Artykuł metodologiczny

Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54410

⸱

5 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje zastosowanie nieukierunkowanej metabolomiki, transkryptomiki i wielowymiarowej analizy statystycznej do transkryptów i metabolitów z jagód winogron w celu uzyskania wglądu w koncepcję terroir, tj. wpływ środowiska na cechy jakości jagód.

Streszczenie

Terroir odnosi się do kombinacji czynników środowiskowych, które wpływają na cechy upraw, takich jak winorośl (Vitis vinifera) zgodnie z określonymi siedliskami i praktykami zarządzania. W tym artykule pokazano, w jaki sposób można wykryć pewne sygnatury terroir w metabolomie i transkryptomie jagód odmiany winorośli Corvina za pomocą wielowymiarowej analizy statystycznej. Metoda wymaga najpierw odpowiedniego planu pobierania próbek. W tym studium przypadku wybrano konkretny klon odmiany Corvina w celu zminimalizowania różnic genetycznych, a próbki pobrano z siedmiu winnic reprezentujących trzy różne makrostrefy podczas trzech różnych sezonów wegetacyjnych. Ze względu na wysoką czułość, zalecane jest podejście metabolomiczne oparte na nieukierunkowanym LC-MS, któremu towarzyszy wydajne przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania MZmine oraz strategia identyfikacji metabolitów oparta na analizie drzewa fragmentacji. Kompleksową analizę transkryptomu można uzyskać za pomocą mikromacierzy zawierających sondy pokrywające ~99% wszystkich przewidywanych genów winorośli, co pozwala na jednoczesną analizę wszystkich genów o zróżnicowanej ekspresji w kontekście różnych terroir. Wreszcie, wielowymiarowa analiza danych oparta na metodach projekcji może być wykorzystana do przezwyciężenia silnego efektu specyficznego dla rocznika, umożliwiając integrację i szczegółową analizę danych metabolomicznych i transkryptomicznych w celu zidentyfikowania korelacji informacyjnych.

Wprowadzenie

Analiza danych na dużą skalę oparta na genomach, transkryptomach, proteomach i metabolomach roślin dostarcza bezprecedensowego wglądu w zachowanie złożonych systemów, takich jak cechy terroir wina, które odzwierciedlają interakcje między roślinami winorośli a ich środowiskiem. Ponieważ terroir wina może być odrębny nawet wtedy, gdy identyczne klony winorośli są uprawiane w różnych winnicach, analiza genomiczna jest mało przydatna, ponieważ genomy klonów są identyczne. Zamiast tego konieczne jest przyjrzenie się korelacjom między ekspresją genów a właściwościami metabolicznymi jagód, które decydują o cechach jakościowych wina. Analiza ekspresji genów na poziomie transkryptomu korzysta z podobnych właściwości chemicznych wszystkich transkryptów, co ułatwia analizę ilościową poprzez wykorzystanie uniwersalnych cech, takich jak hybrydyzacja do unieruchomionych sond na mikromacierzach. Natomiast uniwersalne metody analityczne w proteomice i metabolomice są trudniejsze ze względu na ogromną różnorodność fizyczną i chemiczną poszczególnych białek i metabolitów. W przypadku metabolomiki ta różnorodność jest jeszcze bardziej ekstremalna, ponieważ poszczególne metabolity różnią się znacznie pod względem wielkości, polarności, obfitości i lotności, więc żaden pojedynczy proces ekstrakcji ani metoda analityczna nie oferuje holistycznego podejścia.

Wśród platform analitycznych odpowiednich dla metabolitów nielotnych, te oparte na wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (HPLC-MS) są znacznie bardziej czułe niż alternatywy, takie jak HPLC z detektorami ultrafioletowymi lub diodowymi (HPLC-UV, HPLC-DAD) lub spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), ale na analizę ilościową za pomocą HPLC-MS mogą wpływać takie zjawiska jak efekt matrycy i tłumienie/wzmacnianie jonów1-3. Badanie takich skutków podczas analizy jagód winogron Corvina za pomocą HPLC-MS przy użyciu źródła jonizacji elektrorozpylania (HPLC-ESI-MS) wykazało, że cukry i inne cząsteczki o najniższych czasach retencji były silnie zaniżone, co prawdopodobnie odzwierciedlało również dużą liczbę cząsteczek w tej strefie, oraz że obfitość innych cząsteczek może być niedoszacowana, przeszacowana lub niezależna od efektu matrycy, Jednak normalizacja danych dla efektu macierzy wydawała się mieć ograniczony wpływ na ogólne wyniki4,5. Opisana w niniejszym dokumencie metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy metabolitów o średniej polarności, które gromadzą się w dużych stężeniach w jagodach winogron podczas dojrzewania i na które terroir ma znaczący wpływ. Należą do nich antocyjany, flawonole, flawan-3-ole, procyjanidyny, inne flawonoidy, resweratrol, stylbeny, kwasy hydroksycynamonowe i kwasy hydroksybenzoesowe, które razem decydują o barwie, smaku i właściwościach zdrowotnych win. Inne metabolity, takie jak cukry i alifatyczne kwasy organiczne, są ignorowane, ponieważ oznaczanie ilościowe za pomocą HPLC-MS jest niewiarygodne ze względu na efekt matrycy i zjawiska supresji jonów5. W zakresie polaryzacji wybranym tą metodą podejście to jest nieukierunkowane, ponieważ ma na celu wykrycie jak największej liczby różnych metabolitów6.

Metody transkryptomiczne, które pozwalają na jednoczesne monitorowanie tysięcy transkryptów winorośli, są ułatwione dzięki dostępności kompletnej sekwencjigenomu winorośli 7,8. Wczesne metody transkryptomiczne oparte na wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu cDNA ewoluowały wraz z nadejściem sekwencjonowania nowej generacji w zbiór procedur określanych zbiorczo jako technologia sekwencjonowania RNA. Podejście to szybko staje się metodą z wyboru w badaniach transkryptomicznych. Jednak duża literatura oparta na mikromacierzach, która pozwala na równoległe ilościowe oznaczanie tysięcy transkryptów przez hybrydyzację, zgromadziła się dla winorośli. Rzeczywiście, zanim sekwencjonowanie RNA stało się główną technologią, opracowano wiele dedykowanych komercyjnych platform mikromacierzy, które umożliwiały bardzo szczegółowe badanie transkryptomu winorośli. Spośród ogromnej różnorodności platform, tylko dwie umożliwiały analizę transkryptomu całego genomu9. Najbardziej rozwinięta matryca pozwoliła na hybrydyzację do 12 niezależnych próbek na jednym urządzeniu, zmniejszając w ten sposób koszty każdego eksperymentu. Każdy z 12 podukładów składał się z 135 000 60-merowych sond reprezentujących 29 549 transkryptów winorośli. To urządzenie było używane w wielu badaniach10-24. Te dwie platformy zostały obecnie wycofane z produkcji, ale niedawno zaprojektowano nową, niestandardową mikromacierz, która stanowi nowsze osiągnięcie, ponieważ zawiera jeszcze większą liczbę sond reprezentujących dodatkowe nowo odkryte geny winorośli25.

Duże zbiory danych uzyskane przez transkryptomikę i analizę metabolomiczną wymagają odpowiednich metod statystycznych do analizy danych, w tym technik wielowymiarowych do określania korelacji między różnymi formami danych. Najpowszechniej stosowanymi technikami wielowymiarowymi są techniki oparte na projekcji, które mogą być nienadzorowane, takie jak analiza głównych składowych (PCA), lub nadzorowane, takie jak dwukierunkowa analiza dyskryminacyjna z rzutowania ortogonalnego na struktury utajone (O2PLS-DA)26. Protokół przedstawiony w tym artykule wykorzystuje PCA do eksploracyjnej analizy danych oraz O2PLS-DA do identyfikacji różnic między grupami próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wybór odpowiednich materiałów i opracowanie planu pobierania próbek

  1. Rozpocznij eksperyment od opracowania odpowiedniego planu pobierania próbek. Nie istnieje podejście generyczne i uniwersalne, dlatego każdy plan należy oceniać indywidualnie. Upewnij się, że plan pobierania próbek określa miejsca, czasy oraz precyzyjną procedurę pobierania. Plan pobierania próbek zastosowany w niniejszym studium przypadku przedstawiono na Rysunku 1.
    UWAGA: W niniejszym studium przypadku jagody winogron z jednego klonu (Vitis vinifera cv. Corvina, klon 48) zostały zebrane z siedmiu komercyjnych winnic w trzech różnych makrostrefach w prowincji Werona (jezioro Garda, Valpolicella i Soave). Główne cechy każdej winnicy podsumowano w Tabeli 1. Jagody zbierano podczas trzech sezonów wegetacyjnych (2006, 2007 i 2008) w trzech punktach czasowych, odpowiadających veraison (początkowi dojrzewania), połowie okresu dojrzewania oraz pełnej dojrzałości jagód.
    1. Dla każdego z dostępów (winnica/rok/etap dojrzewania) zbierz 30 gron z różnych pozycji wzdłuż dwóch rzędów winorośli, z randomizacją wysokościy i lokalizacji na roślinie.
    2. Wybierz losowo trzy jagody z każdego grona, unikając tych z widocznymi uszkodzeniami i/lub oznakami infekcji.
    3. Powtórz kroki 1.1.1 i 1.1.2, aby uzyskać trzy niezależne pule.
    4. Usuń nasiona z jagód i natychmiast zamroź okrycie nasienną w ciekłym azocie.
    5. Rozdrobnij 10 zamrożonych jagód z każdej puli za pomocą automatycznej młynki-rozdrabniarki i podziel każdą sproszkowaną próbkę na dwie równe części: jedną do analizy transkryptomicznej, a drugą do analizy metabolomicznej.
    6. Przechowuj proszki w temperaturze -80 °C.
AMBABMCSFAMNPM
MakrostrefaSoaveJezioro GardaValpolicellaJezioro GardaValpolicellaValpolicellaSoave
Wysokość (m)250120450100130250130
Podkładka41BS04K5BB420A420AK5BB41B
Kierunek rzędówE-WN-SE-WE-WE-WN-SN-S
System prowadzeniaSystem nadziemny (Pergola)System nadziemny (Pergola)Pionowe prowadzenie pędów (Guyot)System nadziemny (Pergola)System nadziemny (Pergola)Pionowe prowadzenie pędów (Guyot)Pionowe prowadzenie pędów (Guyot)
Typ glebyGleba gliniasto-ilastaGleba gliniastaGleba ilastaGleba gliniastaGleba gliniasto-ilastaGleba piaszczysto-gliniastaGleba gliniasto-ilasta
Układ sadzenia (m)3.20 x 1.004.50 x 0.804.00 x 1.253.50 x 1.203.50 x 0.752.80 x 1.001.80 x 0.80
Całkowita zawartość wapnia %3.919.318.314.4315.927.9
Wapń aktywny %0.52.69.46.311.33.18.3
Piasek %15476642291336
Glina %43362137396736
Ił %42171321322028
pH gleby8.37.97.88.28.27.87.9
Substancja organiczna (%)2.92.52.21.22.91.62.5
Fosfor wymienny (mg/kg)26737368484764
Potas wymienny (mg/kg)190376620230168154126
Magnez wymienny (mg/kg)272468848623294293183
Wapń wymienny (mg/kg)65005380735863464652100552878
Cukry redukujące w owocach 2006211.25 ± 1.20176.20 ± 0.42187.40 ± 0.00203.70 ± 1.13212.55 ± 0.64195.20 ± 0.00211.65 ± 0.64
Cukry redukujące w owocach 2007190.00 ± 1.27165.25 ± 0.49153.00 ± 0.42203.60 ± 0.71210.90 ± 0.71192.25 ± 0.64188.70 ± 1.84
Cukry redukujące w owocach 2008191.35 ± 0.64178.90 ± 0.57170.05 ± 0.49205.15 ± 1.48188.70 ± 0.57169.35± 0.49108.05 ± 1.06
pH owoców 20063.01 ± 0.012.96 ± 0.012.84 ± 0.002.9 ± 0.002.98 ± 0.003.02 ± 0.003.06 ± 0.01
pH owoców 20072.97 ± 0.003.00 ± 0.002.74 ± 0.003.07 ± 0.012.98 ± 0.002.87 ± 0.013.09 ± 0.00
pH owoców 20082.83 ± 0.003.04 ± 0.012.71 ± 0.002.98 ± 0.012.98 ± 0.002.82 ± 0.003.11 ± 0.00
Data zbioru200620072008
Veraison (zmiana barwy)8-sier18-lip12-sier
Środek dojrzewania4-wrze8-sier2-wrze
Pełna dojrzałość18-wrze29-sier23-wrze

Tabela 1: Główne cechy poszczególnych winnic i daty pobierania próbek. m = metry, E-W = wschód-zachód, N-S = północ-południe.
Schemat procesu pobierania próbek winogron: winnice, etapy dojrzewania, wybór jagód w ciągu trzech sezonów.
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie procedury pobierania próbek. Trzy makrostrefy produkcji wina znajdują się w okolicach miasta Werona w regionie Veneto we Włoszech. Trzy punkty czasowe to veraison (V), reprezentujące początek dojrzewania w uprawie winorośli, środek okresu dojrzewania (MR) oraz jagody dojrzałe (R). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie ekstraktów z proszku z jagód, analiza metabolitów i przetwarzanie danych

  1. Przygotowanie próbek proszku z jagód do analizy.
    1. Przygotować ekstrakty metaboliczne z próbek jagód w temperaturze pokojowej, stosując trzy objętości (w/v) metanolu zakwaszonego 0,1% (v/v) kwasem mrówkowym, w kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kHz przez 15 min. Należy użyć wody i kwasu mrówkowego klasy LC-MS oraz metanolu klasy HPLC.
    2. Odwirować ekstrakty z prędkością 16 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    3. Rozcieńczyć supernatant z kroku 2.1.2 w dwóch objętościach (v/v) wody dejonizowanej i przefiltrować przez filtr 0,2 µm.
  2. Analiza ekstraktów z jagód metodą HPLC-ESI-MS.
    1. Skonfigurować system HPLC-ESI-MS zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: W niniejszym studium przypadku konfiguracja obejmowała system HPLC wyposażony w autosampler, połączony szeregowo ze spektrometrem mas z pułapką jonową i źródłem jonizacji przez rozpylanie elektryczne.
    2. Podłączyć do systemu HPLC kolumnę przedkolumnową C18 (7,5 x 2,1 mm2) oraz kolumnę C18 w odwróconej fazie (150 x 2,1 mm2, wielkość cząstek 3 µm).
    3. Przygotować rozpuszczalniki używane jako fazę ruchomą. Jako rozpuszczalnik A zastosować 5% (v/v) acetonitrylu i 0,5% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie, a jako rozpuszczalnik B 100% acetonitryl. Należy użyć acetonitrylu, wody i kwasu mrówkowego klasy LC-MS.
    4. Przeprowadzić rozdział HPLC z liniowym gradientem rozpuszczalników A i B przy stałym przepływie 0,2 ml min-1, stosując objętość wtrysku próbki 30 µl.
      1. Wstępnie zrównoważyć kolumnę 100% rozpuszczalnikiem A. Po wtrysku próbki wprowadzić gradient od 0% do 10% rozpuszczalnika B w ciągu 5 min, od 10% do 20% rozpuszczalnika B w ciągu 20 min, od 20% do 25% rozpuszczalnika B w ciągu 5 min oraz od 25% do 70% rozpuszczalnika B w ciągu 15 min.
      2. Każdą próbkę analizować w dublecie. Kolejność analizy próbek należy zrandomizować, aby uniknąć efektów wynikających z pracy instrumentu. Między poszczególnymi analizami pozostawić 20 min na ponowne zrównoważenie kolumny 100% rozpuszczalnikiem A.
    5. Rejestrować widma mas w naprzemiennych trybach jonizacji ujemnej i dodatniej. Dla wyników opisanych w niniejszym studium przypadku ustawić parametry zgodnie z Tabelą 2. Dokładne ustawienia urządzenia zależą od konkretnej platformy.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować inne odpowiednie metody, zależnie od konkretnej platformy.
      1. W każdym przypadku, jak przy każdej platformie rozdziału, należy zapewnić odpowiedni czas ponownego zrównoważenia, aby uzyskać powtarzalność czasu retencji. Przy dużej liczbie próbek (powyżej dziesięciu) analizować je w partiach po 9-10 próbek, stosując programy czyszczenia kolumny chromatograficznej (powolne gradienty między dwoma rozpuszczalnikami elucyjnymi) pomiędzy każdą partią. Aby zapewnić wystarczającą powtarzalność czasu retencji, pierwsza analiza chromatograficzna każdej partii powinna być analizą ślepą (t.j. analizą rozpuszczalnika).
    6. Rejestrować również widma mas w trybach fragmentacji jonów ujemnych i dodatnich, ustawiając opcje fragmentacji (dwa jony prekursorowe, MS3). Adnotować metabolity poprzez analizę drzewa fragmentacji (MS/MS i MS3) zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Jest to szczególnie przydatne w przypadku metabolitów roślinnych, ponieważ są one często glikozylowane, w związku z czym pierwsza fragmentacja (MS/MS) ma tendencję do usuwania reszt cukrowych, pozostawiając wolny jon aglikonu, a kolejna fragmentacja (MS3) pomaga zidentyfikować aglikon w oparciu o bibliotekę wzorców autentycznych.
    7. Rejestrować widma MS/MS i MS3 w zakresie m/z 50-1 500 z amplitudą fragmentacji 1 V. Alternatywnie można zastosować inne odpowiednie metody, zależnie od konkretnej platformy.
    8. Dla każdego sygnału m/z porównać wzorce fragmentacji MS/MS i MS3 oraz czasy retencji z biblioteką wzorców autentycznych zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Wiele platform posiada funkcje programowe umożliwiające budowanie tego typu bibliotek poprzez analizę wzorców autentycznych. Powinno to pozwolić na identyfikację wielu sygnałów, jednak nie wszystkie zostaną adnotowane.
    9. W przypadku pozostałych niezidentyfikowanych sygnałów porównać wzorce fragmentacji MS/MS i MS3 z tymi opublikowanymi w literaturze, wyszukując wartości m/z (t.j. wpisując „m/z 353”, aby znaleźć publikacje, w których wspomniano o cząsteczkach o takim m/z) w dowolnej z powszechnie dostępnych wyszukiwarek lub korzystając z baz danych online, takich jak MassBank (www.massbank.jp/en/database.html) i Human Metabolome Database (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
Komponenty spektrometru masFunkcjaParametry
Źródło jonizacji przez rozpylanie elektrostatyczneGaz nebulizujący50 psi, 350 °C
Gaz osuszający10 L/min-1
Pułapka jonowa i detektorSkanowanieTryb pełnego skanowania, 13 000 m/z na sekundę, zakres 50–1500 m/z
Masa docelowa400 m/z
Gaz zderzeniowyHel
Ciśnienie próżniowe1,4 x 10-5 mbar
Źródło kapilarne +4 000 V
Przesunięcie płyty końcowej -500 V
Zbieracz zanieczyszczeń powierzchniowych -40 V
Wyjście nakrętki -121 V
1 października DC -12 V
2 października DC -1,7 V
Soczewka 1 +5 V
Soczewka 2 +60 V
ICC dla trybu jonizacji dodatniej20.000
ICC dla trybu ujemnej jonizacji7,000

Tabela 2:​ Główny zestaw parametrów dla pozyskiwania widm masowych.

OperacjaWybórFunkcjaParametryWartości
Detekcja pikuDetekcja masyCentroidPoziom szumu3,500
Kreator chromatogramuNajwyższy punkt danychmin. przedział czasowy0.15
min. wysokość4,000
tolerancja m/z0.3
Detekcja pikuDekonwolucja pikuWyszukiwanie lokalnego minimumPróg chromatograficzny70
Wyszukiwanie minimum w zakresie RT (min)0:50
Minimalna wysokość względna15%
Minimalna wysokość bezwzględna4,000
Min. stosunek szczytu/krawędzi piku2
Zakres czasu trwania (min)0-10
IzotopyGrupowanie pików izotopowych -tolerancja m/z1.2
tolerancja RT0:50
kształt monotonicznyNie
Maksymalny ładunek3
Izotop reprezentatywnyNie
WyrównanieWyrównywacz łączący -tolerancja m/z1.2
Waga dla m/z10
Tolerancja czasu retencji0:50
Waga dla RT5
Wymagaj tego samego stanu ładunkuNie
Wymagaj tego samego IDNie
Porównaj wzorzec izotopowyNie
Wypełnianie lukWyszukiwarka pików -Tolerancja intensywności20%
tolerancja m/z0.9
Tolerancja czasu retencji0:40
Korekcja RTNie
FiltrowanieFiltr duplikujących się pików -tolerancja m/z1.2
tolerancja RT0:30
Wymagaj tej samej identyfikacjiNie

Tabela 3: Przepływ pracy w programie Mzmine z konkretnymi wartościami do przetwarzania plików danych LC-MS jagód winogron w trybie ujemnym.

  1. Przetwarzanie danych LC-MS.
    1. Uzyskaj dostęp lub pobierz pakiet oprogramowania do przetwarzania danych, który pozwala na wyodrębnienie istotnych informacji z wielu surowych chromatogramów i zbudowanie macierzy danych, w której każdy wykryty metabolit jest ilościowo określony w każdej próbce.
      UWAGA: Poniższe kroki protokołu zostały dostosowane do otwartoźródłowego oprogramowania MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net). Jest to oprogramowanie typu open-source do przetwarzania danych z spektrometrii mas, skupiające się głównie na danych LC-MS.27
    2. Przekształć dane chromatogramu LC-MS do formatu netCDF, korzystając z oprogramowania dostarczonego przez producenta sprzętu. W przypadku wyników opisanych w niniejszym opracowaniu użyj oprogramowania Bruker Daltonics Esquire v5.2 oraz Data Analysis v3.2 i wykonaj kroki zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Można użyć innych konwerterów (dostępnych jest wiele darmowych konwerterów).
    3. Zaimportuj pliki .cdf do oprogramowania.
    4. Zaimplementuj procedury detekcji pików, dopasowania, uzupełniania luk i filtrowania pików z parametrami podanymi w Tabeli 3.
      1. W pierwszym kroku wybierz zaimportowany plik .cdf, następnie przejdź do Visualization → TIC/XIC Visualizer. Umieść kursor u podstawy najmniejszego piku na chromatogramie i zanotuj minimalną intensywność sygnału jonu podstawowego. Następnie przejdź do Raw Data Methods → Peak Detection.
      2. Wybierz Mass Detection i wprowadź poziom sygnału w celu detekcji poszczególnych jonów dla każdego skanu i utworzenia listy jonów.
        UWAGA: Przed wykonaniem detekcji masy sprawdź algorytm – zależy on od spektrometru mas. W naszym przypadku wybieramy Centroid.
      3. Wybierz Chromatogram Builder i wprowadź poziom sygnału, aby połączyć punkty danych z listy jonów i zbudować chromatogram dla każdej wartości masy. W celu dostosowania parametrów Min Time Span oraz tolerancji m/z zapoznaj się z instrukcją obsługi spektrometru mas.
      4. Następnie przejdź do Peak List Methods → Peak Detection → Chromatogram Deconvolution. Wybierz odpowiedni algorytm (w tym przypadku Local Minimum Search), aby umożliwić rozdzielenie każdego chromatogramu na poszczególne piki.
      5. Przeanalizuj manualnie chromatogramy, aby ustalić odpowiednie wartości dla następujących parametrów. Ustaw Chromatographic Threshold na 30%, aby usunąć szum, oraz Search Minimum in RT Range na 2 (min), aby zidentyfikować obecność minimów lokalnych w celu rozróżnienia dwóch pików.
      6. Ustaw Minimum Relative Height na 2.0. Przeanalizuj manualnie chromatogram, aby zidentyfikować minimalną absolutną wysokość sygnału, która odpowiada piku, a nie tłu; ustaw tę wartość jako Absolute Height (na przykład 10 000 w przedstawionym eksperymencie).
      7. Ustaw Min Ratio of Peak Top/Edge na 1.1, aby określić minimalny stosunek intensywności szczytu i najniższego punktu danych piku, który ma zostać rozpoznany jako prawdziwy pik.
      8. Przeanalizuj manualnie chromatogramy, aby sprawdzić, jaki jest minimalny czas trwania poszczególnych pików w zastosowanych warunkach chromatograficznych (na przykład od 0,2 do 2 min, w zależności od związku, w przedstawionych eksperymentach), a następnie użyj tych wartości jako Peak Duration Range (min), aby ustawić zakres dopuszczalnej długości piku jako czasu trwania.
      9. Następnie przejdź do Peak List Methods → Isotopes → Isotopic Peaks Grouper, aby zgrupować izotopy w jednym piku, zazwyczaj w najbardziej intensywnym. Uwaga: Parametry zależą od rozdzielczości spektrometru mas i powtarzalności czasów retencji.
      10. Na koniec przejdź do Peak List Methods → Alignment → Join Aligner, aby dopasować piki w zależności od ich m/z i czasu retencji, korzystając z wyniku dopasowania (match score).
    5. Po dopasowaniu pików uzupełnij wszelkie luki w danych, klikając Peak List Methods → Gap Filling → Peak Finder. Na koniec odfiltruj powielone punkty danych, klikając Peak List Methods → Filtering → Duplicate Peak Filter.
    6. Wyeksportuj wynikowy zbiór danych jako plik .csv.
    7. Ręcznie zmień rozszerzenie .csv na rozszerzenie .txt. Jeśli rozszerzenia plików nie są widoczne, zmień ustawienia komputera, aby je wyświetlić. Przejdź do Opcje Eksploratora plików → Widok → Ustawienia zaawansowane i odznacz pole „Ukryj rozszerzenia dla znanych typów plików”.
    8. Zaimportuj pliki .txt do arkusza kalkulacyjnego. Pozwoli to utworzyć macierz danych, w której wszystkie wykryte metabolity, rozpoznane po numerze identyfikacyjnym, wartości m/z i czasie retencji, są ilościowo określone we wszystkich próbkach pod kątem wartości pola piku.

3. Przygotowanie ekstraktów z proszku z owoców jagodowych do analizy transkryptomu i przetwarzanie danych

  1. Izolacja całkowitego RNA z próbek jagód i ocena jakości RNA.
    1. Izolacja całkowitego RNA z próbek jagód.
      UWAGA: W niniejszym studium przypadku zastosowano zestaw handlowy i zmodyfikowaną procedurę zapewniającą całkowite usunięcie cząsteczek utrudniających analizę RNA, takich jak polisacharydy i polifenole. Poniższe instrukcje są specyficzne dla tego zestawu18.
      1. Odważyć 400 mg proszku z jagód dla każdej próbki, podzielić go na dwie porcje i umieścić po 200 mg w dwóch probówkach do mikrocentryfugi.
      2. Do każdych 200 mg proszku dodać 900 µl roztworu lizującego zawierającego β-merkaptoetanol (dołączonego do zestawu), a następnie natychmiast i energicznie mieszać na wortexie przez co najmniej 30 s. Inkubować próbkę w temperaturze 56 °C przez 5 min, wstrząsając z prędkością 800 rpm.
      3. Odwirować próbki z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze stołowej przez 10 min, aby wytrącić resztki komórkowe.
      4. Przenieść 700 µl supernatantu do kolumny filtracyjnej dołączonej do zestawu (niebieski pierścień mocujący) umieszczonej w probówce zbierającej o pojemności 2 ml. Zamknąć nakrętką i odwirować z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze stołowej przez 1 min, aby usunąć resztkowe zanieczyszczenia. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, używając tej samej kolumny filtracyjnej, ale nowej probówki zbierającej, co pozwoli uzyskać trzy probówki zawierające każda ok. 700 µl oczyszczonego lizatu.
      5. Do każdej probówki z oczyszczonym lizatem wpipetować 750 µl roztworu wiążącego (dołączonego do zestawu) i natychmiast wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy. Przenieść 700 µl tej mieszaniny do kolumny wiążącej dołączonej do zestawu (czerwony pierścień mocujący) umieszczonej w probówce zbierającej o pojemności 2 ml. Zamknąć nakrętką i odwirować z maksymalną prędkością w mikrocentryfudze stołowej przez 1 min, aby związać RNA.
      6. Odlać frakcję przepuszczoną, odwrócić probówkę zbierającą i lekko uderzyć nią o czysty arkusz papieru chłonnego, aby odprowadzić resztkę cieczy.
      7. Włożyć kolumnę z powrotem do probówki zbierającej, wpipetować pozostałą mieszaninę do tej samej kolumny i powtórzyć kroki wirowania oraz odlewania. Powtarzać do czasu przefiltrowania całej mieszaniny przez tę samą czerwoną kolumnę wiążącą.
      8. Następnie postępować zgodnie z pozostałymi instrukcjami zawartymi w zestawie, eluować RNA w 50 µl buforu elucyjnego (dołączonego do zestawu) i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia kroków kontroli jakości.
    2. Określić ilość i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Zapisać stosunki absorbancji, które wskazują na stopień zanieczyszczenia białkami (A260/280) oraz polifenolami/polisacharydami (A260/230).
      UWAGA: RNA odpowiednie do hybrydyzacji na mikromacierzach powinno osiągać wynik co najmniej 1,8 dla obu stosunków.
    3. Ocenić integralność RNA.
      UWAGA: Można zastosować różne systemy. W niniejszym studium przypadku użyto cyfrowego akwizytora wykonującego elektroforezę kapilarną w połączeniu z barwnikiem fluorescencyjnym. RNA odpowiednie do hybrydyzacji na mikromacierzach powinno mieć wskaźnik RIN (RNA Integrity Number) na poziomie co najmniej 8.
  2. Przygotowanie próbek i hybrydyzacja RNA z niestandardową mikromacierzą.
    1. Ustawić początkową ilość całkowitego RNA do analizy mikromacierzowej na 200 ng, rozcieńczając roztwór RNA otrzymany w kroku 3.1.1.8 dejonizowaną wodą wolną od RNaz. Dodać odpowiednią ilość RNA do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml do uzyskania objętości końcowej 1,5 µl.
    2. Dodać 2 µl rozcieńczonego spike mix do każdej próbki RNA i postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu syntezy pierwszej nici cDNA, transkrypcji do cRNA i znakowania cRNA cyjaniną 3CTP.
    3. Oczyścić znakowane cRNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluować w 30 µl wody wolnej od RNaz.
    4. Określić wydajność i aktywność specyficzną każdego cRNA, zapisując trzy wartości na spektrofotometrze: stężenie barwnika cyjaniny 3 (pmol µl-1), czystość RNA (A260/280) oraz stężenie cRNA (ng µl-1). Użyć wzorów zawartych w instrukcji obsługi producenta, aby obliczyć wydajność cRNA (µg) i aktywność specyficzną (pmol Cy3 na µg cRNA).
      UWAGA: Zalecane wydajności i aktywności specyficzne różnią się w zależności od konkretnego formatu mikromacierzy. W niniejszym studium przypadku wybrano format 4-pack 44K; zalecana wydajność wynosiła 1,65, a aktywność specyficzna 9.
    5. Zaprojektować niestandardową mikromacierz przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do projektowania sond.
      1. W celu uzyskania wyników opisanych w niniejszym studium przypadku przygotować nową niestandardową mikromacierz w formacie 4-pack 44K, korzystając z aplikacji internetowej do projektowania mikromacierzy i bibliotek oligonukleotydów. Zaprojektować sondy pasujące do 34 651 docelowych transkrypcyjnych, w tym 29 971 przewidywanych transkrypcyjnych z macierzy Pinot noir V1, 4 500 nowych loci zidentyfikowanych w odmianie Pinot poprzez rekonstrukcję transkryptomu Corvina oraz 180 prywatnych genów Corvina25.
        UWAGA: Wiązało się to z produkcją 34 651 specyficznych sond 60-merowych, obejmujących 29 798 przewidywanych transkrypcyjnych Pinot noir, 4 392 nowe loci Pinot i 179 prywatnych genów Corvina.
    6. Przygotować zestaw do hybrydyzacji zgodnie ze specyfikacją formatu 4-pack w następujący sposób.
      1. Umieścić 1,65 µg cRNA znakowanego Cy3 w końcowej objętości 41,8 µl dejonizowanej wody wolnej od RNaz. Dodać 11 µl 10x Blocking Agent oraz 2,2 µl 25x Fragmentation Buffer. Inkubować w temperaturze 60°C przez 30 min w kąpieli termostatycznej w celu fragmentacji RNA. Natychmiast schłodzić na lodzie przez 1 min.
      2. Na koniec dodać 55 µl 2x hybridization buffer, dobrze wymieszać za pomocą pipety i wirować przez 1 min przy 15 500 x g w temperaturze pokojowej (RT). Bezwłocznie umieścić probówkę mikrocentryfugową na lodzie. Użyć natychmiast, nie przechowywać.
    7. Załadować niestandardową mikromacierz w następujący sposób.
      1. Umieścić szkiełko z uszczelką etykietą do góry w podstawie komory hybrydyzacyjnej. Powoli nanieść 100 µl próbki do hybrydyzacji uzyskanej w kroku 3.2.6.2 na każdą studzienkę uszczelki, dozując ciecz końcówką pipety, unikając pęcherzyków powietrza.
      2. Powoli położyć niestandardową mikromacierz stroną skierowaną w dół, upewniając się, że numeryczny kod kreskowy jest skierowany do góry. Upewnić się, że kanapkowy układ szkiełek jest prawidłowo wyrównany. Na koniec założyć pokrywę komory hybrydyzacyjnej na zestaw szkiełek i ręcznie dokręcić zacisk komory. Obrócić zmontowaną komorę, aby ocenić ruchomość pęcherzyków powietrza.
    8. Umieścić zmontowaną komorę ze szkiełkami w rotatorze w piecu do hybrydyzacji ustawionym na 65 °C. Ustawić prędkość obrotową rotatora na 10 rpm. Pozostawić do hybrydyzacji na 17 h.
    9. Przeprowadzić przemywanie szkiełka z mikromacierzą w następujący sposób.
      1. Najpierw przygotować trzy kuwety do barwienia szkiełek i napełnić je odpowiednimi buforami do mycia: dwie kuwety buforem Wash Buffer 1 w temperaturze pokojowej (RT) i jedną kuwetą podgrzanym (37 °C) buforem Wash Buffer 2.
      2. Rozmontować komorę hybrydyzacyjną i wyjąć zestaw szkiełek. Z numerycznym kodem kreskowym szkiełka z mikromacierzą skierowanym do góry, zanurzyć zestaw w pierwszej kuwecie wypełnionej buforem Wash Buffer 1 w temperaturze pokojowej i przy pomocy czystej pęsety oddzielić uszczelkę od szkiełka z mikromacierzą. Szybko przenieść szkiełko z mikromacierzą do statywu i umieścić w drugiej kuwecie wypełnionej buforem Wash Buffer 1 w temperaturze pokojowej.
      3. Postawić kuwetę na mieszalniku magnetycznym i myć przez 1 min przy umiarkowanym mieszaniu. Szybko przenieść statyw do trzeciej kuwety wypełnionej podgrzanym (37 °C) buforem Wash Buffer 2 i myć przez 1 min przy umiarkowanym mieszaniu.
      4. Powoli wyjąć statyw z kuwety i ostrożnie wyjąć szkiełko ze statywu, unikając powstawania kropel.
        UWAGA: Nie dodawać Triton X-102 do buforów do mycia i pominąć etapu mycia acetonitrylem.
    10. Przechowywać umyte chipy w ciemności w temperaturze pokojowej.
  3. Skanowanie mikromacierzy i ekstrakcja istotnych cech.
    1. Umieścić szkiełko z mikromacierzą w odpowiednim skanerze i zeskanować każdą macierz, korzystając z ustawień parametrów zalecanych w instrukcji obsługi producenta mikromacierzy. W celu uzyskania opisanych tutaj wyników każde szkiełko z mikromacierzą umieszczono w uchwycie (Slide Holder), aby ułatwić procedurę skanowania.
    2. Zaimportować wyjściowy plik .shp do odpowiedniego oprogramowania zdolnego przekształcić sygnał cyfrowy w numeryczne wartości fluorescencji. Sprawdzić raport kontroli jakości, aby upewnić się, że procedura hybrydyzacji przebiegła pomyślnie.
      1. W przypadku wyników opisanych tutaj zastosowano ustawienia parametrów zalecane w instrukcji obsługi oprogramowania do ekstrakcji cech i sprawdzono raport kontroli jakości, aby upewnić się, że parametry wymienione w Tabeli 4 mieszczą się w normalnym zakresie podanym przez producenta.
Nazwa wskaźnika Górna granicaDolna granicaOpis
AnyColorPrcntFeatNonUnif1.00NDProcent cech, które są wartościami odstającymi pod względem niejednorodności cech w którymkolwiek z kanałów
granica wykrywalności 2.000.10Średnia plus 1 odchylenie standardowe dla dodatków wewnętrznych poniżej liniowego zakresu stężeń
nachylenieAbsGE1E1a 1.200.90Wartość bezwzględna nachylenia dopasowania dla sygnału w funkcji stężenia sond E1a
MedCVProcSignal 8.00NDMediana %CV dla sygnału przetworzonego
gSredniaSygnałuujemnejKontroliPoOdjęciuTła5.00-10.00Średnia wartość sygnału po odjęciu tła dla wszystkich prawidłowych kontroli negatywnych (BGSubSignal jest obliczane poprzez odjęcie wartości BGUsed od średniego sygnału cechy)
gNegCtrlAveNetSig 40.00N/DŚrednia wartości sygnału netto wszystkich prawidłowych kontroli negatywnych
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00NDOdchylenie standardowe sygnałów po odjęciu tła dla wszystkich prawidłowych kontroli negatywnych
SygnałPrzetwProcCVMedKontrolaNiegenowa 8.00Brak danychMediana %CV dla przetworzonego sygnału sond niekontrolnych 
gSpatialDetrendRMSFilter15.00NDRezyduum dopasowania detrendingu tła

Tabela 4: Główne parametry należy sprawdzić w celu weryfikacji jakości hybrydyzacji mikromacierzy.

  1. Przetwarzanie danych z mikromacierzy.
    1. Po zeskanowaniu wszystkich szkiełek z mikromacierzami i pozytywnej ocenie kontroli jakości, przygotuj macierz danych rozdzieloną tabulatorami, wybierając wartości gProcessedSignal z każdego pojedynczego pliku wyników podmacierzy, które reprezentują surowe intensywności fluorescencji każdej sondy.
    2. W arkuszu kalkulacyjnym znormalizuj dane względem 75.th percentyla w obrębie każdej macierzy (wartości P) i oblicz średnią wszystkich wartości P pomiędzy wszystkimi różnymi podmacierzami, aby wyznaczyć współczynnik R.
    3. Następnie, w tym samym arkuszu, znormalizuj każdą wartość gProcessedSignal do współczynnika R właściwego dla danej podmacierzy.

4. Przeprowadzenie szczegółowej analizy statystycznej danych metabolomicznych i transkrypcyjnych

  1. Przygotuj oprogramowanie do analizy statystycznej.
    UWAGA: W niniejszym studium przypadku wykorzystano oprogramowanie umożliwiające przeprowadzenie analiz PCA, PLS-DA oraz O2PLS-DA.
    1. Zaimportuj dane metabolomiczne i transkryptomiczne. Przejdź do File → New Regular Project → New Regular Project, aby zaimportować macierz danych uzyskanych za pomocą oprogramowania MZmine. Następnie kliknij Edit → Transpose the whole matrix → Home, przypisz odpowiednie identyfikatory Primary i Secondary ID, a następnie kliknij Finish.
    2. Wykonaj centrowanie danych względem średniej i przeskaluj je, stosując skalowanie Pareta. W oknie Home przejdź do Edit → M1 i zmień odpowiednie parametry w zależności od danych. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, zmień opcję Scale z Unit Variance na Par.
    3. Skaluj dane transkryptomiczne, korzystając z ustawienia Unit Variance.
  2. Przeprowadź wielowymiarową analizę statystyczną.
    1. Zaimplementuj PCA zgodnie z przedstawionym w FRysunek 2W niniejszym studium przypadku analiza PCA ujawnia główne różnice między próbkami, odzwierciedlające różne stadia dojrzewania oraz sezony wegetacyjne.
      1. W oknie Workset wybierz PCA-X jako typ modelu. Naciśnij Autofit. Zwróć uwagę na wartości R2X(cum) i Q2(cum), ponieważ pozwalają one ocenić jakość modelu.
        UWAGA: Zazwyczaj im wyższe wartości, tym lepszy model, jednak modele z bardzo wysoką wartością R2X(cum) mogą wykazywać przeuczenie (over-fitting) danych. Zgodnie z zasadą empiryczną, dodawanie głównych komponentów przerywamy w momencie, gdy wartość Q2(cum) zaczyna spadać.
      2. Następnie wybierz Scores → Scatter, aby wyświetlić wykres obrazujący możliwe grupowanie próbek.
      3. Przeanalizuj wykres wyników PCA (PCA Score Plot). Jeśli uzyskano dobry model (Q2cum >0,5), należy wykorzystać te same klasy próbek do zbudowania modelu O2PLS-DA (krok 4.2.2).
    2. Opracuj dwa modele O2PLS-DA, wykorzystując próbki sklasyfikowane według makrostref, a następnie zwaliduj modele za pomocą testu permutacyjnego z 200 permutacjami.
      1. Przypisz klasy, przechodząc do okna Home → New As → M1 → Observations. Ustaw żądane klasy. Następnie zmień Model Type z PCA-X na O2PLS-DA. Naciśnij Autofit. Upewnij się, że liczba komponentów modelu PLS-DA jest taka sama jak w modelu O2PLS-DA.
      2. Aby zwalidować model O2PLS-DA, należy przejść do Analyze CV-ANOVA i sprawdzić wartość p po prawej stronie. Następnie w oknie Home należy kliknąć New As → M2 i zmienić Model Type z O2PLS-DA na PLS-DA. Następnie należy nacisnąć Autofit.
      3. Przejdź do Analyze → Permutations i wykonaj 200 permutacji (odznacz opcję Recalculate Permutations).
        Uwaga: Wynik końcowy przedstawia okno, w którym wartość R2 powinna zazwyczaj przecinać oś Y w wartościach poniżej 0,4, natomiast wartość Q2 powinna przecinać ujemną część osi Y. Jeśli wartości R2 i/lub Q2 są nieprawidłowe, należy zmniejszyć liczbę komponentów zarówno w modelu PLS-DA, jak i O2PLS-DA.
      4. W oknie projektu (Project Window) należy wybrać M2, a następnie kliknąć Scores → Scatter, aby wyświetlić wykres oraz położenie klas próbek. Aby sprawdzić, jakie metabolity charakteryzują jedną lub więcej konkretnych klas, należy przejść do Plot/List → Scatter.
      5. Zmień Select Data Type na Observations and Loadings → Add Series, a następnie zmień Item in X-Axis i Series odpowiednio na pq(corr) oraz Pred Comp na 1 i 2 lub kolejne komponenty, jeśli są dostępne.
      6. Klikając prawym przyciskiem myszy na wykresie, przejdź do Property → Color i wybierz By Terms, aby odróżnić symbole na wykresie w zależności od cząsteczek i klas. Przejdź do Layout → Format Plot → Axis i/lub Styles, aby zmodyfikować wykres zgodnie z pożądanymi parametrami.
    3. Na podstawie wyników analizy metabolomicznej O2PLS-DA przedstaw różnice w względnych poziomach konkretnych metabolitów lub klas metabolitów w formie histogramów.
    4. Na podstawie wyników analizy transcriptomicznej O2PLS-DA należy wyodrębnić i przypisać geny o zróżnicowanej modulacji do klasyfikacji Gene Ontology (GO)28.
    5. Ręczne określanie zależności między poziomami metabolitów a ekspresją genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Studium przypadku opisane w niniejszym artykule dostarczyło końcową macierz danych obejmującą 552 sygnały (cechy m/z), w tym jony molekularne wraz z ich izotopami, adduktami i niektórymi fragmentami, poddane względnej kwantyfikacji w 189 próbkach (7 winnic x 3 stadia dojrzewania x 3 sezony wegetacyjne x 3 powtórzenia biologiczne). Całkowita liczba punktów danych wyniosła zatem 104 328. Analiza drzew fragmentacji pozwoliła na adnotację 282 cech m/z, odpowiadających metabo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule opisano metabolomikę, transkryptomikę i protokoły analizy statystycznej stosowane do interpretacji koncepcji terroir z jagód winogron. Analiza metabolomiczna za pomocą HPLC-ESI-MS jest wystarczająco czuła, aby wykryć dużą liczbę metabolitów jednocześnie, ale na względną ocenę ilościową wpływa efekt matrycy i tłumienie/wzmacnianie jonów. Podobne podejście zastosowano już jednak do opisania dojrzewania i więdnięcia jagód Corvina po zbiorach, a korekta efektów matrycy miała ograniczony wpływ na wyniki5

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca skorzystała z działań sieciowych koordynowanych w ramach finansowanego przez UE COST ACTION FA1106 "Zintegrowane podejście systemowe do określenia mechanizmów rozwojowych kontrolujących jakość mięsistych owoców w pomidorach i winoroślach". Prace te były wspierane przez projekt "Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale" finansowany przez Fundację Banku CARIVERONA oraz przez projekt "Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)" finansowany przez włoskie Ministerstwo Polityki Rolnej i Leśnej. SDS został sfinansowany przez włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych FIRB RBFR13GHC5 projekt "The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Młynek MłynIKAIKA A11 podstawowy
HPLC AutosamplerBeckman Coulter -System Gold 508 Autosampler
HPLC SystemBeckman Coulter -System Gold 127 Moduł rozpuszczalnika HPLC
C18 Kolumna ochronnaGrace -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Kolumna ochronna
C18 KolumnaGrace -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Kolumnowy
spektrometr masowyBruker Daltonics -Bruker Esquire 6000; Spektrometr masowy był wyposażony w źródło ESI, a analizator był pułapką jonową.
Rozpuszczalniki ekstrakcyjne i HPLCSigma34966Metanol LC-MS klasa
Sigma94318Kwas mrówkowy LC-MS gatunek
Sigma34967Acetonitryl LC-MS gatunek
Sigma39253Woda  Filtry
RC 4 (0,2 μ m)Sartorius17764
Oprogramowanie do zbierania i przetwarzania danych (a) i przetwarzania (b)Bruker Daltonics-BrukerDaltonics Esquire 5.2 Control (a); Oprogramowanie Esquire 3.2 do analizy danych i MzMine 2.2 (b)
Zestaw Spectrum Plant Total RNASigma-AldrichSTRN250-1KTDo ekstrakcji całkowitego RNA z owocni winogron
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
RNA 6000 Nano OdczynnikiAgilent Technologies5067-1511
Chipy RNAAgilent Technologies5067-1511
Bufor do płukania ekspresji genów Agilent 1Agilent Technologies5188-5325
Bufor do płukania ekspresji genów Agilent 2Agilent Technologies5188-5326
Zestaw do etykietowania QuickAmp o niskim wkładzie jednokolorowyAgilent Technologies5190-2305
Zestaw RNA Spike In - jednokolorowyAgilent Technologies5188-5282
Zestaw do hybrydyzacji ekspresji genówAgilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104do oczyszczania cRNA
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-merowa mikromacierzAgilent TechnologiesG2514F-048771 
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/Prowadnice
uszczelkoweAgilent TechnologiesG2534-60012Włącz Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybrydyzacja
Wanna termostatycznaJulabo-Komora
hybrydyzacjiAgilent TechnologiesG2534-60001
Piec do hybrydyzacji mikromacierzyAgilent TechnologiesG2545A
Piec do hybrydyzacji RotatorRack Agilent TechnologiesG2530-60029
Pręt do konwersji rotatoraAgilent TechnologiesG2530-60030
Zestaw do barwieniaBio-Optica10-2000Naczynie do barwienia szkiełkowego i stojak na slajdy
Mieszadło magnetyczneAREX Ogrzewanie Mieszadło magnetyczneF20540163 
Piekarnik termostatycznyThermo ScientificHeraeus - 6030
Skaner mikromatrycowy AgilentTechnologiesG2565CA
Karuzela skanera, 48-pozycyjnaAgilent TechnologiesG2505-60502
Uchwyty do prowadnicAgilent TechnologiesG2505-60525
Oprogramowanie do ekstrakcji cech v11.5Agilent Technologiewskanerze mikromacierzowym Agilent G2565CA
oprogramowanie SIMCA + V13Umetrics
strzykawkowe LC-MS Minisart

Bibliografia

  1. Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
  2. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
  3. Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
  4. Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
  5. Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
  6. Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
  7. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
  8. Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
  9. Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
  10. Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
  11. Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
  12. Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
  13. Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
  14. Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
  15. Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
  16. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
  17. Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
  18. Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
  19. Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
  20. Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
  21. Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
  22. Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
  23. Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
  24. Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
  25. Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
  26. Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
  27. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
  28. Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza transkryptomumetabolomika LC MShybrydyzacja mikromacierzyanaliza g wnych sk adowychanaliza dyskryminacyjna O2PLSidentyfikacja metabolit wstatystyczna integracja danychplan pobierania pr bek jag d

Powiązane artykuły