Method Article

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

DOI:

10.3791/54394

⸱

April 29th, 2017

 ,  , 
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria masowa wykorzystuje przeciwciała sprzężone z etykietami metali ciężkich, podejście, które znacznie zwiększyło liczbę parametrów i możliwości głębokiej analizy znacznie ponad to, co jest możliwe przy użyciu konwencjonalnej cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji. Podobnie jak w przypadku każdej nowej technologii, istnieją krytyczne kroki, które pomagają zapewnić niezawodne generowanie danych wysokiej jakości. Przedstawiono tutaj zoptymalizowany protokół, który obejmuje wiele technik przetwarzania próbek komórek do analizy cytometrii masowej. Opisane tutaj metody pomogą użytkownikowi uniknąć typowych pułapek i osiągnąć spójne wyniki poprzez zminimalizowanie zmienności, która może prowadzić do niedokładnych danych. Aby uzyskać informacje na temat projektu eksperymentu, omówiono uzasadnienie opcjonalnych lub alternatywnych kroków w protokole oraz ich skuteczność w odkrywaniu nowych odkryć w biologii badanego systemu. Na koniec przedstawiono reprezentatywne dane w celu zilustrowania oczekiwanych wyników przedstawionych tutaj technik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria umożliwia jednoczesny pomiar wielu celów przeciwciał na poziomie pojedynczej komórki w dużych populacjach komórek. W tradycyjnej cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji liczba parametrów, które można określić ilościowo, jest ograniczona przez nakładanie się widma między widmem emisyjnym wielu fluoroforów, co wymaga coraz bardziej złożonych obliczeń kompensacyjnych wraz ze wzrostem liczby parametrów. Ograniczenia te są eliminowane za pomocą cytometrii masowej, w której przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi są wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu (TOF), aby znacznie rozszerzyć liczbę parametrów zbieranych je....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie komórek

  1. Pobieranie komórek z tkanki pierwotnej
    UWAGA: Proces opisany dla pobierania komórek z tkanki pierwotnej ma szczególne zastosowanie do tkanki guza piersi myszy i może nie mieć zastosowania, tak jak w przypadku tkanek pierwotnych z innych źródeł.
    1. Przygotować bufor do wytrawiania, rozpuszczając 5 mg hialuronidazy i 30 mg kolagenazy w 10 ml pożywki DMEM/F12 na gram tkanki, która ma być przetworzona. Filtruj sterylizuj bufor mineralizacyjny.
    2. Wyizoluj pierwotny guz gruczołu sutkowego od myszy i zarejestruj masę guza.
    3. Miel tkankę skalpelem #10 przez co najmniej 5 minut.
    4. Doda....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół może być szeroko stosowany do szerokiej gamy próbek hodowanych i pierwotnych komórek, z niewielkimi modyfikacjami. W zależności od wymagań eksperymentu, można go przeprowadzić w sposób modułowy, gdy niektóre elementy, takie jak kodowanie kreskowe lub barwienie powierzchni komórek, nie są konieczne. Wykorzystany w całości protokół ten umożliwia przygotowanie multipleksowanych próbek cytometrii masowej znakowanych pod kątem wykluczenia martwych komórek, identyfi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół został z powodzeniem zastosowany do przetwarzania różnych hodowanych linii komórkowych (hESC H1 i H9, mESC, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) oraz pierwotnych próbek tkanek (szpik kostny myszy, wątroba embrionalna myszy, wątroba dorosłego myszy, guz myszy). Niezależnie od źródła, każda tkanka, która może zostać zdysocjowana na pojedyncze komórki przy zachowaniu stanu komórkowego, powinna być podatna na analizę za pomocą cytometrii masowej, ale może wymagać pewnej optymalizacji protokołu. Waż.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium Barton była wspierana przez grant z Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). Badania te były częściowo wspierane przez stypendium szkoleniowe dla Ryana L. McCarthy'ego z National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. Główny ośrodek, który utrzymuje i obsługuje maszynę do cytometrii masowej, jest wspierany przez grant CPRIT (RP121010) i grant rdzeniowy NIH (CA016672).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mTeSR1 medium kitStem Cell technologies05850Ciepło w temperaturze pokojowej przed użyciem
DMEM F-12ThermoFisher11330-032Ciepło w 37  ° C przed użyciem
AccutaseStem Cell technologies07920Ciepły w 37  ° C przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcejEquitechBAH62
sól fizjologiczna buforowana fosforanemHyklonSH30256.01
SaponinaSigma-Aldrich47036
Identyfikator komórki Pt194FluidigmDostarczony w 1  mM
Cell ID Pt195Fluidigmpodany pod adresem 1  Identyfikator komórki mM
Pt196Fluidigmpodany pod adresem 1  mM
CisplatynaEnzo Life SciencesALX-400-040-M250Rozpuszczalny do 25  mg / ml w
zestawie kodów kreskowych DMSO Cell-ID 20-plex PdFluidigm201060
5-jodo-2'-deoksyurydynaSigma-AldrichI7125Rozpuszczalny w 74  mg/ml w 0,2  N NaOH
Środek pośredniczący Rhod 103Fluidigm201103A
MetanolFisherBP1105-4Schłodzić w temperaturze -20  ° C przed użyciem
Sodium AzideSigma-AldrichS2002
5 mL probówki okrągłodenneFalcon352058
5 mL 35 μ m rurki z nasadką filtracyjnąFalcon352235
EQ czteroelementowe koraliki kalibracyjneFluidigm201078
Hialuronidaza Typ I-SSigma-AldrichH3506
Kolagenaza z Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891
Jednorazowy skalpel #10Sigma-AldrichZ69239

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass CytometrySample PreparationCell StainingCisplatin LabelingAntibody CocktailIridium LabelingSPADE AlgorithmFlow CytometrySingle Cell AnalysisCell Permeabilization

Related Articles