownie zawiesić próbkę w cieczy, delikatnie pipetując.
    6. Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem.
    7. Próbki należy przepłukać dwukrotnie buforem do przemywania o pojemności 500 μl.
    8. Próbki należy przemyć 500 μl PBS.

5. Etykietowanie Iridium

  1. Naprawianie próbek
    1. Zawiesić próbki w 500 μl PBS.
    2. Dodaj 500 μl 4% PFA w PBS.
    3. Inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze suchej temperatury na wytrząsarce orbitalnej z ciągłym mieszaniem.
  2. Zastosuj znakowanie DNA Iridium
    1. Rozcieńczyć 125 μM 500x irydowy odczynnik interkalacyjny w 4% PFA w PBS do stężenia 62,5 nM.
    2. Dodać 500 μl 62,5 nM roztworu irydu PFA do próbek.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z użyciem komórek przepuszczalnych, rozcieńczyć 500x Ir191/193 do końcowego rozcieńczenia 1:2,000, aby uniknąć nadmiernego barwienia.
    3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej ze stałym mieszaniem.
      UWAGA: W przypadku wykonywania monoizotopowego kodowania kreskowego cisplatyny nie należy inkubować próbek z irydem dłużej niż 15 minut, ponieważ silne sygnały Ir193 mogą przyczyniać się do kanału masowego Pt194 i negatywnie wpływać na jakość kodów kreskowych.
    4. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
    5. Próbki należy przemyć dwukrotnie 500 μl 0,1% BSA w przefiltrowanej wodzie dejonizowanej.
      UWAGA: Po przygotowaniu zalecamy przeprowadzenie próbek w ciągu 24 godzin, jeśli to możliwe. Przygotowane próbki mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 °C, ale należy zachować ostrożność, aby uniknąć degradacji. Jeśli to możliwe, mycie końcowe powinno być wykonywane w przefiltrowanej wodzie dejonizowanej bez BSA, ponieważ zmniejszy to osadzanie się osadów na komorze natryskowej i stożkach próbnika maszyny, co zmniejszy czyszczenie narzędzi. W przypadku hESC konieczne jest przeprowadzenie tych płukań z uwzględnieniem BSA, aby uniknąć przywierania próbki do powierzchni probówki.

6. Przygotuj próbki do akwizycji

  1. Policz komórki
    1. Zawieś komórki w 500 μl 0,1% BSA w przefiltrowanej wodzie dejonizowanej i przefiltruj do świeżej probówki przez nasadkę sitka komórkowego 35 μm.
      UWAGA: Obniżenie poziomu BSA dla końcowych płukań zmniejsza pozostałości pozostawione na nebulizatorze cytometrii masowej. Nieprzylegające komórki można umyć i ponownie zawiesić w przefiltrowanej wodzie dejonizowanej.
    2. Policz komórki, przenosząc 10 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej. Rozcieńczyć podwielokrotność do znanego stosunku w błękitu trypanowym (aby pomóc w wizualizacji komórek) i przenieść do hemocytometru lub automatycznego systemu zliczania komórek.
    3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować lub ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu.
  2. Przygotowanie i załadunek próbek
    1. Aby przygotować koraliki kalibracyjne, wyjmij je z lodówki i energicznie wstrząśnij do ponownego zawieszenia.
    2. W przypadku badania próbek przy użyciu automatycznego podajnika próbek do cytometrii masowej dodaj 50 μl kulek kalibracyjnych do każdego dołka płytki z próbką, a następnie dodaj żądaną liczbę komórek do analizy. W przypadku ręcznego wstrzykiwania próbek należy dodać 50 μl kulek kalibracyjnych do próbki, rozcieńczyć próbkę w przefiltrowanej wodzie dejonizowanej, dobrze wymieszać i załadować próbkę do portu iniekcji próbki cytometrii masowej. Odpowiednie rozcieńczenie próbki może się różnić w zależności od typu analizowanej komórki, ale rozcieńczenie 106 jest ogólnie odpowiednie1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół może być szeroko stosowany do szerokiej gamy próbek hodowanych i pierwotnych komórek, z niewielkimi modyfikacjami. W zależności od wymagań eksperymentu, można go przeprowadzić w sposób modułowy, gdy niektóre elementy, takie jak kodowanie kreskowe lub barwienie powierzchni komórek, nie są konieczne. Wykorzystany w całości protokół ten umożliwia przygotowanie multipleksowanych próbek cytometrii masowej znakowanych pod kątem wykluczenia martwych komórek, identyfi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół został z powodzeniem zastosowany do przetwarzania różnych hodowanych linii komórkowych (hESC H1 i H9, mESC, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) oraz pierwotnych próbek tkanek (szpik kostny myszy, wątroba embrionalna myszy, wątroba dorosłego myszy, guz myszy). Niezależnie od źródła, każda tkanka, która może zostać zdysocjowana na pojedyncze komórki przy zachowaniu stanu komórkowego, powinna być podatna na analizę za pomocą cytometrii masowej, ale może wymagać pewnej optymalizacji protokołu. Waż...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium Barton była wspierana przez grant z Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). Badania te były częściowo wspierane przez stypendium szkoleniowe dla Ryana L. McCarthy'ego z National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. Główny ośrodek, który utrzymuje i obsługuje maszynę do cytometrii masowej, jest wspierany przez grant CPRIT (RP121010) i grant rdzeniowy NIH (CA016672).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mTeSR1 medium kitStem Cell technologies05850Ciepło w temperaturze pokojowej przed użyciem
DMEM F-12ThermoFisher11330-032Ciepło w 37  ° C przed użyciem
AccutaseStem Cell technologies07920Ciepły w 37  ° C przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcejEquitechBAH62
sól fizjologiczna buforowana fosforanemHyklonSH30256.01
SaponinaSigma-Aldrich47036
Identyfikator komórki Pt194FluidigmDostarczony w 1  mM
Cell ID Pt195Fluidigmpodany pod adresem 1  Identyfikator komórki mM
Pt196Fluidigmpodany pod adresem 1  mM
CisplatynaEnzo Life SciencesALX-400-040-M250Rozpuszczalny do 25  mg / ml w
zestawie kodów kreskowych DMSO Cell-ID 20-plex PdFluidigm201060
5-jodo-2'-deoksyurydynaSigma-AldrichI7125Rozpuszczalny w 74  mg/ml w 0,2  N NaOH
Środek pośredniczący Rhod 103Fluidigm201103A
MetanolFisherBP1105-4Schłodzić w temperaturze -20  ° C przed użyciem
Sodium AzideSigma-AldrichS2002
5 mL probówki okrągłodenneFalcon352058
5 mL 35 μ m rurki z nasadką filtracyjnąFalcon352235
EQ czteroelementowe koraliki kalibracyjneFluidigm201078
Hialuronidaza Typ I-SSigma-AldrichH3506
Kolagenaza z Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891
Jednorazowy skalpel #10Sigma-AldrichZ69239

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass CytometrySample PreparationCell StainingCisplatin LabelingAntibody CocktailIridium LabelingSPADE AlgorithmFlow CytometrySingle Cell AnalysisCell Permeabilization

Related Articles