Oznaczanie gatunków i oznaczanie ilościowe w mieszaninach z zastosowaniem spektrometrii mas MRM peptydów stosowanych do weryfikacji autentyczności mięsa

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół identyfikacji i ilościowego określania składników w mieszaninach gatunków o podobnych białkach. Spektrometria mas wykrywa peptydy w celu identyfikacji i podaje względną ocenę ilościową za pomocą stosunków powierzchni pików. Jako narzędzie do wykrywania oszustw, metoda ta może wykryć 1% koniny w wołowinie.

Streszczenie

Opisujemy prosty protokół identyfikacji i kwantyfikacji dwóch składników w binarnych mieszaninach gatunków posiadających jedno lub więcej podobnych białek. Kluczowe znaczenie dla tej metody ma identyfikacja "odpowiadających im białek" u gatunków będących przedmiotem zainteresowania, innymi słowy białek, które są nominalnie takie same, ale mają różnice w sekwencji specyficzne dla danego gatunku. Podlegając proteolizie, odpowiednie białka spowodują powstanie pewnych peptydów, które są również podobne, ale z wariantami specyficznymi dla gatunku. Są to "odpowiadające im peptydy". Peptydy specyficzne dla danego gatunku mogą być stosowane jako markery do określania gatunków, podczas gdy pary odpowiadających im peptydów pozwalają na względną ocenę ilościową dwóch gatunków w mieszaninie. Peptydy są wykrywane za pomocą spektrometrii mas monitorowania wielu reakcji (MRM), wysoce specyficznej techniki, która umożliwia określanie gatunków na podstawie peptydów nawet w złożonych systemach. Ponadto stosunek obszarów pików MRM pochodzących z odpowiednich peptydów wspiera względną ocenę ilościową. Ponieważ odpowiadające im białka i peptydy będą w zasadzie zachowywać się podobnie zarówno podczas przetwarzania, jak i podczas ekstrakcji doświadczalnej i przygotowania próbek, względna ocena ilościowa powinna pozostać stosunkowo solidna. Ponadto podejście to nie wymaga wzorców i kalibracji wymaganych w metodach bezwzględnego oznaczania ilościowego. Protokół jest opisany w kontekście czerwonego mięsa, które ma dogodne odpowiadające im białka w postaci odpowiednich mioglobin. Ta aplikacja jest istotna dla wykrywania fałszowania żywności: metoda może wykryć 1% masy mięsa końskiego w wołowinie. Odpowiednia kwant ilościowa białka i odpowiedniego peptydu (CPCP) przy użyciu współczynników powierzchni pików MRM daje dobre oszacowanie masy w stosunku do składu wagowego mieszanki konia i wołowiny.

Wprowadzenie

Europejski skandal z 2013 roku, w którym niezadeklarowane mięso końskie zostało znalezione w wielu produktach z wołowiny sprzedawanej w supermarketach¹, podkreśla potrzebę metod testowania zdolnych do wykrywania i mierzenia oszustw związanych z żywnością w mięsie. Zbadano kilka technologii, w szczególności test immunoenzymatyczny (ELISA) i metody oparte na DNA². Alternatywna metoda, oparta na spektrometrii mas, skupia się na peptydach specyficznych dla gatunku, które z kolei powstają z białek specyficznych dla danego gatunku. Poniżej przedstawiamy jedno z takich podejść opartych na peptydach, które oferuje zarówno identyfikację, jak i względną ocenę ilościową gatunków domieszek w mieszance mięsnej³.

Protokół jest sformułowany w kontekście czerwonych mięs i chęci określenia obecności jednego w drugim na poziomie 1% wagowym, poziomie uważanym przez niektórych za reprezentujący fałszywe zafałszowanie żywności, a nie zanieczyszczenie⁴. Metoda ta opiera się przede wszystkim na identyfikacji białka, które jest nominalnie "takie samo" we wszystkich docelowych mięsach. Mioglobina, białko odpowiedzialne za czerwony kolor mięsa, jest dobrym kandydatem, ponieważ występuje w dużych ilościach, jest stosunkowo tolerancyjne na ciepło i rozpuszczalne w wodzie, a wcześniej było używane do oznaczania gatunków mięsa^5,6. Na przykład mioglobiny dla wołowiny (Bos Taurus), wieprzowiny (Sus scrofa), koni (Equus caballus) i jagnięciny (Ovis aries)³ są nominalnie takie same, zgodnie z wymaganiami, ale ich sekwencje nie są identyczne. Takie grupy "podobnych, ale różnych" białek, takie jak te cztery mioglobiny, można wygodnie opisać jako "odpowiadające im białka". Różnice w sekwencji tych czterech mioglobin są specyficzne dla gatunku: na przykład pełne białka mioglobiny dla bydła mięsnego i konia, odpowiednio P02192 i P68082, zawierają 154 aminokwasy z 18 różnicami w sekwencji między nimi. Podlegając proteolizie przy użyciu trypsyny, białka te wytwarzają dwa zestawy peptydów, z których niektóre są identyczne, a niektóre wykazują jedną lub więcej różnic aminokwasów specyficznych dla gatunku: odpowiednie białka dają zatem początek odpowiadającym im peptydom.

Podejście CPCP ma zatem na celu najpierw zidentyfikowanie białek z dwóch lub więcej gatunków, w przypadku gdy białka te wykazują ograniczone warianty sekwencji specyficznych dla gatunku. Są to odpowiednie białka. W wyniku proteolizy odpowiednie białka dają początek peptydom, z których niektóre wykazują również specyficzne dla gatunku warianty sekwencji odziedziczone po białku macierzystym. Są to odpowiadające im peptydy. Podejście CPCP można wykorzystać do porównania poziomów dwóch odpowiadających sobie białek w próbce mieszanego gatunku poprzez monitorowanie poziomów odpowiednich peptydów.

Naturalną technologią wykrywania znanych peptydów jest wielokrotna spektrometria mas monitorująca reakcje, czyli MRM-MS⁷. Peptydy specyficzne dla gatunku dają jony prekursorowe, które wraz z jonami fragmentacyjnymi spektrometrii mas można łatwo wyszczególnić z wyprzedzeniem za pomocą narzędzi programowych. Listy te są następnie wykorzystywane do instruowania spektrometru mas, aby rejestrował tylko określone pary jonów prekursor plus fragment, zwane przejściami. Konkretny peptyd docelowy jest zatem identyfikowany nie tylko na podstawie czasu jego retencji w chromatografii poprzedzającej spektrometr masowy, ale także na podstawie zestawu przejść mających wspólny jon prekursorowy. Jest to wysoce selektywny sposób wykrywania znanych peptydów, który efektywnie wykorzystuje zasoby spektrometru mas.

Inni autorzy używali spektrometrii mas do testowania zafałszowań mięsa za pomocą markerów peptydowych, ale z różnych białek^8-14. Stosowanie odpowiednich białek, odpowiednich peptydów (CPCP) oznacza jednak, że warunki eksperymentalne mogą być optymalizowane, co pomaga w identyfikacji gatunków w mieszaninie na podstawie znanych przemian specyficznych dla gatunku. Ponadto odpowiednie białka i peptydy będą na ogół zachowywać się podobnie na etapach ekstrakcji, proteolizy i wykrywania. Ponieważ obszary pików przejściowych są ilościowe i odtwarzalne, proporcje powierzchni pików wynikające z par odpowiadających sobie peptydów z różnych gatunków zapewniają bezpośrednie oszacowanie względnych ilości dwóch mięs w mieszance. Z kolei bardziej tradycyjne metody oznaczania ilościowego wykorzystują kalibracje oparte na materiałach referencyjnych w celu ustalenia bezwzględnej oceny ilościowej^14,15.

Chociaż protokół jest opisany w kontekście mioglobiny i mięsa, białka inne niż mioglobina mogą być używane do identyfikacji i względnej kwantyfikacji za pomocą strategii CPCP w mieszankach mięsnych, choć potencjalnie z modyfikacjami protokołu. Ponadto strategia ta ma również zastosowanie do mieszanin binarnych innych gatunków, które mają wspólne jedno lub więcej odpowiadających im białek.

Punktem wyjścia dla protokołu jest oczyszczona 'referencyjna' mioglobina, którą dla niektórych gatunków można kupić, ale dla innych trzeba przygotować za pomocą konwencjonalnej chromatografii wykluczającej rozmiar. Procedura przygotowania mioglobiny referencyjnej nie jest zawarta w protokole, ale jest opisana w innym miejscu³. Narzędzia programowe¹⁶ służą do sporządzania wykazu peptydów kandydujących i przejść wynikających z mioglobin będących przedmiotem zainteresowania. Każda mioglobina referencyjna jest poddawana proteolizie, a powstałe peptydy są analizowane za pomocą chromatografii cieczowej z jonizacją elektronrozpylaną i tandemową spektrometrią mas (LC-ESI-MS / MS) w celu ustalenia, które z kandydujących jonów prekursorowych i przejść są najbardziej przydatne oraz w celu określenia pasujących czasów retencji peptydów. Wynikiem tego etapu jest poprawiona lista peptydów docelowych wraz z ich przejściami, odpowiednia do określenia gatunku, oraz lista par CPCP, odpowiednich do względnej oceny ilościowej. Aby przetestować prawdziwe mięso, przygotowuje się ekstrakcje próbek, a następnie poddaje się je proteolizie w celu wytworzenia peptydów zarówno z mioglobiny, jak i innych obcych białek. Peptydy na bazie mioglobiny są następnie monitorowane przez LC-ESI-MS/MS na podstawie ich wymienionych przejść. Gatunki obecne w mieszaninie identyfikuje się na podstawie pików przejściowych związanych z peptydami markerowymi. Oszacowania względnych ilości dwóch mięs w mieszance binarnej oblicza się przy użyciu stosunków powierzchni pików przejściowych. Zestaw badanych mieszanin par mięs pozwoli na sprawdzenie stosunku powierzchni pików dla danej pary przejść i skalibrowanie ich w stosunku do rzeczywistych mieszanek.

Protokół

1. Proteoliza i analiza mioglobin referencyjnych

1. Proteoliza mioglobin referencyjnych
   1. Przygotować roztwory oczyszczonych mioglobin odniesienia (zakres 0,2 - 0,5 mg/ml w 25 mM wodorowęglanie amonu)³.
   2. Przenieść 1 ml podwielokrotności każdej próbki do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml.
   3. Termiczną denaturację wyekstrahowanych białek poprzez ogrzewanie próbki w gorącym bloku w temperaturze 95 °C przez 30 minut. Schładzać próbkę przez około 15 minut, aż osiągnie temperaturę pokojową. Dodać 30 mg mocznika (końcowe stężenie 0,5 M) w celu poprawy trawienia, a następnie wymieszać.
2. Proteoliza tryptyczna
   1. Przygotować roztwór trypsyny o stężeniu 1 mg/ml w 25 mM wodorowęglanu amonu i przechowywać na lodzie w razie potrzeby. Dodać wystarczającą ilość trypsyny, tak aby końcowa aktywność enzymu wynosiła 420 BAEE (chlorowodorek estru etylowego N-benzoilo-L-argininy) jednostek/mg wyekstrahowanego białka, następnie wymieszać przez delikatne wirowanie i pozostawić do proteolizy przez noc w temperaturze 37 °C.
   2. Przeprowadzić elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE)¹⁷, aby wykazać kompletność proteolizy.
3. Odsalanie próbki po proteolizie
   1. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:2 v:v wodą.
   2. Aktywować polimerowy wkład z odwróconymi fazami (RP) wypełniony materiałem o stężeniu 30 mg RP, dodając 1 ml metanolu, a następnie zrównoważyć wkład, dodając 1 ml 1% kwasu mrówkowego.
   3. Załaduj próbkę do wkładu pod wpływem grawitacji.
   4. Przemyć 1 ml 5% metanolu/1% kwasu mrówkowego pod wpływem grawitacji.
   5. Eluować peptydy za pomocą 1 ml acetonitrylu/wody (90:10 v:v; 0,1% kwasu mrówkowego) pod wpływem grawitacji do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml wstępnie napełnionych 5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
   6. Usunąć rozpuszczalnik w próżni w temperaturze 50 °C za pomocą parownika odśrodkowego przez 120 minut, a następnie ponownie rozpuścić pozostałość w 250 μl acetonitrylu/wody (3:97 v:v; 0,1% kwas mrówkowy).
   7. Przenieść roztwór do fiolki z automatycznym próbnikiem o małej objętości.
      Uwaga: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do analizy metodą chromatografii mas metodą chromatografii cieczowej (LC/MS).
4. Generowanie list przejść dla MRM
   1. Zlokalizuj sekwencje mioglobiny dla różnych mięs z bazy danych UniProt .
   2. Wprowadź sekwencje mioglobiny do pola "Cel" w oprogramowaniu do przewidywania peptydów i przejść (np. Skyline). W razie potrzeby najedź kursorem na peptyd, aby wyświetlić jego listę fragmentów.
   3. Kliknij "Ustawienia" i wybierz "Ustawienia peptydów". Wprowadź preferencje dotyczące trawienia (tj. trypsyna) i liczbę pominiętych rozszczepień (0). Wprowadź wymagany wybór dla dodatkowych parametrów, w szczególności długości peptydu (6 - 25), wykluczeń N-końcowych (0) i zakładanych modyfikacji aminokwasów (brak).
   4. Kliknij "Ustawienia" i wybierz "Ustawienia przejścia". Wybierz preferencje dla typu instrumentu używanego do analizy LC/MS.
   5. Kliknij "Eksportuj" i wybierz "Lista przejść", aby utworzyć arkusz kalkulacyjny zawierający wygenerowane przejścia i parametry MRM.
5. Analiza metodą LC/MS
   1. Skonfiguruj system gradientu binarnego (woda (A) i acetonitryl (B), każdy z 0,1% kwasem mrówkowym v:v) wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC) z automatycznym samplerem, kolumną HPLC z rdzeniem C18 (10 cm x 2,1 mm, wielkość cząstek 2,6 μm) podłączoną do potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego działającego w trybie dodatniego elektrorozpylania z detekcją MRM.
   2. W oprogramowaniu do zbierania danych (np. Analityk) wybierz "Plik" i "Nowy", a następnie kliknij "Metoda pozyskiwania" w wyskakującym okienku, a następnie kliknij "OK".
      Uwaga: Spowoduje to otwarcie edytora metody instrumentu, który zawiera listę podłączonych urządzeń, które umożliwią konfigurację nowej metody LC/MS.
   3. Kliknij "Pompa binarna" i wprowadź wartość natężenia przepływu (300 μl/min) oraz czasy gradientu w tabeli, ustawiając binarny profil gradientu od 3% B do 30% B w ciągu 22 minut, zwiększając do 100% B po 23 minutach przez 5 minut wymywania przed powrotem do warunków początkowych i ponownej równowagi przez kolejne 6 minut.
   4. Kliknij na "Autosampler" i wprowadź objętość iniekcji (5 μl). Włącz "Cykl mycia igły" i wprowadź "Czas prania" (30 sekund) i wybierz "Port spłukiwania".
   5. Kliknij "Termostatowany regulator kolumny" i w "Właściwościach pieca kolumnowego" ustaw "Lewą temperaturę" i "Prawą temperaturę" (40 °C).
   6. Kliknij "Spektrometr mas", a następnie kliknij "Edytuj parametry", aby wprowadzić warunki gazu źródłowego. Wybierz "Typ skanowania" jako "MRM(MRM)" i "Polaryzacja" jako "Pozytywna". Przejdź do "Podsumowanie okresu" i wprowadź "Czas trwania", całkowity czas analizy LC i równoważenia (35 min).
   7. W tabeli kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Potencjał deklastrowania (DP)" i "Energia zderzenia (CP)", aby dodać te kolumny do tabeli. Wprowadź wartości Q1, Q3, czasu (ms), ID, DP i CE dla wszystkich przemian, dla pojedynczego gatunku mięsa, utworzonych na liście przejść (patrz krok 1.4.5).
      Uwaga: Czas (ms) odnosi się do czasu przebywania, czasu, jaki spektrometr masowy spędza na skanowaniu każdego przejścia, którego suma nie powinna przekraczać 3 sekund.
   8. Zapisz plik Metody pozyskiwania (rozszerzenie pliku .dam).
      Uwaga: Kroki 1.5.2 - 1.5.8 należy powtórzyć dla każdego gatunku mięsa. Spowoduje to utworzenie jednego pliku metody dla każdego gatunku mięsa w trybie ekranowym w ramach przygotowań do poniższej analizy.
   9. W oprogramowaniu do zbierania danych kliknij "Acquire" (Pobierz) i wybierz opcję "Equilibrate'. W oknie, które się otworzy, wybierz wymaganą metodę akwizycji, aby rozpocząć równoważenie instrumentu.
   10. Umieść fiolki z próbkami w stojaku w próbniku automatycznym.
   11. Kliknij "Plik" i wybierz "Nowy", a następnie "Partia przejęcia". W zakładce 'Sample' wybierz 'Add Set', a następnie 'Add Samples'. Wprowadź liczbę próbek do analizy i kliknij przycisk "OK". W polu "Akwizycja" wybierz z menu rozwijanego plik metody, który zostanie użyty do analizy.
   12. W tabeli wybierz opcję "Kod tablicy" i wybierz odpowiednią konfigurację tacy z menu rozwijanego. Kliknij lewym przyciskiem myszy nagłówek kolumny "Kod płyty", a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Wypełnij". W polu "Pozycja fiolki" należy wprowadzić pozycję każdej próbki w próbniku automatycznym w wierszach.
   13. W polu "Plik danych" wprowadź nazwę pliku do pobrania, następnie kliknij lewym przyciskiem myszy nagłówek kolumny, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję "Wypełnij". W polu "Nazwa próbki" należy wpisać tożsamość każdej z próbek, które mają zostać poddane analizie. Zapisz jako plik wsadowy akwizycji (rozszerzenie pliku .dab).
   14. Kliknij zakładkę "Prześlij", a następnie zaznacz próbki, które muszą zostać przeanalizowane na LC/MS. Kliknij na "Prześlij". Kliknij "Pobierz" i "Rozpocznij próbkę", aby rozpocząć analizę.
       Uwaga: Każda metoda akwizycji będzie skanować w poszukiwaniu przejść MRM na całej długości chromatografu dla pojedynczego gatunku mięsa. Ustawienia spektrometru mas do akwizycji MRM różnią się w zależności od typu instrumentu i peptydu.
   15. Przeglądaj wygenerowane pliki danych za pomocą oprogramowania do przeglądania danych. Kliknij na XIC (wyekstrahowane jony) i na liście rozwijanej zaznacz wszystkie fragmenty (wartości Q3) dla pojedynczego prekursora (Q1). Otworzy się nowy panel, który pokazuje tylko wybrane przejścia.
   16. Zapisać czas retencji (R_t) dla grup jednoczesnych przejść, ponieważ odpowiadają one pojedynczemu peptydowi.
   17. Powtórz poprzednie dwa kroki dla każdego zestawu przejść w celu przypisania pików do odpowiednich peptydów dla każdego z gatunków mięsa.
   18. Zapisać peptydy markerowe, które są odpowiednie do identyfikacji gatunku (np. peptyd HPGDFGADAQGAMTK, prekursor m/z = 752, R_t = 12,0 min, dla konia), wraz z ich czasami retencji, i zanotować, które tworzą odpowiadające im pary odpowiednie do względnego oznaczania ilościowego.
       Uwaga: Na przykład peptyd markerowy konia (prekursor m/z = 752) ma odpowiadający mu peptyd wołowy, HPSDFGADAQAAMSK (prekursor m/z = 767, R_t = 13,2 min).
   19. W celu stworzenia jednej metody dynamicznej obejmującej wszystkie gatunki mięsa, w oprogramowaniu do przeglądania danych, dla każdego gatunku mięsa po kolei, otwórz dane przejścia XIC dla każdego prekursora (przypisanego do określonego peptydu w 1.5.8).
   20. Powiększ klaster szczytowy w wybranym czasie przechowywania, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając kursor poniżej klastra. Zidentyfikuj najbardziej intensywne przejścia (klikając prawym przyciskiem myszy etykietę szczytu).
   21. Ręcznie rejestruj przejścia i czasy przechowywania w arkuszu kalkulacyjnym.
   22. Aby wprowadzić parametry jako nową metodę dynamiczną w oprogramowaniu LC/MS, kliknij "Spektrometr mas", a następnie kliknij "Edytuj parametry", aby wprowadzić warunki gazu źródłowego. Wybierz "Typ skanowania" jako "MRM(MRM)" i "Polaryzacja" jako "Pozytywna".
   23. Przejdź do "Podsumowanie okresu" i wprowadź czas trwania (ustawiony jako całkowity czas dla analizy i równoważenia LC). W tabeli kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Potencjał deklastrowania (DP)" i "Energia zderzenia (CP)", aby dodać te kolumny do tabeli.
       Uwaga: kolumna "Czas" odnosi się teraz do oczekiwanego czasu przechowywania (min) dla każdego przejścia.
   24. W sekcji "Edytuj parametry" w oprogramowaniu do zbierania danych LC/MS zaznacz pole "Zaplanowane MRM". Wprowadź wartości Q1, Q3, czasu (min), ID, DP i CE dla przejść utworzonych w arkuszu kalkulacyjnym (1.5.21) i zapisz metodę akwizycji (rozszerzenie pliku .dam).
       Uwaga: Ta metoda zazwyczaj zmniejsza liczbę przejść MRM do 4 najbardziej intensywnych dla każdego peptydu i skanuje tylko w oknie czasu retencji dla każdego piku peptydu, zapewniając lepszą czułość i jakość danych. Metoda "dynamiczna" to metoda "kontrolowanego okna czasu przechowywania", czasami nazywana planowaniem.

2. Przygotowanie i analiza próbek kalibracyjnych

1. Ekstrakcja mieszanek mięsnych
   1. Używając mięsa uprzednio zamrożonego, a następnie zmielonego na proszek, przygotuj szereg mieszanek mięsnych, ważąc odpowiednie ilości mięsa (całkowita masa około 300 mg) w plastikowych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml.
   2. Dodać 4 ml buforu ekstrakcyjnego (0,15 M chlorek potasu + 0,15 M bufor fosforanowy o pH 6,5). Wir przez 30 sek. Ekstrahować na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy 250 cyklach/min.
      Uwaga: Cykle/min odnoszą się do ruchu oscylacyjnego.
   3. Przenieść 2 ml ekstraktu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 17 000 x g.
   4. Przenieść 200 μl podwielokrotności supernatantu (rezerwując niewielką ilość do oznaczania białka, patrz 2.2) do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i wysuszyć za pomocą parownika odśrodkowego (wstępnie ustawiony program: 50 °C, bez odpowietrzania i czas trwania 120 min).
2. Test białka
   1. Przenieść 7 μl podwielokrotności zarezerwowanego supernatantu (patrz 2.1.4) w trzech egzemplarzach do studzienek płytki 96-dołkowej.
   2. Przenieść 7 μl podwielokrotności szeregu wzorców białkowych w trzech egzemplarzach, w zakresie 0 - 1,0 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), na tę samą płytkę 96-dołkową.
   3. Dodać 200 μl odczynnika do oznaczania białek Coomassie plus do każdego dołka.
   4. Porównaj wizualnie kolor studzienek próbki z wzorcami białka, aby sprawdzić, czy próbki mieszczą się w zakresie wzorców kalibracyjnych. W razie potrzeby powtórzyć czynność z rozcieńczoną próbką, aby znalazła się w zakresie.
   5. Odstaw talerz na 3 minuty.
   6. Rozbij wszelkie pęcherzyki, które się utworzyły, za pomocą igły podskórnej.
   7. Przeanalizuj płytkę na czytniku płytek przy użyciu standardowego protokołu punktu końcowego o długości fali 595 nm.
   8. Oznaczyć stężenie białka w próbkach, korzystając z danych kalibracyjnych z wzorców białka.
      Uwaga: Jest to wymagane do obliczenia ilości trypsyny użytej w trawieniu tryptycznym.
3. Proteoliza mieszanek mięsnych
   1. Ponownie rozpuścić wysuszoną pozostałość z etapu 2.1.4 w 1 ml 25 mM roztworu wodorowęglanu amonu. Dobrze wymieszaj na rotamixerze.
   2. Postępuj zgodnie z protokołem od kroków 1.1.3 do 1.3.7.
4. Analiza metodą LC/MS
   1. Skonfiguruj LC/MS jak poprzednio (krok 1.5.1).
   2. Utwórz nową partię akwizycji, jak opisano wcześniej (kroki 1.5.9 - 1.5.14), wybierając metodę pozyskiwania utworzoną w kroku 1.5.24, która wykorzystuje dynamiczną metodę LC/MS łączącą wszystkie gatunki mięsa, i uzyskaj dane dla próbek strawionego mięsa.
   3. Wyświetlić pełny chromatogram w oprogramowaniu do przeglądania danych. Wyświetla XIC dla każdego zestawu przejść po kolei. Potwierdź wzrokowo, że każda grupa zawiera wymaganą liczbę pików w kształcie dzwonu w oczekiwanym czasie retencji, potwierdzając w ten sposób istnienie wybranego peptydu.
   4. Wykonaj ocenę ilościową za pomocą oprogramowania do przeglądania danych, aby zintegrować obszary pików dla każdego z interesujących Cię przejść, klikając dwukrotnie opcję "Zbuduj metodę kwantyfikacji" na pasku nawigacyjnym.
   5. W okienku "Wybierz próbkę" wybierz "Plik danych" i "Próbkę" do analizy, aby wygenerować tabelę "Anality".
   6. Kliknij zakładkę "Integracja", aby wyświetlić pierwsze z przejść (analitów), które mają zostać zintegrowane.
   7. Kliknij pole "Analit", aby wyświetlić rozwijaną listę przejść. Wybierz kolejno każde przejście, aby je wyświetlić i wizualnie potwierdzić, że do integracji wybrano właściwy pik. Aby zmodyfikować lub wymusić integrację, kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij kursor nad docelowy szczyt (zostanie on podświetlony na zielono). Kliknij przycisk "Wybierz szczyt" i kliknij "Zastosuj".
   8. Zapisz obszar roboczy jako plik metody (.qmf).
      Uwaga: Spowoduje to utworzenie pliku metody kwantyfikacji do późniejszego obliczenia powierzchni pików próbki.
   9. Kliknij dwukrotnie "Kreator kwantyfikacji" na pasku nawigacyjnym. W oknie "Wybierz próbki" utwórz "Zestaw ilościowy", wybierając pojedynczy "Plik danych", a następnie jedną lub więcej "Dostępne próbki". Wybierz "Dalej", aby wyświetlić pole "Wybierz ustawienia i zapytanie". Pozostaw ustawienia domyślne, wybierz "Dalej", aby wyświetlić "Wybierz metodę". Z rozwijanego pola "Metoda" wybierz plik "Metoda integracji" utworzony w kroku 2.4.8, a następnie wybierz "Zakończ".
      Uwaga: W ten sposób tworzona jest "Tabela wyników", zawierająca obszary pików przejściowych powstających w wyniku mieszanek mięsnych.
   10. Zapisz 'Tabelę wyników' (rozszerzenie pliku .rdb), wyeksportuj jako plik tekstowy (.txt) i otwórz go w arkuszu kalkulacyjnym, aby przejrzeć dane.
   11. Wykreśl wykresy procentu (według obszaru piku przejściowego) jednego mięsa w innym w porównaniu z zmierzonym procentem (w/w) dwóch mięs dla wybranego MRM dla wybranych przejść z odpowiednich peptydów, koncentrując się na tych przypadkach, w których dwa fragmenty zawierają taką samą liczbę aminokwasów, jak liczona od końca C-końcowego.
       Uwaga: Identyczne fragmenty z identycznymi miejscami fragmentacji dają optymalne wyniki.
   12. Należy zbadać wykresy z ppkt 2.4.11 powyżej. Wizualnie lub za pomocą narzędzia linii trendu w pakiecie kreślenia zidentyfikuj grupę wykresów, które są zarówno liniowe, jak i o podobnym nachyleniu. Użyj jednej lub więcej z tych kombinacji CPCP plus fragmentów do kalibracji w prawdziwych próbkach mięsa.
       Uwaga: Wykres przedstawiający nietypowy gradient może wskazywać na tłumienie peptydów lub fragmentów, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia siły sygnału. Wykresy nieliniowe mogą wskazywać na słabą detekcję pików lub inne problemy.

3. Próbki mięsa

1. Ekstrakcja białek z docelowych próbek mięsa
   1. W stosownych przypadkach należy wyciąć z próbki obcy materiał niemięsny za pomocą szpatułki. Na przykład zeskrob sos i makaron ze schłodzonej lasagne.
   2. Odważyć 20 g mięsa do metalowej zlewki.
   3. Dodać 100 ml 0,15 M buforu chlorku potasu/0,15 M monofosforanu potasu o pH 6,5.
   4. Wyekstrahuj białka, mieszając mięso w homogenizatorze wysokoobrotowym przez 1 minutę.
   5. Postępuj zgodnie z protokołem z kroku 2.1.4 - 2.3.2.
2. Analiza próbek metodą LC/MS
   1. Powtórz krok 2.4.2, aby uzyskać dane przy użyciu metody dynamicznej LC/MS.
   2. Zidentyfikuj peptydy z każdej mioglobiny mięsnej, jak to opisano w kroku 2.4.3.
   3. Do oznaczania ilościowego należy użyć oprogramowania do oznaczania ilościowego, aby zintegrować obszary pików dla każdego interesującego przejścia, jak opisano w kroku 2.4.9.
   4. W celu identyfikacji gatunków w mieszaninie należy zapisać te peptydy markerowe spełniające uzgodnione kryteria liczby przejść i sygnał do szumu w odniesieniu do tych przejść.
   5. Do oznaczania ilościowego należy użyć zintegrowanych obszarów pików przejściowych, jak uzgodniono w kroku 2.4.12, a następnie obliczyć procentową zawartość mioglobiny w odniesieniu do powierzchni piku przejściowego, w odniesieniu do dwóch gatunków w mieszaninie.
   6. Wykorzystać wcześniejszą wiedzę z literatury¹⁸ na temat prawdopodobnych poziomów mioglobiny w mięsie, aby oszacować względne ilości wagowe dwóch rodzajów mięsa obecnych w próbce.

Wyniki

W pojedynczym eksperymencie MRM w trybie dynamicznym każde zaprogramowane przejście jest rejestrowane oddzielnie (jako liczba detektorów na sekundę, cps) w określonym oknie czasu przechowywania. Dlatego ze wszystkich danych zebranych w jednym eksperymencie można indywidualnie wyodrębnić szczytową intensywność dla każdego przejścia. Wtedy jedynym skończonym sygnałem jest okno czasu przechowywania ustawione dla tego przejścia. Za oknem sygnał z definicji wynosi zero. Sygnał dla dowolnego przejścia, na przykład 752 → 1269 od konia (monoizotopowa masa peptydu 1 501,66 daltonów, jon prekursorowy m/z 751,84 daltonów, stan naładowania = 2, fragment jonu y¹³) zazwyczaj musi konkurować tylko z szumem pomiarowym, a nie z innymi pikami przejścia, które mogą pochodzić od innych gatunków. Wynikiem wyjściowym jest zatem zestaw czystych pików, po jednym na przejście, we wspólnym czasie retencji dla tych przejść, które mają wspólny jon prekursorowy.

Rysunek 1 pokazuje wynik dla zestawu czterech przejść 752 → (1269, 706, 248, 1366) dla mieszanki 1% w/w konina w wołowinie. Ponieważ cztery pokazane przejścia są związane z koniem i nie występują w próbkach czystej wołowiny, jagnięciny lub wieprzowiny, te piki oznaczają obecność konia. W zależności od kryteriów niezawodności zestaw dwóch lub więcej przejść, z których każde przekracza określony poziom sygnału do poziomu szumu, ustanawia identyfikację. Liczba ta określa zatem obecność końskiej w mieszance 1% w/w koniny w wołowinie.

Czasami wykrywane jest pojedyncze izolowane przejście. Wskazuje to na przypadkowe dopasowanie jonu prekursorowego i pojedynczego fragmentu, być może z obcego białka, z tymi oczekiwanymi z układu i zaprogramowanymi w spektrometrze mas. Osobliwa natura piku i jego pojawienie się w nieoczekiwanym czasie retencji jest sygnaturą przypadkowego przejścia, które można zignorować.

Obszar pod każdym pikiem przejściowym może być obliczany indywidualnie. Na podstawie odpowiedniego fragmentu stosunek obszarów pików przejściowych między końmi a wołowiną, na przykład 752 → 1269 (koń) do 767 → 1299 (wołowina), będzie proporcjonalny do stosunku rzeczywistych mięs w mieszance. Rysunek 2 przedstawia wykres procentowy powierzchni piku dla tych dwóch przejść w stosunku do procentowej masy ciała konia w mieszance konia z wołowiną. Jeżeli procentowe powierzchnie pików przejściowych są zgodne z procentową wagą masy mięsa, wówczas nachylenie wynosi 1. Nachylenie na tym wykresie wynosi 1,03, co wskazuje, że dla tych przejść i pary CPCP powierzchnie pików przejściowych stanowią wiarygodną miarę względnych ilości dwóch mięs w mieszance. Jeśli mięso końskie w próbce było dwa razy bogatsze w mioglobinę niż wołowina, to przy niezmienionych innych czynnikach nachylenie linii byłoby większe niż jeden.

Rysunek 1. Intensywność przejścia MRM w porównaniu z czasem retencji dla 1% w/w konia w wołowinie. Przejścia wynoszą 752 → (1269, 706, 248, 1366), pokazane odpowiednio w kolorze pomarańczowym, czarnym, niebieskim i zielonym. Peptydem markerowym jest HPGDFGADAQGAMTK. Cztery fragmenty przejściowe można oznaczyć odpowiednio y¹³, y⁷, y² i y¹⁴, gdzie yⁿ oznacza liczenie w n aminokwasach od końca C-końcowego peptydu. Stosunek sygnału do szumu waha się od 23 do 53 w czterech przejściach. Dodatkowa czerwona linia oznacza przejście 752 → 1269 dla porównania 0% konia, 100% wołowiny. Wyświetlany jest tylko niezerowy region czasu przechowywania. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Watson et al.³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Wykres konia w wołowinie, jako procent masy w stosunku do masy, w porównaniu z koniem w wołowinie jako procent powierzchni piku przejściowego. Wykres wykorzystuje parę peptydów wołowiny (767) i konia (752) oraz jon fragmentacyjny y¹³ dla obu. Jeśli A oznacza powierzchnię piku, to rzędna wynosi 100A_H / (A_H + A_B). Nachylenie linii najlepszego dopasowania (R² = 0,99) wynosi 1,03. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Watson et al.³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ważny jest wybór odpowiedniego białka docelowego. Dobre białko docelowe musi mieć odpowiednie formy u gatunków będących przedmiotem zainteresowania, wystarczającą zmienność sekwencji zależną od gatunku, specyficzność gatunkową i występować w dostępnych ilościach w organizmach. Do oceny mieszanin, które zostały poddane przetwarzaniu (na przykład obróbce cieplnej), pożądane jest białko o sekwencji stosunkowo odpornej na to przetwarzanie. Mioglobina jest dobrym kandydatem do czerwonego mięsa, w tym gotowanego czerwonego mięsa, ale nie jest jedyną możliwością. Po ustaleniu białka docelowego najbardziej krytyczną częścią protokołu jest proteoliza białka. Białko inne niż mioglobina może wymagać alternatywnego protokołu proteolizy.

Opisany protokół obejmuje segment oparty na referencyjnym oczyszczonym białku. Ma to na celu odkrycie okien czasowych retencji oraz odpowiednich jonów prekursorowych i fragmentacyjnych. Ten segment jest bardzo pomocny, ale nie jest niezbędny.

Chociaż odpowiadające sobie pary peptydów z dwóch interesujących gatunków można wymienić nawet bez eksperymentu, czasami zdarza się, że różnica w sekwencji ma dramatyczne konsekwencje dla profilu trawienia. Na przykład para peptydów VLGFHG (wołowina) i ELGFQG (koń) daje nietypowy wynik kwantyfikacji (objawiający się jako gradient mniejszy niż jeden na rysunku 2). Dzieje się tak, ponieważ ten ostatni peptyd powstaje w wyniku stosunkowo stłumionego rozszczepienia K-E, co powoduje niedoszacowanie poziomu konia w mieszance. Dlatego najlepiej unikać odpowiednich peptydów zaczynających się od różnych aminokwasów. Często fragmenty z dwóch odpowiadających sobie peptydów mają identyczne sekwencje aminokwasów i są dobrze wychowane, ale nie zawsze tak jest i należy to sprawdzić podczas opracowywania metody. Identyfikacja gatunków jest znacznie mniej wrażliwa na te kwestie niż względna ilość.

Protokół został zademonstrowany w odniesieniu do czterech sztuk mięsa czerwonego³. Można uwzględnić dodatkowe gatunki mięsa, chociaż jakość kształtu piku przejściowego może ulec pogorszeniu, jeśli zbyt wiele peptydów markerowych ulega koelucji, skutecznie skracając czas przebywania i ostatecznie pogarszając względne szacunki ilościowe. Ulepszone oprzyrządowanie, które jest już dostępne, poprawi ten cel. Powiązaną kwestią jest to, że nie wszystkie mięsa mają różne mioglobiny. Na przykład mioglobiny konia, osła i zebry są identyczne, a zatem ściśle mówiąc, metoda jest w stanie wykryć konia, osła lub zebrę tylko w wołowinie. W niektórych przypadkach, mimo że mioglobiny nie są identyczne, niektóre kluczowe peptydy mogą być. Na przykład niektóre peptydy markerowe pochodzące z mioglobiny jagnięcej pojawiają się również u kóz.

Komplikacją stojącą przed tą i każdą inną metodą oznaczania ilościowego opartą na białkach jest to, że poziom białka musi być przyjęty jako stały dla wszystkich gatunków, jeśli poziomy białka lub peptydów mają być trywialnie równe poziomom mięsa w mieszance. W przypadku mioglobiny i czterech czerwonych mięs nie jest to uniwersalna prawda. Ogólnie rzecz biorąc, poziomy są zależne od gatunku, przy czym wieprzowina wykazuje najniższy poziom z tych czterech. Ponadto poziom mioglobiny zmienia się w zależności od kawałka mięsa i wieku zwierzęcia. Tak więc, chociaż proporcje obszarów pików przejściowych są wiarygodnie odwzorowane na proporcjach mioglobiny, odwzorowanie na stosunek rzeczywistego mięsa jest oszacowaniem opierającym się na założeniach dotyczących prawdopodobnych źródeł mięsa w mieszance.

Podejście przedstawione w tej pracy różni się pod wieloma względami od innych opublikowanych wkładów. Bardziej typową drogą jest zastosowanie metod proteomicznych do identyfikacji różnych zależnych od gatunku peptydów markerowych, w którym to przypadku markery dla różnych gatunków nie mają ze sobą szczególnego związku^8-12,14,19. W przeciwieństwie do tego, wybraliśmy białka wspólne dla wszystkich interesujących gatunków, aż do wariantów sekwencji zależnych od gatunku³. Oprócz tego, że ma to kluczowe znaczenie dla naszej strategii względnej oceny ilościowej, ma to tę zaletę, że strategie przygotowania próbek można zoptymalizować. Ponadto można oczekiwać, że takie odpowiadające im białka będą zachowywać się podobnie, na przykład podczas ekstrakcji lub komercyjnego przetwarzania próbek, takich jak gotowanie lub konserwowanie. Identyfikacja gatunku zwykle przebiega następnie poprzez wykrywanie różnych peptydów markerowych, podczas gdy w podejściu CPCP identyfikacja gatunków przebiega poprzez wykrywanie blisko spokrewnionych peptydów posiadających zazwyczaj jedną lub dwie różnice w sekwencji. Wreszcie, kwantyfikacja białek w celu oszacowania procentu wagowego jednego gatunku w innym może konwencjonalnie przebiegać poprzez bezwzględną ocenę ilościową każdego białka osobno w oparciu o znane standardy^7,14,15. Jednak w przypadku metody CPCP nie ma potrzeby stosowania metod kalibracji. Zamiast tego poziomy względne szacuje się, porównując siły sygnału dwóch odpowiadających sobie peptydów z dwóch gatunków, całkowicie pomijając etap pomiaru bezwzględnego. Ponieważ ostatecznym celem jest procentowy udział wagowy jednego gatunku w innym, względna ocena ilościowa, CPCP jest zarówno bardziej bezpośredni, jak i prostszy niż porównywanie dwóch bezwzględnych pomiarów ilościowych. Cechy te przekładają się na krótki czas eksperymentowania, który ma wynosić około dwóch godzin przy użyciu udoskonalonych protokołów, co sprawia, że technika ta jest przydatna jako narzędzie szybkiego nadzoru w dziedzinie wykrywania oszustw związanych z żywnością.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Baza danych Uniprot	www.uniprot.org		Swobodnie dostępna baza danych sekwencji białek
Oprogramowanie Skyline	www.skyline.gs.washington.edu		Darmowe oprogramowanie do pobrania, które umożliwia tworzenie ukierunkowanych metod do badań proteomicznych, peptydów i fragmentów Prognozy
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com	O9830
Metanol, klasa HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Wielka Brytania www. fisher.co.uk	10674922
Acetonitryl, klasa HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Wielka Brytania www. fisher.co.uk	10010010
Mocznik	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com	U5378
Trypsyna (z trzustki bydlęcej leczonej TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com	T1426
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com	F0507
Odczynnik do oznaczania białek Coomassie Plus	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Wzorzec białka	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Wielka Brytania www.sigmaaldrich.com	P0914
Homogenizator Ultra Turrax T25	Fisher Scientific, Loughoborough, Wielka Brytania www. fisher.co.uk	13190693
			laboratoryjna Edmund and Buhler KS10
Wirówka Heraeus Fresco 17	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Wirówka próżniowa RC 1022	Czytnik
		8B-S100-UBJ
4000 QTrap potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy	AB Sciex, Warrington, Wielka Brytania www.sciex.com
system LC o szybkiej rozdzielczości 1200	Agilent, Stockport, Wielka Brytania
XB C18 kolumna kapilarna z odwróconymi fazami (100 mm x 2,1 mm, 2,6 i mikro; m wielkość cząstek)	Phenomenex, Macclesfield, Wielka Brytania www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 oprogramowanie	AB Sciex, Warrington, Wielka Brytania www.sciex.com		Akwizycja i analiza danych QTrap, w tym integracja obszaru pików
			Fiolki z automatycznym podajnikiem próbek