Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

Summary

Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.

Abstract

Skóra jest niezbędna dla naszego przetrwania. Zewnętrzna warstwa naskórka składa się z naskórka międzymieszkowego, który jest warstwowym nabłonkiem płaskonabłonkowym pokrywającym większość naszego ciała, oraz przydatkami naskórka, takimi jak mieszki włosowe i gruczoły potowe. Naskórek ulega regeneracji przez całe życie i w odpowiedzi na urazy. Jest to możliwe dzięki populacjom podstawowych komórek macierzystych / progenitorowych naskórka z ekspresją K14, które są ściśle regulowane przez wiele mechanizmów regulacyjnych aktywnych w naskórku oraz między naskórkiem a skórą właściwą. W tym artykule opisano prostą metodę wyjaśniania biopsji skóry myszy o pełnej grubości i wizualizacji wzorców ekspresji białka K14, komórek proliferujących znakowanych Ki67, sebocytów znakowanych czerwienią Nilową i znakowania jądrowego DAPI w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę i ilościowe określenie anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy. Protokół CUBIC jest najlepszą dostępną do tej pory metodą badania interakcji molekularnych i komórkowych w biopsjach skóry o pełnej grubości w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Introduction

Skóra jest niezbędna dla naszego przetrwania. Składa się z trzech głównych warstw: zewnętrznego naskórka, skóry właściwej i tkanki podskórnej. Naskórek jest tkanką silnie regenerującą. Jest to płaskonabłonkowy nabłonek warstwowy, składający się głównie z keratynocytów. Keratynocyty rodzą się w warstwie podstawnej i przemieszczają się w górę przez warstwy nadpodstawne podczas różnicowania, a ostatecznie są zrzucane w zewnętrznej warstwie rogowej około miesiąca po urodzeniu. W naskórku rozwija się wiele przydatków, w tym mieszki włosowe i gruczoły łojowe. Mieszki włosowe również regenerują się w sposób cykliczny przez całe życie¹. Zdolność regeneracyjna naskórka jest możliwa dzięki obecności komórek macierzystych i progenitorowych, które znajdują się w warstwie podstawnej naskórka międzymieszkowego i mieszka włosowego².

Wiele szlaków sygnałowych zostało zaangażowanych w rozwój i regenerację naskórka. Niektóre z nich występują tylko w naskórku, na przykład szlak jeża. Inne zdarzenia sygnalizacyjne zachodzą między skórą właściwą a naskórkiem³. Na przykład uważa się, że sygnały Wnt ze skóry właściwej są ważne dla rozwoju mieszków włosowych i są wydzielane przez brodawkę skórną na początku anagenu w celu aktywacji proliferacji komórek macierzystych / progenitorowych wybrzuszenia mieszków włosowych i wzrostu mieszków włosowych⁴. Ważne jest, aby zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne, które kontrolują rozwój i regenerację naskórka, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób mogą one być zaburzone w regeneracyjnych chorobach skóry, takich jak rak skóry.

Ten artykuł opisuje koktajle Clear, Unobstructed Brain Imaging oraz protokółanalizy C (CUBIC)^5-7 w celu wyjaśnienia preparatów skóry całego wierzchowca i wizualizacji wzorców ekspresji białek w 3 wymiarach w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda CUBIC polega na zanurzeniu tkanki skórnej w dwóch koktajlach chemicznych na bazie aminoalkoholu. Roztwory te dostosowują współczynniki załamania światła w próbce skóry, pozostawiając tkankę przezroczystą i nienaruszone białka, umożliwiając immunodetekcję w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Korzystając z tego protokołu CUBIC, podstawowe i proliferujące populacje keratynocytów w naskórku międzypęcherzykowym i w mieszku włosowym zostały zobrazowane w biopsjach skóry pełnej grubości myszy typu dzikiego przy użyciu przeciwciał anty-Keratyny14 (K14) i anty-Ki67. Gruczoły łojowe w biopsjach skóry typu dzikiego były również wizualizowane za pomocą barwienia czerwienią nilową. Na koniec porównano podstawowe populacje keratynocytów w biopsjach skóry typu dzikiego i hiperplastycznego YAP2-5SA-ΔC⁸.

Ten protokół CUBIC umożliwia wizualną ocenę ekspresji białka w biopsjach skóry pełnej grubości w rozdzielczości pojedynczej komórki i jest ważnym narzędziem do zrozumienia anatomii naskórka i defektów morfologicznych w skórze genetycznie modyfikowanych myszy, a także do zbadania komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i regeneracji naskórka.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki (ACEC) w UNSW Australia zgodnie z zatwierdzonym protokołem ACEC 13/64B.

1. Przygotowanie przezroczystej tkanki skóry myszy

Uwaga: Wszystkie myszy użyte w tym badaniu miały podłoże genetyczne C57BL/6

1. Pobieranie tkanki skórnej myszy.
   1. Humanitarna eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
   2. Ostrożnie usuń włosy z odpowiedniego obszaru skóry za pomocą trymera, uważając, aby nie zranić skóry.
   3. Umyj skórę w celu odkażenia 70% etanolem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   4. Podnieś skórę szyi grzbietowej za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie nożyczkami.
   5. Wypreparuj duży obszar grzbietowej skóry myszy (około 1,5 x 4 cm).
   6. Spłaszczyć skórę skórną do dołu na bibule filtracyjnej i zwrócić uwagę na orientację przednią i tylną próbki.
   7. Przyciąć bibułę filtracyjną wokół rozciętej skóry i umieścić w 15 ml probówce wypełnionej świeżo przygotowanym 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) w PBS.
   8. Utrwal na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w lodówce w temperaturze 4 °C.
   9. Myć skórę 2 x 5 min w PBS w probówce o pojemności 15 ml.
      Uwaga: Poniższe czynności (1.1.10 - 1.1.12) są opcjonalnymi krokami długotrwałego przechowywania tkanki.
   10. Odwodnić wypreparowaną skórę w PBS ze zwiększonym stężeniem etanolu (25%, 50%, 70%) w tubce o pojemności 15 ml podczas 1-godzinnego mycia w temperaturze pokojowej.
   11. Odwodnioną skórę należy przechowywać w 70% etanolu w PBS w probówce o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
   12. Na 4 godziny przed oczyszczeniem należy nawodnić tkankę skórną w PBS ze zmniejszającym się stężeniem etanolu (70%, 50%, 25%, 0%) w probówce o pojemności 15 ml podczas 1-godzinnych etapów mycia w temperaturze pokojowej.
2. Oczyszczanie biopsji skóry myszy
   1. Przygotować roztwór czyszczący CUBIC1, rozpuszczając 3,85 g mocznika i 3,85 g N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiaminy w 5,38 ml wody destylowanej na podgrzewaczu ustawionym na 60 - 70 °C. Użyj gorącego mieszadła.
   2. Dodać 2,31 g eteru mono-p-izooktylofenylowego glikolu polietylenowego/Triton X-100 do roztworu, gdy będzie klarowny i ostygnie do temperatury pokojowej.
   3. Przeciąć skórę myszy ostrą żyletką do biopsji o przybliżonych wymiarach 0,2 x 0,5 cm i zanurzyć w 5 ml roztworu oczyszczającego CUBIC1 w probówce o pojemności 15 ml. Aby zoptymalizować wizualizację mieszków włosowych, należy upewnić się, że dłuższy bok biopsji jest przecięty wzdłuż przednio-tylnego kierunku próbki.
   4. Umieścić na obrotowej platformie w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C.
   5. Zmień roztwór czyszczący po 7 dniach. Przed użyciem należy przygotować świeży roztwór CUBIC1.
   6. Sprawdź przezroczystość tkanki po 7 dniach. W razie potrzeby należy pozostawić biopsje w roztworze oczyszczającym CUBIC1, aż tkanka stanie się całkowicie przezroczysta.
   7. Gdy biopsja skóry stanie się przezroczysta, należy usunąć roztwór CUBIC1 i dodać 4 ml 1× PBS, aby przemyć tkankę 4 razy przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
   8. Umyć tkankę skóry w 20% w/v sacharozy w PBS w probówce o pojemności 15 ml przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
   9. Zamrozić tkankę w podłożu montażowym Optymalna temperatura cięcia (OCT) Związek w probówce o pojemności 15 ml przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Ten krok zwiększy przepuszczalność biopsji dla penetracji przeciwciał w kolejnych krokach.

2. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Rozmrozić tkankę od 1.2.9) do temperatury pokojowej przez 2 - 3 godziny.
2. Umyj chusteczkę w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml PBS przez 8 godzin w temperaturze pokojowej, aby usunąć związek OCT.
3. Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml i inkubować tkankę w 1 ml króliczego przeciwciała anty-keratynowego14 lub króliczego przeciwciała anty-Ki67, oba rozcieńczone w stosunku 1:100 w PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.
4. Przenieść biopsję do probówki o pojemności 15 ml i myć tkankę 4 razy przez 6 godzin w 5 ml PBST na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
5. Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml przeciwciała drugorzędowego anty-królika Alexa594 rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PBST i inkubować przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.
6. Przenieść biopsje do probówki o pojemności 15 ml i umyć tkankę 4 razy przez 6 godzin w 5 ml PBST na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
7. Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml roztworu 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (1:1,000) jądrowego roztworu barwnika jądrowego w PBST i inkubować przez noc na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.
8. Usunąć roztwór przeciwbarwiący DAPI i dodać 1 ml PBST do probówki o pojemności 2 ml, aby umyć tkankę 4 razy przez 6 godzin na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Krok opcjonalny: Biopsje można przechowywać w ciemności w 1x PBS z 0,02% azydkiem sodu przez co najmniej 3 tygodnie.

3. Czerwone zabarwienie Nilu

1. Rozpuścić proszek czerwieni nilowej w dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 1 mg/ml
2. Dodać 1 μl roztworu czerwieni nilowej do 1 ml PBS do końcowego stężenia 1 μg/ml.
3. Rozmrażać tkanki z 1.2.9) do temperatury pokojowej przez 2 - 3 godziny i myć 5 ml PBS przez 8 godzin w temperaturze pokojowej.
4. Przenieś biopsje do probówki o pojemności 2 ml i zanurz tkankę w 1 ml roztworu barwiącego czerwienią nilową na 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Przemyć biopsje skóry w probówce o pojemności 2 ml z 1 ml PBST 4 razy przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
6. Usunąć roztwór PBST z probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml roztworu do barwienia jądrowego DAPI (1:1 000) w PBST i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Usuń roztwór przeciwbarwiący DAPI i dodaj 1 ml PBST do probówki o pojemności 2 ml, aby umyć tkankę skóry 4 razy przez 6 godzin w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Krok opcjonalny: Biopsje można przechowywać w ciemności w 1x PBS z 0,02% azydkiem sodu przez co najmniej 3 tygodnie.

4. Obrazowanie

1. Przygotować roztwór czyszczący CUBIC2, który zawiera 50% (m/v) sacharozy, 25% (w/v) mocznika, 10% (w/v) 2,2′,2′'-nitrylotriotrietanolu i 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Inkubować tkankę skórną w 1 ml roztworu CUBIC2 w probówce o pojemności 2 ml na wytrząsarce przez 24 godziny w piecu o temperaturze 37 °C. Ten krok wyrówna współczynnik załamania światła tkanki.
3. Sprawdź przejrzystość tkanki. Gdy jest czysty, umieść całą biopsję skóry (0,2 x 0,5 cm) na dłuższym boku na szklanym szkiełku nakrywkowym, tak aby kierunek długości mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka nakrywkowego (#1 24 x 60 mm)
   Uwaga: Krok opcjonalny: Biopsje barwione przeciwciałami można przechowywać w roztworze CUBIC2 przez około 7 dni. Biopsje zabarwione czerwienią nilową mogą być przechowywane w roztworze CUBIC2 tylko przez okres do 1 dnia i powinny być zobrazowane tak szybko, jak to możliwe.
4. Przygotować komorę obrazowania (rysunek 1)
   Uwaga: Materiały eksploatacyjne wymagane do przygotowania komory obrazowania to: niebieska tacka, ciastolina lub podobna oraz 2 szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm) (Rysunek 1A).
   1. Przygotować dwa cienkie paski niebieskiego kleju (średnica około 1 mm x 2 cm) i dwa szkiełka nakrywkowe (ryc. 1B).
   2. Umieść niebieskie paski przyklejające się na jednym szkiełku nakrywkowym, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na biopsję skóry (Rysunek 1C). 4.4.3)
   3. Umieścić biopsję skóry między paskami na szkiełku nakrywkowym w kropli roztworu CUBIC2 (ryc. 1C).
   4. Pokryj biopsję skóry drugim szkiełkiem nakrywkowym (ryc. 1D).
5. Umieść komorę obrazowania z zamontowaną biopsją skóry na stoliku mikroskopu konfokalnego i przenieś tkankę do ścieżki świetlnej.
6. Zeskanuj próbkę za pomocą rtęciowego lub halogenowego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych (np. DAPI/GFP/CY3/CY5) w celu zidentyfikowania obszarów zainteresowania wybarwionych fluorescencyjnie.
7. Obrazuj obszary zainteresowania za pomocą obiektywu 10X i 20X (NA 0,75) i standardowych technik obrazowania fluorescencji konfokalnej (np. w przypadku próbek barwionych DAPI oświetlaj laserem 405 nm i zbieraj sygnał fluorescencyjny w zakresie 425 - 475 nm, a w przypadku Alexa Fluor 594 lub próbek barwionych czerwienią Nilową oświetlaj laserem 561 nm i zbieraj sygnał fluorescencyjny w zakresie 570 - 620 nm).
8. Generuj stosy obrazów Z każdego obszaru zainteresowania za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów ze stosu Z mikroskopu (np. za pomocą oprogramowania do obrazowania elementów NIS 4.13, jak opisano poniżej).
   1. Upewnij się, że wybrano optymalną moc lasera i ustawienia PMT HV/Offset, aby zebrać fluorescencję próbki.
   2. Otwórz pasek narzędzi "ND Acquisition" z "Acquisition Controls".
   3. Wybierz zakładkę "Ustawienia serii Z" (upewnij się, że wszystkie inne karty są odznaczone).
   4. Podczas skanowania na żywo ustaw ostrość na górze próbki i naciśnij przycisk "Góra".
   5. Ustaw ostrość na dole próbki i naciśnij przycisk "Dół".
   6. Wprowadź wymagany rozmiar kroku (lub naciśnij przycisk zoptymalizowanego rozmiaru kroku).
   7. Naciśnij przycisk "Uruchom teraz".
   8. Zapisywanie wynikowych stosów obrazów Z jako indywidualnych stosów obrazów TIFF (1 fluorochrom na stos obrazów Z).
9. Użyj stosów Z-stacks obrazu, aby zrekonstruować interesujące obszary objętości 3D za pomocą oprogramowania do analizy 3D (np. przy użyciu Imaris x64 7.2.3, jak opisano poniżej).
   1. Uruchom oprogramowanie do analizy.
   2. Wybierz przycisk "Prześcignij" na pasku narzędzi, aby wygenerować objętość 3D.
   3. Otwórz pierwszy kolorowy obraz Z-stack (np. DAPI).
   4. Użyj narzędzia "dodaj kanał", aby dodać dodatkowe kanały kolorów, po jednym kanale na fluorochrom. Tak więc próbka zawierająca zarówno fluorochromy DAPI, jak i Alexa Fluor 594 będzie wymagała dwóch kanałów.
   5. Użyj narzędzia "Właściwości obrazu", aby ustawić prawidłowe wymiary pikseli (woksela) (XYZ), jak określono w punkcie 4.7 powyżej.
   6. Użyj narzędzia "Regulacja wyświetlania", aby zmienić kolory kanałów w razie potrzeby (np. ustaw kanał DAPI na niebieski, kanał Alexa Fluor 594 na czerwony).
   7. Aby ustawić wolumin 3D w oknie obrazu, użyj myszy komputerowej, aby kliknąć i przeciągnąć wolumin zgodnie z wymaganiami.
   8. Użyj narzędzia "Migawka" na pasku narzędzi, aby wygenerować zrzuty ekranu obrazu 3D.
   9. Użyj narzędzia "Animacja" na pasku narzędzi, aby wygenerować filmy z obracaniem próbki 3D.

Results

Biopsje grzbietowej skóry dorosłego typu dzikiego o pełnej grubości zostały wyjaśnione, wybarwione markerem keratynocytów Keratyny14 (K14) wiążącym przeciwciało, a jądra zostały wybarwione roztworem barwiącym DAPI (Rysunek 2 i Film 1).

Jądra DAPI-dodatnie były widoczne w całej próbce (Rysunek 2A, C), a barwienie K14 było widoczne wyłącznie w jednokomórkowej grubej warstwie podstawnej naskórka międzymieszkowego i zarysowując gruczoły łojowe (cz...

Discussion

Mechanizmy regulacyjne kontrolujące rozwój i homeostazę skóry są najczęściej badane w 2D przy użyciu sekcji tkanek i barwienia histologicznego lub znakowania przeciwciałami, co umożliwia jedynie ograniczoną ocenę morfologii skóry, populacji komórek lub ekspresji białek. Opracowano szereg metod poprawiających wizualizację organizacji przestrzennej komórek i białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3 wymiarach w całych wierzchowcach naskórka^10-13. Niektóre z nich wiążą się jednak z oddzieleniem naskórka od ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6418
Etanol 96% (nieskażony)	Dostawa chemiczna	UN1170
Nil Red	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiamina	Merck Millipore	821940
Eter mono-p-izooktylofenylowy glikolu polietylenowego	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
Optymalna temperatura skrawania (OCT)	Compound Tissue-Tek	4583
przeciwciało anty-Keratynę14	Przeciwciało anty-Ki67 Covance	PRB-155P
	Abcam	ab16667
Osioł anty-królik Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	D2650
Mocznik	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-nitrilotriethanol	Merck Millipore	137002
Mikroskop konfokalny	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Mikroskop
cruZer6 Trymer do twarzy	Braun	Braun cruZer6 Azydek
	Sigma-Aldrich